Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Гидрофильные гексапептиды - новый класс регуляторов АТФ-зависимых транспортных белков множественной лекарственной устойчивости

17

На правах рукописи

Новиков Сергей Александрович

Гидрофильные гексапептнды - новый класс регуляторов АТФ-зависимых транспортных белков множественной лекарственной устойчивости

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва-2008

003453317

Работа выполнена в ФГУ Центральном научно-исследовательском институте эпидемиологии Роспотребнадзора.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Лебедев Василий Вячеславович Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Жердев Владимир Павлович доктор медицинских наук, профессор Козлов Иван Генрихович

Ведущая организация: ГОУ ВПО Московская медицинская академия имени И. М. Сеченова Росздрава.

Защита состоится «.......»...................2008 года в........часов на заседании

диссертационного Совета Д 001.024.01 при ГУ НИИ фармакологии имени В.В. ЗакусоваРАМН по адресу 125315 Москва, Балтийская ул. 8

С диссертацией можно ознакомиться в ученой части ГУ НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН по адресу 125315 Москва, Балтийская ул. 8

Автореферат разослан «........»....................2008 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Вальдман Е.А.

Общая характеристика работы. Актуальность проблемы.

Множественная лекарственная устойчивость опухолевых клеток (МЛУ) является серьезным препятствием на пути химиотерапии злокачественных новообразований. МЛУ - это система защиты популяции клеток от множества лекарств, различающихся по химической структуре и механизму действия на клетку (Glavinas Н. et al., 2004; Ставровская А., 2000).

Транспортные белки, ответственные за МЛУ, принадлежат к суперсемейству ABC ( ATP-Binding Cassette ) транспортеров (Polgar О. et al., 2005). В клетках млекопитающих за МЛУ ответственны, в основном, два типа транспортных белков: multidrug resistance associated protein (MRP) и P-glycoprotein (P-gp). В результате работы транспортных белков клетки приобретают устойчивость к действию широкого спектра химиотерапевтических средств.

Важно отметить, что ABC транспортеры отвечают не только за выведение токсичных и вредных веществ из клетки, но и принимают участие в транспорте медиаторов, цитокинов воспалительной и иммунной системы.

МЛУ возникает в результате активации клеткой её естественных защитных механизмов. Такие механизмы посредством АТФ-зависимых транспортных белков обеспечивают интенсивное откачивание из клетки любых токсических соединений, включая химиотерапевтические препараты (Simon S.M. et al., 1994). Этот процесс существенно снижает эффективность средств, используемых для терапии бактериальных, паразитарных и грибковых инфекций, а также злокачественных новообразований.

До настоящего времени поиск лекарственных средств для преодоления МЛУ основывался на использовании принципа конкурентного ингибирования транспортных систем путем введения избыточной концентрации субстрата. Однако применение конкурентных ингибиторов для преодоления МЛУ осложняется их высокой токсичностью. Конкурентные ингибиторы одновременно подавляют активность тех транспортных белков, которые выполняют ряд жизненно важных физиологических функций. Ингибирование жизненно важных функций транспортеров приводит к токсическому поражению клеток и резкому нарастанию явлений токсикоза. В этой связи принципиальное решение проблемы создания средств преодоления МЛУ видится в использовании таких соединений, которые обладают низкой токсичностью и

способностью оказывать регуляторное действие на активность транспортных систем.

Среди множества лекарственных препаратов и биологически активных соединений, обладающих свойством регулирования МЯУ не обнаружено средств с достаточной специфической активностью и безвредностью. В этой связи становится, очевидно, высокая актуальность проблемы поиска средств преодоления МЛУ.

Создание эффективных средств преодоления МЛУ требует применения принципиально иных подходов к решению проблемы. Таким подходом может быть применение синтетических регуляторных пептидов, обладающих выраженным действием на показатели активности транспортных систем в зависимости от их функционального состояния. Цель работы.

Изучить регуляторное влияние и механизм действия гидрофильных гексапептидов структурной формулы: аргинил-алъфа-аспартил-лизил-валт-тирозш-аргинш (имунофан), лизил-гистидил-глицил-лизил-гистидил-глицин (биопоэтин), щшпо-лизш-гистидил-глицш-лизш-гистидил-глицин (циклобур-син) на АТФ-зависимые транспортные белки множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток. Задачи исследования:

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние трех гексапептидов структурной формулы: аргинил-альфа-аспартил-лизил-валш-тирозил-аргинин (имунофан),лизш-гистидил-глицил-лизш-гистидш-глицин (биопоэтин), цюто-лизил-гистидш-глщш-лизил-гистидш-глицин {циклобурсин) на транспорт субстрата из опухолевых клеток.

2. Определить специфичность действия гексапептидов в отношении транспортных белков МЛУ.

3. Изучить влияние гексапептидов на функциональную активность различных типов транспортных белков множественной лекарственной устойчивости.

4. Определить влияние гексапептидов на чувствительность опухолевых клеток к действию цитостатических препаратов.

5. Определить влияние гексапептидов на экспрессию генов и белков МЛУ.

6. Исследовать влияние гексапептидов на экспрессию маркера силы иммунного ответа (HLA-DR), маркеров Т-лимфоцитов (CD2, CD4, CD8) и В-лимфоцитов (CD22).

7. Исследовать влияние гексапептидов на продукцию антителообразущих клеток.

Научная новизна работы:

Впервые обнаружено ранее неизвестное свойство гидрофильных гексапептидов оказывать регуляторное действие на транспортную систему МЛУ и определена избирательность их действия на отдельные классы АТФ-зависимых транспортных белков. Впервые обнаружено свойство гидрофильных гексапептидов оказывать влияние на чувствительность опухолевых клеток к действию цитостатического препарата - доксорубицина и проведена оценка возможности их применения в качестве средств преодоления МЛУ. Практическая значимость:

Практическое значение работы включает научное обоснование возможного применения гидрофильных регуляторных пептидов в качестве средств преодоления МЛУ. Разработка комплекса экспериментальных моделей изучения регуляторов МЛУ открывает возможность проведения доклинической оценки специфической активности регуляторных пептидов. В дальнейшем это позволит создать новые оригинальные препараты для преодоления МЛУ. Положения, выносимые на защиту:

1. Гидрофильные гексапептиды обладают способностью модулировать активность АТФ-зависимых транспортных белков МЛУ.

2. Гидрофильные гексапептиды обладают высокой регуляторной активностью в отношении транспортных белков МЛУ и не менее чем в 1000 раз превышают действие гидрофобных пептидов - известных ингибиторов транспортных насосов.

3. Регуляторное действие гексапептида имунофана проявляется в зависимости от функционального состояния транспортных белков МЛУ. В период транспорта субстрата гексапептид ингибирует белки АТФ-зависимой транспортной системы, а в латентный период стимулирует их активность.

4. Модулирование транспорта субстрата белками, ответственными за МЛУ под действием гексапептидов, регулируется путем изменения экспрессии транспортных белков или их активности.

5. Гидрофильные гексапептиды обладают плеотропным типом действия -восстанавливают нарушенные функции транспортной системы клетки и обладают иммунорегуляторной активностью.

6. Гидрофильные гексапептиды линейной и циклической структуры вызывают повышение чувствительности опухолевых клеток к действию цитостатического препарата в сверх низких дозах.

Публикации и апробация работы:

Материалы диссертации доложены и обсуждены на апробационной комиссии ФГУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора, на X Всероссийском форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2006), на «Объединенном иммунологическом форуме» (Санкт-Петербург, 2008). По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, из них 1 статья.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из оглавления, введения, обзора литературы, шести глав собственных данных, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа изложена на 100 листах машинописного текста, иллюстративный материал представлен 14 рисунками и 11 таблицами. Список литературы включает 122 источника (8 работ отечественных и 114 зарубежных авторов).

Содержание работы Материалы и методы исследования

Линии опухолевых клеток, использованные в работе. В работе использованы культивируемые in vitro эпителиальные клетки млекопитающих: KB 3-1 - карцинома полости рта человека, MCF-7 -аденокарцинома молочной железы человека, PC 3 - рак предстательной железы человека, также соответствующие им устойчивые к цитостатикам варианты: KB 8-5, MCF-7/Adr-BapnaHT устойчивый к адриабластину, К562 - хронического миелоидного лейкоза, клетки рака гортани человека Нер-2.

Фармакологические препараты, использованные в работе. Доксорубицин (Dox; Sigma, США), имунофан (Бионокс, Россия), адриабластин (adr;. Гедеон Рихтер, Венгрия), циклоспорин A("Sigma", США), дигитонин ("Sigma", США).

Исследование влияния гексапептидов на продукцию антителообразущих клеток

в селезенке мышей.

Использовали мышей-самцов линии CBA/CaLacSto, которых иммунизировали внутривенно эритроцитами барана. Через 10-15 минут после иммунизации мышам внутрибрюшинно вводили гексапептид в объеме 0,5 мл в концентрациях 0,02; 0,1; 0,5 и 2,5 мкг/мл (7-8 животных в группе). На четвертые сутки после иммунизации определяли число антителообразующих клеток в селезенке мыши путем подсчета зон локального гемолиза эритроцитов барана в агарозном геле.

Исследование влияния гексапептидов на экспрессию маркера силы иммунного ответа (HLA-DR). маркеров Т-лимфоцитов (CD2, CD4, CD8) и В-лимфоцитов

(CD22).

В работе использовали клетки периферической крови человека. Уровень экспрессии мембраноассоциированных структур CD2, CD4, CD8, CD22, HLA-DR на мононуклеарных клетках определяли клеточным твердофазным иммунопероксидазным методом, с использованием моноклональных антител к структурам CD2, CD4, CD8, CD22, HLA-DR («Seromed», Великобритания) и антимышиных Р(аЬ')-фрагментов иммуноглобулинов, конъюгированных с пероксидазой хрена («Seromed», Великобритания).

Результаты выражали в процентах изменения значений оптической плотности в опыте, по отношению к значению оптической плотности в контроле (клетки, не обработанные веществом). Каждую опытную группу клеток исследовали в триплете.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с определением достоверности по критерию Стьюдента-Фишера. Определяли достоверность различий выборочных средних опыта и контроля. По вычисленному значению t и количеству сравниваемых вариант определяли достоверность различий, используя таблицу Стьюдента-Фишера. Разницу считали достоверной при уровне значимости не более 5% (р<0,05).

Изучение влияния активности гексапептидов на белки транспортеры P-gp,

MRP. LRP. BCRP.

Активность в клетках транспортных белков, ответственных за МЛУ, определяли несколькими методами:

1. По скорости выхода из клеток R 123 ("ICN", США) (Wielinga P.R. et al., 1998).

2. По интенсивности флуоресценции клеток, предварительно нагружен-ных кальцеином или R 123(Hollo Z. et al., 1994; Homolya L. et al., 1993), на проточном цитофлуориметре «Becton Dickinson» (США).

Определение чувствительности опухолевых клеток к фармакологическим препаратам (MTT-метод).

Изменения чувствительности опухолевых клеток к цитотоксическим препаратам при действии пептидов, использованных в работе, определяли с помощью МТТ-теста и прямого подсчета клеток. Колориметрический метод оценки цитотоксической активности различных веществ с помощью МТТ (3-(4,5-диметил тиазолил-2)-2,5-дифенилтетразолиум бромид) («Sigma», США) основан на способности митохондриальных дегидрогеназ живых клеток превращать «желтый» МТТ в «синий» формазан (Carmichael et al., 1987). Жизнеспособность клеток оценивали по соотношению оптической плотности в контрольных лунках и лунках с клетками, обработанными препаратами. На каждую исследуемую точку по три определения.

Цитофлуориметрическое исследование экспрессии антигенов транспортных белков MRP. P-gp, LRP. BCRP.

Для того чтобы определить уровень экспрессии белков P-gp, MRP1, BCRP и LRP, клетки инкубировали с мышиными МкАТ UIC2 (для P-gp), МкАТ к MRP1, МкАТ к BCRP, МкАТ к LRP (Chemicon, США). Количество клеток, связавших AT, и интенсивность свечения клеток определяли при помощи проточного цитофлуориметра (Becton Dickison), используя программное обеспечение к нему.

Исследование влияния пептидов на экспрессию генов MRP. MDR. LRP. BCRP.

Выделение тотальной РНК осуществляли при помощи TRIzol (Sigma, США) в соответствии с протоколом производителя.

Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием случайных гексануклеотидных праймеров. Для выравнивания количества кДНК в разных образцах амплифицировали ген домашнего хозяйства GAPDH.

Обратную транскрипцию и полимеразную цепную реакцию проводили на амплификаторе Терцик (ДНК-технология, Россия). Число циклов подбирали таким образом, чтобы оказаться в экспоненциальной фазе образования продуктов реакции. Фотографировали гель при помощи аналоговой видеокамеры.

Результаты и обсуждение.

Исследование влияния гексапептидов на экспрессию маркера силы иммунного ответа f HLA-DR), маркеров Т-лимфоцитов (CD2. CD4. CD8) и В-лимфоцитов

(CD22).

Важным для оценки эффекта воздействия иммуномодулирующих препаратов является вызываемое ими изменение экспрессии мембраноассоциированных иммунорегуляторных структур лимфоцитов человека, в первую очередь - CD2, CD4, CD8, HLA-DR.

Полученные данные демонстрируют (табл. 1), что биопоэтин и циклобурсин вызывают достоверное превышение экспрессии HLA-DR и CD2 на поверхности гемопоэтических клеток человека. Таким образом, биопоэтин и циклобурсин обладают свойством увеличивать экспрессию генов иммунного ответа (HLA-DR) и созревание Т-лимфоцитов (CD2).

Полученные данные (табл. 1) свидетельствуют о том, что имунофан действует на С02-положительные Т-клетки, имеющих фенотип CD8+ (Т-супрессоры) и модулируют экспрессию одного из антигенов главного комплекса гистосовместимости класса I I - HLA-DR. При этом максимальное проявление эффекта препарата наблюдалось при его использовании в низкой дозе. Исследование влияния гексапептидов на продукцию антителообразущих клеток

в селезенке мышей.

Анализ представленных результатов демонстрирует, что все три гидрофильных гексапептида имунофан, биопоэтин и циклобурсин обладают выраженной иммунологической активностью (табл. 2). Среди изученных гексапептидов имунофан разрешен для клинического применения и широко используется при коррекции иммунной реакции у онкологических больных. Биопоэтин и циклобурсин не уступают имунофану по иммунологической активности. Подобно имунофану они влияют на экспрессию генов иммунного ответа, маркеры созревания Т-лимфоцитов, количество антителообразующих клеток. Таким образом, все изученные гидрофильные гексапептиды обладают однотипным действием на иммунокомпетентные клетки. Указанное свойство может быть непосредственно связано с влиянием гидрофильных гексапептидов на АТФ-зависимые транспортные белки. Как известно посредством АТФ-зависимых транспортных белков эндогенные медиаторы поступают во внеклеточное пространство и осуществляют цитокиновую регуляцию иммунной реакции организма. Гидрофильные гексапептиды модулируют работу АТФ-зависимых транспортных белков.

Таблица 1. Сравнительная оценка экспрессии поверхностных структур на клетках здоровых доноров под влиянием имунофана (И), биопоэтина (Б) и циклобурсина (Ц).

Доза мкг/мл НЬА-4Ж СБ-2 Т-лимфощпы СО-4 Т-лимфоциты СО-8 Т-лимфоциты СО-22 В-лимфоцит

И Б ц И Б Ц И Б Ц И Б Ц И Б ц

Контроль 100,0± 0,25 100,0± 4,5 100,0± 0,25 100,0± 0,33 100,0± 3,7 100,0± 0,33 100,0± 0,07 100,0± 2,3 100,0± 0,07 100,0± 0,20 100,0± 3,6 н/д н/д 100,0± 6,4 100,0± 0,20

0,02 104,1± 4,2 102,7± 9,8 111,1± 0,01* 160,9± 8,2* 108,9± 14,5 107,9± 0,28* 111,8± 8,1 95,1± 1,5* 101,8± 0,10 170,1± 10,8* 89,1± 11,8 н/д н/д 97,5± 14,6 101,1± 0,84

0,1 114,1± 0,7» 103,3± 7,0 117,1± 1,60* 121,2± 2,1* 108,9± 6,5* 102,2± 0,17 123,4± 2,5* 89,2± 7,3* 93,4± 0,01* 142,1± 6,1* 78,7± 2,6* н/д н/д 97,9± 8,3 121,1± 14,07

0,5 116,4± 1,5* 107,7± 11,1 121,4± 0,77* 125,2± 4,1* 104,8± 6,9 105Д± 0,14* 140,1± 5,8* 90,0± 8,7* 102,1± 17,78 163,0± 8,3* 89,8± 3,9* н/д н/д 98,0± 8,6 110,0± 0,39

2,5 н/д 110,3± 8,7* 114,5± 0,21* Н/Д 116,1± 12,0* 117,6± 0,15* Н/Д 95,1± 8,4 89,4± 0,17* н/д 96,7± 4,1 н/д н/д 100,7± 9,3 113,0± 0,59

Примечания: результаты определения представлены в процентах по отношению к контролю. Контролем служили клетки, не обработанные гексапептидами. Разницу считали достоверной при уровне значимости не более 5% (р<0,05). * - достоверные различия между действием препарата и данными контроля.

В результате изменения уровня транспорта цитокинов из иммуннокомпетентных клеток во внеклеточное пространство происходит изменение всего цитокинового статуса. Действие медиаторов в свою очередь вызывает изменение фенотипической экспрессии генов силы иммунного ответа, маркеров Т-лимфоцитов, количество антителообразующих клеток. Данное наблюдение по изменению иммунологической активности опосредованной продукцией медиаторов побудило нас исследовать влияние гидрофильных гексапептидов на АТФ-зависимые транспортные белки множественной лекарственной устойчивости.

Таблица 2. Влияние биопоэтина, циклобурсина и имунофана на количество антителообразующих клеток в селезенке мыши.

Доза препарата, мкг/мл Число антителообразующих клеток после введения

Биопоэтин Циклобурсин Имунофан

Контроль 100 79 +125 100 83 + 120 100 82+118

0,02 371 * 229 + 603 197 * 153+254 112 75 + 149

0,1 192 * 113 + 327 194 * 128 + 294 181 * 160 + 202

0,5 171 * 110 + 265 166 * 107 + 257 198* 171+225

2,5 228 * 106 + 497 131 87 +199 206 * 138 + 286

Примечание. Представлены отношения числа антителообразующих клеток каждой мыши к среднему арифметическому числа антителообразующих клеток контрольной группы, выраженные в процентах.

* - р<0,05 по сравнению с контролем.

Влияния гидрофильных гексапептидов и конкурентного гидрофобного ингибитора циклоспорина А на транспорт субстрата из опухолевых клеток.

В данной работе объектом исследования являлись синтетические регуляторные гидрофильные гексапептиды. В этой связи возникла необходимость провести сравнительное исследование фармакологической активности гидрофильных гексапептидов с классическим конкурентным ингибитором - гидрофобным циклическим пептидом циклоспорином А.

Определяли влияние имунофана, биопоэтина, циклобурсина и конкурентного ингибитора МЛУ— циклоспорина А на выход Я 123 из клетки Нер-2. Влияние каждой концентрации агентов на выход И. 123 определяли в

нескольких опытах. На рис. 1 приведены средние значения R с квадратичными отклонениями, для концентраций, где было больше 3 повторностей.

Как видно из рисунка 1 все три гексапептида ингибируют выход R 123, причём оптимум концентраций, при которых эффект максимален одинаков: 1нг\мл. Однако величина R несколько различается: R равно 3.2, 3.0 и 2.8 для биопоэтина, циклобурсина и имунофана соответственно. Значение R для циклоспорина А равно 3.2 и достигается оно при концентрации в три тысячи раз большей, чем для гексапептидов. Все концентрационные зависимости имеют максимум, наличие которого, по-видимому, объясняется тем, что использованные агенты не только подавляют откачивание R 123, но и увеличивают пассивную проницаемость мембраны. С увеличением концентрации данный эффект начинает преобладать и значение R уменьшается.

Таким образом, в моделях по определению транспорта родамина показана исключительно высокая активность гексапептидов по сравнению с конкурентными ингибиторами. Гексапептиды по активности превышают конкурентный ингибитор (циклоспорин А) не менее чем в 1000 раз. При этом гексапептиды сохраняют свои регуляторные свойства и восстанавливают нарушенные функции транспортной системы клетки.

Влияние гидрофильных гексапептидов на функциональную активность транспортных белков множественной лекарственной устойчивости.

Основной задачей данной части работы было определить изменение функциональной активности белков МЛУ в клетках К562, MCF7, MCF7/Adr, IS9, KB 8-5, KB 3-1 и РСЗ линий при действии на них гидрофильных гексапептидов линейной и циклической структуры.

Изучение функциональной активности транспортных белков в различных линиях клеток позволяет раскрыть специфичность действия гексапептидов. Экспериментальные модели, используемые в работе, позволяли определять активность транспортных белков только двух типов: MRP и P-gp. Поэтому в данном контексте под специфичностью следует понимать избирательность действия на белки MRP или P-gp. Для определения специфичности действия использовали клеточные линии с экспрессией отдельных типов белков МЛУ. Например, в культуре клеток РСЗ МЛУ представлена преимущественно белками MRP, а в клетках MCF7/Adr белком P-gp.

Изучение активности транспортных белков проводили в тесте определения субстратов MRP и P-gp - Кальцеина и R 123. R 123 -

флуоресцентный краситель, который является субстратом обоих транспортных белков, а кальцеин является специфическим субстратом MRP.

Рис.1. Концентрационная зависимость ингибирования скорости выхода R 123 (R) из клеток Нер-2 при добавлении циклобурсина, биопоэтина, имунофана и циклоспорина A. R=V1/V2, где VI и V2 - скорости выхода R 123 в контроле и в присутствии ингибиторов соответственно.

3,5

3 -2,5 2 -1,5 1

0,5 -

—♦— Биопоэтин —■- -Имунофан —к— Циклоспорин А - Циклобурсин

о

0,001

0,01

0,1

1000

10000 100000

1 10 100 Концентрация, нг/мл

Определение флуоресцентного красителя кальцеина или R 123 осуществляли методом проточной цитофлуориметрии. При интенсивности флуоресценции ниже контрольных значений белки МЛУ активно транспортируют флуоресцентный краситель из клетки. В случае, если интенсивность флуоресценции выше контрольных значений, то активность транспортных белков понижена.

Первоначально исследовали влияние гидрофильных гексапептидов на клетки экспрессирующие оба типа транспортных белков: MRP и P-gp. С этой целью использовали линии клеток IS9 и КВ8-5. В качестве субстрата транспортных белков применяли флуоресцентный краситель R 123.

Полученные данные демонстрируют выраженную тенденцию к уменьшению интенсивности флуоресценции в клетках IS9 и КВ8-5, которая носит статистически не достоверный характер (табл. 3). Таким образом, среди изученных гексапептидов только один из них - имунофан оказывает

выраженное действие на функциональную активность транспортных белков МЛУ в клетках IS9.

Таблица 3. Интенсивность флуоресценции R 123 в клетках IS9 и КВ8-5 экспрессирующих MRP и P-gp под влиянием гексапептидов.

~ ——_____ Линии клеток Гексапептиды " —_____ IS9 KB 8-5

Имунофан 93,5±1,3* 94,3±4,1

Биопоэтин 96,4±3,5 97,1±5,9

Циклобурсин 95,1±3,0 96,2±2,4

Примечания: результаты определения представлены в процентах по отношению к контролю. Контролем служили клетки, не обработанные гексапептидами. Разницу считали достоверной при уровне значимости не более 5% (р<0,05).

* - достоверные различия между действием препарата и данными контроля.

Возможно, отсутствие выраженного действия гексапептидов связано с тем, что они не влияют на транспортные белки MRP и P-gp или действуют на белки в противофазе (MRP активирует, P-gp ингибирует или наоборот).

Представленные результаты не позволяют оценить специфичность действия гексапептидов на отдельные типы транспортных белков. Для решения данной задачи использовали клеточные линии, в которых транспортные белки представлены только одним типом MRP или P-gp.

Таким требованиям отвечают клеточные линии MCF7 и MCF7/Adr. Клетки MCF7 экспрессируют белок MRP, а в линии клеток MCF7/Adr белки, ответственные за МЛУ, представлены P-gp. В опытах использовали флуоресцентный краситель R 123, который транспортируется из клетки, как белками MRP, так и P-gp.

Данные представленные в таблице 6 показывают, что интенсивность флуоресценции в клетках MCF7, обработанных гексапептидами, превышает контрольные значения. Таким образом, представленные результаты демонстрируют, что имунофан, биопоэтин, циклобурсин ингибируют повышенную активность транспортных белков MRP.

Дальнейшую оценку специфичности действия гексапептидов проводили на модели клеток MCF7/Adr, которые преимущественно экспрессируют P-gp. Полученные результаты представлены в таблице 4.

Анализ результатов представленных в таблице 4 показывает, что гексапептиды вызывают селективное ингибирование транспортных белков MRP

в клетках \1CF7. Напротив, действие гексапептидов на клетки МСР7/Аёг, экспрессирующие транспортный белок Р-§р, носит совершенно иной характер.

Таблица 4. Интенсивность флуоресценции Я 123 в клетках МСР7 и МСР7/Ас1г под влиянием исследуемых гексапептидов.

~ -—-_____ Линии клеток Гексапептиды " —-—_____ MCF7 MCF7/Adr

Имунофан 113,5±2,3* 89,3±2,1*

Биопоэтин 117,4±3,5* 101,1±8,5

Циклобурсин 109,1±2,0* 87,2±2,4*

Примечания: результаты определения представлены в процентах по отношению к контролю. Контролем служили клетки, не обработанные гексапептидами. Разницу считали достоверной при уровне значимости не более 5%(р<0,05).

* - достоверные различия между действием препарата и данными контроля.

Так имунофан и циклобурсин вызывают достоверное снижение флуоресценции, что указывает на активацию транспортной функции белков Р-gp. Иначе говоря, гексапептиды оказывают разнонаправленное действие на транспортные белки MRP и P-gp. Действие гексапептидов на транспортные белки MRP имеет характер выраженного ингибирования, а на транспортные белки P-gp активации.

Биологический смысл данного явления остается не ясный. Возможно, что сопряженная регуляция различных транспортных белков необходима для обеспечения высокой надежности системы откачивания и детоксикации клеток организма. Ингибирование одного из транспортных белков активирует работу другого, отвечающего за ту же функцию.

Результаты использования кальцеина, как специфического субстрата MRP представлены на рисунке 2.

В представленной аранжировке экспериментов в качестве клеток-мишеней использовали линию РСЗ, экспрессирующую преимущественно белки MRP типа. Выбор модели определялся необходимостью максимально сократить погрешность определений от влияния других транспортных белков.

Более интенсивная флуоресценция в клетках РСЗ показывает, что транспортные белки снижают выброс специфического субстрата в окружающую среду (в данном случае кальцеина). Таким образом, использование специфического субстрата позволило определить высокую активность всех гексапептидов в отношении транспортного белка MRP.

Рисунок 2. Интенсивность флуоресценции кальцеина в клетках РСЗ в контроле (черная линия) и при действии имунофана (А), биопоэтина (Б) и циклобурсина (В).

Ось ординат - интенсивность флуоресценции. Ось абсцисс - количество событий.

Примечание: представлены значения на основании 5 ООО событий. Таблица 5. Интенсивность флуоресценции кальцеина в клетках РСЗ и КВ 31 под влиянием исследуемых гексапептидов.

~~ —__^ Линии клеток Гексапептиды" —^^ РСЗ КВЗ-1

Имунофан 150,5±5,3* 115,3±4,1*

Биопоэтин 161,4±4,5* 123,1±7,5*

Циклобурсин 133,1±8,1* 108,2±5,4

Примечания: результаты определения представлены в процентах по отношению к контролю. Контролем служили клетки, не обработанные гексапептидами. Разницу считали достоверной при уровне значимости не более 5% (р<0,05).

* - достоверные различия между действием препарата и данными контроля.

В таблице 5 представлены общие результаты влияния гексапептидов на транспорт кальцеина в линиях клеток РСЗ и КВ 3-1. Данные показывают, что под действием гексапептидов интенсивность флуоресценции увеличивается в клетках PC 3 и КВ 3-1. Это говорит в пользу того, что гексапептиды ингибируют транспорт кальцеина из клеточных линий с экспрессией MRP.

Данные, приведенные выше, показывают, что все исследуемые гексапептиды в независимости от их структуры объединены общим признаком селективного действия в отношении транспортного белка MRP. Действие гексапептидов на транспортный белок P-gp остается не ясно. Возможно, гексапептиды непосредственно влияют активность белка P-gp. Другое объяснение данного феномена основывается на возможности включения компенсаторных механизмов клетки. Повышение концентрации субстрата в

клетке при ингибировании MRP вызывает компенсаторное увеличение активности другого транспортного белка P-gp. Сопряженная регуляция двух типов белков MRP и P-gp обеспечивает высокую надежность системы детоксикации клетки.

Влияние гидрофильных гексапептидов на действие цитостатических

препаратов.

Результаты представленные в предыдущей главе in vitro демонстрируют способность гидрофильных гексапептидов модулировать работу транспортных белков MRP в сверх низких дозах, порядка десятых долей наномоль. Специфическая активность гидрофильных гексапептидов не менее, чем в 1000 раз превышает действие известных ингибиторов транспортных насосов гидрофобных пептидов таких как циклоспорин А и его химические производные. Существование субстратной специфичности транспортных белков не позволяло оценить действие гидрофильных гексапептидов в отношении других групп химических веществ, в том числе цитостатических препаратов. Поэтому при оценке возможности использования гидрофильных гексапептидов для устранения развития феномена МЛУ возникла необходимость изучить их влияние на транспорт цитостатических препаратов.

Данные представленные на рисунке 3 показывают, что влияние гексапептидов увеличивает чувствительность клеток MCF7 к цитотоксическим препаратам, т.е. снижает уровень МЛУ.

Обнаруженный феномен ингибирования МЛУ может быть обусловлен двумя причинами. Возможно, снижение МЛУ связано с ингибированием активности транспортных белков, ответственных за откачивание доксорубицина из клетки. Другой механизм накопления цитостатиков в клетке может быть обусловлен уменьшением количества транспортных белков. Очевидно, что снижение количества транспортных белков в клетке вызовет торможение откачивания и соответственно накопления цитостатика в опухолевых клетках.

Важно отметить, что гексапептиды в клетках с преимущественной экспрессией P-gp не изменяют чувствительность к цитостатику. Возможно, это связано с тем, что в клетках KB 8-5 за транспорт препарата из клетки отвечают белки обоих типов - преимущественно P-gp и в меньшей мере MRP. Вклад этих белков в АТФ-зависимый транспорт из клетки во внеклеточное пространство не одинаков. Ингибирование активности белков MRP вызывает компенсаторное увеличение транспорта, опосредованного белками P-gp.

Рисунок 3. Действие гексапептидов на выживаемость клеток МСР7 в МТТ-тесте.

Ч

\

Л

\

\

■ Контроль Имунофан •Биопоэтин Циклобурсин

и*«"-? З.ШЧО"-? 6.25* 10^-7 1.25*10^-6 2.5Ч(Г-6 Концентрация ООХ, М

5«10"-«

10»10^

Рисунок 4. Действие гексапептидов на выживаемость клеток РСЗ в МТТ-тесте.

Конфнграция ООХ, М

С другой стороны изменение экспрессии транспортного белка MRP также может влиять на активность P-gp. Увеличение количества белка MRP приводит к уменьшению активности P-gp и наоборот. Таким образом, посредствам сопряженной регуляции активности белков P-gp и MRP, клетки могут контролировать уровень откачивания цитостатиков и соответственно формирование МЛУ.

С целью дальнейшей оценки влияния гидрофильных гексапептидов на формирование МЛУ были проведены опыты на клетках РСЗ, экспрессирующих только транспортный белок MRP (рис. 4).

Как видно, из результатов, представленных на рисунке 4, гексапептиды линейной и циклической структуры увеличивают чувствительность к действию цитостатического агента опухолевых клеток экспрессирующих MRP. Поскольку линия РСЗ экспрессирует только один белок MRP, то явление сопряженной регуляции, посредствам откачивания цитостатика через другие транспортные

Полученные данные по активности транспортных белков при действии гексапептидов «ин витро» показывают неоднозначность результатов в зависимости от методов исследования и использованных моделей. Так, например в моделях по определению транспорта R 123 показана исключительно высокая активность гексапептидов по сравнению с конкурентными ингибиторами. Гексапептиды по активности превышают конкурентный ингибитор (циклоспорин А) не менее чем в 1000 раз. При этом гексапептиды сохраняют свои регуляторные свойства и восстанавливают нарушенные функции транспортной системы клетки.

Совокупность данных полученных на моделях с использованием R 123 отчетливо демонстрирует влияние гексапептидов на активность АТФ-зависимых транспортных белков.

Влияние гидрофильных гексапептидов на уровень экспрессии генов и белков-

транспортеров.

Как следует из ранее полученных данных, уменьшение транспорта флуоресцентного красителя, возможно, вызвано двумя причинами. Вероятно, это связано с уменьшением количества белков MRP или P-gp. Другая точка зрения может основываться на влиянии гексапептидов на активность транспортных белков MRP. С целью проверки и уточнения механизма действия гидрофильных гексапептидов было изучено их влияние на экспрессию транспортных белков P-gp, LRP, BCRP и MRP.

В дальнейшем использовали концентрацию гидрофильных гексапептидов равную 1 нМ. Результаты исследования обнаружили принци-пиальные различия в механизме действия имунофана и биопоэтина. (табл. б).

Таблица 6. Экспрессия транспортных белков МЛУ клетками линии РСЗ и КВ 8-5 при действии на них имунофана и биопоэтина.

Контроль + Имунофан + Биопоэтин

РСЗ КВ 8-5 РСЗ КВ 8-5 РСЗ КВ 8-5

МБЯ1 36,6±2,3 96,5±3,0 38,2±2,5 98,2±1,1 40,2±3,5 94,2±2,0

МШ> 64,1±1,5 73,2±3,0 41,6±2,4* 43,5±4,0* 67,1±3,5 66,8±5,0

ВСЯР 95,6±3,2 92,0±4,5 98,6±2,5 97,7±2,2 94,2±5,1 88,6±4,1

ЬИР 68,6±2,5 30,6±5,0 69,2±5,4 33,1±8,8 70,4±2,8 33,5±4,1

Примечания: контролем служили клетки, не обработанные гексапептидами. Представлены значения процентного содержания окрашен-ных моноклональными антителами клеток на основании 5 ООО событий. Раз-личия считали достоверными при уровне значимости не более 5% (р<0,05).

* - достоверные различия между действием препарата и данными контроля.

Результаты определения показывают, что действие имунофана вызывает уменьшение экспрессии белка МИР(табл. 6). Экспрессия других исследуемых белков, остается неизмененной, как при действии имунофана, так и биопоэтина. Данные представлены в таблице 6.

Наши данные показывают, что оба гексапептида оказывают высокое ингибирующее действие на выброс субстрата. Однако реализация эффекта осуществляется различными путями. Имунофан модулирует экспрессию транспортных белков МЛУ, а биопоэтин их активность.

Одной из вероятных причин снижения экспрессии белков-транспортеров МЛУ может быть связано с подавлением синтеза соответствующих мРНК. С целью определения такой возможности исследовали действие гидрофильных гексапептидов на экспрессию основной группы генов: МКР1, 1ЛР, МБ111, ответственных за формирование МЛУ.

Представленные результаты демонстрируют, что под действием имунофана снижение экспрессии МЯР1 и ЬЯР непосредственно связано с

уменьшением количества мРНК. Напротив, биопоэтин изменяет активность белка MRP без изменения его количества.

Анализ представленных результатов демонстрирует, что гидрофильные регуляторные пептиды различной химической структуры являются высоко эффективными модуляторами транспортных систем, обеспечивающих формирование МЛУ. В отличии от других ингибиторов МЛУ гидрофильные гексапептиды обладают исключительно высокой специфической активностью и низкой токсичностью в пределах действующих концентраций. До настоящего времени все попытки создания лекарственных препаратов для преодоления МЛУ оказались безуспешными. Обнаруженное свойство гидрофильных гексапептидов открывает принципиальную возможность их применения для преодоления МЛУ.

* * *

Развитие МЛУ представляет собой одну из основных причин безуспешной химиотерапии злокачественных новообразований. Исследования последних лет показали, что молекулярные механизмы МЛУ разнообразны и лекарственная устойчивость клетки может определяться включением различных механизмов -от ограничения накопления лекарства внутри клетки до отмены программы гибели клетки, индуцируемой веществом.

Все известные ингибиторы МЛУ оказывают действие по принципу конкурентного ингибирования транспорта лекарственных веществ из клетки во внеклеточное пространство. Однако, до настоящего времени нет ингиби-торов МЛУ, которые приемлемы для применения в клинике, поскольку в эффективных дозах они оказывают мощное токсическое действие.

Создание клинически приемлемых средств для преодоления МЛУ требует применения принципиально нового подхода к решению поставленной задачи.

Предложенное нами научное направление по созданию лекарственных средств для преодоления МЛУ основывается на принципе фармакологического регуляторного действия на АТФ-зависимую транспортную систему клеток путем применения биологически активных гидрофильных гексапептидов. Указанные соединения являются оригинальными и разработаны под руководством профессора В.В. Лебедева в лаборатории иммунологии и биотехнологии ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора.

В условиях целостного организма действие регуляторных гидрофильных гексапептидов проявляется в виде множества параллельных эффектов, как со стороны иммунной системы, так и со стороны других органов и систем (Lebedev

V.V. et al., 1998). Модулирующее действие является универсальным для регуляторных пептидов различного происхождения и выражается в восстановлении функции ЦНС и эндокринных органов через изменение содержания вторичных мессенджеров и каскадного усиления сигнала в соответствующих клетках-мишенях (Lebedev V.V. et al., 1998).

Как показали проведенные исследования гидрофильные регуляторные гексапептиды, в отличие от других биологически активных веществ оказывают специфическое действие на различные функции клетки, в том числе на транспортную систему ABC. Более того, гексапептиды по критерию специфичности действия на АТФ-зависимые транспортные белки превосходят известные аналоги препаратов конкурентного типа действия. Так, наиболее активный специфический ингибитор MRP пробенецид, вызывает подавление транспортных белков только в концентрации около 1 мМ, то есть на шесть порядков больших, чем гидрофильные гексапептиды.

Модулирование транспорта субстрата белками, ответственными за МЛУ, может регулироваться двумя механизмами. К числу таких механизмов следует отнести изменение количества транспортных белков или их активности.

Установлено, что гидрофильные гексапептиды линейной и циклической структуры вызывают повышение чувствительности опухолевых клеток к действию цитостатического препарата - доксорубицина в сверх низких дозах. Обнаруженное свойство указывает на перспективу создания лекарственных средств на основе гидрофильных гексапептидов для преодоления МЛУ. Действие гексапептидов на изменение чувствительности опухолевых клеток к различным цитотоксическим препаратам открывает возможность их использования для лечения злокачественных новообразований, осложненных МЛУ.

Выводы.

1. Обнаружено свойство гидрофильных гексапептидов структурной формулы аргинт-алъфа-аспартил-лизил-валил-тирозил-аргинин (имунофан); лизил-гистидил-глицил-лизил-гистидил-глицж (биопоэтин); цикло -лизил-гистидил-глщил-лизш-гистидш-глицин (циклобурсин) модулировать активность АТФ-зависимых транспортных белков МЛУ.

2. Гидрофильные гексапептиды обладают высокой регуляторной активностью в отношении транспортных белков МЛУ и не менее чем в 1000 раз превышают действие гидрофобных пептидов - известных ингибиторов транспортных насосов.

3. Регуляторное действие гексапептида имунофана проявляется в зависимости от функционального состояния транспортных белков МЛУ. В период транспорта субстрата гексапептид ингибирует белки АТФ-зависимой транспортной системы, а в латентный период стимулирует их активность.

4. Модулирование транспорта субстрата белками, ответственными за МЛУ под действием гексапептидов, регулируется путем изменения экспрессии транспортных белков или их активности.

5. Гидрофильные гексапептиды оказывают плеотропное действие на клетки: восстанавливают нарушенные функции транспортной системы, влияют на экспрессию генов иммунного ответа, созревание Т-лимфоцитов, количество антителообразующих клеток.

6. Гидрофильные гексапептиды линейной и циклической структуры вызывают повышение чувствительности опухолевых клеток к действию цитостатического препарата в сверх низких дозах, что открывает возможность их использования для лечения злокачественных новообразований, осложненных МЛУ.

Список сокращений

МЛУ — множественная лекарственная устойчивость; РП — регуляторные пептиды;

ABC — ATP-Binding Cassette семейство транспортеров;

Dox - доксорубицин

LRP — lung-resistance-related-protein;

MRP — multidrug resistance associated protein;

P-gp — Р-гликопротеин (P-glycoprotein);

R 123 — родамин 123.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Лебедев, В.В. Влияние регуляторных пептидов - прототипа тимического гормона (имунофан) и прототипа бурсопоэтина на транспортные белки множественной лекарственной устойчивости [Текст] / В.В. Лебедев, С.А. Новиков // Российский Биотерапевтический Журнал. - 2007. - № 1 - С. 58.

2. Новиков, С.А. Синтетический прототип фрагмента тимического гормона -имунофан, регулятор активности транспортных белков множественной лекарственной устойчивости [Текст] / С.А. Новиков // Медицинская иммунология.- 2006. - Том 8, № 2-3. - С. 452.

3. Лебедев, В.В. Гидрофильный гексапептид имунофан - гиперактивный регулятор транспортных белков множественной лекарственной устойчивости [Текст] / В.В. Лебедев, С.А. Новиков // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2006. - № 12. - С. 649-651.

4. Лебедев, В.В. Фармакологическая коррекция множественной лекарственной устойчивости гидрофильными регуляторными пептидами [Текст] / В.В. Лебедев, С.А. Новиков, Е.Ю. Рыбалкина, Т.Н. Заботина // Российский иммунологический журнал. - 2008. - № 2-3. - С. 310.

5. Новиков, С.А. Иммунотропные гексапептиды - регуляторы чувствительности опухолевых клеток к доксорубицину [Текст] / С.А. Новиков, В.В. Лебедев, Е.Ю. Рыбалкина, Т.Н. Заботина // Российский иммунологический журнал. - 2008. - № 2-3. - С. 312.

6. Лебедев, В.В. Регуляторные пептиды - новый класс биологически активных соединений для преодоления множественной лекарственной устойчивости [Текст] / В.В. Лебедев, С.А. Новиков // Материалы XIV Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - М., 2007. - С. 618.

Подписано в печать 30.10.2008 г. Заказ № 693. Типография "Медлайн-С" 125315, г. Москва, Ленинградский пр-т, д.78, к.5 Тел. 152-00-16 Тираж 100 шт.

Актуальность проблемы:

Множественная лекарственная устойчивость опухолевых клеток (МЛУ) является серьезным препятствием на пути химиотерапии злокачественных новообразований. МЛУ - это система защиты популяции опухолевых клеток от множества лекарств, различающихся по химической структуре и механизму действия на клетку [50,122].

Транспортные белки, ответственные за МЛУ, принадлежат к суперсемейству ABC транспортеров ( ATP-Binding Cassette ) [84]. К ABC семейству относят более сотни транспортных белков, обнаруженных у про и эукариотов[56,87].

В клетках млекопитающих за МЛУ ответственны, в основном, два типа транспортных белков: multidrug resistance associated protein (MRP) и P-glycoprotein (P-gp). Субстратами для обоих типов транспортных белков является широкий спектр противоопухолевых соединений: антрациклины, этопозид, винкристин, таксол и др. В результате работы транспортных белков клетки приобретают устойчивость к действию широкого спектра химиотерапевтических средств.

Важно отметить, что ABC транспортеры отвечают не только за выведение токсичных и вредных веществ из клетки, но и принимают участие в транспорте медиаторов, цитокинов воспалительной и иммунной системы. В свою очередь, цитокины, посредствам взаимодействия с рецепторами, осуществляют контроль роста и развития клеток иммунной системы. Поэтому АБС транспортеры опосредовано влияют на развитие иммунной реакции организма. В этой связи вполне логично предположить, что регуляторные пептиды, влияющие на клетки иммунной системы, могут регулировать и активность транспортных белков.

МЛУ возникает в результате активации клеткой её естественных защитных механизмов. Такие механизмы посредством АТФ-зависимых транспортных белков обеспечивают интенсивное откачивание из клетки любых токсических соединений, включая химиотерапевтические препараты [100]. Этот процесс существенно снижает эффективность средств, используемых для терапии бактериальных, паразитарных и грибковых инфекций, а также злокачественных новообразований.

До настоящего времени поиск лекарственных средств для преодоления МЛУ основывался на использовании принципа конкурентного ингибирования транспортных систем путем введения избыточной концентрации субстрата. Однако применение конкурентных ингибиторов для преодоления МЛУ осложняется их высокой токсичностью. Конкурентные ингибиторы одновременно подавляют активность тех транспортных белков, которые выполняют ряд жизненно важных физиологических функций. Ингибирование жизненно важных функций транспортеров приводит к токсическому поражению клеток и резкому нарастанию явлений токсикоза. Поэтому применение конкурентных ингибиторов в качестве лекарственных препаратов для преодоления МЛУ оказывается бесперспективным. В этой связи представляется целесообразным применение биологически активных соединений, обладающих регуляторной активностью на транспортную функцию белков МЛУ. Из перечисленного широкого спектра заболеваний, лечение которых осложняется, а порой и невозможно из-за МЛУ, очевидна необходимость поиска эффективных регуляторов МЛУ. В этой связи принципиальное решение проблемы создания средств преодоления МЛУ видится в использовании таких соединений, которые обладают низкой токсичностью и способностью оказывать регуляторное действие на активность транспортных систем.

В настоящее время отсутствуют точные сведения о частоте возникновения МЛУ среди пациентов, получающих химиотерапию.

Предполагают, что не менее половины всех случаев развития токсикоза и невозможного завершения полного курса химиотерапии вызваны возникновением МЛУ. МЛУ возникает не только при лечении онкологических больных. Ряд инфекционных агентов, например, малярийный плазмодий, грамм положительные бактерии, гельминты и другие способны к появлению МЛУ. До настоящего времени все попытки создать лекарственные препараты обеспечивающие преодоление МЛУ оказались безуспешными.

Среди множества лекарственных препаратов и биологически активных соединений, обладающих свойством регулирования МЛУ не обнаружено средств с достаточной специфической активностью и безвредностью. В этой связи становится, очевидно, высокая актуальность проблемы поиска средств преодоления МЛУ.

Как уже было отмечено традиционное направление, основанное на поиске конкурентных ингибиторов МЛУ, не позволяет достигнуть положительных результатов. Создание эффективных средств преодоления : МЛУ требует применение принципиально иных подходов к решению проблемы. Таким подходом может быть применение синтетических регуляторных пептидов, обладающих выраженным действием на показатели активности транспортных систем в зависимости от их функционального состояния.

Одним из перспективных направлений в создании новых регуляторных пептидов является подход, основанный на модификации последовательности аминокислот путем замены или элонгации структуры, для получения соединений, обладающих более высокой фармакологической потенцией. Цель работы:

Изучить регуляторное влияние и механизм действия гидрофильных гексапептидов структурной формулы: аргинил-алъфа-аспартш-лизгт-валил-тирозил-аргинин (имунофан), лизил-гистидил-глицгт-лизш-гистидш-глицин (биопоэтин), цишо-лшггл-гистндш-глгщш-лызш-гистидш-глкцин (циклобурсин) на АТФ-зависимые транспортные белки множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток. Задачи исследования:

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние трех гексапептидов структурной формулы: аргинил-алъфа-аспартил-лизил-валил-тирозил-аргинин (имунофан),лизил-гистидил-глицил-лизил-гистидил-глицин (биопоэтин), цикяо-лизил-гистидш-глицш-лизил-гистидил-глицин (циклобурсин) на транспорт субстрата из опухолевых клеток.

2. Определить специфичность действия гексапептидов в отношении транспортных белков МЛУ.

3. Изучить влияние гексапептидов на функциональную активность различных типов транспортных белков множественной лекарственной устойчивости.

4. Определить влияние гексапептидов на чувствительность опухолевых клеток к действию цитостатических препаратов.

5. Определить влияние гексапептидов на экспрессию генов и белков МЛУ.

6. Исследовать влияние гексапептидов на экспрессию маркера силы иммунного ответа (HLA-DR), маркеров Т-лимфоцитов (CD2, CD4, CD8) и В-лимфоцитов (CD22).

7. Исследовать влияние гексапептидов на продукцию антителообразущих клеток.

Научная новизна работы:

Впервые обнаружено ранее неизвестное свойство гидрофильных гексапептидов оказывать регуляторное действие на транспортную систему МЛУ и определена избирательность их действия на отдельные классы АТФ-зависимых транспортных белков. Впервые обнаружено свойство гидрофильных гексапептидов оказывать влияние на чувствительность опухолевых клеток к действию цитостатического препарата - доксорубицина и проведена оценка возможности их применения в качестве средств преодоления МЛУ. Практическая значимость:

Практическое значение работы включает научное обоснование возможного применения гидрофильных регуляторных пептидов в качестве средств преодоления МЛУ. Разработка комплекса экспериментальных моделей изучения регуляторов МЛУ открывает возможность проведения доклинической оценки специфической активности регуляторных пептидов. В дальнейшем это позволит создать новые оригинальные препараты для преодоления МЛУ. Положения, выносимые на защиту:

1. Гидрофильные гексапептиды обладают способностью модулировать активность АТФ-зависимых транспортных белков МЛУ.

2. Гидрофильные гексапептиды обладают высокой регуляторной активностью в отношении транспортных белков МЛУ и не менее чем в 1000 раз превышают действие гидрофобных пептидов - известных ингибиторов транспортных насосов.

3. Регуляторное действие гексапептида имунофана проявляется в -зависимости от функционального состояния транспортных белков МЛУ. В период транспорта субстрата гексапептид ингибирует белки АТФ-зависимой транспортной системы, а в латентный период стимулирует их активность.

4. Модулирование транспорта субстрата белками, ответственными за МЛУ под действием гексапептидов, регулируется путем изменения экспрессии транспортных белков или их активности.

5. Гидрофильные гексапептиды обладают плеотропным типом действия -восстанавливают нарушенные функции транспортной системы клетки и обладают иммунорегуляторной активностью.

6. Гидрофильные гексапептиды линейной и циклической структуры вызывают повышение чувствительности опухолевых клеток к действию цитостатического препарата в сверх низких дозах.

I. Обзор литературы

Главной задачей нашей работы было исследование действия гексапептидов на регуляцию транспортных белков множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток. В этой связи представлялось целесообразным включить в обзор литературы одного раздела, посвященного общей характеристике явления множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток, а другой данным научной литературы относительно регуляторных пептидов, которые были опубликованы к началу нашей работы.

Ы.Общая характеристика явления множественной лекарственной устойчивости.

Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) - это невосприимчивость популяции клеток опухоли одновременно к целому ряду химиотерапевтических препаратов разного химического строения и с разным механизмом действия на клетку. Явление устойчивости к широкому классу лекарственных соединений известно для различных биологических объектов[64,71]. Оно существенно снижает эффективность средств, используемых для терапии бактериальных, паразитарных и грибковых инфекций, а также злокачественных новообразований. Из перечисленного широкого спектра заболеваний, лечение которых осложняется, а порой и невозможно из-за МЛУ, очевидна необходимость поиска эффективных ингибиторов МЛУ.

В клетках млекопитающих за МЛУ ответственны в основном два типа транспортных белков: multidrug resistance associated protein (MRP) и P-glycoprotein (P-gp), которые обнаружены в опухолях различного происхождения (лимфомах, саркомах, карциномах и нейробластомах) [6,29,71]. Субстратами для обоих типов транспортных белков является широкий спектр противоопухолевых соединений; например, антрациклины, этопозид, винкристин, таксол[89]. Однако в отличие от P-gp, MRP

10 транспортирует различные соединения из клеток в измененном виде, как коньюганты с глутатионом или глюкуроновой кислотой[71].

Изучение резистентности клеток к химиотерапии важно и для практической онкологии, поскольку с ней нередко связывают неудачи лечения злокачественных новообразований. Неэффективность терапии обусловлена не только изменением опухолевых клеток, но и целым рядом других причин, по которым препарат не доходит до клетки в адекватной и активной форме.

В частности, апоптоз - один из основных механизмов самопрофилактики онкологических заболеваний.

Апоптоз играет главную роль как в развитии, так и в гомеостазе. Апоптоз вызывает большинство химиопрепаратов[54]. Из таблицы 1 видно, что механизмы резистентности популяций опухолевых клеток к токсическим воздействиям разнообразны, а изменения в клетке, приводящие к лекарственной устойчивости обладают возможностью прерывать путь реализации повреждения на любом этапе.

МЛУ была впервые обнаружена Biedler J.L. и соавторами в 1970 году в опытах с культивируемыми клетками[15]. Было показано, что воздействие на культуры клеток одного препарата может привести к возникновению популяции, резистентной одновременно ко многим другим веществам, с которыми клетки не встречались (перекрестная устойчивость) [45]. Разнообразие механизмов МЛУ значительно затрудняют как диагностику причин устойчивости больных к терапии, так и выработку разумных протоколов по преодолению МЛУ опухолевых клеток. Обсуждение каждого отдельного механизма МЛУ показывает, что чувствительность опухолевых клеток к терапии в большой степени зависит от того, что сейчас принято называть «клеточным контекстом»: от сочетания особенностей регуляции жизненно важных процессов клетки, связанных с ее видовой и тканевой принадлежностью, а также с теми генетическими изменениями, которые произошли в клетке в ходе ее малигнизации и прогрессии новообразования.

Природная» МЛУ исходно свойственная опухолевым клеткам (например, опухоли головного мозга, резистентны к химиотерапии из-за гематоэнцефалического барьера).

Таблица 1. Основные механизмы лекарственной устойчивости опухолевых клеток[47,122].

Основные этапы реализации цитотоксического действия лекарственных препаратов Изменения, приводящие к лекарственной устойчивости Механизм лекарственной устойчивости (примеры)

1 Накопление препарата в клетке Снижение накопления препарата в клетке Активация белков транспортеров (P-gp, MRP).

2 Активация или сохранение активности препарата внутри клетки Инактивация препарата или отсутствие его активации Активация ферментов системы глутатиона, секвестрация препарата во внутриклеточных везикулах

3 Повреждение мишени препарата Изменение мишени, повышенная репарация повреждений Мутации генов топоизомераз, увеличение степени репарации ДНК

4 Блок клеточного цикла и гибель клетки Отмена апоптоза или блокада клеточного цикла, возникающих в ответ на действие цитостатика; активация Мутации гена р53, активация гена BCL-2 генов, контролирующих апоптоз

Приобретенная МЛУ может возникать в результате химиотерапии. В популяциях опухолевых клеток в результате воздействия цитостатика появляются редкие генетические варианты резистентных клеток, которые получают селективное преимущество и размножаются.

Селективное преимущество клеткам обеспечивает не обязательно лекарственная устойчивость, но и, такие признаки как ускоренное размножение, изменение чувствительности к факторам роста и пр. Эти факторы влияют на селекцию клеток лекарственными препаратами. Существенный интерес представляют также так называемые «адаптационные изменения», в условиях которых большинство клеток популяции оказывается устойчивым к лечению за счет временной активации защитных механизмов клеток.

V. Выводы

1. Впервые в мире, обнаружено свойство гидрофильных гексапептидов структурной формулы аргинил-алъфа-аспартил-лизил-валил-тирозил-аргинин (имунофан); лизил-гистидил-глицш-лизил-гистидил-глицин (биопоэтин); цикпо-лизш-гистидш-глш(ил-лизш-гистидил-глицин (цикло-бурсин) модулировать активность АТФ-зависимых транспортных белков МЛУ.

2. Гидрофильные гексапептиды обладают высокой регуляторной активностью в отношении транспортных белков МЛУ и не менее, чем в 1 ООО раз превышают действие гидрофобных пептидов - известных ингибиторов транспортных насосов.

3. Регуляторное действие гексапептида имунофана проявляется в зависимости от функционального состояния транспортных белков МЛУ. В период транспорта субстрата гексапептид ингибирует белки АТФ-зависимой транспортной системы, а в латентный период стимулирует их активность.

4. Модулирование транспорта субстрата белками, ответственными за МЛУ под действием гексапептидов, регулируется путем изменения экспрессии транспортных белков или их активности.

5. Гидрофильные гексапептиды оказывают плеотропное действие на клетки: восстанавливают нарушенные функции транспортной системы, влияют на экспрессию генов иммунного ответа, созревание Т-лимфоцитов, количество антителообразующих клеток.

6. Гидрофильные гексапептиды линейной и циклической структуры вызывают повышение чувствительности опухолевых клеток к действию цитостатического препарата в сверх низких дозах, что открывает возможность их использования для лечения злокачественных новообразований, осложненных МЛУ.

1У.Заключение

Развитие МЛУ представляет собой одну из основных причин безуспешной химиотерапии злокачественных новообразований. Исследования последних лет показали, что молекулярные механизмы МЛУ разнообразны и лекарственная устойчивость клетки может определяться включением различных механизмов - от ограничения накопления лекарства внутри клетки до отмены программы гибели клетки, индуцируемой веществом.

Обсуждение каждого отдельного механизма МЛУ показывает, что чувствительность опухолевых клеток к терапии в высокой степени зависит -от сочетания особенностей регуляции жизненно важных процессов клетки, связанных с ее видовой, тканевой принадлежностью, а также с теми генетическими изменениями, которые произошли в клетке в ходе ее малигнизации и прогрессии новообразования.

Множественность и разнообразие механизмов МЛУ значительно затрудняют как диагностику устойчивости больных к химиотерапии, так и выработку разумных протоколов по преодолению МЛУ опухолевых клеток.

Естественно, на первый план выходит исследование механизмов возникновения МЛУ и поиск фармакологических средств воздействия на данные механизмы.

В настоящее время обнаружено или синтезировано три поколения ингибиторов МЛУ, с возрастающей эффективностью и уменьшающимися побочными явлениями. Впервые ингибирование МЛУ было показано для верапамила - блокатора кальциевых каналов. В дальнейшем были обнаружены ингибиторы МЛУ, относящиеся к другим классам соединений. Все эти ингибиторы были активны при высоких концентрациях (5-50мкМ), в которых они были токсичны, или оказывали нежелательные эффекты (иммунносупрессия, нарушения сердечной деятельности и др.). Наиболее активным из первого поколения ингибиторов МЛУ считают циклоспорин А.

Все известные ингибиторы МЛУ оказывают действие по принципу конкурентного ингибирования транспорта лекарственных веществ из клетки во внеклеточное пространство.

С 1993 г и по настоящее время синтезирован ряд конкурентных ингибиторов проявляющих ингибирующую активность в интервале 20-100 нМ. Наиболее эффективный из ингибиторов третьего поколения -циклопропилдибензосуберан (LY 335979) который в 10 раз активнее циклоспорина А. Однако, до настоящего времени нет ингибиторов МЛУ, которые приемлемы для применения в клинике, поскольку в эффективных дозах они оказывают мощное токсическое действие.

Создание клинически приемлемых средств для преодоления МЛУ 1 требует применения принципиально нового подхода к решению поставленной задачи.

Перспективным направлением поиска средств преодоления МЛУ могут быть биологически активные соединения, оказывающие регуляторное действие на работу ABC транспортеров. Типичным представителем таких соединений являются гидрофильные регуляторные пептиды, которые оказывают свое действие через сигнальную систему клетки. Диапазон поиска новых гидрофильных регуляторных гексапептидов определяется возможностями модификации химической структуры естественных регуляторных пептидов с целью повышения их регуляторной активности.

Предложенное нами научное направление по созданию лекарственных средств для преодоления МЛУ основывается на принципе фармакологического регуляторного действия на АТФ-зависимую транспортную систему клеток путем применения биологически активных гидрофильных гексапептидов. Изучали три гидрофильных гексапептида: структурной формулы: аргинил-альфа-аспартил-лизил-валил-тирозил-аргинин (имунофан), структурной формулы: лизгш-гистидил-глицип-лизил-гистидил-глицин (биопоэтин), структурной формулы: цикло- лизил-гистидил-глицил-лизил-гистидш-глицин (циклобурсин). Указанные соединения являются оригинальными и разработаны под руководством профессора В.В. Лебедева в лаборатории иммунологии и биотехнологии ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора.

В условиях целостного организма действие регуляторных гидрофильных гексапептидов проявляется в виде множества параллельных эффектов, как со стороны иммунной системы, так и со стороны других органов и систем[73]. Так, например, посредством изменения продукции регуляторных пептидов клетками тимуса, костного мозга и селезёнки поддерживается нейроэндокринная регуляция гомеостаза всего организма[73]. Модулирующее действие является универсальным для регуляторных пептидов различного происхождения и выражается в восстановлении функции ЦНС и эндокринных органов через изменение содержания вторичных мессенджеров и каскадного усиления сигнала в соответствующих клетках-мишенях[73].

Полученные данные свидетельствуют о том, что гексапептиды действует на С02-положительные Т-клетки, имеющие фенотип CD8+ (Т-супрессоры) и модулирующие экспрессию одного из антигенов главного комплекса гистосовместимости II класса — HLA-DR. Указанное свойство может иметь важное практическое значение в комплексной терапии опухолей.

Как показали проведенные исследования гидрофильные регуляторные гексапептиды, в отличие от других биологически активных веществ оказывают специфическое действие на различные функции клетки, в том числе на транспортную систему ABC.

В отличие от конкурентных ингибиторов МЛУ регуляторные гидрофильные гексапептиды обладают исключительно низкой токсичностью, что принципиально важно для их применения в клинике.

Впервые нами было обнаружено, что гидрофильные гексапептиды обладают исключительно высокой регуляторной активностью в отношении транспортных белков МЛУ.