Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Гиперэкспрессия гена множественной лекарственной устойчивости (MDR-1) у больных хроническим миелолейкозом. Клинико-лабораторное сопоставление и прогноз заболевания

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

РОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕМАТОЛОГИИ И ТРАНСФУЗИОЛОГИИ

На правах рукописи

СТЮФ ИРИНА ЮРЬЕВНА

УДК 616.155.392.8:[612.119:575.113

ГИПЕРЭКСПРЕССИЯ ГЕНА МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ (М1Ж-1)'У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ МИЕЛОЛЕЙКОЗОМ. КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНОЕ СОПОСТАВЛЕНИЕ И ПРОГНОЗ ЗАБОЛЕВАНИЯ

14.00.29 - Гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Р Г Б, ОД - 5 МАЙ 19Я7

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1997

Работа выполнена в Санкт-Петербургском государственном медицинском университете имени академика И.П. Павлова

Научные руководители: доктор медицинских наук А.Ю. Зарицкий

доктор медицинских наук П.Г. Князев

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук М.Н. Блинов

^доктор биологических наук Г.Е. Аркадьева

Ведущая организация: Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова

Защита состоится V1 " й/ь^'/ъЯ-л^А- 1997 Года в 7л часов на заседании Специализированного Совета (шифр Д.084.19.01) при Российском научно-исследовательском институте гематологии и тр'ансфузиологии (г. Санкт-Петербург, улица 2-я Советская, дом 1$,конференц-зал)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института

Автореферат разослан " ЛО" .(М^ииСи 1997 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета кандидат медицинских наук

В.С. Быков

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Ведущим механизмом, обеспечивающим опухолевой клетке способность быть нечувствительной к воздействию летальных доз цито-статических препаратов, является система множественной лекарственной устойчивости [P. Hoffman, 1991]. К семейству генов этой системы принадлежит ген множественной лекарственной устойчивости (MDR-1) [Т. Tsucuo, 1988]. В последние годы повышается интерес к изучению уровня экспрессии гена MDR-1 в опухолевых клетках, поскольку результаты полихимиотерапии (ПХТ) больных злокачественными заболеваниями часто коррелируют с уровнем экспрессии этого гена в опухолевых клетках [Н. Pinedo, G. Giaccone, 1995]. Повышенный уровень экспрессии данного гена был выявлен также у здоровых лиц в ряде клеток различного гистогенеза, в том числе в CD34 (+) гемопоэтиче-ских клетках [P. Hoffman, 1991]. Это позволило выдвинуть предположение, что высокий уровень экспрессии данного гена в опухолевых клетках имеет отношение не только к защите клетки от цитостатических препаратов [Н. Pinedo, G. Giaccone, 1995].

Клиническая значимость уровня экспрессии гена MDR-1 в гемо-поэтических клетках была выявлена у больных злокачественными заболеваниями солидного типа, множественной миеломой, острым лейкозом, лимфомами [К. Nooter, S. Sonneveld, 1994]. Однако, в отношении больных хроническим миелолейкозом (ХМЛ) вопрос изучен пока недостаточно [S. Hagawish-Becker, D.Hossfeld,1996].

В связи с этим актуальным представляется исследование уровня экспрессии гена MDR-1 в гемопоэтических клетках больных ХМЛ для прогнозирования течения заболевания.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Определить клиническую значимость уровня экспрессии гена-МО/?-1 в гемопоэтических клетках больных ХМЛ в разных фазах заболевания.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Изучить уровень экспрессии гена МО/?-1 в гемопоэтических клетках больных ХМЛ в динамике в разных фазах заболевания.

I

2. Проанализировать взаимосвязь уровня экспрессии гена МО/?-1 в гемопоэтических клетках больных ХМЛ с препаратами, потенциально индуцирующими гиперэкспрессию данного гена.

3. Проанализировать взаимосвязь уровня экспрессии гена МО/?-1 в гемопоэтических клетках больных ХМЛ с известными прогностическими критериями течения данного заболевания.

4. Проанализировать взаимосвязь уровня экспрессии гена МО/?-1 с продолжительностью жизни больных ХМЛ и продолжительностью каждой фазы данного заболевания.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ :

1.Уровень экспрессии гена МОЯ-1 в гемопоэтических клетках больных ХМЛ не зависит от использования антрациклинов и алкалоидов барвинка розового в предшествующих схемах лечения.

2. Уровень экспрессии гена МО/?-1 в гемопоэтических клетках больных ХМЛ не зависит от фазы заболевания и содержания бластных клеток в периферической крови этих больных.

3. Уровень экспрессии гена МО/?-1 в гемопоэтических клетках не коррелирует с появлением дополнительных хромосомных аберраций в гемопоэтических клетках больных ХМЛ в фазе бластного криза.

4. Продолжительность жизни и длительность хронической фазы больных ХМЛ коррелирует с уровнем экспрессии гена МО/?-1 в гемо-

поэтических клетках этих больных и является негативным прогностическим признаком в отношении как продолжительности жизни, так и длительности хронической фазы заболевания.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА При выполнении исследования было обнаружено, что характер предшествующей терапии не влияет на уровень экспрессии гена МОЯ-1 в гемопоэтических клетках больных ХМЛ в разных фазах заболевания. Оказалось, что известные прогностические признаки не коррелируют с уровнем экспрессии гена МОЯ-1 в гемопоэтических клетках больных, включенных в настоящее исследование. Впервые получены данные о взаимосвязи между продолжительностью жизни и длительностью хронической фазы (ХФ) больных ХМЛ, включенных в настоящее исследование, и уровнем экспрессии гена МОЯ-1 в гемопоэтиче-ских клетках этих больных: повышение уровня экспрессии гена МОЯ-1 в гемопоэтических клетках этих больных является негативным прогностическим признаком как в отношении длительности ХФ в целом, так и длительностью времени между исследованием уровня экспрессии данного гена и развитием БК или смертью больного.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ В исследовании выявлен новый прогностический критерий длительности хронической фазы ХМЛ, который, наряду с уже известными критериями, может позволить улучшить планирование химиотерапии при данном заболевании (раннее или отсроченное проведение ауто- или алло-трансплантации костного мозга - ТКМ). Более того, выявление гиперэкспрессии гена МОЯ-1 может способствовать выбору режима кондиционирования перед ТКМ. В работе разработан простой и недорогостоящий метод выявления гиперэкспрессии генов в индивидуальных клетках на цитологических препаратах.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Полученные данные были представлены на 10 всероссийском съезде гематологов и трансфузиологов (Санкт-Петербург, 1996 год); на Международных симпозиумах "Новые направления в лечении лейкозов" (Санкт-Петербург, 1992 и 1994), In: The first International Conference on trace elements, free radicals, tumor markers, chromosomal analysis and cytokines in clinical medicine and biochemistry (TFTCC), (Kuwait, 1995); In: 9th Symposium Molecular Biology of Hematopoiesis and Treatment of Leukemias and Lymphomas (Italy, Genoa, 1995)..

РЕАЛИЗАЦИЯ РАБОТЫ Результаты работы и разработанный метод широко используются в оценке прогноза больных ХМЛ, находящихся на лечении в онкогемато-логическом отделении для взрослых Центра Передовых Медицинских Технологий г. Санкт-Петербурга, в гематологическом кабинете поликлиники N32, в НИИ Онкологии им. проф. H.H. Петрова, клиники факультетской терапии СПбГМУ имени академика И.П.Павлова.

ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ Диссертация изложена на 101 странице машинописного текста, содержит 16 таблиц и 6 рисунков. Список литературы включает 143 источника отечественной и зарубежной литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Исследование проведено у 63 больных Ph-позитивным ХМЛ в разных фазах развития заболевания. 47 больных было исследовано только в одной фазе заболевания, из них 28 больных - в ХФ заболевания, 6 - в фазе предбластного криза (пре-БК), 13 - в фазе властного криза (БК); 9 больных было исследовано в двух фазах заболевания : 6 - в ХФ и фазе БК, 3 - в ХФ и пре-БК; 5 больных было исследовано в трех фазах - в ХФ, в пре-БК и БК. Таким образом, в ХФ заболевания было ис-

следовано 42 больных, з фазе пре-БК - 16, в фазе БК - 26. У 17 из 42 больных, исследованных в ХФ заболевания, уровень экспрессии гена MDRA был исследован в динамике ХФ; в фазе пре-БК - у 3 из 16; в фазе БК - у 6 из 26. Всего было выполнено 186 анализов. Средний возраст больных составил 45 лет (от 18 до 75 лет), из них 35 мужчин и 28 женщин. Больные лечились в гематологическом кабинете N 2, на отделении онкогематологии для взрослых Центра Передовых Медицинских Технологий, на гематологическом отделении кафедры факультетской терапии Сенкг-Петербургского Государственного Университета им. акад. И.П.Павлова в период времени с 1989 по 1996 год. Цитогене-тические исследования проводились у всех больных для верификации диагноза, а также в дальнейшем по мере профессии заболевания для выявления дополнительных поломок хромосом. Контрольная группа составляла 20 здоровых лиц, 6 из них исследованы в динамике в период с 1989 по 1996 год. Средний возраст лиц контрольной группы - 39,6 года (от 18 до 67 лет), из них 10 мужчин и 10 женщин.

В данной работе для определения уровня экспрессии гена MDR-1 был использован метод гибридизации in situ - HIS (L. Kanz, et al., 1988]. ' Метод HIS позволяет оценивать уровень экспрессии исследуемого гена в единичной клетке и дает меньший процент ошибок по сравнению с иммуноцитохимическими методами и rt-PCR [S. Hagawish-Becker, D. Hossfeld, 1996].

Препараты периферической крови (ПК) больных ХМЛ и контрольной группы здоровых лиц были приготовлены следующим образом : фракцию мононуклеаров из ПК выделяли на градиенте фиколл-верографин (р=1,077). Клетки помещали на предметное стекло, покрытое пара-фильмом, в лунку диаметром 5 мм. Каждая лунка содержала 35-38 тыс. клеток. После обработки клеток этиловым спиртом с последова-

тельно возрастающей концентрацией этанола (от 70' до 95') стекла хранили до проведения гибридизации в эксикаторе, содержащем вла-гопоглотитель, при 4'С не более полугода.

Для проведения гибридизации использовали зонд: кДНК гена MDR-1, длиной 1,1 т.п.н. Выделение кДНК гена MDR-1 осуществляли по модифицированному методу Т. Маниатиса и др., 1988. Мечение специфических зондов осуществляли в реакции NlCK-трансляции (реактивы фирмы "Amersham", Великобритания). Меченую кДНК денатурировали термически при ЮО'С в течение 5 мин., быстро охлаждали и сразу использовали для гибридизации с клетками, ранее фиксированными на предметных стеклах.

Перед реакцией гибридизации предметные стекла, содержащие фиксированные клетки, обрабатывали в 0,2 М HCl (при комнатной температуре - KT, 20 мин.), в PBS-буфере (KT, 3 мин.), в гхЗБС-буфере (70'С, 30 мин.). Ацетилирование проводили в 0,02% растворе уксусного альдегида (KT, 5 мин.), в 0,1м растворе триэтаноламина (KT, 10 мин.). Клетки обезвоживали в спиртовых растворах с последовательно возрастающей концентрацией этанола (от 70' до 100'). Предгибридизацию выполняли в растворе 50% формамида, однснфатного растЕора Ден-хардта (0,02 % поливинилпирролидона, 0,02% фиколла, 0,02% бычьего сывороточного альбумина, 1тМ ЭДТА, 500 мкг/мл дрожжевой тРНК; 37'С, 2 часа). Затем этот раствор заменяли гибридизационным, содержащим наряду со всеми перечисленными компонентами кДНК гена MDR-1, меченую 33-Р. Реакцию гибридизации вели при 37'С в течение 16-24 часов. Время инкубации в гибридизационном растворе зависело от удельной активности меченого зонда и подбиралось в каждом конкретном опыте. По завершении гибридизации стекла промывали в растворе, содержащем 50% формамид, ТЕ-буфер и физиологический рас-

твор (56'С, 1 час). Затем проводили 20-кратную отмывку в ТЕ-буфере при постоянном перемешивании, меняя буфер каждые 20-30 мин. После этого препараты обезвоживали в этиловом спирте с последовательно возрастающей концентрацией этанола (70* до 96'). Далее при желто-зеленом освещении стекла покрывали фотоэмульсионной суспензией, нагретой до 42'С. Фотоэмульсионная суспензия содержала 50 мл фотоэмульсии ЗМ (НИИХимФотопроект, Москва) ,5 мл пластификатора (35% раствор глицерина в 96' этиловом спирте), 1,2 мл дубителя (4% раствор углекислого натрия) и 43,8 мл разбавителя (0,1% КВг). Время экспозиции - 24 часа, температура - 4'С. Стекла проявляли, последовательно выдерживая каждое стекло в проявителе (0,3 % амидола, 1% сульфита натрия и 0,1% лимонной кислоты), в дистиллирова-ной воде, в закрепителе (40% раствор гипосульфита натрия) и промывали под проточной водой 15-20 мин. Клетки фиксировали краской Лейшмана (2 мин.), промывали водой, окрашивали краской Романовского (3 мин.) и высушивали на воздухе. В каждом препарате подсчитывали число Ш/?-экспрессирующих клеток из 300-400 клеток. Уровень экспрессии гена MDR-1 определяли как по количеству гранул серебра на единичную клетку, так и по числу М)/?-экспрессирующих клеток (увеличение объектива х90, масляная иммерсия).

Результаты исследований оценивали методом четыпехпольных таблиц Фишера; для оценки взаимосвязи количества бластных и MDR-экспрессирующих клеток использовали компьютерную программу корреляционного анализа Statistics for Windows. Продолжительность жизни больных и длительность каждой фазы заболевания были рассчитаны неинтервальным методом Каплана-Мейера [Е. Kaplan, P. Meier, 1958].

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Изучение уровня экспрессии гена MDR-1 в гемопоэтических

клетках гематологически здоровых лиц. В гемопоэтических клетках контрольной группы здоровых лиц уровень экспрессии гена AiOf?-1 оценивали по числу гранул серебра, обнаруженном в единичной клетке. Количество гранул серебра в одной клетке из общего числа проанализированных на каждом препарате, составляло от 0 до 7. Средняя величина = 3, относительная случайная ошибка = 7,5%. Для оценки фона подсчитывали количество гранул серебра на поверхности, равной трем диаметрам клетки. Площадь, равная размерам трех клеток, была выбрана, поскольку на таком расстоянии друг от друга в среднем расположены фиксированные клетки в препарате. Количество гранул серебра, обнаруженное на данной площади из 300 - 400 проанализированных полей, составляло от 0 до 7. Средняя величина = 3, относительная случайная ошибка = 6%. Средние значения и погрешности обеих величин сопоставимы между собой, а уровень экспрессии гена MDR-1 в гемопоэтических клетках лиц контрольной группы сопоставим с уровнем фона. Следовательно, гемо-поэтические клетки контрольной группы лиц могут быть использованы в качестве отрицательного контроля, т.е. метод позволяет оценивать лишь повышенный уровень экспрессии данного гена.

2. Изучение уровня экспрессии гена MDR-1 в гемопоэтических

клетках больных ХМЛ Уровень экспрессии гена MDR-1 в гемопоэтических клетках больных ХМЛ оценивали согласно следующим критериям :

- низкий уровень (уровень фона) - количество гранул серебра, не превышающее уровень экспрессии гена, определенного на препаратах,

полученных от лиц контр:льной группы (до 7 гранул на единичную клетку),

- повышенная экспрессия (гиперэкспрессия) - количество гранул серебра, превышающее 7 гранул на единичную клетку.

Гиперэкспрессия гена AOR-1 в лейкемических клетках больных XMJ1 была обнаружена у 16 из больных в ХФ заболевания (38,1%), у 10 из 16 больных в фазе предБК (62,5%) и у 12 из 26 больных в фазе БК (46,2%). Анализ полученньх данных свидетельствует, что достоверного отличия между частотой появления повышенного уровня экспрессии гена MDR-1 и фазой забогевания больных ХМЛ обнаружено не было (Р>0,05). Результаты согласуются с данными других авторов, использовавших метод Nothem-ибридизации для определения уровня экспрессии гена MDR-1 в тейкемических клетках больных ХМЛ [А. Goldman, 1990J. Отсутствие повышения частоты появления гиперэкспрессии гена MDR-1 в гемотоэтических клетках больных в фазе БК дает Основание предположит», что предшествующая терапия и количество властных клеток в ПГ исследуемых больных не будут оказывать влияния на уровень экспресии исследуемого гена.

2.1. Влияние предшествующей терапии на уровень экспрессии гена MDR-1 в гемоюэтических клетках больных ХМЛ.

Литературные данные зидетельствуют, что гиперэкспрессию гена MDR-1 в опухолевых клетгах могут индуцировать такие группы цито-статических препаратов, ¡ек антрациклины, алкалоиды барвинка розового, эпиподофиллотоксинз! [I. Moskow, К. Cowan, 1988], и интерферон [Y.Kang,1994], В связи с этлм представлялось важным сравнить частоту появления повышенно? экспрессии гена MDR-1 в гемопоэтических клетках больных ХМЛ в зависимости от схемы лечения. Были составлены следующие группы вольных: в первую группу были включены

больные, для лечения которых применялись препараты, потенциально индуцирующие гиперэкспрессию гена МОЯ-1. Гиперэкспрессия данного гена была выявлена в 7 из 17 исследований (41,1%). Вторая группа состояла из больных, в схему лечения которых не входили данные препараты. В 39 из 102 исследований (38,2%) была обнаружена гиперэкспрессия гена МОЯ-1. Расчеты показали, что частота появления гиперэкспрессии гена МОЯ-1 в гемопоэтических клетках больных ХМЛ не зависит от предшествующего воздействия препаратов, потенциально индуцирующих гиперэкспрессию гена МОЯ-1 (Р>0,05).

В дальнейшем представлялось важным выявить взаимосвязь между частотой появления гиперэкспрессии гена МОЯ-1 и другими лабораторными показателями, с которыми может быть связано обнаружение гиперэкспрессии данного гена в гемопоэтических клетках больных ХМЛ, включенных в настоящее исследование.

2.2. Сопоставление количества властных н МОЯ-позитивных

клеток в ПК больных ХМЛ.

Количество ШЯ-экспрессирующих клеток у больных в ХФ заболевания колебалось от 0 до 90%, в фазе пред-БК - от 0,5% до 10%, в фазе БК - от 0,1% до 10%. Анализ полученных результатов свидетельствует, что достоверная корреляционная связь между двумя переменными - количеством бластных и МО/?-экспрессирующих клеток отсутствует (г=0,02). Эти результаты подтверждают данные об отсутствии взаимосвязи между частотой появления гиперэкспрессии данного гена и фазой заболевания, полученные ранее.

2.3. Взаимосвязь дополнительных хромосомных аберраций с

появлением гиперэкспрессии гена МОЯ' 1.

Дополнительные хромосомные аберрации были выявлены у 9 больных ХМЛ БК (47%) и у одного больного в фазе пред-БК (5,5%). Со-

поставление цитогенетических и молекулярно-биологических данных показало, что в лейкемических клетках 3 из 9 больных ХМЛ БК были обнаружены и дополнительная Ph-хромосома и гиперэкспрессия гена MDR-1. Полученные данные согласуются с данными других авторов, которые также обнаружили, что гиперэкспрессия гена MDR-1 в лейкемических клетках больных Ph-позитивным ОЛЛ встречается достоверно чаще, чем у больных Ph-негативным ОЛЛ [S. Savignano et at., 1993]. Можно предположить, что образование химерного транскрипта bcr-abl прямо или косвенно усиливает экспрессию гена MDRA в лейкемических клетках больных ХМЛ БК и ОЛЛ. В двух других группах больных, в клетках которых были обнаружены трисомия 8 (4 человека) и инверсия хромосомы 17 (5 человек) корреляции с гиперэкспрессией гена MDR-1 обнаружено не было.

2.4. Гиперэкспрессия гена MDR-1 в гемопоэтичесхих клетках больных ХМЛ БК и вариант бластного криза.

Согласно клиническим данным, у 21 больного развился бластный криз по миелоидному типу , у 5 - по лимфоидному. Результаты позволяют утверждать, что среди больных с лимфоидным вариантов БК ги-перэкпрессия гена MDR-1 встречается достоверно реже (Р<0,01). Эти данные согласуются с результатами других авторов, которые обнаружили гиперэкспрессию гена MDR-1 в клетках миелоидного ряда (CD13) у больных ХМЛ БК [R. Weide et а!., 1990; Л.Г. Туркина и др., 1996].

3. Взаимосвязь продолжительности жизни больных ХМЛ и уровня экспрессии гена MDR-1.

Известно, что уровень экспрессии гена MDR-1 в опухолевых клетках может коррелировать с продолжительностью жизни больных злокачественными заболеваниями [К. Nooter, S. Sonneveld, 1994; S. Hagawish-Becker, D. Hossfeld, 1996]. В связи с этим представлялось

целесообразным рассчитать продолжительность жизни и длительность каждой фазы в отдельности у больных, включенных в настоящее ис- ^ следование. Для решения этой задачи был использован метод расчета продолжительности жизни или фазы заболевания [Е. Kaplan, P. Meier, 1958]. Исследуемые больные были разделены на следующие группы :

- фуппу 1-а составили больные, в клетках которых наблюдалась гиперэкспрессия гена на разных стадиях заболевания -16 из 42 в ХФ, 10 из 16 - в фазе акселерации, 12 из 26 - в БК.

- группу 1-6 составили пациенты, в клетках которых уровень экспрессии гена на разных стадиях заболевания обнаружен не был - 26 из 42 в ХФ, 6 из 16 - в фазе пред-БК и 14 из 26 - в фазе БК.

В качестве начальной точки отсчета был выбран момент постановки диагноза, а в качестве события - дата смерти больного. Расчеты показали (рис.1), что продолжительность жизни больных, в клетках которых была обнаружена гиперэкспрессия гена MDR-1, достоверно короче по сравнению с продолжительностью жизни больных, в клетках которых гиперэкспрессии данного гена выявлено не было.

4. Взаимосвязь гиперэкспрессии гена MDR-Л, появляющейся в стадиях БК и пред-БК, с продолжительностью этих фаз.

Длительность фаз пред-БК и БК была рассчитана для двух групп больных, исследованных в этих фазах заболевания:

- группа 2-а была составлена из больных, в клетках которых наблюдалась гиперэкспрессия гена,

- группа 2-6 - больные, в клетках которых уровень экспрессии гена обнаружен не был.

В качестве начальной точки отсчета был выбран момент наступления фазы пред-БК или БК, а в качестве события - дата смерти больного. Расчеты показали, что достоверной разницы между длительностью

фаз пред-БК и БК в группах больных 2-а и 2-6 не было (Р > 0,05). Следовательно, продолжительность фаз пред-БК и БК не коррелирует с появлением гиперэкспрессии гена ШЯ-1 в лейкемических клетках исследованных больных ХМЛ БК и пред-БК.

5. Взаимосвязь продолжительности жизни и длительности ХФ больных ХМЛ с гиперэкспрессией гена МОЯ-1, появляющейся в

ХФ заболевания.

Продолжительность жизни была рассчитана для двух групп больных, исследованных в ХФ заболевания:

- группу 3-а составили больные, в клетках которых была обнаружена гиперэкспрессия гена;

- группу З-б составили пациенты, в клетках которых уровень экспрессии гена обнаружен не был.

Расчеты показали (рис. 2), что продолжительность жизни больных, в клетках которых был обнаружен высокий уровень экспрессии гена МОЯ-1, была достоверно короче, чем продолжительность жизни больных, в клетках которых уровень экспрессии данного гена сохранялся на уровне фона (Р<0,01). Следовательно, корреляция продолжительности жизни больных ХМЛ с уровнем экспрессии гена МОЯ-1, обнаруженная нами ранее, сохранилась. Для этих же групп больных были рассчитаны длительности ХФ заболевания. Расчеты показали (рис.3), что длительность ХФ у больных, в клетках которых была обнаружена гиперэкспрессия гена МОЯ-1, была достоверно короче по сравнению с длительностью ХФ у больных, в клетках которых уровень экспрессии данного гена сохранялся на уровне фона (Р<0,05). Эти данные подтверждают результаты, полученные ранее. Следовательно, появление гиперэкспрессии гена МОЯ-1 в гемопоэтических клетках больных ХФ яв-

ляется неблагоприятным фактором для больного, а группы больных 1-а и 3-а можно отнести к группам "повышенного риска".

6. Взаимосвязь гиперэкспрессии гена МО/?-1 и продолжительности жизни больных ХМЛ от момента исследования.

У 17 из 42 больных ХМЛ в хронической фазе заболевания была исследована динамика изменения уровня экспрессии гена МО/?-1. У 6 из 17 больных гиперэкспрессия гена выявлялась в разное время после постановки диагноза ^ от 1 до 54 месяцев. В связи с этим, логично предположить, что гиперэкспрессия гена МО/?-1 была обнаружена у тех больных, которые исследованы в период времени, близкий к БК, а у больных, в клетках которых уровень экспрессии гена сохранялся на уровне фона, день исследования был близок к дню постановки диагноза. Для проверки этого предположения, представлялось целесообразным сравнить продолжительность хронической фазы от момента постановки диагноза до дня исследования в группах больных 3-а и З-б. В качестве начальной точки отсчета принимался день постановки диагноза, а в качестве конечной - день исследования. Результаты расчетов свидетельствуют, что достоверной разницы между продолжительностью хронической фазы со дня постановки диагноза до дня исследования в двух группах больных не было (Р > 0,05). Следовательно, период времени со дня постановки диагноза до момента исследования не оказывал существенного влияния на расчеты продолжительности жизни и ХФ больных ХМЛ. В связи с этим, представлялось целесообразным рассчитать продолжительность жизни для групп больных 3-а и З-б, но в качестве начальной точки отсчета выбрать момент исследования, а в качестве события - смерть больного. Результаты расчетов свидетельствуют (рис.4), что продолжительность жизни от мо-

мента исследования больных группы 3-а была достоверно короче, чем для пациентов группы З-б (Р<0,01).

Для этих же групп больных были рассчитаны длительности ХФ заболевания от момента исследования. Анализ полученных результатов показал (рис.5), что длительность ХФ от момента исследования больных, в клетках которых была обнаружена гиперэкспрессии гена МО/?-1 была достоверно короче длительности ХФ пациентов, в клетках которых гиперэкспрессии гена выявлено не было (Р<0,001). Следовательно, появление гиперэкспрессии гена в хронической фазе заболевания является неблагоприятным прогностическим признаком для больного; причем, прогностическая значимость повышения уровня экспрессии гена сохраняется на всем протяжении хронической фазы заболевания. Полученные результаты представлены в Таблице 1.

Таблица 1

Взаимосвязь клинико-лабораторных показателей с гиперэкспрессией гена МОЯ-1

Параметры Взаимосвязь с гиперэкспрессией гена МОЯ-1

Фаза заболевания не обнаружена

Предшествующая терапия препаратами, потенциально индуцирующими гиперэкспрессию гена MORA не обнаружена

Количество бластных клеток не обнаружена

Дополнительные хромосомные аномалии не обнаружена

Миелоидный вариант БК обнаружена позитивная корреляция

Продолжительность жизни обнаружена негативная корреляция

Продолжительность жизни от момента исследования обнаружена негативная корреляция

Длительность ХФ обнаружена негативная корреляция

Длительность ХФ от момента исследования обнаружена негативная корреляция

Длительность пре-БК и БК не обнаружена

Рис.1. Кривые продолжительности жизни больных ХМЛ

Рис.2. Кривые продолжительности жизни больных ХМЛ (уровень экспрессии гена определялся в ХФ заболевания)

Рис.3. Кривые длительности ХФ заболевания

Рис.4. Кривые продолжительности жизни от дня исследования

Рис.5. Кривые длительности ХФ заболевания от дня исследования

7. Сравнение результатов прогноза .по вока! с распределением больных по группам риска, выполненном на основании анализа уровня экспрессии гена МОЯ-1.

Одним из общепризнанных прогностических критериев для больных ХМЛ является критерий Бока! X Данный критерий позволяет с большой степенью вероятности распределять больных по группам риска и предсказывать длительность ХФ при постановке диагноза [ХБока!, Е. Сох, 1984].

Сравнение результатов распределения больных по группам риска согласно критерию Бока!¿. и уровню экспрессии гена МОЯ-1 показало, что состав групп различен. Ретроспективный анализ показал, что для 3 из 16 больных с благоприятным прогнозом по Бока! «I. прогноз оказался ошибочным (18,7%), точнее был прогноз по уровню экспрессии гена МОЯ-1. Расчет среднего значения критерия Бока! для групп больных,

распределенных согласно уровню экспрессии гена MDR-1, показал, что вся группа благоприятного прогноза по уровню экспрессии гена MDR-1 относится к группе благоприятного прогноза по критерию Sokal. При оценке уровня экспрессии-гена.WDR-1 в группе промежуточного прогноза по критерию J.Sokal оказалось, что она гетерогенна. Ретроспективный анализ показал, что в данной группе прогноза по J.Sokal у 3 из 7 больных прогноз при постановке диагноза оказался ошибочным, в то время как при распределении группы повышенного риска согласно уровню экспрессии гена MDR-1, ошибочных прогнозов для этой группы пациентов практически не было. Для больных этой группы правильным был прогноз по уровню экспрессии гена MDR-1. Таким образом, можно сделать вывод, что два данных прогностических критерия не зависят друг от друга, а прогноз по уровню экспрессии гена MDR-1 уточняет прогноз по Sokal J. для промежуточной группы больных ХМЛ.

ВЫВОДЫ

1. Метод гибридизации in situ позволяет оценивать уровень экспрессии гена MDR-1 в лейкемических клетках больных ХМЛ.

2. Уровень экспрессии гена MDR-1 в гемопоэтических клетках больных ХМЛ может повышаться в любой фазе заболевания.

3. Уровень экспрессии гена MORA в гемопоэтических клетках больных ХМЛ не зависит характера предшествующей цитостатической терапии препаратами, потенциально индуцирующими гиперэкспрессию гена MDRA.

4. Повышение уровня экспрессии гена MDR-1 в гемопоэтических клетках исследованных больных ХМЛ в ХФ заболевания является неблагоприятным прогностическим признаком в отношении продолжительности жизни.

5. Уровень экспрессии гена MDR-1 в гемопоэтических клетках больных XMJ1 пред-БК и БК криза не коррелирует с длительностью этой фазы.

6. Повышение уровня экспрессии гена MDR-1 в гемопоэтических клетках больных ХМЛ в хронической фазе заболевания является неблагоприятным прогностическим признаком в отношении длительности ХФ.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Результаты, полученные в настоящем исследовании однозначно свидетельствуют о возможности применения метода гибридизации in situ для определения уровня экспрессии гена MDR-1 в гемопоэтических клетках больных ХМЛ. Использование данного теста в клинической практике способствует уточнению прогноза заболевания и распределению больных ХМЛ по группам риска. В этой связи метод гибридизации in situ может .быть рекомендован для широкого клинического внедрения, особенно при отборе пациентов для ТКМ.

СТАТЬИ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Титов К.В., Стюф И.Ю., Князев П.Г. Молекулярные аспекты множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток \\ Вопросы онкологии.- 1994 .-V. 16.- N 4-6, С.241-251.

2. Стюф И.Ю., Быкова Т.В., Фролова О.И., Соминская A.A., Зариц-кий А.Ю. MDR-1 gene expression in chronic myelogenous leukemia : prognostic marker of the disease \\ In: NATO ASI Series "Gene Teghnol-ogy". Series H: Cell Biology.- 1996.- v.94.- p.175-179.

3. Зарицкий А.Ю., Стюф И.Ю., Фролова О.И., Быкова Т.В., Титов К.В., Афанасьев Б.В. MDR-1 gene expression in Chronic Myelogenous Leukemia (CML) \\ Acta Haematologica.-1995.- v. 93,- p.183, 5/12.

4. Стюф И.Ю., Быкова Т.В., Титов К.В., Лыщев А.А. Применение метода гибридизации in situ для определения статуса опухолевой популяции у больных с заболеваниями системы крови \\ Сборник тезисов докладов VI научной конференции молодых ученых и специалистов. Ужгород.-1991 .-С. 111.

5. Стюф И.Ю., Быкова Т.В., Титов К.В., Аникина Н.А. Сопоставление экспрессии генов с-тус и MDR-1 у больных острым лейкозом и хроническим миелолейкозом \\ Системные аспекты патологии. Сборник научных трудов I СПбМИ им. акад. И.П. Павлова под ред. В.В. Томсона. Санкт-Петербург.-1992,- С. 61.

6. Быкова Т.В., Стюф И.Ю., Фролова О.И., Титов К.В. Клиническое значение определения гена bcr-abl методом гибридизации in situ при хроническом миелолейкозе \\ Системные аспекты патологии. Сборник научных трудов I СПбМИ им. Акад. И.П. Павлова под ред. В.В. Томсона. Санкт-Петербург.-1992 - С. 44-45.

7. Стюф И.Ю. Expression of MDR-1, р53 and myc genes in chronic myelogenous leukemia (CML) in relation of prognosis of this disorder \\ In : The first International Conference on trace elements, free radicals, tumor markers, chromosomal analysis and cytokines in clinical medicine and biochemistry (TFTCC), Kuwait.-1995.-# K-59.