Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:ЭКПРЕССИЯ И АКТИВНОСТЬ БЕЛКОВ МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ ОПУХОЛЕЙ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ИНГИБИТОРА ПРОТЕАСОМ БОРТЕЗОМИБА

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ "РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР имени H.H. БЛОХИНА" РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ

МЕДИЦИНСКИХ НАУК

на правах рукописи

04201350125

Лалетина Лидия Александровна

ЭКПРЕССИЯ И АКТИВНОСТЬ БЕЛКОВ МНОЖЕСТВЕННОЙ

ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ ОПУХОЛЕЙ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ИНГИБИТОРА ПРОТЕАСОМ БОРТЕЗОМИБА

(Онкология -14.01.12)

ДИССЕРТАЦИЯ НА СОИСКАНИЕ УЧЁНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

Научный руководитель: Профессор, д.м.н. A.A. Ставровская

Москва - 2012

Оглавление

Список сокращений..........................................................................5

I. Введение......................................................................................6

II. Литературный обзор.......................................................................9

II.1. Устойчивость опухолей к терапии...................................................9

II. 1.1. Механизмы множественной лекарственной устойчивости (МЛУ)

опухолей. Многофакторная ЛУ............................................................9

II. 1.2. Основные транспортёры семейства ABC......................................11

II. 1.3. Экспрессия ABC-транспортеров в опухолях..................................13

II. 1.4. Стволовые клетки и ABC-транспортеры........................................14

II.1.5. Регуляция ABC-транспортеров...................................................14

II. 1.5.1. Регуляция транскрипции генов ABC-транспортеров. Факторы

транскрипции, регулирующие ABC транспортеры...................................14

II. 1.5.1.а. Влияние белка р53 на регуляцию транскрипции АВС-

транспортеров...............................................................................17

И. 1.5.1.6. Влияние белка YB-1 на регуляцию транскрипции ABC

транспортеров.......................................................................................................18

И. 1.5.1.в. Роль факторов транскрипции семейства АР-1 в регуляции гена

MDR1..........................................................................................19

II. 1.5.2. Регуляция ABC-транспортеров на пост-транскрипционном

уровне...................................................................................................................20

II. 1.5.3. Пути сигнальной трансдукции, вовлеченные в регуляцию АВС-

транспортеров...............................................................................22

II.1. 6. Многофакторная МЛУ. Сигнальный путь PI3K/Akt/ PTEN................24

II. 1. 7. Участие систем деградации белков в лекарственной устойчивости

опухолей......................................................................................27

II. 1. 7.1. Протеасома. Её строение и роль в клетке....................................29

II. 1. 7.2. Противоопухолевые агенты, действие которых направленно на ингибирование активности протеасом.................................................31

II.l. 7.3. Бортезомиб и транспортные белки семейства ABC........................34

III. Материалы и методы.....................................................................................35

III. 1. Линии клеток, использованные в работе...................................................35

111.2. Реагенты, использованные в работе..........................................................35

111.3. Оценка цитотоксичности препаратов - колориметрический метод (МТТ)......................................................................................................................36

111.4. Метод антительного сдвига (UIC2-shift assay или UIC2-OAC)............37

111.5. Оценка функциональной активности Р-гликопротеина с помощью родамина (Rh 123)...........................................................................37

111.6. Иммуноцитохимический анализ белков.........................................38

111.7. Выделение РЖ и ОТ-ПЦР.........................................................................38

111.8. Иммуноблотинг........................................................................39

111.9. Иммунноцитохимическое определение внутриклеточной локализации

белка YB-1....................................................................................40

IV. Результаты................................................................................41

IV-1. Исследование цитотоксического действия бортезомиба на различные линии чувствительных и резистентных к лекарственным препаратам

опухолевых клеток.........................................................................41

IV-2. Влияние бортезомиба на функциональную активность и экспрессию

Р-гликопротеина (Pgp)......................................................................44

IV-2 Л. Оценка влияния бортезомиба на функциональную активность и экспрессию Р-гликопротеина (Pgp) в клетках K562/Í-S9 с помощью метода

антительного сдвига (UIC2-shift assay или UIC2-OAC)..............................44

IV-2.2. Влияние бортезомиба на выброс родамина 123 клетками K562/Í-S9..47 IV-3. Влияние бортезомиба на степень чувствительности родительских и

резистентных опухолевых клеток к препаратам круга МЛУ......................50

IV-4. Влияние бортезомиба на экспрессию гена MDR1 и других генов круга

МЛУ в опухолевых клетках разного гистогенеза...................................52

IV-4. 1. Базальный уровень экспрессии мРНК генов МЛУ в исследованных клетках........................................................................................52

IV-4. 2. Влияние бортезомиба на содержание мРНК генов МЛУ в

исследованных линиях.....................................................................53

IV-5. Влияние бортезомиба на количество белков множественной

лекарственной устойчивости в опухолевых клетках...............................55

IV-6. Изменения активности киназ Akt и ERK1/2 под влиянием бортезомиба

в лекарственно-устойчивых и родительских клетках..............................57

IV-7. Анализ уровня экспрессии генов MDR1 и MRP1 в опухолевых клетках при воздействии на них бортезомиба и Ly 294002 (специфического

ингибитора фосфорилированной формы Akt-киназы).............................58

IV-8. Влияние бортезомиба на фенотип МЛУ при длительном воздействии

препарата на популяции опухолевых клеток.............................................59

IV-8.1. Сравнение чувствительности к бортезомибу клеток до и после

длительного культивирования в присутствии этого препарата..................62

IV-8.2. Сравнение конститутивной экспрессии фосфорилированной формы киназы Akt в клетках до и после длительного культивирования в

присутствии бортезомиба.................................................................................64

IV-8.3. Исследование экспрессии белка Pgp и маркеров стволовых кроветворных клеток CD34 и CD38 в клетках до и после длительного

культивирования в присутствии бортезомиба.......................................65

IV-9. Роль белка YB-1 в характере ответа опухолевых клеток на

бортезомиб..................................................................................66

IV-9.1. Определение влияния бортезомиба на экспрессию мРНК гена YB-1 в

опухолевых клетках.......................................................................67

IV-9.2. Исследование влияние бортезомиба на локализацию белка YB-1 в опухолевых клетках.......................................................................68

V. Обсуждение результатов...............................................................69

VI. Выводы....................................................................................77

VII. Список литературы....................................................................79

Список сокращений

МЛУ - множественная лекарственная устойчивость

Pgp - Р-~тликопротеин

XMJI - хронический миелолейкоз

PI3K - фос-,фоинозитол--,3--'киназа

СКО - стволовые клетки опухоли

AT - антитела

ДМСО - диметилсульфоксид SDS - натрия додецилсульфат PBS - фосфорно-солевой буфер

EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота, динатриевая соль п.н. - пара нуклеотидов

I. Введение

Множественная лекарственная устойчивость опухолевых клеток (МЛУ)

9

является серьезным препятствием на пути химиотерапии злокачественных новообразований. МЛУ - это система защиты популяции опухолевых клеток одновременно от многих лекарств, различающихся по химической структуре и механизму действия на клетку [108, 33]. МЛУ - важный фактор, определяющий эволюцию популяций малигнизированных клеток. Среди известных молекулярных причин лекарственной устойчивости опухолей человека хорошо охарактеризованным на сегодняшний день механизмом является повышенная активность белка семейства ABC Р-гликопротеина (АВСВ1 или Pgp), кодируемого геном MDR1 (АВСВ1). В семейство ABC (ATP binding cassette) входит несколько других мембранных белков, имеющих отношение к МЛУ, таких как белки семейства MRP (семейство АВСС), белок BCRP (ABCG2) и др. Белок Pgp, используя энергию АТФ, транспортирует группу различающихся по структуре веществ из цитозоля и/или из плазматической мембраны во внеклеточное пространство [39]. Однако, активность транспортных белков семейства ABC может не только определять защиту популяций опухолевых клеток от лекарственных препаратов, но и способствовать дальнейшей прогрессии опухоли другим путем. Ранее в нашей лаборатории были получены данные, свидетельствующие в пользу того, что противоопухолевый препарат, ингибитор тирозинкиназ иматиниб (Gleevec), может отбирать клетки, гиперэкспрессирующие Pgp и другие ABC транспортеры. Такие клетки, возможно, являются стволовыми опухолевыми клетками [109]. Таким образом, селекция противоопухолевыми препаратами нового поколения (таргетными препаратами) клеток, гиперэкпсрессирующих ABC транспортеры, может оказаться фактором, способствующим размножению клеток, поддерживающих существование новообразования.

В настоящее время активно изучается новый класс таргетных противоопухолевых агентов, действие которых направленно на ингибирование активности протеасом, так как деградация белка в клетке является одним из важнейших процессов, связанных с её нормальным функционированием. Показано, что ингибирование активности протеасом приводит к апоптозу. Одним из наиболее известных и уже применяемых в клинике протеасомных ингибиторов для лечения множественных миелом, лимфом и некоторых других опухолей, является бортезомиб (PS-341, Velcade). Механизмы и закономерности эволюции популяций малигнизированных клеток при воздействии бортезомиба не ясны, в частности, не ясно участие ABC транспортеров в этом процессе.

Основные цели и задачи исследования

Цели данной работы: Исследование роли транспортных белков семейства ABC в эволюции злокачественных новообразований под влиянием бортезомиба и изучение молекулярных механизмов регуляции ABC транспортеров ингибиторами протеасом. В соответствии с основными целями исследования были поставлены следующие задачи:

1. Получить ответ на вопрос, транспортируют ли ABC белки бортезомиб?

Для этого сравнить чувствительность родительских клеток и клеток, гиперэкспрессирующих Pgp , к бортезомибу, оценить скорость выброса этими клетками флуоресцирующего вещества родамина 123 , а также применить метод 1ЛС2-сдвига (UIC2 shift assay), который позволяет судить как об экспрессии, так и об активности Pgp, в присутствии бортезомиба.

2. Получить ответ на вопрос, изменяется ли экспрессия и активность ABC транспортеров (Pgp, MRP 1, BCRP) при краткосрочном и длительном воздействии бортезомиба.

3. Получить ответ на вопрос, изменяется ли экспрессия маркеров опухолевых стволовых клеток при длительном воздействии бортезомиба.

4. Получить ответ на вопрос, участвуют ли сигнальный путь, контролируемый фосфоинозитол -3-киназой (PI3K), и многофункциональный белок YB-1 в характере ответа популяций опухолевых клеток на бортезомиб.

Научная новизна

Впервые было проведено систематическое исследование, которое дало ответ на вопрос, является ли бортезомиб субстратом ABC транспортера - Pgp. Впервые была исследована эволюция экспрессии и активности ABC транспортеров при длительном воздействии бортезомиба на культуры малигнизированных клеток. Впервые было показано, что при продолжительном воздействии бортезомиба в популяции клеток, гиперэкспрессирующих АБС транспортер, накапливаются варианты с повышенной активностью киназы Akt, в то время как в популяции родительских клеток это не наблюдается. Впервые было проведено исследование корреляций изменений экспрессии ABC транспортеров под влиянием бортезомиба и маркеров стволовых клеток опухолей. Впервые была исследованы изменения многофункционального белка YB-1 при ответе опухолевых клеток на бортезомиб.

II. Обзор литературы.

II. 1 Устойчивость опухолей к лекарственной терапии

Одной из важнейших причин, препятствующих успешному лечению злокачественных новообразований, является развитие устойчивости опухолей к лекарственной терапии (ЛУ). По этой причине уже несколько десятилетий исследование механизмов лекарственной устойчивости является одним из приоритетных направлений онкологии. Понимание механизмов этого явления важно ещё и потому, что те же механизмы, которые включаются в подвергаемой химическому воздействию раковой клетке, в норме играют важнейшую роль, обеспечивая защиту всего живого от вредных воздействий. По аналогии с изучением устойчивости микроорганизмов к антибиотикам, исследование лекарственной устойчивости в онкологии фокусируется на двух важных моментах: во-первых, на ЛУ, возникающей благодаря генетическим изменениям, происходящим в клетке во время опухолевой трансформации, во-вторых, на генетических изменениях, которые происходят в результате токсического воздействия химиопрепаратов на опухоль. Исследователи этого вопроса не оставили без внимания тот факт, что возникновение резистентности к одному из препаратов, часто оказывается резистентностью к препаратам различного строения и спектра действия, т.е. множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ).

II. 1.1. Механизмы множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) опухолей. Многофакторная МЛУ

В последние годы набор механизмов, которые могут определять МЛУ, значительно расширился, и картина организации защиты клетки от повреждения усложнилась. Один из главных методов выяснения механизмов МЛУ - отбор клеток, выживших в присутствии

цитотоксического препарата, и обнаружение генов и белков, измененных в таких клетках по сравнению с исходными. Некоторые исследователи выделяют три основных механизма возникновения ЛУ в клетке: первый -сниженный вход веществ в клетку; второй - изменения внутриклеточных мишеней лекарств и сигнальных путей, например, нарушения в клеточном цикле, нарушения механизмов апоптоза, изменения метаболизма самого препарата и пр.; третий - усиление выброса препаратов из клетки [36, 22].

Различные механизмы могут быть задействованы одновременно в возникновении резистентности в подвергшейся действию токсина клетке. Таким образом, речь идет не просто о МЛУ, а об многофакторной МЛУ, т.е. об МЛУ, определяемой несколькими факторами [108]. Остается неясным, связаны ли и как связаны разные защитные механизмы клетки, действующие сочетанно. Этот вопрос выступает в настоящее время на первый план.

Впервые устойчивость к лекарствам была описана в 1950 году, для клеток лейкоза мыши, резистентных к 4амино-Ш0-метил-птероглютаминовой кислоте [13]. В 70-ые годы прошлого столетия К. Dano описал активное выведение дауномицина клетками, обладающими резистентностью и к другим антрациклинам, а также к винка-алкалоидам [22]. Продолжая работу Dano, другая группа учёных показала, что фенотип МЛУ определяется повышенной экспрессией на клеточной мембране белка с молекулярной массой 170 kDa, названного Р-гликопротеином [43]. Затем был клонирован ген MDR1, кодирующий Pgp [91]. За последние 30 лет стало понятно, что некоторые представители семейства белков АТФ-зависимых транспортеров (ATP-binding cassette (ABC) transporters), такие как Р-гликопротеин (по новой терминологии - АВСВ1), являются важнейшими факторами, определяющими МЛУ. Поэтому, исследуя механизмы МЛУ в том или ином конкретном случае, имеет смысл начинать с изучения именно ABC транспортеров, которые широко экспрессированы в нормальных тканях и в

опухолях и их способность формировать лекарственную устойчивость не вызывает сомнения [54].

II. 1.2. Основные транспортеры семейства ABC

Наиболее широко охарактеризованными АВС-транспортерами являются такие белки как: Р-гликопротеин (также известный как MDR1 или АВСВ1), MRP1 (по новой терминологии АВСС1) и BCRP (также известный как MXR, по новой терминологии ABCG2). Открытия Pgp и белка MRP 1 стали крупным прорывом в понимании механизмов МЛУ, что побудило к исследованию многочисленных белков с соответствующей структурой и аналогичными транспортными функциями. В целом, семейство ABC у человека включает 49 генов и состоит из 7-ми подсемейств [44, 26]. Отнесение белка к тому или другому подсемейству зависит от его доменной организации - числа и сочетания трансмембранных (TMD) и АТФ-связывающих доменов (ABC домены). ABC домены всех белков данного семейства сходны (они имеют 30-40% гомологии, независимо от субстратной специфичности транспортеров, которая весьма различается) [44, 26].

Семейство АБС - эволюционно консервативно и представлено практически у всех живых организмов - от прокариот до млекопитающих [39]. Многие АБС транспортеры имеют сходный набор TMD и ABC доменов и состоят как из двух частей, каждая из которых может включать шесть трансмембранных спиралей и два нуклеотид - связывающих домена (Pgp, MRP1), так и состоять из одной части (BCRP) [44].

MDR1 MXR

Рисунок 1. Схема строения белков множественной лекарственной устойчивости Р-гликопротеина (Pgp; MDR1; АВСВ1) и BCRP (ABCG2; MXR). 1 - домены содержащие трансмембранные участки (обозначены прямоугольниками); 2 - АТФ-связывающие домены (обведены овалом); 3 - фрагмент мембраны. (Ставровская, 2000 [108])

Основные транспортеры, ответственные за МЛУ - Pgp (АВСВ1 ), MRP 1 (АВСС1) и BCRP (ABCG2) [26] - связывают самые разнообразные субстраты, включающие органические анионы и неанионные компоненты, химиотерапевтические препараты, иные лекарственные препараты (например, некоторые лекарства используемые в кардиологии и неврологии), многие флуоресцентные красители, а также другие вещества (например бромистый этидий) [3]. Сходство структурной организации трансп