Автореферат и диссертация по медицине (14.00.06) на тему:Некоторые молекулярные и клеточно-тканевые характеристики патогенеза артериальной гипертензии: особенности наследования и клеточной энергетики (экспериментальное исследование)

Актуальность темыГипертоническая болезнь (первичная или эссенциальная гипертензия) остается крупнейшей нерешенной медицинской и, одновременно, социальной проблемой. Главное проявление болезни - "беспричинное" стойкое повышение артериального давления - опасное постепенной инвалидизацией и тяжелыми осложнениями в виде нарушения мозгового кровообращения, мозговых кровоизлияний, развития инфаркта миокарда, сердечной или почечной недостаточности. Смертность от сердечно-сосудистой патологии, причинно связанной с гипертензией, превышает все остальные причины смерти населения.

Большая частота первичной гипертензии среди населения, достигающая 15% и более всей популяции, предполагает действие какого-то мощного средового фактора, как одной из главных составляющих ее этиологии. К таким факторам относят хроническую нервно-психическую перегрузку, другие неблагоприятные воздействия внешней среды, повидимому, еще не полностью распознанные.

В то же время первичная (эссенциальная) гипертензия имеет выраженные признаки генетически детерминированного заболевания. У человека, в отличие от существующих моделей гипертензии, наследуется не заболевание в целом, а лишь предрасположенность к болезни. Эта предрасположенность реализуется в течение жизни человека под влиянием неблагоприятных факторов среды.

Несмотря на прогресс в биологии и медицине, до последнего времени не сформировалось единого представления о патогенезе первичной гипертензии, в то же время нет решающих данных и в отношении выяснения ее генетических основ. Обе категории явлений имеют очевидную связь, т.к. успешный поиск генетических детерминант во многом определяется схемой патогенеза, которая адекватно отражает природу этой патологии. Изучение этиологии и патогенеза на экспериментальных моделях первичной гипертензии позволяет нам глубже понять как механизмы наследования, так и патогенетические особенности развития гипертонии.

Спонтанная генетически детерминированная гипертензия крыс как модель эссенциальной гипертензии человека.

Использованная в настоящем исследовании модель первичной (эссенциальной) гипертензии - спонтанная гипертензия крыс линии Okamoto-Aoki (spontaneous hypertension of rats, SHR) с достаточным основанием признана большинством исследователей наиболее близкой моделью этой формы патологии человека, повторяющей основные патогенетические характеристики и особенности своего клинического прототипа [Okamoto 1963, Yamori 1983]. Наибольшее сходство между этими формами гипертензии проявляется в следующих чертах, подтверждающих состоятельность этой модели:1. Обе формы развиваются на основе врожденной предрасположенности к гипертензии, проявляя неменделевский тип наследования. В случае спонтанной гипертензии крыс, механизм наследования, как и наследуемый признак, усилены инбридингом, и гипертензия передается потомству с частотой в 100%.

2. Обе формы первичной гипертензии в своем развитии обнаруживают четкую связь с определенной фазой жизненного цикла, проявляясь у людей на 3-4 десятилетии, а у крыс, соответственно, на 5-6-й неделе жизни. Обе формы характеризуются медленным прогрессирующим течением, давая в финале сердечную или почечную недостаточность или развитие мозгового инсульта.

3. Обе формы гипертензии обнаруживают слабую зависимость от натрия хлорида (NaCI) в диете.

4. В обоих случаях выявляется вовлеченность в патогенетический механизм неврогенных механизмов и отсутствие стабильных проявлений повышенной активности ренин-ангиотензиновой системы.

5. Отмечены однотипные отклонения в структуре и ионтранспортной функции клеточных мембран. Эти изменения и при эссенциальной гипертен-зии и у крыс со спонтанной гипертензией носят распространенный характер, проявляясь в недостаточности мембранной регуляции свободного ци-топлазматического кальция и появлением его избытка в цитозоле и накоплением кальция в митохондриях [Постнов 1987].

6. Для обеих форм гипертензии характерно наличие распространенного в тканях сокращения артериол и капиляров, увеличения отношения толщины сосудистой стенки к просвету артерий, концентрической гипертрофии левого желудочка сердца и ресетинга барорецепторов артерий с гипер-тофией каротидных телец.

7. Обе формы гипертензии отвечают гипотензивным эффектом на применение кальциевых антагонистов, блокаторов адренергических рецепторов, ингибиторов ангиотензин превращающего фермента и диуретиков - т.е. лекарственных средств, нормализующих (на период их применения) кальциевый баланс в клетках тканей организма с первичной гипертензией.

Линия крыс со спонтанной гипертензией (SHR), поддерживаемая инбридингом и образовавшая изолированную колонию, содержащуюся в настоящее время в особом виварном помещении РКНПК МЗ РФ, была завезена из Монреальского института клинических исследований (Clinical Research Institute of Montreal, Canada) в 1973 году. Животные были прямыми потомками SHR, выведенных K.Okamoto и K.Aoki в Японии (Киото) в конце 50-х - начале 60-х гг. Со времени переселения в нашу страну линия дала более 44 поколения. За время воспроизведения линия полностью сохранила экстерьерные признаки, плодовитость и проявления гипертензии по срокамвозникновения, высоте АД, морфометрическим и гистологическим данным (почки, надпочечники, сердце, головной мозг).

Нормотензивные крысы линии Вистар (Normotensive Wistar-Kyoto (WKY), составляющие контроль для SHR, были получены в 1974 г. из г. Киото (Япония) от профессора Y. Yamori, и любезно переданы в лабораторный виварий проф. Х.М. Марковым (Институт педиатрии РАМН). Линия контрольных животных поддерживалась инбридингом по той же схеме, что и SHR, и содержалась в одинаковых с ними условиях. На протяжении всего времени содержания линии WKY (40 поколений) животные полностью сохранили присущие им признаки и характерный для данной линии уровень артериального давления (70-120 мм рт.ст.)Цель исследования.

Целью исследования является прояснение молекулярных основ патогенеза артериальной гипертензии на экспериментальных моделях первичной и вторичной гипертензии.

Задачи исследования.

1. Изучить состояние энергетических систем клетки при экспериментальных моделях первичной и вторичной гипертензии (у крыс со спонтанной гипертонией линии SHR, у крыс с ДОКА -солевой гипертонией, у крыс с гипертиреоидной гипертонией и у крыс с циклоспорин-А индуцированной гипертензией).

2. Оценить функциональное состояние митохондриального аппарата клеток в отношении синтеза АТФ при спонтанной гипертензии крыс и различных экспериментальных моделях артериальной гипертонии.

3. Изучить влияние кальция на энергетический гомеостаз клетки и функциональное состояние митохондрий.

4. Прояснить роль нарушений энергетического обеспечения клетки в патогенезе первичной гипертензии.

5. Изучить особенности наследования ряда биохимических и физиологических фенотипических характеристик у крыс-гибридов первого и второго поколения, полученных от скрещивания спонтанно-гипертензивных крыс линии SHR с нормотензивными крысами линии WKY.

6. Изучить распределение умеренного ID повтора у крыс со спонтанной гипертонией и его ассоциацию с проявлениями гипертензивного фенотипа у гибридов второго поколения.

Основные результаты исследования и научная новизна полученных данных.

Впервые описано наличие недостаточности энергетического обеспечения клеток и тканей, связанное с уменьшением скорости синтеза АТФ митохондриями. Показано, что данное нарушение обусловлено кальциевой перегрузкой митохонрий и/или с развивающимся повреждением шРТ каналов ми-тохондриальной мембраны.

В исследовании впервые показано наличие особенностей в распределение умеренного ID повтора в геномной ДНК, которое ассоциировано с целым рядом физиологического и биохимического фенотипа у гибридов второго поколения, в частности с артериальным давлением, уровнем экспрессии цито-скелетных белков мембраны эритроцита и т.д. Показано, что уровень артериального давления и гипертрофия миокарда у крыс-гибридов второго поколения наследуются независимо, что позволило начать выведение новой ин-бредной линии без давления, но с гипертрофией миокарда.

Практическая значимость.

Полученные данные вносят новое знание в понимании патогенеза гипертонии. Результаты открывают новые механизмы, задействованные в повышении и поддержании артериального давления при спонтанной (первичной) и вторичных системных гипертензиях. В результате формируется новое понимание гипертонии как болезни недостатка энергии, что со временем может привести к созданию нового класса гипотензивных препаратов.

Положения выносимые на защиту.• У крыс со спонтанной гипертензией линии SHR имеет место мембранный дефект, одним из проявлений которого является количественное отклонение от нормы содержания ряда периферических и интегральных мембранных белков эритроцитов который наследуется у крыс гибридов второго поколения вместе с уровнем артериального давления.• Возможной геномной основой развития спонтанной артериальной ги-пертензии у крыс является перераспределение в геноме умеренного ID повтора.• Спонтанная (первичная) гипертензия крыс (SHR) сопровождается нарушением энергетического статуса клеток, заключаемого в неком дефиците энергии, запасаемой в АТФ.• Дефицит энергии связан с подавлением АТФ-синтетической функции митохондрий, в случае спонтанной гипертензии, за счет нарушений регуляции митохондриального транспорта свободного (ионизированного) кальция.

ОСОБЕННОСТИ НАСЛЕДОВАНИЯ У КРЫС SHR НЕКОТОРЫХ ХАРАКТЕРИСТИК ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ.

Мембранная концепция первичной (эссенциальной) гипертензии человека была сформулирована в середине 70 - начале 80 годов [Постнов 1987]. Тем не менее, вопрос о роли нарушений функции клеточных мембран и их значении в этиологии и патогенезе первичной артериальной гипертензии остается актуальным, и исследования в этом направлении продолжаются.

Ряд авторов считает, что при первичной гипертензии нарушения в геноме относятся к тем его участкам, которые контролируют структурное состояние мембран. Приводятся данные, свидетельствующие о том, что нарушения структурной организации мембран при первичной гипертензии вызваны, скорее всего, изменениями ее белкового состава [Постнов 1987, Иванов 2004].

Синтез белковых компонентов мембраны находится под прямым или опосредованным генетическим контролем [Rapp 1983]. Отклонения в структуре и функции клеточных мембран при первичной гипертензии обусловлены, по-видимому, изменениями в геноме, что позволяет использовать их в качестве показателей, предположительно коррелирующих с синдромом повышенного артериального давления. Такой подход демонстрирует важность изучения экспрессии цитоскелетных белков и последующего определения их роли в патогенезе гипертензии.

Для конкретизации возможных отклонений в структурной организации мембран при первичной гипертензии был проведен сравнительный анализ количественных характеристик белков мембраны эритроцитов у крыс со спонтанной гипертензией (SHR) и у крыс линии WKY с нормальным артериальным давлением, а также у крыс первого и второго поколения, полученных от скрещивания вышеуказанных линий — Fj F2 (SHR х WKY).

Успехи молекулярной биологии дали возможность выявить причины многих наследственных заболеваний, связав их с мутациями в уникальных генов. Однако, для такого распространенного заболевания, как эссенциальная гипертония, этого до сих пор сделать не удалось, несмотря на то, что значительная роль фактора наследственности является общепризнанной, найти ген, ответственный за данное заболевание. Кроме того, высокий процент (до 30%) больных среди населения говорит о том, что в возникновении этого заболевания велика роль внешних факторов, при воздействии которых может проявиться наследственная предрасположенность. Согласно гипотезе, высказываемой в этой работе, причиной эссенциальной гипертонии может быть динамическая мутация, представляющая собой прогрессирующую амплификацию в геноме тандемных олигонуклеотидных повторов, в результате которой нарушается функционирование отдельных генов [Бебихов 1997]. В связис этим, по-прежнему значимыми являются исследования, посвященные изучению характера наследования признаков, которые считаются маркерами эс-сенциальной гипертензии. Их последующий анализ может помочь конкретизировать картину изменений в геноме, вызываемых динамической мутацией.

Известно, что одним из маркеров эссенциальной гипертони является повышенная активность Са" -зависимых К -каналов [Покудин 1989]. Другой характеристикой, характерной для спонтанной и эссенциальной гипертензии, является наличие нарушений в экспрессии белков цитоскелета клетки. Далее приводятся данные по изучению характера наследования этих признаков в Р2-гибридах крыс (SHRxWKY).

Животные. В работе использовали 40 самцов и 42 самки крыс второго поколения, полученного в результате скрещивания животных со спонтанной гипертензией (SHR) и нормотензивного контроля (WKY). Скрещивание проводилось по схеме (самец WKY х самка SHR). Две особи первого поколения (брат-сестра) определялись как родительская пара следующего. Потомство этих пар составило изучаемую популяцию F2. В качестве контрольной группы были взяты самцы и самки крыс линии со спонтанной гипертензией (SHR) и линии с нормальным давлением (WKY).

Регистрацию артериального давления проводили с помощью имплантированного в брюшную аорту катетера, соединенного с электроманометром СР-01, используя систему компьютерной регистрации параметров гемодинамики "Bioshell".

Подготовка проб теней к электрофорезу. Для приготовления пробы растворяли 1 мг сухих теней эритроцитов в 40 мкл уравновешивающего буфера следующего состава (в расчете на 10 мл):1. 3 г мочевины;2. 0,2 г ДСН;3. 1,25 мл раствора 3;4. 0,5 мл меркаптоэтанола;5. 5 мкл красителя бромфенилового синего.

Одномерный электрофорез по Леммли. Электрофорез в присутствии ДСН проводили по методу Laemmli U. К. [Гааль 1982]. Для этой цели использовали следующие растворы:1. 60% раствор акриламида, 0,8% - N, N'-метилен-бисакриламида;2. буфер для разделяющего геля: 1 М трис - НС1 (рН=8,8);3. буфер для концентрирующего геля: 0,5 М трис - НС1 (рН=6,8);4. 10% раствор ДСН;5. 10% раствор персульфат аммония;6. ТЕМЕД;7. Электродный буфер для электрофореза: 0,025 М трис, 0,193 М глицин, 0,1% ДСН (рН=8,3).

Раствор персульфат аммония готовили непосредственно перед употреблением, электродный буфер использовали не более 3 раз. Электрофорез проводили в пластинах ПААГ размером 160x160x1 мм, приготовленных с линейным градиентом концентрации акриламида 5-25%. Формирователь пластин ПААГ состоял из двух стекол размером 180x180x3 мм, между которыми находились смазанные силиконом текстолитовые прокладки толщиной 1 мм.

Приготовление полимеризующих смесей, необходимых для получения одной пластины ПААГ, проводили по следующей схеме:5% смесь - 0,85 мл (раствор 1), 3,6 мл (2), 0,101 мл (4), 0,02 мл (5), 0,005 мл (6) и 5,5 мл дистиллированной воды;25% смесь - 4,2 мл (раствор 1), 3,6 мл (2), 0,101 мл (4), 0,02 мл (5), 0,005 мл (6) и 2,6 мл дистиллированной воды. Через смеситель растворы подавались перестальтическим насосом в формирователь пластины в течение 10 минут, заполняя его на 4 см ниже верхнего края. Сверху на полимеризующую смесь наслаивали 0,5 мл воды. Полимеризация продолжалась 30-40 минут, после чего воду удаляли.

Для приготовления концентрирующего геля объемом 10 мл брали 0,66 мл (раствор 1), 2,5 мл (3), 0,1 мл (4), 0,07 мл (5), 0,004 (6) и 6 мл дистиллированной воды. Вставляли формирователь лунок и наслаивали небольшое количество воды. Полимеризация длилась 20-30 минут.

Пластина ПААГ перед электрофорезом стабилизировалась в течение 24 часов. Для уравновешивания ячеек ПААГ проводили префорез в режиме 25 мА, 30 минут. Электрофорез проводили при силе тока 35 мА при нарастании напряжения до 300 В до входа проб в разделяющий гель, затем стабилизировали питание по напряжению и заканчивали при достижении лидирующим красителем 1 см до края пластины геля.

Окрашивание белков мембран эритроцитов на электрофореграммах кумасси R-250. Белки окрашивали кумасси голубым R-250 по модифицированной методике Fairbanks [Fairbanks 1971] в течение часа, в растворе, содержащем 10% уксусной кислоты, 25% изопропанола, 0,05% кумасси голубого R-250. Не связавшуюся краску отмывали 12 часов 10% уксусной кислотой до полного исчезновения фонового окрашивания.

Отмытые фореграммы затем дегидрировали в течение 30 минут в растворе, содержащем 280 мл изопропанола, 25 мл глицерина и 195 мл дистиллированной воды. После этого пластины ПААГ плотно фиксировали между двумя слоями целлюлозной бумаги и в натянутом состоянии высушивали 24 часа при комнатной температуре.

Денситометрирование одномерных электрофореграмм. Денситомет-рирование одномерных электрофореграмм проводили на лазерном денситометре "Ultroscan XL" фирмы LKB (Швеция). Встроенным в прибор интегратором рассчитывали площади (в мм") под пиками на денситограммах. Идентификацию мембранных белков осуществляли согласно классификации Steck - Hest - Fairbanks [Fairbanks 1971, Hest 1982] (таблица 1). Молекулярную массу белковых фракций определяли с помощью маркерных белков: бычьего сывороточного альбумина (Mr=68 kD), овальбумина (Mr=43 kD), химотрип-синогена (Mr=68 kD), миоглобина (Mr=17,5 kD) и цитохрома С (Mr=12,4 kD).

Полученные значения пересчитывали на 1 мг общего белка в исследуемом образце сухих мембран эритроцитов, исключая гемоглобин.

Основные мембранные белки эритроцитов крыс со спонтанной гипертензией линии SHR и крыс нормотензивного контроля линии WKY и их сравнительный анализ.

Количественное содержание белков мембран эритроцитов крыс линии SHR в сравнении с контрольной линией WKY. В рамках настоящего исследования было проведено изучение количественной представительности основных мембранных белков эритроцитов у крыс чистой линии SHR со спонтанной генетически обусловленной гипертензией и у крыс контрольной линии WKY. Полученные результаты количественных показателей белков мембран эритроцитов этих групп в сравнении представлены в таблице 2.

Из нее видно, что наиболее представительными в мембранах крыс линии SHR являются белки полос 1, 2, 3 и 4.2. Второе место занимает содержание белков полос 2.1, 4.5 и 5. Слабо представленными оказались белки полос 4.1, 4.9, 6, 7 и 8. Наименьшим содержанием отличался минорный белок полосы 4.9. В мембранах контрольной линии сохраняется аналогичное рейтинговое распределение содержания основных белковых фракций. ПолученныеТаблица 1. Классификация основных белков мембран эритроцитов крыс по Steck Т., Hest С., Fairbanks G.

Фракции белков Частное название белка Мол. масса (Mr/kD) Число копий на клетку Хромосомная локализация1 спектрин (а-цепь) 240-260 200 000 lq242 спектрин (Р-цепь) 220-225 200 000 14А2.1 анкирин 200-215 100 000 8р13 анионтранспортный 90-100 1 000 000 17q21белок 4.1а белок 4.1а 80 100 000 1р36.24.16 белок 4.16 78 100 000 1р344.2 паллидин 72-76 200 000 4.5 белок 4.5 55 1рЗ4.9 белок 4.9 48 50 000 7А5 актин 42-43 500 000 7А6 глицеральдегид-3- 35 500 000 12р13.31фосфатдегидрогеназа 7 тропомиозин 27-29 500 000 lq31-418 глутатион-S- 19-23 100 000 1р31трансфераза данные согласуются с функциональной нагрузкой белков в мембране и не противоречат сведениям, имеющимся в литературе [Горбунов 1993, Горбунова 1997]Результаты сравнительного анализа стандартных статистик количественного содержания совокупности мембранных белков представлены в таблице 2. Из нее видно, что мембраны эритроцитов крыс этих линий различаются по 6 фракциям основных белков. В гипертензивной выборке в сравнении с контролем имеет место увеличение содержания а-спектрина и егосуммарной фракции и снижение количества белков полос 3, 4.16, суммарного 4.1, 4.2. Наблюдаемые различия носили достоверный характер.

Значения дисперсий свидетельствуют о выраженной межиндивидуальной вариабельности количественного содержания большинства белковых фракций как у крыс SHR, так и в контрольной линии WKY. Дисперсии показателей белки мембран эритроцитов в этих выборках достоверно различались по белкам 4.1а, 4.16, 4.5 и 6, при этом гетерогенность количественного содержания белков полос 4.1а и 6 выше у гипертензивных животных, вариабельность количества белков 4.16 и 4.5 значительнее у нормотензивных.

Таким образом, проведенное исследование содержания белки мембран эритроцитов в группах крыс с моделью спонтанной гипертонии и нормотензивных крыс позволило оценить количественную их представительность. Можно признать доказанным, что БСМЭ крыс линии SHR в сравнении с линией WKY характеризуется изменением количественного содержания целого ряда периферических и интегральных белков с молекулярной массой от 70 до 260 kD. В то же время выявленные различия в количественных характеристиках белков не отражают структуру количественных взаимосвязей рассматриваемых совокупностей. Необходимость получения интегральных сведений о БСМЭ исследуемых линий послужила причиной включения в анализ приемов многомерной статистики.

Характеристика белкового спектра мембран эритроцитов крыс-гибридов F^ в сравнении с инициальными линиями.

Особенности количественной представительности белкового спектра мембран эритроцитов крыс Fj интеркросса WKYxSHR.

Из таблиц 1, 2, 3, 4 видно, что общая рейтинговая система количественной представительности отдельных белковых фракций крыс F] в сравнении с инициальными кроссами не изменена: наиболее представительными белками остаются белки полос 1, 2, 3 и 4.2, наименьшим содержанием характеризуется белок полосы 4.9.

В работе установлены отличия в количественном составе БСМЭ крыс Fi от нормотензивного контроля: имело место увеличение содержания белка 4.9 и снижение количества белков полос 3, 4.1а, 4.16 и суммарного 4.1. При этом в количественном содержании белков полос 3, 4.1а, 4.1 нами отмечены различия в мембранах чистых линий, а изменение содержания белков полос 4.16, 4.9 и 7 включается в совокупность мембранных нарушений только в Fj.

Значение дисперсии свидетельствует о выраженной межиндивидуальной вариабельности количественного содержания большинства белковых фракций у крыс Fi. Наименьшей гетерогенностью характеризуются белки полос 4.16 и 4.9 (таблица 3). Причем сравнительный анализ дисперсий БСМЭ линии WKY и крыс Fj показал наличие достоверного уменьшения вариабельности по белкам полос 3, 4.16, суммарной 4.1, 4.2, 5, 8, что может свидетельствовать о снижении гетерогенности основных белки мембран эритроцитов исследуемой выборки.

Из таблицы 4 следует, что у крыс Fj в сравнении с крысами линии SHR имело место увеличение содержания белка полосы 4.2. По остальным фракциям белков различий не наблюдалось.

Значения дисперсий количественных характеристик белки мембран эритроцитов крыс Fj достоверно отличаются от дисперсий гипертензивных крыс по фракциям 2, 2.1, 4.1а, суммарной 4.1, 4.2, 5, 6, 8. Межиндивидуальная вариабельность количественного содержания данных белков у гибридов F1 менее выражена.

Количественная представительность белков мембран эритроцитов крыс-гибридов второго поколения F?.

Изменение содержания белков мембран эритроцитов в F2 в сравнении с предыдущими поколениями интеркросса.

С целью установления изменений количественного содержания БСМЭ на различных этапах интеркросса были рассмотрены особенности количественной представительности основных белки мембран эритроцитов крыс-гибридов F2 интеркросса и проведен их сравнительный анализ с аналогичными показателями предыдущих поколений интеркросса линий WKY и SHR. Результаты анализа представлены в таблицах 5, 6, 7.

Из таблицы 5 видно, что БСМЭ крыс F2 отличается от спектра линии WKY по 3 фракциям белков. Отмечено уменьшение количества белка полосы 4.1а и суммарной фракции 4.1 и увеличение содержания белка 4.9 в F2. При этом изменения содержания фракции 4.9 не отмечено при сравнении чистых линий между собой.

Значения дисперсий демонстрируют выраженную межиндивидуальную вариабельность количественных характеристик белки мембран эритроцитов гибридов F2. При этом гетерогенность фракций суммарной 4.1, 4.2 и 4.5 в F2 по сравнению с контролем снижена, фракций 2.1 и 8 повышена.

Особенности сонаследования экспрессии белков мембран эритроцитов и гемодинамических параметров у гибридов второго поколения.

Количественные изменения в экспрессии структурных белков мембраны эритроцитов в большей степени, по-видимому, обусловлены геномными причинами. Как известно, во втором поколении интеркросса ин-бредных линий происходит расщепление признаков. Корреляция уровня артериального давления и экспрессии конкретных мембранных белков позволяет сузить круг генов-кандидатов, возможно определяющих нарушение мембранных функций при первичной гипертензии.

В работе выявлены корреляции содержания белков с уровнем АД у гибридов F2 по а и (3 спектрину, белкам полос 4.1 а, 4.2, 4.5, тропомиозину. Данные представлены в рисунках 1 -4.

Статистический анализ исследуемых показателей проводился с учетом групповых различий особей по полу. Значения коэффициентов корреляции женской и мужской популяции гибридов F2 по (3 спектрину достоверны и соответственно равны 0,31 и -0,44 (р<0,05) (рис. 1).

В общей группе разнонаправленные показатели компенсируют друг друга, что приводит к уменьшению величины коэффициента (R=0,012). Аналогичная картина наблюдается по результатам анализа белка полосы 4.1 а (рис. 2), при этом изменяется знаковая принадлежность коэффициентов (R=-0,46 - для самок и 0,38 — для самцов). Для белка полосы 4.5 характерна отрицательная корреляция между количеством белка и показателем САД, с величиной R=-0,47 в выборке самок (при чем р<0,001) и R=-0,31 в общей популяции F2 (р<0,01) (рис. 3). Представляет интерес тот факт, что сравнение содержания белков и диастолического АД демонстрирует идентичный результат корреляций по белку полосы 4.5 (рис. 4), при чем коэффициент корреляции для самок -0,47, для всего поколения -0,31. В группе самцов обе субъединицы спектрина коррелируют с диастолическим АД. Аналогичные результаты обнаруживают белок полосы 4.1 а и тропомиозин, при этом коэффициенты корреляции равны 0,39 и 0,42, соответственно. В силу того, что СрАД — показатель усредненный и в большей степени функционально независим, достоверность корреляций часто снижается. Однако анализ значений СрАД и количественных характеристик мембранных белков обнаруживает устойчивые знаковые значения корреляций в мужской и женской популяциях по тем же фракциям, что и в случае с САД и ДАД.

Полученные данные могут свидетельствовать о генетическом детерминировании изменений выше перечисленных белков и возможном их участии в развитии мембранных нарушений и феномена гипертензии в целом. Несмотря на то, что кодирующие гены белков находятся в соматических хромосомах, появление противоположных корреляций в содержании ряда белков с АД по полу указывает на возможное влияние X или Y хромосомы на уровень их экспрессии.

Рисунок 4. Графическое изображение корреляций между содержанием белка полосы 4.5 и уровнем диастолического артериального давления для популяции F2 : А - самки, R=-0,47, р<0.001; Б - популяция в целом, R=-0.31, р<0.01Хотя и не обнаружены значимые различия в уровне экспрессии белка полосы 4.5 (глюкозо-транспортный белок) в эритроцитах материнских линий, высокая степень корреляций с давлением у крыс F2 может указывать на его причастность к факторам, определяющим развитие спонтанной гипертензии крыс.

Изучение характера наследования повышенной активности Са2+-зависимых К+ каналов в F? гибридах крыс (SHRxWKY).

Успехи молекулярной биологии дали возможность выявить причины многих наследственных заболеваний, связав их с мутациями в уникальных генах. Однако для такого распространенного заболевания, как эссенциальная гипертония, этого до сих пор сделать не удалось. Несмотря на то, что значительная роль фактора наследственности является общепризнанной, не найден ген, ответственный за данное заболевание. Кроме того, высокий процент (до 30%) больных среди населения говорит о том, что в возникновении этого заболевания велика роль внешних факторов, при воздействии которых может проявиться наследственная предрасположенность. Согласно одной из гипотез, предлагающей объяснение полученным фактам, причиной эссенциаль-ной гипертонии может быть динамическая мутация, представляющая собой прогрессирующую амплификацию в геноме тандемных олигонуклеотидных повторов, в результате которой нарушается функционирование отдельных генов. В связи с этим по-прежнему значимыми являются исследования, посвященные изучению характера наследования признаков, которые считаются маркерами эссенциальной гипертензии. Их последующий анализ может помочь конкретизировать картину изменений в геноме, вызываемых «динамической мутацией» (см. ниже).

Известно, что одним из маркеров эссенциальной гипертони является повышенная активность Са -зависимых К -каналов. Глава посвящена изучению характера наследования это признака в Р2-гибридах крыс (SHRxWKY).

Предположив, что повышенная активность Са2+-зависимых К+-каналов при спонтанной гипертензии у крыс генетически детерминирована, мы измеряли эту величину у потомков второго поколения крыс (SHRxWKY) и определили коэффициенты корреляции между активностью Са" -зависимых К каналов и величиной систолического и диастолического давления в смешанной группе F2 гибридов (SHRxWKY). Показано (рис. 5), что в обеих случаях величина активности Са2+-зависимых К+-каналов практически не корррели-рует с давлением (г=0.076 для систолического давления и г=-0.01 для диастолического давления в исследуемой группе).

Известно, что у мужчин и женщин, больных гипертонической болезнью, при наличии общей тенденции отклонения от нормы, наблюдаются между собой достоверные различия ряда характеристик ионтранспортной функции клеточной мембраны, поэтому мы разделили нашу группу по половому признаку и исследовали характер зависимости между активностью Са2+-зависимых К+-каналов и систолическим и диастолическим давлением в группах самцов и самок F2 гибридов крыс (SHRxWKY). Показано, что в обеих группах активность Са2+-зависимых К+-каналов коррелирует с давлением, корреляция является значимой, однако коэффициенты корреляции имеют противоположные знаки (рис. 6, 7). Так, например, коэффициент корреляции между активностью Са -зависимых К -каналов и диастолическим давлением у самцов равен 0.37, а у самок -0.44.

О-)- -fМы определили активность Са" -зависимых К -каналов в группах самцов и самок крыс со спонтанной гипертензией и нормотензивного контроля, из которых были взяты животные для скрещивания. Как видно из рисунка 8, различий в активности Са2+-зависимых К+-каналов между самцами и самками внутри группы нормотензивных или спонтанно гипертензивных животных не наблюдается, хотя различия между группами прослеживаются четко. Распределение значений активности Са -зависимых К -каналов у F2 гибридов в зависимости от пола и давления представлено в таблице 8. Из таблицы видно, что среднее значение активности каналов по всей группе животных F2 довольно высокое и приближается по величине к активности К-каналов у спонтанно гипертензивных крыс. В группе с нормальным давлением только у самцов F2 активность Са2+-зависимых К+-каналов не отличалась достоверноот нормотензивного контроля (WKY). В группе F2 с высоким давлением ак9-f- -fтивность Са -зависимых К -каналов по величине была близка к значениям, полученным для SHR, причем у самок эта величина была достоверно ниже, чем у самцов (см. также рис.5).

Таблица 8. Половые особенности активности Са -зависимых К -каналов эритроцитов у гибридов виторого поколенияГруппа Давление Активность каналов Активность каналовСист/диаст Самцы F2 Самки F2мм.рт.ст. Группа 1 163/103 18,9 ± 1,6 20,0+1,4Все животные п=40 п=42F2 Группа 2 Выше 165/105 21,5+3,4 ** 17,5+4.6 **С высоким дав- п=20 п=14лением Группа 3 Ниже 150/95 15,4+ 4,0 ** п=7 20,4+1,9 ** п=8С нормальным давлением ** - р<0.05В начале 80-х годов была предложена классическая схема определения генов, вовлеченных в патогенез эссециальной гипертензии, которой до настоящего момента придерживается большинство исследователей. Обязательным этапом в таких работах должно быть не только обоснование биохимической связи между найденным признаком и повышенным давлением, но и изучение наследования найденного признака и подтверждение его косегрега-ции с давлением у потомков второго поколения. Ранее было показано, что повышенная активность Са2+-зависимых К+-каналов у крыс со спонтанной гипертензией является характеристикой нескольких типов клеток, и исходя из этого можно предположить, что она может быть генетически детерминирована. Хотя мы не исследовали сам ген, кодирующий белок, нам представлялось интересным изучить характер наследования этого признака у потомков второго поколения крыс (SHRxWKY).

120 130 140 150 160 170 180 190 200 210Сист. давление, мм.рт.ст.—175 85 95 105 115 125 135Рисунок 5. Корреляционная зависимость между активностью Са -зависимых К+-каналов и систолическим (а) и диастолическим давлением (б) у потомков второго поколения крыс (SHRxWKY).(а) - R=0.076, р<0.49, N=82;(б) - R=-0.01, р<0.92, N=82.

130 140 150 160 170 180 190 200 210Сист. давление, мм.рт.ст.130 140 150 160 170 180 190 200Рисунок 6. Корреляционная зависимость между активностью Са2+-зависимых К+-каналов и систолическим давлением у самцов (а) и самок (б) потомков второго поколения крыс (SHRxWKY).(а) - R= 0.45, р<0.002, N=42;(б) - R=-0.37, р<0.02, N=40.

Диастол.давление мм.рт.ст.

Рисунок 7. Корреляционная зависимость между активностью Са -зависимых К+-каналов и диастолическим давлением у самцов (а) и самок (б) потомков второго поколения крыс (SHRxWKY).(а) - R=0.37, р<0.01, N=42;(б) - R=-0.44, р<0.005, N=40.рс 0.01 Р< 0.01 SHR WKYРисунок 8. Активность Ca^ -зависимых К -каналов у самцов и самок крыс SHR и WKY.- самки,□ - самцыРисунок 9. Активность Са2+-зависимых Г-каналов у самцов и самок F2 гибридов крыс (SHRxWKY), имеющих систолическое давление выше 165мм.рт.ст. I - самки, I | - самцыСчитается, что Са2-зависимые К+-каналы вносят основной вклад в процесс вазорелаксации гладких мышц после воздействия вазоконстриктор-ных гормонов, поскольку большинство гладкомышечных клеток не генерируют потенциал действия, достаточный для активации потенциалзависимых К"-каналов, Индуцируемая вазоконстрикторными гормонами деполяризация плазматической мембраны и повышение концентрации цитоплазматического кальция активирует Са2 -зависимых К+-каналы и вызывает выход калия изцитоплазмы, нейтрализующий процессы вазоконстрикции и деполяризации и возвращающий значение мембранного потенциала к базальному уровню.

Ранее показано, что активность Са -зависимых К каналов в тромбоцитах, культивируемых гладкомышечных клетках и эритроцитах SHR повышена по сравнению с нормотензивным контролем (WKY) [Афанасьева 1999]. При этом выявленная активация каналов при гипертонии не обусловлена свойствами рецепторов, поскольку различия сохранялись при действии на клетки агентов, повышающих кальций нерецепторным путем. По данным England в гладкомышечных клетках спонтанногипертензивных крыс усиление калиевого тока через плазматическую мембрану связано с повышенной чувствительностью этих каналов к кальцию [England 1986]. Возможно, повышенная активность Са2+-зависимых К+-каналов является одним из механизмов, компенсирующих увеличенные ответы клеток на вазоконстриктор-ные гормоны при гипертонии, и связана с изменениями в потенциалчувстви-тельных и кальцийчувствительных доменов, имеющихся в структуре белка.

Совокупность перечисленных фактов, указывающих, что выявленные различия в активности каналов при гипертонии, во-первых, затрагивают несколько типов клеток и, во-вторых, связаны со свойствами самих каналов, дает возможность предположить, что этот признак будет передаваться вместе с повышенным давлением, поэтому в нашей работе мы изучили характер его наследования в F2 гибридах крыс (SHRxWKY).

Как видно из рисунка 5, повышенная активность Са2+-зависимых К+-каналов в общей популяции потомков второго поколения практически не коррелирует с давлением. Однако, разбив исследуемую группу по половому признаку, мы обнаружили, что в обеих новых группах корреляции с давлением существуют, но имеют противоположные знаки (рис. 6, 7). При этом в группах родителей (SHR и WKY) различий в активности Са -зависимых К -каналов между самцами и самками не наблюдалось (рис. 8).

На существование различий в характеристиках ионтранспортной функции клеточной мембраны при гипертонии между полами стали обращать внимание сравнительно недавно. Однако сейчас уже имеется ряд данных, подтверждающих этот факт. Показано, например, что скорость Na+/Li+ про-тивотранспорта при гипертонии у мужчин на 10-15% выше, чем у женщин [Бритов 1991]. Различия в скорости Na+, К+-котранспорта еще более значительны (скорость Na+, К+-котранспорта у мужчин на 29% выше, чем у женщин [Cusi 1991].

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ДЕТЕРМИНАНТНОЙ РОЛИ ПОВТОРЯЮЩИХСЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ДНК В ГЕНЕЗЕ ПЕРВИЧНОЙ ГИПЕРТЕНЗИИ.

Безуспешность многократных попыток определения генетических детерминант клинического и экспериментального (SHR) вариантов первичной гипертензии, а также ряд особенностей, отличающих эту патологию человека от других наследуемых заболеваний, дали основание предположительно рассматривать генетической детерминантой первичной гипертензии не повреждения уникальных генов, а наследуемые генные перестройки повторяющихся последовательностей ДНК или реорганизации их кластеров [Бебихов 1997, 2001]. Методом геномной дактилоскопии, разработанном в нашей лаборатории, у SHR, по сравнению с контролем (WKY) установлено наличие полиморфизма по распределению умеренного ID-повтора, который в этой связи рассматривался в качестве возможного триггера геномных перестроек у SHR.

Первичная или эссенциальная гипертензия может быть определена как не менделевски (не моно- и не полигенно) наследуемое заболевание. Такой вывод обоснован данными популяционной генетики, семейного анамнеза, исследований пар близнецов более чем за четверть века. Что если не нарушения в самих генах является геномной основой эссенциальной гипертензии? Первичная гипертензия, для которой характерны генерализованные отклонения вион-транспортной функции мембран и нарушения клеточной энергетики может быть детерминирована геномными перестройками кластеров повторяющихся последовательностей. Данные литературы и оригинальные позволяют рассматривать ретропозицию в качестве триггера таких перестроек.

Эссенциальная гипертензия в отличие от вторичной, приобретаемой гипертензии, представляет собой генетически детерминированное заболевание.

Разделение гипертензии на приобретаемую и наследуемую, прежде чем утвердилось, долгое время представляло предмет дискуссии. Потребовались кропотливые и масштабные исследования, чтобы доказать существование гипертензии генетически детерминированной, т.е. передающейся по наследству. В существовании наследуемой гипертензии убеждают следующие доказательства.

Позитивный семейный анамнез. Представителей случайной выборки тестировали по двум показателям: величине артериального давления и наличию в семейной истории сердечно-сосудистой патологии. По этим двум параметрам была показана значимая положительная корреляция [Harlan 1962]. Ставился вопрос, не может ли это быть на самом деле наследование продолжительности жизни или величины массы тела - параметров, для которых вероятно сопряжение с развитием сердечно-сосудистой патологии. Было показано, что наличие позитивной семейной истории в отношении сердечнососудистая патология вносит самостоятельный и определяющий вклад в предрасположенность к гипертензии [Molen 1970].

Исследования пар близнецов. Пары близнецов одного пола случайной выборки сравнивали по показателям артериального давления. Была показана высоко значимая корреляция, хотя время проявления патологии могло варьировать внутри пары. По-видимому, этот последний показатель определялся влиянием средовых факторов. Здесь проявляется важное отличие генетически детерминируемой гипертензии от приобретенной. Наследуемая гипертензияможет проявиться в зависимости от воздействия средовых факторов раньше или позднее, т.е. обыкновенно к 30, 40 или реже к 50 годам; однако если генетическая предрасположенность к гипертензии имеется, то к 60 годам она оказывается проявлена практически обязательно (параметры близнецов будут близко совпадать) [Molen 1970] [Piatt 1963]. Вторичная же гипертензия не связана, по-видимому, с какой-либо возрастной группой [Piatt 1963].

Таким образом было установлено, что гипертензия определенно может быть задана генетически. Дальнейшие исследования были направлены на то, чтобы определить тип наследования.

С целью выяснения типа наследования гипертензии разными авторами были получены распределительные кривые (какой % лиц с каким давлением) для различных возрастных групп [Hamilton 1954]. В результате было установлено, что по показателям давления популяция однородна. Т.е. в популяции не обнаруживается какой-либо естественный "водораздел" позволяющий разбивку на группы имеющих и не имеющих повышенное давление. Был сделан неожиданный после установления наследуемости гипертензии вывод, что распределение не такое, как можно ожидать при моно- или полигенном заболевании [Hamilton 1954].

Таким образом, правомерно предложенное недавно подразделение наследуемой гипертензии на "менделевскую" и эссенциальную [О'Вугпе 1998] [Hamet 1998]. К "менделевской" - канонически наследуемой — относятся две моногенные редко встречающиеся формы артериальной гипертензии. Это первичный глюкокортикоид зависимый гиперальдостеронизм (glucocorticoid remediable aldosteronism) [Chu 1982; Ulick 1983; Lifton 1992] и гипертензия, определяемая мутацией в бета-субъединице натриевого канала почечного эпителия (синдром Liddle) [Shimkets 1994].

При эссенциальной (первичной) гипертензии потомству передается не болезнь как таковая, а признаки, определяющие предрасположенность. Полагают, что для проявления самой болезни необходимо воздействие на организм неблагоприятных факторов внешней среды, включая известные факторы риска. Но, несмотря на то, что влияние среды в происхождении гипертонической болезни значительно, это заболевание детерминировано на уровне ДНК и необходим поиск молекулярного (геномного) источника болезни.

Конкретные генетические детерминанты эссенциальной гипертензии пока не определены. Однако выявлен ряд особенностей, отличающих первичную гипертензию от иных наследуемых заболеваний. Вероятно, эти отличия могут указать путь решения проблемы. Таковыми являются:• Наследование. Первичная гипертензия человека проявляет неменде-левский тип наследования и это ставит ее вне ряда генетических болезней, обусловленных мутацией в уникальном гене или в группе генов.• Распространенность. Эссенциальная гипертензия характеризуется распространенностью на 2-3 порядка выше т.н. классических генетических болезней, наследуемых по менделевскому типу. Больные эссенциальной гипертензией могут составлять в популяции 15-20%.• Развитие. Первичная гипертензия как у людей, так и на экспериментальной модели, у спонтанно гипертензивнных крыс (Spontaneously Hypertensive Rats, SHR, линия Okamoto - Aoki [Okamoto 1963.]) в своем развитии проявляет четкую связь с определенной фазой жизненного цикла, появляясь у людей на 3-4 десятилетии и у крыс, соответственно, на 5-6 неделе жизни.

Интересно также, что с возрастом наблюдается увеличение разброса по показателям давления. В среднем по популяции с возрастом существенно увеличивается только диастолическое давление. Систолическое давление с возрастом увеличивается незначительно. Однако с возрастом значимо возрастает разброс по показателям как систолического, так и диастолического давления [Molen 1970].

Первичная гипертензия изначально не определяется нарушением (поломкой) в системах и механизмах регуляции кровообращения и контроля АД. Ренин-ангиотензиновая, периферическая нервная система, гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая система, простагландины и др. — все они вовлекаются в патогенез гипертензии, осуществляя "подгонку" системного АД к некому уровню, высота которого детерминируется ионтранспортной функцией мембранного аппарата клеток и уровнем энергетики всей совокупности тканей организма. Величина регулируемых мембранами внутриклеточных констант ионных концентраций, а по существу, величина электрохимческих градиентов, создаваемых в клетках, и является абсолютной детерминантой оптимального уровня системного АД в организме. При первичной гипертензии в ее клинической и экспериментальном (SHR) вариантах отмечены распространенные отклонения в ионтранспортной функции плазматической мембраны клеток и изменения величины внутриклеточных концентраций ионов ("мембранный дефект"), подтверждающие инициирующую роль мембранного фактора в развитии болезни [Postnov 1985, 1990, Постнов Ю.В. 1998].

Таким образом, гипертензия является:(i) неменделевски наследуемым,(ii) широко распространенным,(iii) со-определяемым средовыми факторами,(iv) возраст-зависимым заболеванием,(v) в основе которого лежит нарушение йонтранспортной и энергетической функции клеток.

Вероятно, истоки первичной гипертензии следует искать в глубоких нарушениях метаболизма, так или иначе связанных с энергетикой клетки. Последнее относится к особой категории общих биологических явлений, в регуляции которых на уровне ДНК задействован, по-видимому, геном как целое. Можно предполагать поэтому, что неменделевский характер наследования при первичной гипертензии определяется изменениями ДНК, вызванными амплификацией и/или реорганизацией в ней повторяющихся последовательностей.

Итак, гипертензия наследуется, но никакой субпопуляции носителей "гена гипертензии" выявить не удается. Факт этот представляет основу для принятия в качестве рабочей гипотезы следующего предположения. По-видимому, наследуются не качественные изменения (повреждения тех или иных генов), а количественные или "паттерновые" изменения в геноме, т.е. наследуются геномные перестройки.

Это открывает новый подход к вопросу о геномных детерминантах гипертензии. В качестве субстрата и триггера геномных перестроек известны не уникальные, а повторяющиеся последовательности генома. Молекулярной (геномной) основой гипертензии может быть наследуемое изменение в геноме организации повторяющихся последовательностей. К такому предположению склоняет анализ и данных литературы, и оригинальных (см. ниже).

Изменения организации повторов, если они произошли в половых клетках, будут наследоваться. Однако, будучи количественными и, главное, динамическими, они будут давать картину неканонического, неменделевского наследования.

Наследуемые количественные динамические изменения организации повторов изучены. Исследовано их модулирующее влияние на фенотип. Тан-демные кластеры повторов с размером повторяющейся единицы от 2 до нескольких сотен пн предложено называть последовательностями-носителями кода модуляции [Трифонов 1997]. Такие кластеры могут располагаться в межгенных областях и в интронах, реже в экзонах генов. Кроме этого, они образуют протяженные спейсеры в гетерохроматиновых, в частности, тело-мерных и прицентромерных районах хромосом.

Кластеры повторов могут оказывать количественное влияние на экспрессию генов и, следовательно, на ту или иную биохимическую функциюклетки (в частности, на ее энергетику). Тандемный кластер повтора напоминает по своему действию на экспрессию близлежащего гена реостат (а не выключатель), т.е. его влияние сказывается по принципу "больше-меньше" (а не "да-нет"). "Больше" или "меньше" определяется количеством копий в кластере и степенью вырожденности копий. Собственно, два эти параметра и кодируют модуляцию экспрессии гена.

Кластер тандемного повтора может модулировать активность генов окружения, представляя собой:• мишень связывания белковых регуляторных факторов;• спейсер между функциональным участком и регуляторным районом;• участок конформационной гибкости ДНК (петля, шпилька, участок с высоким потенциалом неправильного спаривания).

Известны случаи, когда наличие в 5'-нетранслируемом районе гена кластера короткого тандемного повтора необходимо для поддержания нормального уровня экспрессии [Toutenhooft 1998].

Кластерами различных тандемно повторяющихся последовательностей представлено около 25% всей ДНК генома. Для сравнения, последовательности-носители триплетного кода аминокислот (гены) составляют лишь около 5% ДНК генома. Таким образом, если ЭГ действительно задается изменениями в последовательностях, несущих код модуляции, понятна высокая (15-25% популяции) распространенность ЭГ по сравнению с другими наследуемыми заболеваниями.

Если число повторяющихся единиц в кластере выходит за пределы нормы, это приводит к недо- или сверхэкспрессии близлежащего гена, результатом чего может явиться отклонение той или иной функции клетки (например, снижение энергетического обмена). Подчеркнем, число копий повтора в кластере непостоянно. Оно может меняться в результате "соскальзывания" реплицирующейся нити ДНК или вследствие неравного кроссинговера. Т.е. процессы, модулируемые кластерами олигонуклеотидного повтора, могут "пере-программировываться" после каждого цикла репликации.

В этом контексте важен вопрос, остающийся пока не выясненным. Что именно может заставить реплицирующуюся нить соскальзывать или кластер рекомбинировать?В качестве кандидатов на роль геномных детерминант ЭГ могут рассматриваться перестройки в последовательностях кода модуляции как внут-рихромосомных районов генома, так и таковые теломерных районов.

Механизм детерминирования патологии разрастающимся кластером повторов может быть упрощенно представлен следующим образом. Ген и по-следовательность-энхансер (усилитель) его экспрессии разделены кластером повтора. Т.е. расстояние, на которое они отстоят друг от друга, задано этим кластером. В норме это расстояние оптимально для того, чтобы фактор экспрессии, связываясь с энхансером, взаимодействовал с геном, обеспечивая необходимый уровень его экспрессии. Допустим, кластер повтора увеличился. Это может привести к ухудшению взаимодействия с геном фактора, связанного с энхансером. Дальнейшее увеличение кластера поведет к модификации а затем и к нарушению экспрессии гена.

Сейчас большое внимание привлекают работы, описывающие изменения кластеров тринуклеотидного повтора. Когда количество копий тринуклео-тидного повтора возрастает выше предельного, эффектом оказывается патология. Процесс увеличения числа копий развертывается в течение нескольких поколений, что приводит к усилению патологии. Этот процесс получил название динамическая мутация [Richards 1992]. Известно уже 13 детерминируемых динамическими мутациями болезней. Возможно, что их и больше. Так, предполагают, что первичная легочная гипертензия, патология, приводящая к недостаточности правого желудочка сердца, обусловлена ДМ в локу-се 2q31 генома [Loyd 1999]. Такое предположение обусловлено особенностями наследования данного заболевания:1) наследуется не легочная гипертензия как таковая, а предрасположенность к ней,2) заболевание "омолаживается" в ряду поколений (потомки больных заболевают во все более молодом возрасте).

В настоящее время не известен другой, чем ДМ, процесс, "омолаживания" заболевания при его наследовании. Однако только предположения о динамической мутации может быть недостаточно для объяснения молекулярных основ легочной гипертензии. Остается непонятной следующая особенность данного заболевания: женщины оказываются подвержены приблизительно в два раза чаще мужчин.

Распространенность в популяции заболеваний, обусловливаемых динамической мутацией, на порядок ниже, чем эссенциальной гипертензии. Это не исключает, однако, возможность того, что одной из молекулярных (геномных) основ ЭГ является динамическая мутация или подобный процесс. Допустим, есть 10 генов, причем динамическая мутация около любого из них может снизить энергетический баланс клетки и стимулировать гипертензию. Естественно, вероятность развития заболевания будет в этом случае на порядок выше, чем, если бы болезнь могла быть следствием динамической мутации лишь около одного гена, как это в уже изученных детерминируемых динамической мутацией патологиях. Такому представлению не противоречат результаты работ O'Donovan 1997 и Bulle 1997. Сопоставление приводимых в них данных позволяет прийти к выводу, что более 2000 генов генома расположены около коротких тринуклеотидных повторов.

Хотя динамическая мутация пока описана только для кластеров три-нуклеотидного повтора, нельзя исключать возможность вовлечения в подобный процесс также и иных типов кодов модуляции. Вероятно, представление о динамической мутации будет со временем расширено. Пока можно лишь констатировать, что для крыс линии SHR была выявлена геномная гетерогенность относительно контроля по длине кластеров динуклеотидного повтора(CA)n [Kotelevsev 1992]. В процессы, подобные ДМ, могут вовлекаться также и тандемные кластеры с большей протяженностью повторяющейся последовательности. Специфическую разновидность последовательностей кода модуляции представляют кластеры теломерного повтора. Повторяющиеся последовательности на концах хромосом защищает гены прителомерных районов от деградации. У человека теломеры фланкированы кластерами гекса-нуклеотидного повтора TTAGGG.

Длина теломер устанавливается во время внутриутробного развития и последовательно модифицируется - сокращается с каждым раундом репликации - после рождения. Причина этого укорачивания — концевая недореплика-ция вследствие невозможности образования крайнего РНК-праймера при репликации 3'-конца ДНК [Оловников 1972]. Темп сокращения теломер программирует продолжительность жизни клетки и, может быть, организма.

Средняя длина теломер, таким образом, есть функция возраста органа или ткани. Фактически, это показатель степени их старения. Этот показатель характеризуется как высокой степенью полиморфизма в популяции, так и высокой степенью наследуемости. Исследования на близнецах показывают, что наследственность играет важную роль в определении длины теломер [Slag-boom 1994]. Интересно, что, несмотря на одинаковую генетику и одинаковые внутриутробные условия, длина теломер у близнецов все-таки различается, хотя и незначительно по сравнению с тем, как она различается у лиц, не являющихся близнецами. Т.е. длина теломер есть геномный параметр, со-определяемый средовыми факторами.

Высказано предположение, что развитие эссенциальной гипертензии может оказаться связанным с делециями в кластерах теломерного повтора во время внутриутробного развития [Aviv 1997]. С позиций понимания гипертензии как процесса, компенсаторного по отношению к нарушению клеточной энергетики, это предположение может быть конкретизовано следующим образом. Укорачивание теломер изменяет экспрессию жизненно важных регуляторных генов, локализованных в субтеломерном гетерохроматине [Wright 1992]. Поэтому сокращающиеся теломеры работают как "биологические часы". Энергетический потенциал стареющей клетки последовательно снижается. Если ткань, состоящая из клеток-потомков клетки с дефектной те-ломерой, подвергнется стрессорному воздействию факторов среды, в ней произойдет апоптоз и, компенсаторно, ускоренная пролиферация [Hamet 1996], а, значит, длина теломер будет ускоренно сокращаться. Тогда укороченная еще на стадии внутриутробного развития теломера сыграет роль "слабого звена", клеточная энергетика окажется нарушена и, компенсаторно, будет наблюдаться развитие гипертензии.

Если цепь событий действительно такова, возникает вопрос: что может сделать кластер теломерного повтора короче во время внутриутробного развития? Какое событие на молекулярном уровне может стать триггером деми-нуции теломерного повтора?Наиболее мощный триггер геномных перестроек, известный на настоящее время, представляют ретроэлементы генома [Бебихов 1998]. Высказано предположение, что прогрессирующие изменения в кластерах последовательностей-носителей кода модуляции изначально могут задаваться встраиванием в этот кластер мобильного элемента [Бебихов 1997].

Встраиваясь в кластер олигонуклеотидного повтора, мобильный элемент прерывает монотонность этого кластера. Такое нарушение монотонности может, при репликации этого участка, провоцировать "соскальзывание" реплицирующейся нити ДНК. То есть, это событие, которое на молекулярном уровне способно запустить процесс роста кластера. Потеря монотонности кластера олигонуклеотидного повтора (CCG)n наблюдалась в локусе FRA16A генома человека, который был охарактеризован как "предрасположенный" к динамической мутации [Sutherland 1995]. Это нарушение монотонности может объясняться, скорее всего, встраиванием мобильного элемента.

Мобильный элемент может спровоцировать также и перестройку кластера теломерного повтора. Теломерный участок со встроенным мобильным элементом в принципе способен рекомбинировать с любым другим участком генома, содержащий мобильный элемент этого же семейства. Результатом рекомбинации может оказаться укорочение теломеры. Такое событие на молекулярном уровне приведет в дальнейшем к более быстрому, чем в норме, возрастному повреждению жизненно важных генов прителомерного района. Уменьшение количества копий в кластере теломеро-ассоциировнного повтора (TAS) в результате перемещения Р-элемента было обнаружено у дрозофилы [Thompson-Steward 1994].

Существуют факты, указывающие на то, что в геноме крыс линии SHR имело место перемещение мобильного элемента, которое, вероятно, и послужило триггером геномной перестройки, определяющей наследуемое повышенное давление. Так, в геноме крыс экспрессируются многочисленные копии умеренных повторов, принадлежащих к классу ретроэлементов [Martin 1995]. Недавно был обнаружен ретротранспозон, транскрипция которого в миокарде SHR на два порядка интенсивнее чем у негипертензивного контроля соответствующего возраста [Sirokman 1997]. Данный ретротранспозон, длина транскрипта которого 7,5 тпн., проявил гомологию с семейством RATRLTR. Причиной такой сверхэкспрессии может быть мутация или ретропозиция данного элемента, специфическая для SHR.

Было высказано предположение, что наиболее вероятными триггерами перестроек в геноме грызунов могут быть такие умеренные повторы, как ре-тропозоны семейств ID [Gutierre-Hurtman 1984] и LI [Voliva 1984]. Эти мобильные элементы известны особенно высокой способностью генерировать геномные перестройки в кластерах тандемно повторяющихся последовательностей и в этом смысле аналогичны Kpnl ретропозонам приматов. Если геномным триггером фенотипического эффекта повышенного давления является перемещение ретропозирующего элемента, можно ожидать геномный подиморфизм повторов внутри линии Wistar (общий предок спонтанно гипер-тензивных крыс SHR и нормотензивных крыс WKY).

В данной работе показано, что в геноме SHR имеются перестройки, по сравнению с контролем, копий ретропозонов. Возможно, данная ретропози-ция и повлекла за собой феномен спонтанной гипертензии. Результат был получен благодаря использованию оригинального метода обнаружения полиморфизма именно повторов, названного авторами СКАН. Полиморфизм был выявлен по расположению копий ретропозона ID, принадлежащего к классу коротких перемежающих последовательностей (SINE).

Данный результат свидетельствует о наличии в геноме SHR дополнительных копий повтора ID, которых нет в геноме крыс WKY. Эта ретропози-ция ID может быть использована в качестве молекулярного маркера (одного из молекулярных маркеров) SHR.

Дальнейшими исследованиями был подтвержден полиморфизм по распределению ID повтора, а также впервые показано, что паттерн распределения копий ID в геноме сонаследуется с уровнем артериального давления и другими гемодинамическими, морфометрическими и биохимическими характеристиками спонтанной гипертензии крыс [Никоненко 2000]. Анализ элек-трофореграмм, полученных методом СКАН, показал, что расщепление по исследуемому признаку имеет сложный характер. Всего было выявлено 35 полос, совокупность которых определяла генотип отдельной особи поколения F2 по распределению копий ID повтора.

По распределению копий ID повтора в геноме ("ID-паттерн") оказалось возможным с высокой точностью предсказывать значение каждой из вышеперечисленных фенотипических характеристик. Так, например, девять полос электрофореграммы позволяли точно предсказывать уровни систолического и диастолического артериального давления у F2 потомков от скрещивания SHRxWKY.

Расщепление признаков в Fj и F2 (SHRxWKY) не соответствовало стандартному менделевскому, что подтвердило правомерность термина неканоническая мутация, предложенного авторами для описания молекулярных основ гипертензии. Вероятно, спонтанная гипертензия крыс линии SHR детерминирована на молекулярном уровне геномными перестройками, вызванными ретропозицией ID повтора.

Повтор ГО хорошо изучен [Иванов 1995]. В геноме крысы он представлен 120-130 тыс. копий. Его относят, наряду с последовательностями В1-семейства, к суперсемейству Alu-подобных повторяющихся последовательностей. Первичная структура ID имеет все отличительные признаки ретропо-зона: фланкирована прямыми повторами, содержит 3'-терминальную по-ли(А)-область и внутренний промотор РНК-полимеразы III. ID локализован в интронах, т.к. обнаруживается в ядерных предшественниках, но не в зрелой сплайсированной мРНК. Ядерная про-мРНК, содержащая ID-последовательность, присутствует в различных тканях животного, но малые цитоплазматические РНК (ВС1 длиной 160 н. и ВС2 - 110 н.), несущие эту последовательность, специфичны для нервной ткани. Эти РНК, транскрибируемые РНК-полимеразой III, присутствуют в следовых количествах при рождении и накапливаются постнатально в цитоплазме клеток головного мозга (-2000 копий на клетку у десятидневных крыс).

Показано, что ID-элемент может функционировать как энхансерная последовательность, которая увеличивала транскрипцию в 5-7 раз под контролем промотора SV40 в клетках грызунов, в которых присутствует ВС РНК, но не в клетках, в которых этих РНК нет [McKinnon 1986]. Таким образом, ре-тропозон ГО является энхансером, для действия которого нужна коэкспрессия гомологичных цитоплазматических РНК.

Показано также, что на посттранскрипционном уровне ID может модулировать экспрессию целых групп генов [Vidal 1993]. Интересно, что такоедействие ID-повтор оказывает, именно, в составе более сложных регулятор-ных последовательностей, включающих в себя кластеры других повторов.

Предположения о ключевой роли взаимодействия кластеров тандемно повторяющихся последовательностей и мобильных элементов генома в осуществлении жизненно важных молекулярно-биологических процессов высказывались и ранее [Бебихов 1993, Sprading 1994]. По-видимому, такое взаимодействие может лежать и в основе нестандартно наследуемого изменения генетического материала, обусловливающего патологию. Наряду с выявленным сонаследованием особенностей "ID-паттерна" генома и повышенного давления у F2 потомков от скрещивания SHRxWKY существует и ряд непрямых свидетельств триггерной роли повторяющихся и, прежде всего, ретропози-рующих элементов генома в развитии гипертензии. Такими свидетельствами являются совпадения основных параметров развития эссенциальной гипертензии и развития перестроек повторяющихся последовательностей генома.

Наследуемая гипертензия проявляет высокую распространенность в популяции. Высокой распространенностью характеризуются геномные перестройки, вызываемые встраиванием ретроэлемента. Процесс ретропозиции включает две стадии копирования: транскрипцию и обратную транскрипцию [Georgiev 1984]. Результатом их умножения оказывается большое количество внехромосомных кольцевых копий ретроэлемента. Ретроэлемент может характеризоваться избирательным встраиванием [Valgeirsdottir 1990, Arcot 1995, Куренова 1990]. Таким образом, в популяции может с высокой частотой воспроизводиться однотипный мутантный "паттерн".

Представление о эссенциальной гипертензии как о следствии нарушения кода модуляции позволяет понять ее высокую распространенность, также исходя из того, что носителями этого кода являются около 25% последовательностей генома, тогда как триплетный код (собственно гены) представлен лишь 5% геномной ДНК.

Эссенциальная гипертензия обнаруживает связь с фазой жизненного цикла (возраст зависимое заболевание). Экспрессия ревертазы, без которой невозможна ретропозиция, также связана с фазой жизненного цикла. Известна пренатальная экспрессия ревертазы [Иванов 1995]. Возраст же проявления эссенциальной гипертензии около 35 лет. Именно это несовпадение фаз может указывать конкретный молекулярный механизм геномного детерминирования гипертензии. Пренатальная ретропозиция запускает рост кластера последовательностей кода модуляции, а уже постнатально, по прошествии такого количества циклов репликации, которое достаточно для роста кластера за пределы нормы, проявляется патология.

Эссенциальная гипертензия характеризуется плавностью перехода от нормы к патологии, как отмечал еще Pickering [1968]. Отсутствие скачкообразного перехода к патологии характерно и для отклонений в ионтранспорт-ной функции мембранного аппарата клеток, отражающих смещение констант внутриклеточных ионных концентраций. Параметры перехода "нормальной" ДНК в нестабильную (растущий или сокращающийся кластер последовательностей кода модуляции) также варьируют от индивидуума к индивидууму и "норма" числа копий "представляет скорее ряд, чем однозначно определяемую характеристику" [Richards 1992].

Таким образом, характерные особенности болезни, данные в приведенном выше определении гипертензии, получают молекулярные корреляты, если рассматривать эссенциальную гипертензию как заболевание, развертывающееся на основе геномных перестроек повторяющихся последовательностей.

Задачей последующего исследования, успешно выполненного в большей своей части, было подтверждение четкой корреляции выявленного ранее полиморфизма по распределению ID-повтора с высотой АД, некоторыми гемодинамическими характеристиками и показателями, характеризующими спонтанную гипертензию на клеточном уровне. Уже полученные данные указывают на состоятельность направления и перспективность его продолжения для изучения геномной детерминанты гипертонической болезни человека.

Метод СКАН. Для обнаружения полиморфизма по расположению в геноме различных семейств умеренно повторяющихся последовательностей авторами был разработан новый метод молекулярной дактилоскопии генома в целом, получивший наименование СКАН [Никоненко 1998].

Принцип метода следующий. Поскольку геном эукариот интерсперси-рован кластерами тринуклеотидных повторяющихся последовательностей, СКАН использует эту особенность организации эукариотического генома для выявления полиморфизма в расположении умеренных повторов. Проводится полимеразная цепная реакция (ПЦР) с использованием двух праймеров: один комплементарен последовательности умеренного повтора, другой представляет собой тринуклеотидный повтор. Перед проведением ПЦР геномная ДНК подвергается полной рестрикции одной из крупнощепящих рестриктаз (рисунок 10).

Для обнаружения межлинейного полиморфизма между WKY и SHR в качестве праймеров для ПЦР-анализа нами были избраны последовательности умеренного повтора ID и высокоповторяющегося тринуклеотидного AGC. Основания для выбора именно этих праймеров следующие. Для обнаружения межлинейного полиморфизма между WKY и SHR в качестве праймеров для ПЦР-анализа нами были избраны последовательности умеренного повтора ID и высокоповторяющегося тринуклеотидного AGC. Основания для выбора именно этих праймеров следующие.

Рисунок 10. Схема метода «СКАН».53'Праймер-затравка для полимеразной цепной реакции комплиментарный ID-повторуПраймер-затравка комплиментарный AGC повтору, закрепляющийся на конце повтора за счет трех случайных нуклеотидовID-повтор AGC-повторМесто расщепления геномной ДНК ферментом-рестриктазой EcoRV Участки ДНК ампдлифицирующиесяУчастки ДНК не ампдлифицирующиесяРетропозон ID из генома крыс обладает особенно высокой способностью генерировать геномные перестройки в кластерах повторяющихся последовательностей [Sutcliff 1984]. Это заставило нас предполагать ID наиболее вероятным триггером возможной динамической мутации у SHR.

На настоящее время известно восемь болезней, обусловливаемых ДМ. В пяти случаях это ДМ по кластеру тринуклеотидного монотонного повтора AGC. Лишь в трех остальных случаях заболевание обусловлено ДМ в кластере CCG. Причем, все эти три случая представляют собой нарушения в различных сайтах одной и той же Х-хромосомы [Sutherland 1995].

Для проведения ПЦР в качестве праймеров использовали два синтезированных олигонуклеотида:1. CRC3: 5' NNN (AGC)s 3' где N - случайно выбранный нуклеотид.

2. CRC5: 5' GGA ТТТ GCT CAG TGG TAG GA 3'— праймер на умеренно повторяющуюся последовательность генома грызунов ID (Brain Identifier; первоначально обнаружена экспрессия в РНК в клетках головного мозга крыс).

Электрофоретическое разделение ПЦР-продуктов проводилось в 6%-ном полиакриламидном геле (ПААГ) с 7М мочевиной. Гель окрашивали азотно-кислым серебром. Сравнивали картины распределения электрофоре-тических бэндов у крыс двух линий — SHR, WKY и гибридов первого Fi и второго поколения F2. С целью получения гетерозигот Fi скрестили две чистые линии инициальных кроссов (самец WKY х самка SHR). Две особи первого поколения (брат - сестра) определялись как родительская пара следующего. Потомство от пар Fi, в совокупности, составило изучаемую популяцию F2(подробнее получение гибридов описано в главе «Наследование биохимических и физиологических особенностей у спонтанно-гипертензивных крыс линии SHR). Всего было обследовано 19 животных - гибридов второго поколения F2(SHRxWKY).

Выявление геномных перестроек с участием кластера умеренного повтора ID у Го-потомков от скрещивания (SHRxWKY).

Метод СКАН позволяет определить полиморфизм по распределению в геноме кластеров умеренного повтора ID на основании анализа фрагментов ДНК, полученных в результате амплификации участков генома, являющихся пограничными между кластерами ID и кластерами тринуклеотидного повтора AGC (рисунок 11) Анализ электрофореграмм показал, что расщепление по исследуемому признаку имеет сложный характер. Всего было выявлено 35 полос, совокупность которых определяла генотип отдельной особи поколения F2 по распределению кластеров ID-повтора.

Анализ корреляционной связи между величиной артериального давления и распределением кластеров умеренного повтора ID.

Основным фактором, доказывающим гипотезу о сонаследовании артериального давления и полиморфизма по распределению ID-повтора, является наличие достоверной корреляции между величиной АД и наследованием электрофоретических фрагментов, характеризующих генотип.

При этом большое значение имеет выбор модели для описания исследуемой зависимости. Простейшая модель линейной регрессии, на наш взгляд, не дает возможности адекватно описать полученные результаты: модель должна описывать не только нарастание геномных перестроек с увеличением давления, но и выявлять ЭФ фрагменты, наличие или отсутствие которых будет определять гипертензивный или нормотензивный фенотип.

Рисунок 11. Электрофореграмма, полученная методом «СКАН»Полиморфные электрофоретические полосыSHRМаркер лДНК/EcorV ^WKYf2Поэтому для анализа данных была выбрана модель многомерной кусочно-линейной регрессии, где в качестве предикторных переменных были использованы значения, полученные при обработке электрофореграмм. На основе этой модели были рассчитаны величины множественных коэффициентов корреляции R между спектрами полос на электрофореграммах и величинами систолического и диастолического артериального давления, а также определили оптимальный состав полос, описывающих каждую из этих величин. Результаты анализа представлены ниже в таблице 9.

Таблица № 9. Значения коэффициентов множественной регрессии (R), описывающих различные фенотипические характеристики у F2 (SHRxWKY) гибридов.

Фенотипические характеристики № ЭФ полос Коэффициент множественной регрессии (R) Статистическая значимость (Р)ДАД 11, 14 0,63 0,019САД 23,32 0,69 0,026ЧСС 15, 17,27 0,74 0,01Пол 14, 15, 22 0,81 0,002Вес 14, 15,22 0,87 0,0001% веса сердца 9, 29 0,63 0,02Са2+-зависимая гиперполя- 14, 18 0,63 0,05ризация мембраны эрит- роцитов а спектрин 3,6, 19 0,98 0,0002(3 спектрин 2,27 0,9 0,003Белок полосы 4,1а 12, 22, 24 0,91 0,002Тропомиозин 27 0,65 0,04Кроме этого, проведен анализ частных связей между высотой давления (АД) и каждой из основных описывающих его полос, рассчитаны регрессионные коэффициенты. Его результаты, представленные в таблице 10, позволяют увидеть, как появление или, наоборот, исчезновение какой-либо полосы на электрофореграмме связано с повышением давления. Используя метод многомерной кусочно-линейной регрессии, можно предсказать уровень артериального давления у животных. На рисунке 12 представлены графики, отражающие реальные и предсказанные по электрофореграмме уровни систолического, диастолического артериального давления и частоты сердечных сокращений по наличию или отсутствию описывающих их электрофоретиче-ских полос.

Анализ корреляционной связи между распределением кластеров умеренного повтора ID и изменениями, характеризующими спонтанную гипер-тензшо на клеточном уровне.

Поскольку отличительной характеристикой спонтанной гипер-тензии у крыс является патология клеточных мембран, которая выражается в изменении их ионтранспортной функции и ряда структурных характеристик, мы исследовали корреляционную связь между распределением кластеров умеренного повтора ID и некоторыми из этих параметров у F2 гибридов крыс (SHRxWKY). В качестве таковых были выбраны активность Са" -зависимых К+-каналов (о которой судили по величине гиперполяризации плазматической мембраны эритроцитов в ответ на кальциевый ионофор) и количественная характеристика спектра структурных белков мембраны эритроцитов.

Ранее показано, что эти параметры изменены при спонтанной гипертензии и их наследование коррелирует с давлением. Как видно из таблицы 10, коэффициент множественной корреляции между величиной Са" -зависимой гиперполяризации плазматической мембраны эритроцитов и распределением кластеров умеренного повтора ID составляет 0.63 (при р=0.05).

Таблица 10. Значения регрессионного коэффициента (3, полученные методом множественной регрессии, по спектру распределения кластеров умеренного повтора ID и величинам гемодинамических характеристик у F2 (SHR х WKY) гибридов.№ ЭФ Фенотипическая регрессионный Статистическая Молекулярныйполосы характеристика коэффициент (Р) значимость (Р) вес ЭФ полосы (т. н.п.)2 (3 спектрин -0,57 0,01 5,83 а спектрин 0,48 0,002 5,76 а спектрин 0,38 0,008 5,49 % веса сердца 0,44 0,04 4,611 ДАД 0,36 0,1 4,512 Белок полосы 4,1а -0,51 0,03 4,214 ДАД 0,46 0,04 3,714 Вес -0,47 0,003 3,714 Пол 0,5 0,007 3,714 Са2+-зависимая гиперполяризация мембраны эритроцитов 0,34 0,1 3,715 Пол -0,47 0,01 3,615 Вес 0,43 0,006 3,615 ЧСС -0,38 0,06 3,617 ЧСС -0,46 0,03 3,418 Са2+-зависимая гиперполяризация мембраны эритроцитов -0,46 0,07 3,319 а спектрин -0,45 0,003 3,222 Пол -0,47 0,01 3,022 Вес 0,63 0,0004 3,022 Белок полосы 4,1а -0,32 0,1 3,023 САД -0,39 0,07 2,924 Белок полосы 4,1а -0,70 0,002 1,927 ЧСС 0,49 0,02 1,627 Тропомиозин 0,65 0,04 1,627 р спектрин -0,70 0,003 1,629 % веса сердца -0,40 0,07 1,432 САД 0,48 0,03 1,3Рисунок 12. Предсказанный и наблюдаемый уровень систолического (а), диастолического (б) артериального давления и частоты сердечных сокращений (в) у гибридов второго поколения.АНаблюдаемый205135144 148 152 156 160 164 168 172 176ПредсказанныйНаблюдаемыйПоепсказанныйНаблюдаемый 360180220 240 260 280 300 320ПредсказанныйДля исследовании корреляционной связи между спектром структурных белков мембраны эритроцитов и распределением кластеров умеренного повтора ID были выбраны полосы а и (З-спектрина, полоса 4.1а, и полоса 7 (тропомиозин), поскольку содержание белка именно в этих полосах при спонтанной гипертензии значимо отличается от нормотензивного контроля и коррелирует с давлением в Р2-гибридах [Купреева 1999]. Значения коэффициентов множественной корреляции между содержанием белка в этих полосах и распределением кластеров умеренного повтора ID представлены в таблице 10. Для содержания белка в обеих полосах спектрина и в полосе 4.1а величина коэффициентов корреляции больше 0.9, т.е. распределение кластеров умеренного повтора ID описывает более 80% процентов значений этих показателей.

Анализ корреляционной связи меэ/сду морфометрическилш характеристиками и распределением кластеров умеренного повтора ID.

В развитии первичной гипертензии, как у крысы, так и у человека, большое значение имеет пол. В нашем исследовании пол животного имеет ключевое значение. В популяции животных второго поколения половые различия становятся критическими в сонаследовании артериальной гипертензии с содержанием белков мембран эритроцитов и величиной Са" -зависимой гиперполяризации плазматической мембраны эритроцитов. Пол животного описывается тремя электрофоретическими полосами с коэффициентом корреляции 0,81 при р<0,002. Теми же полосами описывается и вес животного, что естественно, так как самцы в среднем на 100 г тяжелее самок.

При анализе степени гипертрофии сердца обнаружено, что она не наследуется совместно с гипертензией (данные приведены в главе, посвященной гипертрофии миокарда), то есть не является результатом повышения артериального давления, а определяется, по-видимому, независимой геномной причиной. В настоящем исследовании гипертрофия описывается двумя полосами с коэффициентом корреляции 0,63 при р<0,02. Это относится к полосам 9 и 29, которые не прослеживаются ни в одном из описываемых гипер-тензивных фенотипов.

Анализ распределения кластеров умеренного повтора ID в геноме гибридов второго поколения, полученных от скрещивания SHR и WKY, показал, что повышенное давление сонаследуется с этими геномными перестройками. Расщепление в Fi иF2(SHRxWKY) не соответствует стандартному менделевскому наследованию. Это справедливо в случае гибридов второго поколения как для фенотипических, так и для генотипических параметров (геномных перестроек с вовлечением ID повтора). Наблюдаемое несоответствие каноническому типу наследования можно объяснить тем, что наследование геномных перестроек с вовлечением умеренных повторов представляет собой динамический процесс, развертывающийся во времени. Подобный тип изменений генома условно может быть назван неканонической мутацией.

Под термином "неканоническая мутация" подразумеваются динамические (т.е. развертывающимися во времени) изменениями какого-либо кластера повторяющихся последовательностей или изменения "паттерна", возникающего в результате взаимодействия нескольких таких процессов. Эти изменения, развертывающиеся в геноме, способны к передаче по наследству. В то же время, как процессы динамические и количественные, они представляют явление неменделевского (неканонического) наследования.

Субстрат неканонической мутации представляют последовательности, несущие код модуляции (см. выше). Такими последовательностями представлено около 25% всей ДНК генома. Для сравнения, последовательности-носители триплетного кода аминокислот (гены, т.е. субстрат "канонической" мутации) составляют лишь около 5% ДНК генома. Таким образом, если молекулярной (геномной) основой первичной гипертензии действительно является неканоническая мутация, то становится понятным высокая (15-25% популяции) распространенность первичной гипертензии (ЭГ) человека по сравнению с другими наследуемыми заболеваниями.

Анализ с помощью метода кусочно-линейной регрессии позволяет разделить выборку животных на две подгруппы, в которых связь между гемоди-намическим характеристиками и ЭФ полосами описывается двумя различными способами. Такое разделение не зависит от параметра (систолического артериального давления (САД), диастолического артериального давления (ДАД) или частоты сердечных сокращений (ЧСС)), по которому оно проводится, а проходит по среднему значению для данной выборки. Значения граничных параметров составляют, соответственно, 164 мм.рт.ст. для САД, 104 мм.рт.ст. для ДАД и 270 уд/мин для ЧСС. В группе животных с величиной вышеуказанных гемодинамических параметров ниже граничных, полосы 9, 14, 15, 21, 24, 27, 32, 33 неизменно присутствуют в спектре распределения кластеров ID повтора и показывают значимую корреляцию с величинами данных параметров, тогда как в другой группе присутствие или отсутствие в ЭФ спектре тех же полос непостоянно. Противоположно этому, полосы 7, 20, 28, 30 постоянно присутствуют в ЭФ спектрах группы животных с параметрами выше граничных и варьируются в первой группе животных.

Важным подтверждением гипотезы о том, что перестройки с вовлечением кластера умеренного повтора ID являются молекулярно-генетической основой спонтанной гипертензии, может служить наличие корреляций между их распределением и параметрами, характеризующими спонтанную гипертензию на клеточном уровне (изменениями ионтранспортной функции плазматической мембраны, ее структурных характеристик). В частности выявлена связь геномных перестроек с величиной Са" -зависимой гиперполяризации мембраны эритроцитов и спектром структурных белков в мембране эритроцитов.

Оба выбранных параметра являются маркерами спонтанной гипертензии на клеточном уровне. Изменение формы и объема эритроцитов, наблюдаемое при спонтанной гипертезии у крыс, вероятнее всего связано с изменениями в белковом спектре мембран эритроцитов. Анализ содержанияКрыс отличают высокая, по сравнению с человеком, частота сердечных сокращений (350 - 500 ударов в минуту), малые размеры и большая относительная масса сердца, быстрая смена (а зачастую и одновременное протекание) процессов де- и реполяризации миокарда, малая продолжительность и амплитуды волн и пиков кривой ЭКГ, отсутствие стабильной базовой линии [Аринчин 1966]. Все это затрудняет получение качественного сигнала.

Применение метода векторкардиографии (ВКГ) на мелких лабораторных животных позволяет избежать многих технических трудностей. ВКГ отличают высокая точность и чувствительность, большая информативность и наглядность по сравнению с общепринятыми скалярными проекциями ЭКГ [Gannedahl 1995, Jensen 1994]. В представленной работе была использована новая система для компьютерной регистрации и обработки электрических сигналов сердца крыс на базе клинического варианта системы, разработанного фирмой «Геолинк-электроникс» (Москва).

Целью исследования является создание экспериментальной генетической модели гипертрофической кардиомиопатии у крыс путем выведения новой линии животных с гипертрофией миокарда на основе инбридинга по фенотипическим признакам гипертрофии миокарда и низкого артериального давления у гибридов от интеркросса спонтанно гипертензивных крыс и нор-мотензивных крыс линии Вистар-Киото на основе прижизненной оценки степени гипертрофии миокарда и уровня артериального давления. Животные.

Использовали следующие группы крыс:1) Крысы со спонтанной гипертензией (SHR) в возрасте 20-22 недель, 6 самцов и 8 самок.

2) Нормотензивные крысы линии Вистар-Киото (WKY) того же возраста, 14 самцов и 9 самок.

Животные линий SHR и WKY представляют собой чистые линии, поддерживаемые в РКНПК более 30 лет (60 поколений).

3) Гибриды Fi (WKY x SHR) в возрасте 20 -24 недели, 12 самцов и 15 самок.

4) Гибриды F2 (WKY х SHR) в возрасте 20-24 недели, 42 самца и 37 самок.

5) Гибриды 3-11 поколений (F3 - F11) от последовательного близкородственного скрещивания для получения новой лини крыс с гипертрофией миокарда (в возрасте 20-24 недели, 155 самцов и 130 самок). Животные родительских линий и гибриды содержались в биоклинике РКНПК на стандартной диете при неограниченном доступе к питью.

Схема скрещивания крыс WKY и SHR использовалась та же что и в предыдущих исследовниях. Гетерозиготы первого поколения (Fi) получали путем скрещивания самцов WKY и самок SHR. Две особи первого поколения (брат - сестра), выбранные случайным образом, определялись как родительская пара следующего. Потомство от 10 пар Ft составило в совокупности изучаемую популяцию второго поколения F2.

Определение ВКГ-признаков. Наркотизированных кетамином (100 мг/кг, в/б) крыс, фиксировали за конечности в положении "на спине". Подкожные, стальные игольчатые электроды подсоединяли к R, L, VI, F, N стандартного клинического набора входных проводов отведений для регистрации электрокардиограммы и помещали в соответствующие точки по рисунку 15.Рисунок 15. Схема подключения электродов (а) и оси получаемых отведений (б) при регистрации ЭКГ у крысы.

Сигнал регистрировали, обрабатывали и хранили с помощью специализированного программно-аппаратного комплекса, включавшего в себя выносную плату со встроенным АЦП (12 разрядов, частота оцифровки 1000 Гц), приставку для регистрации кардиосигнала, компьютер типа IBM PC. Система и программное обеспечение были созданы в отделе Медицинской техники фирмы «Геолинк-электроникс» (Москва). Программное обеспечение позволяет устранять помехи при записи кардиосигнала, автоматически и полуавтоматически определять характерные точки кривой ЭКГ, представительный кардиоцикл, автоматически корректировать базовую линию.

Каждый экспериментальный файл содержал в себе 200 кардиоциклов. По ним рассчитывали как параметры стандартных отведений ЭКГ, так и векторные характеристики. Исходными данными являлись моментные амплитудные значения кардиосигнала.

После измерения всех амплитудных параметров по 200 накопленным кардиоциклам в отведении Y (соответствует второму отведению в нашей системе) строили их вероятностные распределения. Затем, наиболее близкий к медиане этих распределений по выбранным параметрам цикл использовали в качестве представительного. После коррекции выбранных программой автоматически точек начала и конца волны Р, комплекса QRS и конца Т-волны такого цикла по нему конструировали проекции векторной петли QRS комплекса и Т-волны в горизонтальной (Н) и фронтальной (F) плоскостях.

Все вычисления проводили относительно базовой линии. Для интервала Q-T за ее начало принимали горизонталь, проведенную через среднюю из нескольких точек начала комплекса QRS. Для интервала PQ базовой линией служила другая горизонталь, проведенная через среднюю из нескольких точек начала Р-волны.

По выделенному представительному кардиоциклу анализировали период охвата возбуждением миокарда желудочков (комплекс QRS) и рассчитывали средний суммарный вектор QRS по площади векторной петли (рисунок 16). Кроме того, определяли угол отклонения его проекции на горизонтальную и фронтальную плоскости от оси I отведения (QRS Н и QRS F, соответственно), угол отклонения его начальной составляющей, усредненной за первую половину кардиоцикла (QRSb Н и QRSb F); угол отклонения его конечной составляющей - за вторую половину кардиоцикла (QRSe Н и QRSe F).

Рисунок 16. Векторные петли QRS и Т, конструируемые по скалярным ЭКГ-сигналам, и схема вычисляемых векторных характеристик.QRSFY(ll)0,5 мВY (N)Т ZC-V1)X(l)I, II, VI, - оси скалярных отведений ЭКГ, соответствующие векторкардио-графическим осям X, Y, Z; F - фронтальная плоскость; Т - трансверзальная плоскость; LS - левая сагиттальная плоскость; во фронтальной плоскости схематично изображены проекции начального (QRSb F), среднего суммарного (QRS F) и конечного векторов (QRS e F) петли QRS; петля QRS - векторная петля, соответствующая периоду деполяризации миокарда или комплексу QRS стандартной ЭКГ; Т-петля - векторная петля, соответствующая периоду реполяризации миокарда или Т-волне скалярного отображения электрического сигнала сердца; масштабная разметка ЭКГ-сигнала соответствует 0,5 мВ.

Форму векторной петли оценивали по углу между начальным и конечным вектором (QRSbAe Н и QRSbAe F). У гибридов 8-11 поколений анализировались изменения ВКГ во фронтальной плоскости (которая, по нашему опыту и данным литературы, является наиболее информативной при выявлении гипертрофии миокарда у крыс). Вычислялись компоненты X (DMx) и Y (DMy) максимального вектора QRS, и компоненты X (DHx) и Y (DHy) вектора полуплощади QRS (рис. 17).

Фронтальная плоскость (XY)DDРисунок 17. Схема вычисляемых векторкардиографических параметров. DM — максимальный вектор QRS, DH — вектор полуплощади QRS, DMy — компонента Y максимального вектора QRS, DHy - компонента Y вектора полуплощади QRS, X, Y - оси соответствующих отведений.Y (II)Определение веса сердца и его отделов. В конце эксперимента под эфирным наркозом у животных извлекали сердце. Определяли массу всего сердца, а также правого и левого желудочков, межжелудочковой перегородки.

Статистическую обработку данных осуществляли с помощью пакета статистических программ Statistica (США). Данные представлены в виде М±т. Для внутригрупповых сравнений самцов и самок использовали Т-тест Стьюдента, для множественных сравнений групп животных тест Ньюмена-Кейсла.

Полученные в ходе исследования гемодинамические и морфометри-ческие данные у гибридов первого и второго поколений (F) и F2) в сравнении с SHR и WKY представлены в таблице 11.

Из таблицы 11 видно, что различия по уровню АД между самками и самцами во всех группах оказались недостоверны. Такой результат не противоречит классическим представлениям о динамике развития артериальной гипертонии в зависимости от пола животного [Wexler 1985, Adams 1989]. Если на стадии нарастания системного давления в первые недели жизни такая разница может быть выявлена, то на стадии "плато", свыше 18 недель, уровень АД стабилизируется и дальнейшие изменения касаются структурных компонентов (сосудистое русло, сердце, печень и др.) Другим подтверждением такого объяснения могут служить результаты двухфакторного анализа ANOVA/MANOVA из пакета статистических программ STATISTICA (Statistica Inc., США) нашей популяции F2 животных по зависимости параметров АД от пола и относительной массы левого сердца (левый желудочек + межжелудочковая перегородка) к массе тела.

Единственно значимое увеличение по уровню САД у самцов по сравнению с самками наблюдали в группах с наименьшими значениями относительного веса левого сердца: 166±3 мм.рт.ст против 157±4 мм.рт.ст., р<0,05.

В среднем по группе значения АД были самыми высокими у SHR, самыми низкими у WKY, а у гибридов Fj и F2 занимали промежуточные положение. Диапазон САД составил у SHR от 172 до 216 мм.рт.ст., у WKY - от 115 до 149 мм.рт.ст., у F] - от 152 до 178 мм.рт.ст. и у F2 - от 135 до 192 мм.рт.ст. Аналогичная закономерность прослеживается для ДАД (таблица 15). Таким образом, животные F2 наследовали фенотип по гемодинамическим показателям как от SHR, так и от WKY, причем для этих гибридов была характерна более широкая вариабельность исследуемых параметров по сравнению с FbВо всех группах животных наблюдали тенденцию к более высокому уровню ЧСС у самок по сравнению с самцами своей группы, но только у F2, по-видимому, в связи с достаточно большим количеством животных в группе, эта тенденция становится статистически значимой. Кроме того, самок во всех группах отличал меньший вес тела и сердца по сравнению с самцами. Таким образом, относительное увеличение ЧСС у самок можно объяснять как исходя из характерного для них меньшего веса тела (известно, что чем меньше животное, тем выше его ЧСС), так и отталкиваясь от наличия структурных изменений в адренергической системе миокарда на этой стадии развития экспериментальной гипертензии, которые могут быть более ярко выражены у самцов [Рощевский 1988, McConnaughey 1993]. Для веса сердца и его отделов самцов Fj были характерны значимые отличия и от SHR, и от WKY. Самцы F2 по тем же параметрам отличались как от обеих исходных родительских групп, так и от своих непосредственных родителей Fj.

Внутригрупповых отличий по параметрам, характеризующим форму и расположение QRS петли между самками и самцами у гибридов Fb F2, животных линий SHR и WKY обнаружено не было (таблица 12). Если аналогичные данные о независимости ЭКГ-сигнала от пола у нормотензивных грызунов известны, то для ВКГ-исследования это первый подобный опыт относительно гипертензивных крыс.

Полученные данные свидетельствуют, что начальные этапы возбуждения миокарда сходны у всех групп животных (таблица 12, рисунок 18). Судя по обнаруженным межгрупповым отличиям, диагностически значимыми для определения гипертрофии можно считать суммарный вектор QRS, его конечную составляющую QRSe и угол между начальным и конечным векторами QRSbAe, описывающий ширину векторной петли.

Характерной особенностью QRS-петли у крыс линии SHR являлось достоверное смещение конечного вектора вверх, кзади и влево вследствие сильного запаздывания процесса деполяризации гипертрофированного миокарда по сравнению с WKY (рисунок 18, а, б).

На обычной кривой ЭКГ этот процесс замедленного охвата возбуждением желудочков по сравнению с WKY отражался в увеличении длительности QRS-комплекса и изменении соотношения амплитуд его зубцов. Однако эти параметры были недостаточно чувствительны применительно не только к исходным родительским группам животных, но и к гибридам F] и F2.

Чуть с меньшей амплитудой, но подобно конечному смещался суммарный вектор QRS и, соответственно, в несколько раз увеличивался угол между начальным и конечным векторами возбуждения миокарда (другими словами, возрастала ширина петли). Полученные векторкардиографические данные сходны с описанными ранее для животных с выраженной артериальной гипертонией и гипертрофией миокарда.

Для изучения наследования различных фенотипических признаков был проведен корреляционный анализ гемодинамических, морфометрических и векторкардиографических признаков в популяции F2 животных. Полученные результаты суммированы в таблице 13. Значимых корреляций САД и ДАД, с одной стороны, и морфометрическими показателями с другой, выявить не удалось. С точки зрения формальной генетики, это указывает на не сцепленное наследование артериальной гипертензии и гипертрофии при спонтанной гипертензии крыс SHR, что позволяет говорить о гипертрофии миокарда как о самостоятельной, а не опосредованной гипертензией, характеристике этой линии крыс. С другой стороны, существует устоявшаяся точка зрения, что круглосуточное мониторирование, в отличие от простого однократного измерения АД (последний способ использовали в нашем случае), позволяет выявить корреляцию с параметрами, характеризующими гипертрофию сердца. Возможно, длительный мониторинг позволит выявить те колебания АД, которые связаны с изменениями гуморального статуса организма и приводящие к долговременным сдвигам в тканевом метаболизме, проявляющимся в гипертрофии сердца.

Однако любое длительное исследование имеет иные цели и задачи, связанные больше с изучением динамики развития патологии, а не диагностического соотношения определенных ее признаков на конкретной стадии процесса. В пользу правомерности нашего подхода свидетельствуют и публикации последних лет, где на разных линиях крыс подтверждается гипотеза о независимом наследовании гипертрофии миокарда и гипертонии у животных, генетически предрасположенных к повышенному уровню АД [Harris 1995].

Для гибридов популяции отмечается высокая зависимость между весом сердца и его отделов и векторными характеристиками процесса возбуждения миокарда (таблица 13). Меньшее влияние на деполяризацию оказывают систолическое и диастолическое давление в большом круге кровообращения.

Существует некоторая связь электрической активности сердца с АД у самцов - гибридов второго поколения. Для них характерна связь систолического и диастолического АД с горизонтальной проекцией суммарного QRS-вектора (R=0,35, р<0,03 и R=0,33, р<0,04). Обнаружены достоверные связи параметров QRS-петли (QRS Н, QRS F, QRSe, QRSbAe) с весом сердца и его левых отделов. Коэффициент корреляции составил от 0,39 до 0,48 для QRS в горизонтальной плоскости, -0,43 и -0,48 во фронтальной (р<0,01), то же для QRSe: 0,33-0,45 и -0,40 -0,43, р<0,01; то же для QRSbAe: 0,35-0,43 и 0,38-0,43, р<0,05. Самки характеризовались наличием достоверных корреляций в том же диапазоне значений для коэффициента между весовыми параметрами левого сердца и фронтальной проекцией суммарного вектора QRS, а так же правого желудочка сердца и горизонтальной проекцией QRSe.

Таблица 13. Корреляционная таблица для измеренных параметров популяции гибридов F2QRS QRSe QRSbAe Показатель F Н F Н F Н самцы самки самцы самки самцы самки самцы самки самцы самки самцы самкиСАД 0,35 <0,03 ДАД 0,33 <0,04 чсс -0,31 <0,017 Масса животного -0,44 -0,43 0,45 0,38 0,43 <0,004 <0,005 <0,004 <0,015 <0,005 Масса сердца -0,48 -0,38 0,39 <0,002 <0,022 <0,01 Масса левого отдела сердца -0,45 -0,42 0,48 -0,4 0,33 0,43 0,35 <0,003 <0,011 <0,002 <0,009 <0,035 <0,005 <0,026 Масса левого желудочка -0,43 -0,39 0,41 <0,006 <0,020 <0,008 Примечание. F - фронтальная плоскость проекции вектора QRS; Н - горизонтальная плоскость проекции вектора QRS. Данные представлены в виде значения коэффициента корреляции и его доверительной вероятности.

Таким образом, можно заключить, что, в первую очередь, структура миокарда, а не уровень АД, определяют функциональные характеристики электрической активности сердца на стадии установившейся артериальной гипертонии. Причем наследование структурных особенностей сердца и соответствующих им электрических характеристик в значительной степени связано с полом животного.

В возрасте 14 недель систолическое артериальное давление (АД) у самцов F4 (n=l 1) и F5 (п=10) составило 127+3 и 123+3 мм рт. ст., что гораздо ниже, чем у самцов SHR (183+5 мм рт. ст., п=8) и близко полученному для WKY (128+3 мм рт. ст., п=8). Сходные уровни АД наблюдали и у самок крыс исследованных популяций животных (SHR - n=8, WKY - n=9, F4 -n=10, F5 - п=10). Эти данные позволяют заключить, что полученные гибриды четвертого и пятого поколений обладают нормотензивным фенотипом по признаку АД.

В популяциях гибридов 8 — 11 поколений для регистрации ЭКГ выбирались особи с систолическим АД меньше 130 мм.рт.ст. Так, значения систолического АД у гибридов F9 - Fl 1, отобранных для регистрации ЭКГ, (121±2 мм.рт.ст., 113±0,2 мм.рт.ст., 106±0,3 мм.рт.ст.) были меньше не только по сравнению с SHR (183±5 мм.рт.ст., р<0,001), но и по сравнению с WKY (128±3 мм.рт.ст., р<0,01) (рис. 18).

При развитии гипертрофии миокарда у гибридов F8 - Fn сдвиг конечных векторов деполяризации влево и вверх приводил к уменьшению значений Dmy и DHy (рисунок 19, 20). Выраженное уменьшение этих параметров (DMy<0,24 мВ и DHy<0,23 мВ) встречалось у 20 из 26 (77%) животных F8, 25 из 32 (78%) животных F9, 42 из 49 (86%) животных Fi0 и 33 из 38 (87%) животных Fn.

При анализе морфометрических данных у гибридов F4 — F9 в сравнении с SHR и WKY в возрасте 22 недель вес тела не отличался у различных групп животных. Однако, как вес тела, так и сердца у самок по сравнению с самцами был достоверно ниже. Вес сердца в группах самцов гибридов F4 — F9 был достоверно выше, чем в группе WKY, но при этом ниже значений для группы SHR (рисунок 21, 22).

Вес левого желудочка сердца у самцов в группах гибридов F4, F5 и F6 составил 0,41±0,01 г, 0,47±0,03 г и 0,57±0,05 г, что близко полученному для группы SHR (0,46±0,03 г и достоверно выше, чем в группе WKY (0,31±0,03 г, р<0,05).

Вес левого отдела сердца (левый желудочек и межжелудочковая перегородка) у самцов в группах гибридов F6 - F9 был близок полученному для группы SHR и достоверно выше, чем в группе WKY (рисунок 23).

Метод ЭКГ и ВКГ позволяет достаточно дифференцированно охарактеризовать различные степени гипертрофии у крыс, генетически предрасположенных к спонтанной гипертензии. Диагностически значимыми для определения гипертрофических структурных изменений миокарда у животных со стабильно высоким уровнем АД можно считать отклонения суммарного вектора QRS, его конечной составляющей, угла между начальным и конечным векторами QRS, описывающий ширину векторной петли, компонент Y вектора полуплощади QRS и максимального вектора QRS. При этом не обнаружено непосредственной связи ВКГ-параметров с полом во всех изученных группах животных. По-видимому, такая зависимость опосредуется только через особенности строения миокарда. Полученные результаты свидетельствуют в пользу того, что гипертрофия и гипертензия у SHR кодируются различными группами генов. Последнее позволяет нам говорить о гипертрофической кардиомиопатии у крыс со спонтанной гипертензией как об отдельном фенотипическом и генотипическом признаке. Отсюда следует возможность выведения методом последовательного скрещивания новых линий животных, характеризующихся гипертрофией без повышенного артериального давления при использовании раннего контроля уровня АД и неинвазивного мониторинга гипертофических изменений миокарда с помощью ВКГ. Такие крысы могли бы стать не только генетической моделью изучения гипертофической кардиомиопатии, но нашли бы свое применение и во всевозможном фармакологическом тестировании новых препаратов, в более тонком изучении механизмов их действия.

В результате инбридинга по фенотипическим признакам гипертрофии и низкого артериального давления получено одиннадцать поколений крыс -гибридов от интеркросса SHR и WKY, которые являются основой для выведения новой линии животных с выраженной гипертрофией миокарда без повышенного уровня артериального давления.

ОСОБЕННОСТИ МИТОХОНДРИЙ ПРИ СПОНТАННОЙ ГИПЕРТЕНЗИИ КРЫС.

Энергообразовательная функция митохондрий.

Задача этой части работы дать обобщенное изложение современных представлений о процессах энергопродукции в митохондриях клеток, чтобы облегчить понимание сущности отклонений энергообразования при хронической гипертензии вообще и первичной гипертензии в частности.

Основанием для обсуждения подобной связи могут служить несколько примеров системной гипертензии в случаях, где нарушение энергообразования составляет самую сущность патологического процесса. Таким примером, прежде всего, может служить гипертиреоз (тиреотоксикоз) - состояние, при котором организм страдает от избытка образования тиреоидных гормонов в связи с гиперплазией щитовидной железы или вследствие гормон-продуцирующей опухоли этого органа. Избыточное поступление в организм тиреоидных гормонов вызывает разобщение процессов окисления и фосфо-рилирования на уровне митохондрий, рассеивание энергии (выход протонов) в виде образования избыточного тепла и проявления интоксикации, позволивших уже давно назвать тиреотоксикоз «болезнью митохондрий» [Hoch 1962]. Другим примером связи митохондриального энергообразования с системной ги-пертензией является так называемое холодовое разобщение - развитие гипертензии при длительной холодовой экспозиции экспериментальных животных. Очевидную связь с рассматриваемым вопросом имеют также данные о более высокой внутренней температуре тела у крыс со спонтанной гипертензией [Price 1990; Berkey 1990]. Следует лишь оговорить, что последняя черта, по-видимому, в более полной мере может проявиться на модели первичной гипертензии у крыс - животных, имеющих особенности терморегуляции в связи с присущим им, хотя бы в редуцированном виде, феноменом гибернации - сезонной спячки, характерной для многих диких представителей этого вида животных. Выработка тепла в этот период обусловлена специальным механизмом разобщения фосфорилирования в митохондриях бурого жира [Nicholls 1984]. Данные об особенностях метаболизма макроэргических фосфатов и системы креатин-фосфата в тканях при первичной гипертензии приведены при обсуждении собственных результатов работы.

Представления о биологической роли митохондрий за последние годы претерпели изменения и существенно расширились. К известному определяющему значению этих клеточных органелл в обеспечении продукции АТФ путем аэробного дыхания, в последнее полтора десятилетия добавилось понимание их роли в опосредовании важнейшей фазы существования клеточной формы жизни - программируемой смерти клеток или апоптоза. Однако прогресс в отношении изучения биологической роли митохондрий этим не ограничился. Сейчас начинает проясняться значение митохондрий в обеспечении циркуляторного гомеостаза организма, роли митохондриальных нарушении в некоторых распространенных формах сердечно-сосудистой патологии, в частности, гипертонической болезни [Постнов, 2000] и более локальных по своим проявлениям и ограниченных по распространенности формах, таких, как кардиомиопатии [Wallace 1999].

Поскольку настоящее исследование посвящено развитию этого направления, в рамках намеченной задачи целесообразно выделить следующие разделы:(i) образование энергии и особенности при гипертензии; (и) источники реактивных окислительных веществ (реактивных окислительных радикалов, reactive oxygene species (ROS) и побочные продукты работы электронной транспортной цепи митохондрий;(iii) связь митохондриальной дисфункции с системой оксида азота (NO).

Митохондрии генерируют клеточную энергию в виде АТФ путем окислительного фосфорилирования. Митохондриальный генератор энергии, работающий на принципе окислительного фосфорилирования, обозначают для краткости OXPHOS.

Рисунок 24. Схема окислительного фосфорилирования (OXPHOS), демонстрирующая общую структуру и происхождение реактивных окислительных веществ (ROS). Комплекс I - АД: убихинон оксиредуктаза. Комплекс II - сукци-нат убихинон-оксиредуктаза. Комплекс III - убихинон: ситохром С оксиредуктаза. Комплекс IV - цитохром-с-оксидаза. Комплекс V — АТФ-синтаза. ANT — аденин-нуклеотидный переносчик.цитоэольматриксNADH+ Н*I. cobNADHе"^♦CoQH^.X.i-rн*iiiITонCyt сxvн,окг02fey-АД*АТФАДФantГАТФIВнутренняя митохондриальная мембранаOXPHOS состоит из пяти полипептидных ферментных комплексов, АТФ-синтазы и адениннуклеотидного переносчика (см. схему на рисунке 23). Комплексы I, II, III, IV составляют транспортную цепь электронов (ТЦЭ). Все полипептидные комплексы OXPHOS встроены во внутреннюю мембрану митохондрий.

ТЦЭ окисляет водород, производимый из органических кислот (таких как пируват и жирные кислоты) атомным кислородом с образованием воды (схема на рисунке 24). Электроны, принесенные с NAD+ (никотинамид динуклеотид) переносятся на дыхательный комплекс I /NADH: убихинон оксидоредуктаза и на коэнзим Qi0 (CoQ). Электроны, поступающие из цикла трикарбоновых кислот (с сукцината), переносятся на комплекс II (сукцинат: убихинон оксиредуктазу) и CoQ. С последнего электроны последовательно переносятся на комплекс III (убихинол: цитохром с оксидо-редуктазу), затем на цитохром с (cyt.c), далее поступают в комплекс IV (цитохром с оксидазу) и, наконец, к атомарному кислороду (1/2 02), образуя воду. Энергетический уровень системы переноса понижается по мере продвижения электронов в ТЦЭ, а высвобождаемая энергия используется на выкачивание протонов через внутреннюю митохондриальную мембрану из матрикса в межмембранное пространство и в цитозоль через комплексы I, III, IV. Внутренняя мембрана митохондрий в результате движения электронов по ТЦЭ и выхода протонов, становится подобием конденсатора, заряженного положительно и закисленного снаружи и отрицательно заряженного и щелочного со стороны матрикса. Образующийся на внутренней мембране митохондрии электрохимическиий потенциал (А1?), называемый иногда протонной движущей силой (proton motive force, pmf), состоит, таким образом, из протонного концентрационного градиента (АрН) равного 1рН или 60mV и электрогенного потенциала (160mV), в сумме составляя 220mV.

Энергия, запасенная в митохондриальном «конденсаторе» в виде электрохимического потенциала (ДЧО, используется на синтез АТФ при обратномтранспорте протонов в матрикс через протонный канал мембраны частице Р0АТФ-синтазного комплекса Н4" - АТФазы (Fo Fi) где происходит конденсация АТФ из АДФ и неорганического фосфата (комплекс V схемы на рис. 24).

В изучении роли электрохимического градиента внутренней мембраны митохондрий немалое значение имело выявление феномена разобщения процессов окисления и фосфорилирования, вначале показанного при действии на митохондрии 2,4-динитрофенола и некоторых детергентов, проявляющих разобщающее воздействие уже в следовых концентрациях. 2,4-динитрофенол и подобные ему вещества, действуя как переносчики протонов, уравновешивают концентрацию нГ по обе стороны внутренней мембраны митохондрий, разрушают этим протонный градиент [Mitchell 1969]. Воздействие детергентов, по-видимому, несет в себе элемент нарушения структуры мембраны, возникновение ее «текучести», а в итоге - тот же конечный эффект разрушения протонного градиента. Механизмы холодового и тиреогенного разобщения митохондриального дыхания и фосфорилирования, составляя специальную тему, подробно не рассматриваются в настоящем обзоре. Более близким теме нашего исследования является феномен «окислительного накопления (аккумуляция) кальция» в митохондриях [Lehninger 1967] сопровождающийся сокращением синтеза АТФ, в основе чего лежит так же процесс разобщения, опосредованный нарушением формирования протонного электрохимического градиента мембраны. Сведения о функции шРТ каналов (пор) митохондрий позволяет рассмотреть этот вопрос с новых позиций.

Утечка протонов в митохондриях.

В образовании протонного электрохимического градиента и процесса синтеза АТФ в митохондриях существенное значение имеет явление утечки протонов по градиенту их концентрации, достигающее 20-30% от базального уровня протонов, генерируемых в процессе дыхания (proton leak). Утечка протонов означает их возвращение по градиенту концентрации и рассеивание (в том числе в виде тепла) вместо использования в механизме конденсации АТФ в F0Fi комплексе и в транспорте этого соединения. В митохондриях различных типов клеток (за исключением клеток так называемого бурого жира грызунов) истечение протонов происходит через липидный бислой [Brown 1992].

Скорость истечения возрастает с нарастанием величины протонного градиента. В буром жире грызунов, особенно развитом у видов, впадающих в зимнюю спячку, митохондрии адипоцитов имеют особый специализированный протеин, который опосредует утечку протонов, необходимую для обеспечения теплопродукции в период спячки [Bouillard 1986], играя, по-видимому, роль прото-нофора. Хотя разобщающий протеин был найден только в митохондриях бурого жира, экспрессия мР1Ж этого белка была выявлена в других тканях при воздействии на животных холодового стресса [Shinohara 1991]. Сам по себе этот факт примечателен тем, что достаточно длительно (несколько недель) воздействие холода на крыс вызывает развитие артериальной гипертензии, в патогенезе которой механизм митохондриального разобщения играет ключевую роль.

Нарушения энергетического метаболизма тканей при артериальных гипер-тензиях различного генеза.

В клинических исследованиях у больных с эссенциальной гипертензи-ей в скелетной мускулатуре было обнаружено более низкое содержание фос-фокреатина (Фкр) в состоянии покоя, наряду с более глубоким снижением отношения АТФ/неорганический фосфат (АТФ/Фн) после окончания нагрузочных (тестов по сравнению со здоровыми людьми) [Ronquist 1995]. Показано также, что уровень АТФ в эритроцитах таких больных существенно ниже, чем людей с нормальным уровнем АД [Емелина 1972, Resnick 1994]. Взятые вместе, эти данные свидетельствуют о том, что изменения энергетического метаболизма в клетках тканей различного типа являются, по-видимому, характерной особенностью артериальной гипертензии.

Целью настоящего исследования была проверка предположения о том, что хроническая артериальная гипертензия сопровождается нарушениями обмена макроэргических фосфатов в различных тканях, независимо от этиологии или способов ее индуцирования.

В работе были оценены тканевые фонды адениннуклеотидов (АТФ+АДФ+АМФ) и система фосфокреатин-креатин (Фкр-Кр) в миокарде, скелетных мышцах, печени и селезенке крыс WKY в сравнении с этими показателями у крыс со спонтанной гипертензией SHR, а также в эксперименте на крысах при гипертензии, вызванной введением гормона щитовидной железы - трийодтиронина (Тз), и на модели почечной гипертензии.

В работе использовали крыс-самцов со спонтанной гипертензией SHR и контрольной к ним линии WKY в возрасте 12 недель, массой 225-250 г и артериальным давлением (АД) 160-190/110-130 мм рт.ст. Крысы линии WKY того же возраста и пола служили исходным материалом для воспроизведения двух других моделей экспериментальной гипертензии — тиреоидной (тирео-токсической) и почечной (вазоренальной) гипертензии.

Тиреоидную гипертензию воспроизводили ежедневным введением трийодтиронина катетером через пищевод в виде взвеси в воде из расчета 500 мкг гормона в сутки в течение 14 дней. Почечную гипертензию воспроизводили за 3 недели до исследования наложением спирали из нихромовой проволоки на ствол левой почечной артерии с одновременным удалением правой почки — вариант почечной гипертензии по Goldblatt (one kidney one clamp hypertension).

Систолическое артериальное давление (АД) измеряли не менее трех раз в течение двух недель, предшествовавших исследованию, плетизмографиче-ским методом на хвостовой артерии у бодрствующего животного. Животных содержали на брикетированном лабораторном корме и водопроводной воде. За 12 часов до исследования животных отстраняли от корма при свободномдоступе к воде. Данные об уровне АД, массе тела и сердца животных в группах приведены в табл. 14.

АТФ и ФКр в тканевых экстрактах определяли спектрофотометриче-ски, используя глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, гексокиназу, креатинкиназу. АДФ и АМФ определяли энзиматически с помощью миокиназы, пируватви-назы и лактатдегидрогеназы. Для определения креатина использовали реакцию с а— нафтолом и 2,3 - бутадионом [Bergmeyer 1974]. Фонд адениннукле-отидов и общий креатин рассчитывали как £АН=АТФ+АДФ+АМФ иЕКр=ФКр+Кр, соответственно. Содержание метаболитов выражали в мкмоль/г сухой массы ткани.

По данным, представленным в таблице 15, видно, что наиболее выраженные однонаправленные изменения в содержании адениннуклеотидов при всех исследованных формах артериальной гипертензии - спонтанной, тирео-идной и почечной проявлялись в ткани миокарда и в печени. Так, в этих тканях при гипертензии, по сравнению с контрольной группой нормотензивных животных (WKY), существенно снижено содержание АТФ. При тенденции к снижению Z АН в обеих тканях в группах с гипертензией, лишь в группе SHR оно достигало статистической значимости и было наиболее выраженным в миокарде (до 85,00 ± 5,27% от контроля при р < 0,05). Изменение содержания других адениннуклеотидов в этих тканях было менее постоянным: увеличение содержания АДФ выявлено лишь в миокарде при почечной гипертензии и в печени при тиреоидной гипертензии. Увеличение содержания АМФ выявлено в миокарде животных с тиреоидной и почечной гипертензией и в ткани печени всех групп животных с гипертензией.

Несмотря на менее однородный характер перераспределения АДФ и АМФ в группах с гипертензией, реальная значимость данных подкрепляется достоверным уменьшением в обеих тканях при всех типах гипертензии отношения АТФ/АДФ при сниженном энергетическом заряде за исключением миокарда SHR, где различия по величине энергетического заряда не достигали статистической значимости (рис. 25).

Достоверное снижение содержания АТФ отмечено в ткани селезенки у крыс со спонтанной гипертензией и в группе тиреоидной гипертензии (табл. 15). В ткани этого же органа отмечено увеличение содержания АДФ у крыс со спонтанной гипертензией, а содержание АМФ - у животных всех групп с гипертензией. В результате суммарное содержание адениннуклеотидов (ZAH) в исследованных моделях гипертензии в этой ткани не отличалось от этого показателя в контрольной группе.

Однако энергетический заряд в ткани селезенки SHR и крыс с тиреоид-ной гипертензией был достоверно ниже, чем в группе контроля (WKY), а отношение АТФ/АДФ было у SHR сниженным (до 66,38 ± 5,88% от этого показателя в группе контроля) только при спонтанной гипертензии (рис. 25).

Рисунок 25. Отношение АТФ/АДФ и значения энергетического заряда в тканях гипертензивных крыс в % к в этим показателям у нормотензивных животных линии WKY.

Содержание АТФ в скелетной мышце у SHR и у крыс с тиреоидной гипертензией не отличалось от контроля, но в группе с почечной гипертензией отмечено существенное превышение АТФ по сравнению с таковым у WKY (на 38,09 ± 3,31% по сравнению с контролем) (табл. 15).

Содержание АДФ и АМФ в скелетной мышце животных с тиреоидной и почечной гипертензией было достоверно ниже этих показателей у нормо-тензивных крыс. Такое перераспределение адениннуклеотидов приводило к увеличению фонда ХАН в скелетной мышце животных с почечной и тиреоидной гипертензией. В результате отношение АТФ/АДФ для этих двух моделей гипертензии было выше, а энергетический заряд этой ткани у животных с почечной гипертензией был несколько больше, чем у нормотензивных животных (рис. 25).

Содержание ФКр в миокарде во всех группах гипертензивных животных было снижено по сравнению с этим показателем у нормотензивных крыс (табл. 16). В наибольшей степени это снижение отмечено в группах тиреоидной и почечной гипертензии до 14,9+4,3% 6,7 + 4,2 % соответственно (в группе SHR различия не достигали достоверного значения). Снижению ФКр соответствовало достоверное уменьшение ХКр в миокарде всех групп гипертензивных животных, возрастая в ряду SHR > почечная гипертензия > тирео-идная гипертензия. В последней группе снижение ХКр сочеталось с достоверным снижением содержания свободного Кр (до 66,5+4,2 % от его уровня у крыс WKY), в то время как в других двух группах гипертензивных животных содержание ХКр было таким же, как и у нормотензивных крыс.

В скелетной мышце гипертензивных животных содержание ФКр было достоверно снижено у крыс SHR и в группе с почечной гипертензией; содержание Кр во всех группах гипертензивных животных было достоверно ниже, чем у крыс WKY (табл. 16). Этому соответствовало снижение ХКр во всех гипертензивных группах.

В печени и селезенке - органах, содержащих исходно низкие уровни ФКр, тиреоидная гипертензия сопровождалась значительным снижением содержания ФКр (соответственно до 32,4+11,7 и 39,8+4,3% от этого показателя у WKY) (табл. 16). Содержание Кр и, как следствие, ХКр в наибольшей степени снижалось в печени крыс с почечной гипертензией и достоверно отличалось от соответствующих значений у животных двух других гипертензив-ных групп (р<0,05).

Результаты исследования регистрируют наличие изменений в состоянии клеточной энергетики тканей в двух других экспериментальных моделях системной артериальной гипертензии, представленных соответствующими аналогами в клинике, а именно, тиреоидной (тиреотоксической) и почечной гипертензией, которые относят к формам вторичной гипертензии человека.

Выявленная картина изменений в деталях не однотипна, в ней содержатся черты, общие для всех трех моделей, использованных в исследовании, что можно отнести к особенностям органной топографии изменений, которые наиболее глубоко и однонаправлено проявляются в ткани печени и в миокарде. Они составляют, несмотря на патогенетическое различие моделей, некое универсальное для них качество.

Настоящее исследование четко демонстрирует, что в тканях при всех изученных формах гипертензии имеется понижение содержания АТФ, уменьшение отношения АТФ/АДФ, уменьшение энергетического заряда тканей, что, с учетом тенденции к снижению содержания фосфокреатина и общего креатина в группах артериальной гипертензии (табл. 16), указывает на преобладание в обмене макроэргических фосфатов процесса гидролиза АТФ и наличие дефицита его восполнения.

Изучение гипертрофированного миокарда крыс со спонтанной гипертензией показало, что снижение уровня АТФ, фосфатного потенциала или увеличение цитоплазматической концентрации Фи становится наиболее очевидным не в покое, а при увеличении сократимости сердца под действием нагрузок [Lortet 1993, Aussedat 1992]. Большая степень снижения энергетических показателей (АТФ, отношение АТФ/АДФ и энергетического заряда) в сердце крыс с почечной гипертензией и тиреоидной группы даже в отсутствии нагрузок может свидетельствовать о повышенной интенсивности преобразования энергии в клетках миокарда у этих животных, чем в кардиомиоци-тах крыс SHR и WKY (табл. 15, рис. 25). На это указывают и более низкие уровни ФКр и ЕКр в миокарде при этих моделях экспериментальной гипертензии (табл. 16).

При всех экспериментальных моделях гипертензии в скелетной мышце крыс уровни ФКр и IKP были достоверно ниже, чем у нормотензивных животных (Табл. 16). Эти данные согласуются с результатами комплексного исследования пациентов с первичной артериальной гипертензией [Resnick 1994]. У таких больных в скелетной мышце в покое с помощью метода биопсий и ЯМР-спектроскопии было обнаружено более низкое содержание ФКр и сниженное отношение АТФ/Ф,, при нагрузке, а также более низкая скорость регенерации ФКр после нагрузочных тестов по сравнению со здоровыми людьми. В дополнение к этому, уровень АТФ и 2,3-дифосфоглицерата в эритроцитах этих больных был значительно ниже, чем у нормотензивных пациентов [Емелина 1972, Resnick 1994].

Если изменения в состоянии энергетики миокарда можно было бы объяснить рабочей перегрузкой сердца и интенсификацией процессов преобразования энергии, то подобные изменения в клетках печени (как и их отношение к гипертензии вообще), по-видимому, требуют иного объяснения. Ответ на этот вопрос отчасти дает исследование модели артериальной гипертензии, связанной с избыточным насыщением организма тиреоидными гормонами (внашем случае трийодтиронином). Известно, что синдром гипертиреоидизма у человека, проявляющийся высокой симпатикотонией, гипертрофией миокарда и системной артериальной гипертензией, сопровождается выраженной дисфункцией митохондриального аппарата клеток, что позволяет рассматривать тиреотоксикоз как «болезнь митохондрии» [Hoch 1962]. Проявления ми-тохондриальной дисфункции выявлены также и при других вариантах воздействия избытка Т3 в экспериментах на крысах [Thompson 1993]. Действуя в избытке, гормоны щитовидной железы (тироксин и трийодтиронин) разобщают в митохондриях перенос электронов по дыхательной цепи и синтез АТФ, вызывая «бесполезное» рассеяние электронов и, блокируя этим фосфо-рилирование, уменьшают продукцию АТФ. Подобный механизм воздействия Т3 хорошо объясняет изменения системы макроэргических фосфатов и фос-фокреатина как в отношении миокарда, так и для печени. Влияние Т3 в других тканях (скелетная мышца, селезенка) проявляется слабее, сохраняя, однако общую с предыдущим направленность различий там, где они достигали достоверной значимости (табл. 15, 16).

При рассмотрении спонтанной гипертензии крыс можно предполагать, что отмеченные здесь нарушения клеточной энергетики в тканях также обусловлены митохондриальной дисфункцией, хотя причины последней, по-видимому, иные, чем в случае токсического воздействия на организм трийод-тиронина. Ключевым звеном патогенеза этой формы экспериментальной патологии (как и первичной гипертензии человека) является недостаточность мембранной регуляции внутриклеточного кальция (мембранный «дефект») с образованием повышенных концентраций ионов кальция в цитозоле. Последующая аккумуляция избытка цитозольного кальция митохондриями может служить причиной нарушения энергообразовательной функции этих орга-нелл [Постнов 2000, Postnov 1981, Постнов, Бакеева 2000]. Конкретная причина нарушений клеточной энергетики, выявленных при почечной гипертензии, пока не имеет объяснения, однако причастность к этому феномену митохондрий вероятна. Основанием для этого предположения могут служить данные о механизме влияния ангиотензина II на клетку, которое проявляется в усилении входа Са2+ и высвобождении этого иона из ретикулума, чем вызывается повышение концентрации кальция в цитозоле и в митохондриальном матриксе. В условиях резкого активирования ренин-ангиотензиновой системы при почечной гипертензии кальциевая перегрузка митохондрии может служить причиной отмеченных нарушений энергетического состояния тканей. Однако конкретное содержание патогенетической связи нарушений тканевой энергетики и феномена артериальной гипертензии нуждается в дальнейшем изучении.

Результаты работы впервые демонстрируют изменения в клеточной энергетике различных тканей, общие для трех экспериментальных моделей системной артериальной гипертензии, имеющих аналогию в клинике человека в виде эссенциальной, реноваскулярной и тиреотоксической форм гипертензии.

Кроме того, регистрируются нарушение баланса энергопродукции и энергопотребления в клетках ряда тканей, что указывают на существование в них дефицита восполнения энергии при артериальной гипертензии.

Морфология митохондриального аппарата кардиомиоцитов крыс со спонтанной гипертензией (SHR).

Рассматривая возможные причины нарушений клеточно-тканевой энергетики при первичной гипертензии прежде всего следует определить причастность к этому митохондрии - клеточных органелл, играющих роль универсального поставщика энергии для всех клеточных функций. Энергия требуется и для обеспечения устойчиво неравновесного распределения ионов мембранным аппаратом клеток, т.е. поддержания константных величин градиентов ионных концентраций в цитоплазме клеток.

Целью настоящего исследования было изучение ультраструктуры ми-тохондриального аппарата кардиомиоцитов при спонтанной гипертензии крыс линии SHR и у крыс контрольной (нормотензивной) линии (WKY), с охватом основных этапов становления митохондриальной системы клеток в онтогенезе - от новорожденного животного до взрослого. Животные. В исследовании использовали крыс линии SHR и крыс контрольной линии WKY. Забирался материал от крыс - самцов обеих линий (по 3 животных каждой линии) в следующие сроки жизни: 2 нед., 4 нед., 6 нед., 12 нед., а также у новорожденных крыс, забитых в течение 2 часов с момента рождения (пол не определялся). Измерение давления животных (у 6-нед, 12-нед) производили стандартным методом на хвосте с помощью резиновой манжеты, фотоэлектрического датчика и записи на полиграфе. Животных забивали декапитацией под эфирным наркозом.

Изъятые тотчас после забоя кусочки миокарда левого желудочка фиксировали в 2,5% глутаровым альдегидом на фосфатном буфере, постфикси-ровали осмиевой кислотой и после дегидратации в спиртах возрастающей концентрации, заключали в эпоксидную смолу. Ультратонкие серийные срезы готовили на ультрамикротоме LKB-V (Швеция), контрастировали уранил-ацетатом и цитратом свинца и просматривали в электронном микроскопе JEM-100CX (Япония) при ускоряющем напряжении 80 КВ.

При электронно-микроскопическом исследовании кардиомиоцитов у крыс со спонтанной гипертензией выявлены значительные изменения структурной организации митохондриального аппарата, относящиеся как к пространственной организации популяции митохондрии в кардиомицитах, так и к структуре составляющих ее митохондрий.

Важно отметить, что эти изменения, в разной степени выраженные, прослеживаются на протяжении всех исследованных сроков онтогенеза - от новорожденного до взрослого (12 недель) животного, прогрессируя с возрастом.

В кардиомиоцитах новорожденных SHR, по сравнению с контролем, количество митохондрий уменьшено, они расположены в виде скоплений в зоне ядер (рис. 26), не обнаруживая между собой никаких структурных соединений. Встречаются митохондрии, расположенные непосредственно в ядре, что может быть связано либо с наличием глубоких инвагинаций в мембране ядра, либо с присутствием замкнутых вакуолей внутри последнего. Существование подобных вакуолей показано для дрожжевых клеток [Campbell 1998].

Исследование ультраструктуры кардиомиоцитов новорожденных SHR при большем увеличении выявляет значительные изменения внутренней организации митохондрий. На электронно-микроскопической фотографии ми-тохондриального кластера кардиомиоцита новорожденной крысы со спонтанной гипертензией (рис. 27) эти органеллы отличаются округлой шаровидной формой, удлиненные митохондрии отсутствуют.

Рисунок 26. Электронномикроскопическая фотография миокарда новорожденной крысы SHR. Митохондрии образуют скопления в зоне ядер. Стрелкой отмечена митохондрия, расположенная в ядре. Х24000.

Рисунок 27. Митохондриальный кластер кардиомиоцита новорожденной крысы SHR. Митохондрии округлой формы. Значительные отклонения в морфологии крист: наряду с правильными взаимопараллельным расположением, кристы образуют ячеистые структуры. Матрикс в состоянии набухания. х21000.

Существенно изменена морфология крист: наряду с правильным взаимно параллельным расположением в большинстве митохондрий, кристы образуют ячеистую структуру. Матрикс митохондрий светлый, соответствующий состоянию незначительного набухания. В отдельных митохондриях в матриксе видны обширные электронно-прозрачные зоны. Исследование подобных митохондрий на серийных ультратонких срезах показывает, что эти органеллы имеют необычную организацию: наружная митохондриальная мембрана ограничивает отдельные компартманты, образованные внутренней мембраной (рис. 31а). Подобные митохондрии определяют термином «септи-рованные митохондрии».

У 2-недельных SHR число митохондрий возрастает, но они все еще располагаются в виде скоплений около ядер кардиомиоцитов. Внутренняя организация митохондрий усложняется - они имеют более развитую систему крист, но также, как в митохондриях новорожденных SHR, матрикс органеллпросветленный, встречаются септированные митохондрии с электронно-прозрачными зонами в матриксе.

К 4-недельному возрасту у SHR и у крыс контрольной группы (WKY) окончательно формируется сократительная система кардиомиоцитов. Количество митохондриального материала резко увеличивается и основная масса митохондрий располагается рядами вдоль миофибрилл, однако нет объединения митохондрий в единую систему митохондриального ретикулума, известную для кардиомиоцитов в норме [Bakeeva 1983]: митохондриальные контакты отсутствуют, несмотря на близкое расположение и непосредственное прилегание отдельных органелл (рис. 28); митохондрии имеют светлый обводненный матрикс и округлую форму - признаки, указывающие на их набухание. Кроме этого, здесь также встречаются более крупные митохондрии, с локальными электронно-прозрачными зонами в матриксе (септированные митохондрии).

У 6-недельных SHR отчетливо различаются две популяции митохондрий. Основная масса митохондрий имеет просветленный матрикс, развитую систему крист, в которой, как и у новорожденных животных выявляются изменения в пространственной ориентации складок внутренней мембраны. Кроме этого в кардиомиоцитах присутствуют митохондрии, размеры которых во много раз превышают размеры основной популяции митохондрий (рис. 29). Большую часть объема таких митохондрий занимает электронно-прозрачный матрикс, в котором просматриваются замкнутые мембранные пузырьки, вероятно, разрушенные кристы. Немногочисленные кристы выявляются только по периферии этих органелл (см. также ниже).

Рисунок 28. Митоходрии кардиомиоцита SHR 4-х недель. Отсутствие меж-митохондриальных контактов, просветление матрикса. Форма митохондрий шаровидная. х52000.

У 12-недельных крыс со спонтанной гипертензией изменения структуры митохондрии прогрессируют. На фоне основной популяции митохондрий, находящихся в состоянии умеренного набухания, резко выделяются митохондрий, размеры которых во много раз превышают органеллы основной популяции (рис. 30). По своим характеристикам эти структуры соответствуют известным в литературе мегамитохондриям (Ммх) [Судариков 1997]. Подробный ультраструктурный анализ обнаруженных Ммх показал многокамерное их строение.

На рисунке 31 в показана мегамитохондрия, состоящая из 3 отдельных компартментов, ограниченных единой наружной митохондриальной мембраной. Механизм образования этих структур изучен недостаточно, в частности, в вопросе о том, являются ли Ммх следствием увеличения отдельных митохондрий или же результатом их слияния. Полученные нами данные впервые позволяют достоверно показать один из механизмов образования Ммх. Так, рисунок 31 (а, б, в) иллюстрирует основные этапы процесса поэтапного формирования мегамитохондрий.

Рисунок 29. Ультраструктура митохондриального аппарата кардиомиоцита 6-недельного самца SHR. В большинстве митохондрий матрикс просветлен, кристы с нарушенной пространственной ориентацией складок внутренней мембраны; присутствуют необычно крупные митохондрии с разрушенными кристами, остатки которых выявляются лишь по периферии органелл.

Рисунок 30. Мегамитохондрии в кардиомиоците SHR 12-и недель. Х21000.

Как видно на электронно-микроскопических фотографиях рис. 31, в септированных митохондриях увеличивается количество компартментов, происходит резкое увеличение и обводнение пространства матрикса, деструкция крист, в результате чего образуются ограниченные двумя мембранами замкнутые полости значительных размеров. Подобные структуры иногда определяют как очаговую деструкцию или «очаговую дегенерацию» кардио-миоцита или как «парциальный некроз» клетки, не связывая это явление с митохондриями.

Параллельно процессу образования Ммх из септированных форм митохондрий происходит развитие ультраструктуры основной популяции митохондрий от органелл небольшого размера (менее половины длины саркоме-ра), с немногочисленными кристами у новорожденных до крупных митохондрий, диаметром в величину саркомера, с плотно упакованными кристами у взрослых животных.

Исследоваие выявило значительные изменения в структурной организации митохондриального аппарата кардиомиоцитов у крыс со спонтанной гипертензией (SHR) - экспериментальной модели эссенциальной гипертензии человека. Изменения обнаружены как в пространственной организации митохондриального аппарата, так и в ультраструктуре составляющих его митохондрий.

Изменения, интенсивность которых нарастает с возрастом, впервые отмечены на протяжении всего периода становления митохондриального аппарата кардиомиоцитов в онтогенезе - от новорожденного до взрослого животного. Поскольку появление повышенного артериального давления у SHR в нашей популяции регистрируется между 5 и 6 неделями жизни, рабочая перегрузка миокарда в связи с гипертензией не может рассматриваться определяющим фактором развития выявленных изменений: в своих основных проявлениях они существуют ранее формирования гипертензии. Этот вывод соответствует положению о том, что у SHR отсутствует прямая корреляция между гипертензией и гипертрофией миокарда [Cutilletta 1978], что отмечено также при изучении наследования этих признаков у гибридов второго поколения (SHR х WKY) F2 [Петрухина 2000].

Формирование митохондриальной системы кардиомиоцитов SHR несколько отстает от такового у крыс WKY, что прослеживается как у новорожденных, так и у крыс 2 недельного и отчасти 4 недельного возраста. Проявляется это уменьшенным количеством митохондрий к моменту рождения с последующей задержкой группирования органел в околоядерной зоне, отсутствием межмитохондриальных контактов и замедлением процесса объединения митохондрий в единую систему митохондриального ретикулума.

На протяжении всего отрезка онтогенеза, прослеженного в настоящем исследовании (начиная с момента рождения), в кардиомиоцитах можно выделить две популяции, имеющих, по-видимому, различный путь развития. Основная - изменения в ультраструктуре которой ограничивается умеренным набуханием, просветлением матрикса, увеличением общего объема с изменением (округлением) формы митохондрий.

Рисунок 31. Превращение септированной (а) митохондрии в мегамитохонд-рию (б, в) в кардиомиоците SHR. а - новорожденное животное; х76000. 6-6-недельная крыса; х76000. в - 12-недельная крыса; х48000.

Другая, меньшая популяция митохондрий, существенно отличаясь по выраженности изменений ультраструктуры, проходит путь развития от обычных по размерам септированных митохондрий в кардиомиоцитах новорожденных до мегамитохондрий в более позднем возрасте.

Механизм и причины образования септированных митохондрий, как и патофизиологическое значение этого феномена, неизвестны. Показанное в нашем исследовании превращение септированных митохондрий в мегамито-хондрии внешне напоминает процесс ретенции, вызванной нарушениемтранспорта метаболитов между внутренним пространством митохондрий и цитоплазмой кардиомиоцита.

Функциональное значение изменений ультраструктуры основной популяции митохондрий можно объяснить на основе параллельных биохимических и цитологических исследований взаимосвязи структуры и функции этих органелл. По своим морфологическим характеристикам изменения ультраструктуры митохондрий в кардиомиоцитах крыс со спонтанной гипертензией соответствуют структуре митохонриальных препаратов при регистрации разобщения окисления и фосфорилиования. Подобные изменения структуры митохондрий показаны на изолированной диафрагме, а также в кусочках миокарда, инкубированных в присутствии 40 мкмолей 2,4-динитрофенола (концентрация, вызывающая разобщение процессов окисления и фосфорилирования). Кроме этого, в условиях in vivo, при холодовом разобщении окисления и фосфорилирования морфология митохондрий скелетной мышцы претерпевает те же изменения ультраструктурных параметров митохондрий, как и в нашем исследовании [Бакеева 1972, Бакеева 1978].

В пользу подобной интерпретации физиологического значения выявленных нами изменений свидетельствуют данные о резком усилении способности митохондрий, выделенных из ткани сердца SHR аккумулировать Са" из среды инкубации, содержащий этот ион в пределах от 3 до 30 мкмолей [Орлов 1980]. Известно, что аккумуляцияСамитохондриями и синтез в них АТФ - два альтернативных процесса, сопряженных с переносом электронов. Усиление Са2+-аккумулирующей способности митохондрий означает сокращение в них синтеза АТФ, что, повидимому, и происходит в кардиомиоцитах у спонтанно гипертензивных крыс уже с момента рождения, т.е. до развития гипертензии, находя подтверждение в исследованиях, регистрирующих нарушения энергетического обмена в сердце при этой форме первичной гипертензии [Писаренко 1998, Jelicks 1991]. Можно предполагать, что понижение способности митохондриального аппарата кардиомиоцтов синтезироватьАТФ является основной причиной как самого феномена концентрической гипертрофии левого желудочка сердца, так и причиной резкого измненения у SHR характера потребляемого миокардом «топлива» (энергоносителя), именно, снижение утилизации миокардом жирных кислот и увеличение потребления глюкозы. Подобный сдвиг приносит миокарду энергетическую выгоду, отчасти компенсируя недостаток АТФ, поскольку потребление глюкозы вместо жирных кислот дает на 10% более АТФ на каждый моль использованного миокардом кислорода [Christe 1994].

Нарушение продукции АТФ в митохондриях кардиомиоцитов в соответствии с механизмом, рассмотренным выше, по-видимому, не является изолированным явлением, а происходит и в других тканях у SHR, приобретая генерализованный характер. В частности, в клетках жировой ткани (адипоци-тах) спонтанно гипертензивных крыс линии SHR было выявлено более чем 1,5-кратное увеличение митохондриального пула кальция и отмечено резкое повышение способности митохондрий аккумулировать кальций, что означает подавление образования в них АТФ [Postnov, Orlov 1979, Postnov 1981,].

Данные о состоянии клеточно-тканевой энергетики при первичной артериальной гипертензии.

Немногочисленные данные о состоянии энергетического метаболизма клеток и тканей при первичной гипертензии не составляют единого направления и представлены, преимущественно, отдельными исследованиями, по большей части, решающими частные задачи вне какой-либо патогенетической концепции. Одной из предпосылок, позволяющих обсуждать проблему энергетики в плане патогенеза, являются данные о нарушениях при гипертензии ионтранспортной функции клеточных мембран, поскольку конечная зависимость ионного транспорта от энергии очевидна.

Так, рассматривая асимметричное распределение ионов, создаваемое на клеточных мембранах с помощью энергии АТФ, как разновидность устойчиво неравновесной термодинамическом системы, можно оценить имеющееся при первичной гипертензии уменьшение величины ионных концентрационных градиентов как признак не восполнения энергии в этой системе. Действительно, наличие при первичной гипертензии изменений цитоплазматической концентрации катионов в виде либо повышения концентрации одних ионов (Na+, Са2+), либо снижения других (Г, Мд2+) означает неспособность (недостаточность) клеточных мембран поддерживать в цитоплазме нормальные величины градиента концентрации важнейших ионов (Na+, К+, Са2+, Mg2+) по отношению к внеклеточной среде. Наличие дефицита энергообразования может явиться причиной этого феномена [Постнов, 1998].

Наличие дефицита энергии в различных типах клеток при первичной гипертензии можно, по-видимому, объяснить отмеченные в немногочисленных исследованиях изменения содержания адениннуклеотидов (АТФ, АДФ, АМФ), фосфокреатина (ФКр), креатина и неорганического фосфата. Одним из первых подобных исследований является работа Л.П. Емелиной, в которой показано изменение содержания адениннуклеотидов в эритроцитах крови больных эссенциальной гипертензией - снижение содержания АТФ на 28% по сравнению с контрольной группой, в сочетании с увеличением в них содержания АДФ, уменьшением отношения АТФ/АДФ и понижением величины энергетического заряда системы макроэргических фосфатов [Еме-лина, 1972].

В 1994 г. группа американских исследователей из лаборатории известного кардиолога J.H. Laragh, используя метод 31Р ЯМР - спектроскопии, также отметила значительное снижение содержания АТФ в эритроцитах при эссенциальной гипертензии и пришла к выводу о существовании при этой патологии нарушений клеточного энергетического метаболизма. Наличием дефицита клеточных энергетических ресурсов авторы пытались объяснить выраженную подверженность больных гипертензией ишемическим нарушениям в сердце и головном мозге [Resnick 1994].

Почти одновременно в Швеции было выполнено исследование по изучению энергетического баланса в скелетных мышцах не леченных больных эссенциальной гипертензией [Ronquist 1995]. Уникальность работы в том, что исследование проводили на биопсии биохимическими методами in vitro и одновременно in vivo, используя ЯМР-спектроскопию, до и после физической нагрузки. Авторы обнаружили у больных гипертензией 30% снижение содержания фосфокреатина, в то время как энергетический заряд и содержание адениннуклеотидов не были изменены. ЯМР- спектроскопическое исследование показало необычно медленное снижение содержания ФКр при физической нагрузке и замедленное его восстановление как и восстановление рН после окончания нагрузки. Отмечено, что феномен зеркально отражается медленным темпом понижения отношения АТФ/Фн во время физической нагрузки и замедленным восстановлением этого отношения после ее окончания. Авторы делают вывод о повышении скорости обмена АТФ в скелетных мышцах больных гипертензией, нормальный уровень которой обеспечивается за счет запаса энергии в системе фосфокреатина.

Конечной причиной изменения энергетического баланса в скелетной мускулатуре больных эссенциальной гипертензией авторы считают нарушенную ионную проницаемость клеточных мембран и обусловливают этим возрастание расхода энергии на активный транспорт ионов, обеспечивающий стабильность их неравновесного распределения и сохранения величины ионных концентрационных градиентов на мембранах миоцитов [Ronquist 1995].

Большинство работ по клеточной энергетике при первичной гипертензии выполнено на сердце крыс со спонтанной гипертензией и посвящено выяснению ее особенностей при нагрузочных пробах или временной ишемии миокарда. Характерно, что в силу естественной критической зависимости сократительной функции миокарда от поступления энергии изменения содержания адениннуклеотидов при гипертензии проявляются слабо, поскольку стабильный уровень АТФ в кардиомиоцитах поддерживается за счет фосфокреатина. Тем не менее, кроме некоторого и непостоянного снижения уровня АТФ в кардиомиоцитах SHR, по сравнению с WKY, при гипертензии находят повышенное содержание неорганического фосфата, уменьшение потенциала фосфорилирования и уменьшение содержания Mg 2+ [Jelicks 1991]. Более глубокие нарушения энергетики миокарда у SHR отмечены в виде проявлений неполного восстановления энергетического метаболизма при реперфузии сердца после ишемии или под воздействием перфу-зионной перегрузки [Buser 1991; Assedat 1992].

Сведения об особенностях обмена в тканях с низкой энергетической зависимостью представлены в доступной литературе единичным (обычно попутными) наблюдениями. Так, например, в большом исследовании о влиянии анестетиков на энергетический метаболизм сердца и печени в ткани последней у интактных крыс со спонтанной гипертензией отмечен более низкий уровень АТФ [Kashimoto 1994]. Так же единичные сведения о состоянии энергетического обмена при вторичных гипертензиях. Этот раздел представлен единственным исследованием, в котором показано значительное понижение, по сравнению с контролем, энергетическое обеспечений тромбоцитов при развитии острой ренин-зависимой гипертензии у крыс. В частности, у крыс с этой формой гипертензии содержание АТФ в тромбоцитахбыло снижено на 40% при уменьшенном отношении АТФ/АДФ [Шестакова 1989]. Наши исследования, приведенные в настоящей работе, восполняют информацию по этим вопросам.

Цель настоящего исследования - оценить способность изолированных митохондрий печени и мозга крыс SHR синтезировать АТФ и выяснить ее зависимость от концентрации вне митохондриального кальция.

Исследования проводили на крысах линии SHR (spontaneously hypertensive rats Okamoto - Aoki strain) и нормотензивных крысах линии WKY (Wistar - Kyoto) в возрасте 20 недель (самцы, масса 260-300 гр., систолическое давление 180-200 мм. рт. ст. и 90-120 мм. рт. ст. соответственно). К моменту исследования животные в течение суток не получали пищу при свободном доступе к воде. Выделение митохондрий производили из печени и мозга животного по методу, описанному D. Jonson, Н. Lardy. Митохондрии суспендировали в 0,25 М растворе сахарозы. Суспензию митохондрий во время эксперимента хранили на льду.

Для определения митохондриального дыхания полярографическим методом использовали электрод Кларка. Измерение проводили в буфере 1 следующего состава: сахароза - 150mM, КС1 - 75тМ, ротенон - 3 мкМ, КН2РО4 -5mM, MgCl2 - 2,5mM (рН 7,4). Реакцию начинали добавлением суспензии митохондрий (2-3 мг белка). Через 30-40 секунд после стабилизации системы добавляли сукцинат в конечной концентрации 10 мМ. Регистрировали скорость поглощения кислорода и через 40-60 секунд добавляли 200 мкМ АДФ. После последовательного изменения скоростей дыхания добавляли 100 мкМ 2,4-динитрофенола. Регистрировали убыль кислорода до наступления анаэробиоза. По полученной кривой рассчитывали коэффициент дыхательного контроля, коэффициент фосфорилирования АДФ/О и скорость фосфорилирования. Для изучения влияния кальция на перечисленные параметры в среду инкубации перед сукцинатом добавляли кальций в концентрации 5, 10, 20, 30 или 50 мкМ.

Содержание кальция в выделенных митохондриях определяли на атом-но-абсорбционном спектрофотометре Yanaco (Япония) с использованием беспламенной атомизации. Для измерения полученную после выделения суспензию митохондрий растворяли в 0,1% тритоне Х-100 в соотношении 1:10.

Синтез АТФ митохондриями in vitro измеряли двумя способами: с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии и с использованием люцефирин-люцеферазнеой реакции свечения в присутствии АТФ.

Синтез АТФ митохондриями печени измеряли в буфере, содержащем кальций в концентрациях 0, 5, 10, 20, 30 или 50 мкМ. В реакционный раствор добавляли сукцинат в конечной концентрации 10 мМ и препарат митохондрий (2-3 мг белка). Через минуту в этот раствор добавляли 200 мкМ АДФ и в момент перемешивания начинали отсчет времени. После этого из пробирки, где происходила реакция, через заданные интервалы времени отбирались пробы, которые вводили в пробирку с 5 М хлорной кислотой. Хлорная кислота разрушала митохондрии и тем самым останавливала синтез АТФ. После нейтрализации пробы 5 М гидроксидом калия и осаждения белка центрифугированием в супернатанте измеряли содержание аденин-нуклеотидов. По результатам измерения строили график зависимости содержания АТФ от времени. Скорость синтеза АТФ определяли по линейному участку полученной кривой (рис. 32).

Рисунок 32. Пример изменения концентрации макроэргических фосфатов в пробе в присутствии митохондрий.

0,050,0020—I40время, с6080Рисунок 33. Пример хроматограммы лизата митохондрий (WKY, 30 сек после добавления АДФ в среду инкубации)Содержание АМФ, АДФ и АТФ в пробах измеряли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (рис. 33).

Изократический обратнофазовый метод измерения, разработанный О. Sellevold с соавт. [Sellevold 1986], применяли с небольшими модификациями. Разделение проводили на колонке Beckman Analytical Pack (США) С-18 (сферические частицы Змкм, длиной 75мм и диаметром 4,2 мм). Детектирование осуществляли ультрафиолетовым детектором (Kontron Uvikon LCD 725, Швейцария) при длине волны 254 нм. Мобильная фаза содержала 220мМ ди-гидрофосфата калия, 2,3 мМ тетрабутил-аммониум-бромида и 3% ацетонит-рила, рН 6,2.

Синтез АТФ митохондриями головного измеряли люциферин-люциферазным методом [Jonson 1967] в буфере, содержащем 155 мМ сахарозу, 5 мМ MgCl2, 5 мМ сукцинат натрия, 11 мМ КН2Р04 -К2НР04 буфер рН 7.4, 1 мг/мл люциферазы и 7.1 мкМ люциферина. В реакционный раствор добавляли суспензию митохондрий в конечной концентрации 0,2 мг/мл, перемешивали и начинали реакцию добавлением 200 мкМ АДФ. Скорость синтеза АТФ определяли по линейному участку полученной кривой (рис. 34). Кальций в концентрации 20 и 40 мкМ вносили в реакционный раствор перед добавлением митохондрий.

Рисунок 34. Пример записи люцеферин-люцеферазной реакции на люмино-метре LKB 1250 (Швеция). Стрелкой обозначен момент добавления АДФ.

Концентрацию белка в пробах определяли методом Бредфорда. Для оценки функционального состояния митохондрий использовался также показатели коэффициента дыхательного контроля, скорости фосфорилирования и коэффициента фосфорилирования. Представлялось важным не только сравнить эти параметры митохондрий у SHR и WKY, но и изучить влияние на них возрастающих концентраций внемитохондриального кальция.

Скорость синтеза АТФ. Результаты измерения скорости синтеза АТФ в митохондриях печени крыс SHR и WKY, а также зависимость скорости синтеза от концентрации кальция во внешней среде приведены на рис. 10. Показано, что в митохондриях печени крыс SHR по сравнению с WKY на 30% снижена скорость синтеза АТФ. Повышение концентрации наружного кальция в митохондриях WKY снижает скорость образования АТФ на 40 % (р<0.01), в то время как в митохондриях SHR скорость синтеза АТФ практически не изменяется. При 50 мкМ кальция в среде инкубации скорости синтеза АТФ в митохондриях печени крыс SHR и WKY практически одинаковы (рис. 35).

Рисунок 35. Зависимость скорости синтеза АТФ в митохондриях печени крыс SHR (п=8) и WKY (п=8) от концентрации кальция в среде инкубации. * - р<0.05, **- р<0.01, по сравнению с WKY.■—WKY ■•— SH RО0,45 01 020304050Концентрация кальция в среде, мкМРезультаты измерения скорости синтеза АТФ митохондриями головного мозга крыс SHR и WKY, а также зависимость скорости синтеза от концентрации кальция во внешней среде приведены на рисунке 36. За 100% принята скорость синтеза АТФ в митохондриях крыс WKY в среде без кальция.

Показано, что в митохондриях головного мозга крыс SHR по сравнению с WKY на 30 % снижена скорость синтеза АТФ (р<0.05). Внесение в среду кальция в концентрации 20 мкМ значительно (почти на 50 % от исходного уровня) снижает скорость синтеза АТФ как в митохондриях SHR, так и в митохондриях WKY. При этой концентрации кальция скорость синтеза АТФ у SHR также достоверно ниже по сравнению с WKY. Увеличение концентрации кальция в среде до 40 мкМ еще значительнее снижает скорость синтеза АТФ как в митохондриях SHR, так и в митохондриях WKY, при этом достоверность различий между SHR и WKY сохраняется. Интересно, что увеличение концентрации кальция в среде от 20 до 40 мкМ не оказывает значительного влияния на скорость синтеза АТФ в митохондриях SHR, но достоверно снижает скорость синтеза АТФ в митохондриях WKY (р=0,05).

Рисунок 36. Влияние Са" на скорость синтеза АТФ митохондриями головного мозга крыс SHR и WKY.п=ьQ>(О 1СЛ'v> а>с<ла.ь-<100 •75 ■50 •25 П=6—■—wky —о— shrп=бп=бг 102030I40Наиболее вероятной причиной снижения АТФ в митохондриях SHR может быть перегрузка этих органелл Са источником которого может быть избыток цитозольного кальция [Постнов 1987], образующийся в связи с характерным для первичной гипертензии нарушением мембранной регуляции внутриклеточного распределения этого иона и развивающейся в этих условиях недостаточности функции mPT-пор, выводящих кальций из матрикса митохондрий. Наличие функциональных нарушений тРТ- пор в митохондриях мозга SHR подтверждается более усиленной аккумуляцией Са" изолированными митохондриями SHR (по сравнению с контролем) при инкубации последних с нарастанием концентрации кальция в среде инкубации [Kravtsov 1983].

Данные настоящего исследования о снижении АТФ-продуцирующей способности митохондрий головного мозга спонтанно гипертензивных крыс (SHR) свидетельствуют в пользу существования в клетках мозга при гипертензии дефицита энергообразования.

Скорость фосфорилирования оценивали по расходу кислорода для производства АТФ из заданного количества АДФ. Показано, что при отсутствии кальция во внешней среде скорости фосфорилирования в митохондриях печени крыс SHR и WKY практически не различаются. С ростом концентрации кальция в среде скорости фосфорилирования имеют тенденцию к снижению, причем у SHR в большей степени, чем у WKY, достигая при концентрации внешнего кальция 30 мкМ статистически значимого различия.

Коэффициент дыхательного контроля непосредственно отражает степень сопряжения дыхания и фосфорилирования в полученных препаратах митохондрий. С ростом концентрации кальция дыхательный коэффициент падает, как у WKY, так и у SHR, однако у последних снижение происходит быстрее. При концентрации кальция во внешней среде 50 мкМ коэффициент дыхательного контроля в митохондриях SHR равен 1, что означает наступление полного разобщения дыхания и фосфорилирования.

Отношение АДФ/О. Об эффективности окисления АДФ митохондриями SHR и WKY судили по отношению АДФ/О. Показано, что с ростом концентрации кальция эффективность окисления в митохондриях SHR достоверно снижается, в то время как в митохондриях WKY различия по этому параметру недостоверны.

Содержание кальция в выделенных митохондриях печени крыс SHR и WKY перед инкубацией, измеряли методом атомно-абсорбционной спектроскопии. Различий по этому параметру не отмечено. Однако, данный метод дает содержание в митохондриях общего кальция (и связанного и свободного) и не позволяет оценить содержание свободного кальция, имеющего определяющее влияние на все кальций зависимые процессы.

Впервые обнаруженное настоящим исследованием существенное (в среднем на 30%) снижение скорости синтеза АТФ в митохондриях печени крыс со спонтанной гипертензией дает прямое объяснение выявленному ранее (в сотрудничестве с лабораторией О.И.Писаренко) факту уменьшения содержания АТФ в клетках печени SHR по сравнению с таковым у нормотензивных животных контрольной группы WKY [Писаренко 1998]. Наиболее вероятной причиной подавления АТФ в митохондриях гипертензивных крыс является перегрузка этих органелл кальцием, источником которой можетIбыть избыток цитозольного кальция [Са ]с, образующийся вследствии нарушенной мембранной регуляции этого иона [Постнов 2000, Постнов 2001].

Данные М. Devynck с соавт., показавших уменьшение Са-связывающей способности плазматической мембраны гепатоцитов крыс SHR [Devynck 1981], могут служить косвенным доказательсством существования в клетках печени нарушения кальциевого баланса, как одного из проявлений мембра-нопатии, характерной для первичной гипертензии. В исследованиях нашей лаборатории (С.Н. Орлов с соавторами) по изучению in vitro обмена кальция в жировой ткани SHR [Postnov 1981], а также при первичной (эссенциальной) гипертензии у людей [Postnov 1980], было показано значительное (в 1,5 -1,7,по сравнению с соответствующим контролем) увеличение пула внутриклеточного обмениваемого кальция, принадлежность которого к митохондриям адипоцитов была очевидной из сравнения величины пула митохондрий и других Са-депонирующих структур этих клеток [Орлов 1980]. Наконец, изучение процесса аккумуляции кальция изолированными митохондриями при варьировании концентраций этого катиона в инкубационной среде от 3 до 30 мкМ показало резкое превышение у SHR, по сравнению с WKY, Са-аккумулирующей способности митохондрий, нарастающее по мере увеличения концентрации кальция в среде. Различия были обнаружены в трех видах клеток — в кардиомиоцитах [Орлов 1980], в клетках жировой ткани [Postnov 1980], и в синаптосомах, выделенных из головного мозга [Kravtsov 1983]. Эти данные свидетельствуют прежде всего о том, что важнейшим следствием ранее выявленных распространенных мембранных нарушений [Postnov 1984] при первичной гипертензии вообще и спонтанной гипертензии крыс в частности, является кальциевая перегрузка митохондрий, ведущая к снижению синтеза АТФ в тканях различных органов.

Поскольку освобождение матрикса митохондрий от поступающего в избытке цитозольного кальция осуществляется через специальные каналы, названные шРТ-порами (mitochondrial permeability transition pores [Zoratti 1995]). Феномен резкого повышения аккумуляции изолированными митохондриями в клетках SHR в приведенных выше исследованиях, как и обнаружение укрупненных пулов обмениваемого кальция в адипоцитах, следует, по-видимому, рассматривать как следствие нарушенной функции этих тРТ-каналов. Известно, что транспортная, мелиоративная способность этих каналов при длительной и интенсивной кальциевой перегрузке митохондрий может необратимо изменяться [Miller 1998, Leninger 1967]. Вероятно, нарушением работы mPT-пор в митохондриях SHR можно объяснить исходные различия в АТФ синтетической функции изолированных митохондрий SHR и WKY при отсутствии кальция в среде инкубации, как и низкую чувствительность скорости синтеза АТФ на повышении концентрации внемитохондри-ального кальция (рис. 35, 36).

Существование в митохондриях SHR нарушений в механизме выведения кальция через mPT-каналы хорошо объясняет и более раннее чем у WKY (т.е. при меньших концентрациях кальция в инкубационной среде) разобщение дыхания и фосфорилирования. Подобный тип разобщения подробно описан в работах A. Leninger с соавт. [Leninger 1967] и интенсивно изучается в аспекте участия в нем mPT-каналов [Huser 1999, Brustovetsky 2000].

Данные, впервые представленные настоящим исследованием, свидетельствуют в пользу того, что клеточный энергетический дефицит, проявления которого ранее обнаружены в различных тканях при первичной гипертензии, является следствие разобщения окисления и фосфорилирования в митохондриях клеток в связи с кальциевой перегрузкой последних.

Для прояснения природы кальциевой перегрузки митохондрий было предпринято исследование кальций индуцируемого выхода кальция из мито-зондрий.

Особенности кальций-индуцируемого выхода кальция из митохондрий печени спонтанно-гипертензивных крыс.

Обнаружение многочисленных отклонений в энергетическом статусе клеток различных тканей при спонтанной гипертензии крыс (Spontaneosly Hyprtensive Rats - SHR) подтверждают важную роль дефицита клеточного энергообразования в развитии этой патологии [Постнов 2001]. На его существование указывает показанное выше снижение энергетического заряда в системе и уменьшение отношения АТФ/АДФ, а также перераспределение содержания АТФ, АДФ, АМФ в тканях с относительно низкой скоростью утилизации АТФ (печень, селезенка) [Писаренко 1998]. Дальнейшие исследования, проведенные в нашей лаборатории, показали, что выявленные изменения энергетического баланса клеток у SHR связаны с нарушением АТФсинтетической функции митохондрий [Будников 2002, Дорощук 2004], что было показано для тканей печени и головного мозга. В частности, у митохондрий SHR было обнаружено снижение скорости синтеза АТФ и коэффициента дыхательного контроля. В этих работах были также исследованы зависимости указанных параметров от концентрации свободного кальция в среде измерения. Показано снижение устойчивости митохондрий SHR к кальциевой перегрузке по сравнению с контролем, которое проявляется в ещё большем отрицательном влиянии на функцию синтеза АТФ. Таким образом, вероятной причиной подавления митохондриального синтеза АТФ является перегрузка этих органелл кальцием, источником которой может служить избыток цитозольного кальция, образующийся вследствие нарушенной мембранной регуляции этого иона при артериальной гипертензии [Постнов 1987]. Поэтому изучение систем кальциевого гомеостаза митохондрии и взаимосвязь этих систем с системой синтеза АТФ при первичной гипертензии представляет большой интерес. Настоящее исследование посвящено изучению работы систем, регулирующих концентрацию кальция в митохондриях печени крыс SHR, а именно особенностям кальций-индуцируемого выхода кальция (Calcium Induced Calcium Release - CICR) [Ichas 1997].

Исследования проводились на 8 крысах линии SHR (Spontaneously Hypertensive Rats Akamoto-Aoki strain) и 8 нормотензивных крысах линии WKY (Wistar-Kyoto Rats), самцах, в возрасте 20 недель (масса 260-300 г, систолическое давление 180-200 мм. рт. ст. и 90-120 мм. рт. ст. соответственно). К моменту исследования животные в течение суток не получали пищу при свободном доступе к воде.

Выделение митохондрий производили из печени животного по методу, описанному выше. Полученные митохондрии суспензировали в буфере, содержащем 250 мМ сахарозы, 5 мМ HEPES рН 7,4 и хранили на льду. Концентрацию митохондриального белка в полученной суспензии митохондрий перед началом опытов оценивали спектрофотометрически, и впоследствии уточняли по методу Лоури.

Скорость поглощения и выделения кальция митохондриями регистрировалась при помощи кальциевого электрода Orion 93-20 и цифрового многоканального рН-метра-иономера Эконикс "Экотест-120". Измерение проводили в буфере следующего состава: сахароза 155 Мм; MgCl2 2,5 мМ; сукци-нат калия 5мМ; КН2Р04/КН2Р04 2 мМ; рН 7,4. Начальная концентрация кальция в среде измерения С0 задавалась добавлением раствора хлорида кальция. Измерения проводились в диапазоне концентраций 10"6-10"3 М. Реакция поглощения кальция начиналась в момент добавления митохондрий в среду. Концентрация белка митохондрий в пробе составляла 2,8 мг/мл. Типичная кривая, характеризующая митохондриальный цикл кальций-индуцированного выхода кальция (CICR), приведена на рис. 36а. Для количественного описания цикла CICR было введено 7 параметров, которые вычисляются из каждой индивидуальной кривой. Параметры С0 и Cmjn соответствуют начальной и минимальной концентрациям ионов кальция в среде измерения, параметры ti и t2 характеризуют продолжительность цикла. Скорость Vi соответствует фазе поглощения ионов кальция митохондриями из внешней среды, а скорости V2 и V3 - выбросу кальция митохондриями в среду. В процессе обработки результатов было обнаружено, что взаимосвязанные параметры tb t2 и Cmjn несут одну и ту же информацию, и для дальнейшего анализа можно выбрать лишь один из них. Из этих параметров наиболее уверенно и с наименьшей погрешностью определялся параметр длительности цикла t].

Набухание митохондрий регистрировали спектрофотометрически при длине волны 540 нм в буфере следующего состава: сахароза 250 мМ, MgCl2 2,5 мМ, сукцинат калия 5мМ, КН2Р04/ КН2Р04 5 мМ (рН 7,4). Концентрация5 3кальция в среде варьировалась в интервале 10" -10" М. Реакцию начинали добавлением суспензии митохондрий (2,8 мг белка)На рисунке 376 приведены типичные кривые изменения концентрации кальция в среде после добавления митохондрий. В первый момент наблюдается резкое снижение концентрации кальция в среде измерения вследствие поглощения ионов кальция митохондриями. Далее наступает насыщение, что проявляется в достижении некоторой минимальной концентрации в среде. Затем начинается фаза выброса кальция митохондриями обратно в среду и постепенно концентрация кальция в среде достигает своего начального уровня.

По мере увеличения начальной концентрации кальция в среде продолжительность цикла уменьшается, и минимальная концентрация возрастает, возрастает также скорость выброса кальция в фазе выхода.

Все закономерности цикла CICR характерны для митохондрий как SHR так и WKY. Однако выход кальция из митохондрий при спонтанной гипертензии имеет ряд особенностей. На рисунке 38 приведен типичный пример кривой циклов кальций-индуцируемого выхода кальция для митохондрий SHR и WKY при 55цМ Са. Из рисунка видно, что длительность цикла у митохондрий, выделенных из печени крыс SHR на треть меньше и митохондрии WKY способны снижать содержание кальция в среде до более низкой концентрации (на 30+5% ниже), чем митохондрии SHR. При этом длительность цикла и способность снижать содержание кальция в среде для нормотензив-ных животных в 1,30+0,05 (р<0.05) превышает таковую для гипертензивных во всей области изученных концентраций кальция.

Рисунок 37. а) Кривая, характеризующая цикл кальций-индуцированного выхода кальция (CICR). Со - начальная концентрация кальция в среде; Cmin -минимальная концентрация ионов кальция в среде, V! - скорость поглощения ионов кальция митохондриями, V2 и V3 - скорости выброса кальция митохондриями, ti и t2 - продолжительность быстрой и медленной фазы выброса, б) CICR при различных концентрациях кальция С0. "М" -добавление митохондрий в среду. 1-75 мкМ; 2- 105 мкМ; 3-115 мкМ; 4-125 мкМ.

100 200 300 400 500Время, секВремя, секЗависимость скорости поглощения ионов кальция митохондриями из среды измерения от начальной концентрации кальция приведена на рис. 39. Она представляет собой прямую пропорциональность — с ростом начальной концентрации С0 абсолютное значение скорости возрастает, причём для SHR и WKY зависимость едина, т.е. во всем диапазоне изученных концентраций кальция скорость его поглощения митохондриями спонтанно гипертензив-ных крыс такая же, как в контроле.

Рисунок 38. Кривые циклов кальций-индуцируемого выхода кальция для митохондрий, полученных от одной из пар SHR (сплошная линия) и WKY (прерывистая линия) в одном сеансе выделения при начальной концентрации Са 55|аМ. Момент добавления митохондрий помечен стрелкой и буквой "М".

6,0x10"5 п5,0x10"4,0x10 "- 3,0x10 "сч (ОО2,0x10"'1,0x10"0,0200-1-1—300—I— 400—I-1-1-1-1500 600 700Время, секРисунок 39. Зависимость скорости поглощения ионов кальция митохондриями из среды измерения Vi от начальной концентрации кальция в среде Сп.с0, цмКак указывалось выше, индуцированный выход кальция из митохондрий в среду происходит в две стадии. Зависимость скорости выхода кальция из митохондрий в первой стадии выхода V2 от начальной концентрации кальция в среде С0 приведена на рис. 40. Как и остальные параметры, скорость V2 линейно зависит от начальной концентрации С0. При этом, в области концентраций больше 120 мкМ, скорость V2 для SHR достоверно выше, чем для WKY. Увеличение скорости выброса кальция из митохондрий гипер-тензивных крыс в этом диапазоне концентраций составляет в среднем 30% ±5 % (р< 0,002). Вторая стадия выброса характеризуется скоростью V3, но этот параметр определялся с большой погрешностью, в полной мере его количественный анализ провести не удалось. Можно лишь указать, что эта скорость так же, как и Vi возрастает с увеличением начальной концентрации кальция в среде С0, однако достоверных различий между SHR и WKY обнаружено не было.

Скорость набухания митохондрий при концентрациях кальция выше 10'4 М также достоверно выше у SHR и составляет 123+12% (р<0.05) по сравнению WKY (100%). Необходимо отметить, что начало набухания митохондрий соответствует по времени началу выброса из них кальция.

Рисунок 40. Зависимость скорости выхода кальция из митохондрий в первой стадии выхода У2 от начальной концентрации кальция в среде С0.регуляции и обмена кальция при спонтанной гипертензии, выявленные ранее для плазматических мембран разных типов клеток, присутствуют и в мембране митохондрий. Имеющиеся данные позволяют сделать вывод, что более ранний (в ответ на меньшую концентрацию поглощенного кальция) выход кальция из митохондрий SHR вызван изменениями в функционировании mPT-пор [Zoratti 1995]. Об открытии mPT-пор в режиме высокой проводимости говорит тот факт, что кальций-индуцируемый выброс кальция в наших экспериментах ингибировался циклоспорином (данные не приводятся), и что одновременно с выбросом кальция из митохондрий начиналось их набухание. Нарушение функционирования mPT-пор у крыс SHR проявляются как в более раннем (в ответ на меньшую концентрацию поглощенного кальция) их открытии, так и в увеличении скорости выброса кальция и набухания митохондрий. Нужно отметить, что скорость поглощения кальция митохондриями, которая не связана с работой mPT-пор, при спонтанной гипертензии крыс не отличается от нормы.

Полученные результаты подтверждают уже установленный ранее в наших работах факт снижения устойчивости митохондрий SHR к кальциевой перегрузке, в частности, более раннее по сравнению с WKY наступление разобщения дыхания и фосфорилирования при добавлении кальция в среду инкубации [Будников 2002].

Можно предполагать, что снижение устойчивости митохондрий SHR к кальциевой перегрузке связано с уже имеющимся в митохондриях SHR избытком свободного кальция. По ранее полученным в лаборатории данным при концентрациях кальция от 3 до 30 мкМ было отмечено резкое превышение Са-аккумулирующей способности митохондрий жировой ткани и миокарда SHR по сравнению с контролем (WKY), нарастающее по мере увеличения кальция в среде. При изучении in vitro обмена кальция в жировой ткани SHR было показано увеличение в 1.5-1.7 раза пула внутриклеточного обмениваемого кальция, принадлежность которого к митохондриям была очевидна из сравнения величины кальциевого пула митохондрий и других каль-ций-депонирующих структур. В нашей работе мы не зафиксировали достоверных различий в скорости поглощения кальция между митохондриями SHR и WKY при концентрациях ниже 100 мкМ, однако наш метод позволяет лишь косвенно оценить содержание кальция в митохондриях.

Снижение устойчивости митохондрий печени SHR к кальциевой перегрузке, очевидно, связано с ускорением перехода mPT-пор в режим высокой проводимости, возможной причиной которого может быть повреждение структуры mPT-канала в результате каких-либо воздействий, например, в результате этой же кальциевой перегрузки митохондрий или действия какого-либо вещества, способствующего переходу каналов в проводящий режим. Переход mPT-пор в проводящий режим приводит к сбросу ионных градиентов на внутренней мембране митохондрий, что влияет на снижение АТФ-синтезирующей способности митохондрий и в свою очередь приводит к развитию энергетического клеточного дефицита. Таким образом, проявляется взаимосвязь между распространенными мембранными нарушениями и клеточным энергетическим дефицитом.«Окислительное накопление» ионов Са2+ в митохондриях, по Ленинжеру, как вариант митохондриального разобщения.

Изолированные интактные митохондрии обладают способностью в процессе дыхания накапливать Са2+ и некоторые другие двухвалентные катионы. Процесс прекращается при добавлении в среду 2,4-динитрофенола или ингибиторов дыхания, что указывает на его зависимость от энергии, поставляемой ТЦЭ. Ленинжер с соавт. [Lehninger 1967] показали, что при накоплении Са2+ в митохондриях снижается образование АТФ. Таким образом, энергия переноса электронов по дыхательной цепи может использоваться либо на синтез АТФ, либо на накопление кальция, но не на осуществление обоих этих процессов одновременно. Поскольку накопление ионов Са + в митохондриях сопровождается выкачиванием эквивалентного количества Н+ из матрикса в среду и уменьшением образования АТФ, т.е. своеобразным видом разобщения работы ТЦЭ и процесса образования АТФ, «окислительное накопление» Са митохондриями, оказалось ключевым феноменом в случаях развития целого ряда патологических процессов, в которых просматривается определяющая роль дефицита клеточного энергообразования, а также сопровождающего режим подобного дефицита усиления образования побочных продуктов работы ТЦЭ - реактивных окислительных веществ (окислительного стресса). Оба эти явления играют роль в патогенезе рассматриваемой нами патологии..::.!. - I:;';.:':.'.143.:;::. ::.л::/.- : : ■ ■.

КалЩиЬв&й koHrhprnfrriampukcHtiix д%гйдрогеНазУ\ ■ 'Из многих факторов, регулирующих работу дыхательной цепи митохондрий и энергообразовательную функцию органелл (скорость утилизации АТФ, концентрация АДФ во внешней среде, концентраций кислорода, объемных и конформационных изменений митохондрий и других факторов) особый интерес, в силу избранной тематики исследования, представляет роль кальция в механизме митохондриальном энергообразования.

Известно, что концентрация цитозольного кальция определяет уровень сво94- 94бодного Са в митохондриальном матриксе. Выравнивание концентрации Са в обоих пулах осуществляется работой переносчиков в мембране митохондрий: электрогенным однонаправленным переносчиком осуществляется по94глощение иона (uptake), выход обеспечивается Na/Ca обменником, а также работой каналов (пор) временной митохондриальной проницаемости, создающих род концентрационно-пространственных осцилляции Са2+ в цитозоле (подробнее ниже). Этой сигнализацией опосредуется связь систем интеграции организменного уровня с митохондриями как эффекторами энергообразования (см. ниже).

Концентрация свободного кальция в митохондриальном матриксе поддерживается на уровне 100-500 nM [Somlio 1985, McCormack 1989, 1990]. Временное повышение этого уровня стимулирует работу трех матриксных дегидрогеназ: пируват дегидрогеназы, NADH-изоцитрат дегидрогеназы и 2-оксиглютарат дегидрогеназы, влияя тем самым на интенсивность дыхания и синтез АТФ. Одно из значений стимулирования Са матриксных дегидрогеназ состоит, по-видимому, в предотвращении опасного для клетки критического падения отношения АТФ/АДФ путем одновременного стимулирования продукции АТФ и процессов его утилизации. Предполагается также, что Са2+ контроль матриксных дегидрогеназ предотвращает избыточное расходование свободной энергии путем утечки протонов [Brown 1992].

Побочные продукты транспортной цепи системы OXPHOS - реактивные окислительные вещества (reactive oxygen species ROS, реактивные окислительные вещества).

В процессе активного дыхания большая часть потребляемого кислорода превращается в воду, но часть электронов из комплекса I и убихинонового цикла (от CoQH-, см. рис. ) непосредственно переходят на кислород, образуя ион супероксида (супероксиданион -02-). Последний с помощью магний-содержащей супероксид-десмутазы (MnSOD), действующей в матриксе митохондрий и SOD, содержащей молекулы меди и цинка (Cu/Zn SOD) в ци-тозоле, превращается в перекись водорода (Н2О2). Перекись водорода под влиянием глютатион-пероксидазы (GPx) в присутствии переходных металлов превращается в гидроксильный ион (ОН) - наиболее активный радикал из всех побочных окислительных продуктов (ROS) транспортной цепи электронов. В отличие от супероксиданиона и перекиси водорода гидроксильный ион не имеет специальных ловушек [Bandy 1990; Goldhaber 1992].

Предполагается, что до 5% всего кислорода, поступающего в дыхательную цепь митохондрий, идет на образование побочных продуктов окисления. Подавление транспорта в ТЦЭ вызывает накопление электронов на ранних этапах транспорта и этим усиливает образование реактивных окислительных радикалов (reactive oxygen species, ROS) [Ksenzenko 1983].

Однако длительный избыток образования этих продуктов вызывает повреждения митохондриальных протеинов, липидов и нуклеиновых кислот (окислительный стресс). Острое и интенсивное воздействие окислительного стрессаможет инактивировать (Fe-S) центры I, II и III комплексов системы OXPHOS (Turrens J.F.Boveris А., 1980; Turrens J.F. et al, 1985), а также ингибировать аконитазу в цикле трикарбоновых кислот, снижая уровень энергопродукции митохондрий [Wallace 1999].

Особый интерес в плане развиваемой темы представляют данные о связи процессов генерации кислородных радикалов, образующихся при работе митохондриального OXPHOS, с системой тканевой (особенно эндотелиальной) продукции оксида азота, играющего важную роль в регуляции тонуса сосудов и периферического кровообращения вообще.

В качестве «ловушки» для NO супероксиданион, выступающий при взаимодействии с оксидом азота как восстановительный агент, отдавая электрон на образование из NO перокси нитрита (ONOO"). ONOO" обладает еще большей реакционной способностью, чем NO или 02. Участвуя во многих реакциях, в том числе в нитрозилировании тирозиновых остатков в белках, пере-кисном окислении липидов, инактивации аконидаз и подавлении транспорта электронов в митохондриях, пероксинитрит вызывает развитие апоптоза и мутаций [Волин 1998].

Реактивные окислительные радикалы влияют на эндотелий-зависимое расслабление, которое в значительной мере определяется равновесием между О2" NO. В условиях усиленной генерации 02 это равновесие может смещаться от вазодилятаторного эффекта NO к проявлениям повреждающего действия ONOO и усиления вазоконстрикторных проявлений [Somers 1999).

Реактивные окислительные радикалы, кроме воздействия на NO, оказывают прямое влияние на сердечно-сосудистую систему как внутри- и межклеточные медиаторы передачи сигнала, модулируя тонус и структуру сосудов. Так например, 02" и Н202 вызывают сокращение сосудов [Cosentino 1994] и пролиферацию сосудистых гладкомышечных клеток [Rao 1992]. Более того, усиленное образование реактивных окислительных радикалов обнаруживается в культуре эндотелиальных клеток у крыс с генетически детерминированной гипертензией (SHRSP), [Grunfeld 1995], и в сосудах животных с гипертензией, вызванной инфузией ангиотензина II [Laursen 1997].

Однако связь энергообразования с кровообращением, помимо влияния побочных продуктов работы электронной транспортной цепи митохондрий на систему оксида азота, может, по-видимому, осуществляться и другим путем. Выявленная в ряде исследований способность эритроцитов выделять в кровь содержащийся в них АТФ [Bergfeld 1992; Ellsworth 1995], а, следовательно, допущение механизма трансмембранного транспорта этого нуклеотида в эритроцитах как и транспортной роли эритроцитов в переносе АТФ, в сочетании с четким эффектом релаксации при интралюменальном введении сравнительно малых количеств АТФ [Ellsworth et al, 1995], дали основание предположить существование особого механизма регуляции периферического кровообращения. Он реализуется через воздействие приносимого эритроцитами АТФ на Р2у - пури-норецепторы эндотелия и стимуляцию эндотелием продукции того же оксида азота (N0) и простациклина, PGI2 - не менее мощного вазодилятатора [Martin 1985].

Нарушение окислительного метаболизма головного мозга как фактор патогенеза артериальной гипертензии.

Одним из факторов, способных сдвинуть set-point в системе регуляции артериального давления в сторону больших значений системного АД (гипертензии), является окислительный метаболизм головного мозга, критическая зависимость которого от кровоснабжения, а, следовательно, от обеспеченности кислородом и связанного с этим энергетическим обеспечением, общеизвестна.

Зависимость системного кровообращения и уровня артериального давления от достаточности окислительного метаболизма в головном мозге хорошо иллюстрируется экспериментальными исследованиями по воспроизведению так называемой церебральной ишемической гипертензии. Ограничение мозгового кровотока двусторонней поэтапной перевязкой внутренней и наружной сонных артерий вызывает у подопытных животных (опыты успешны на кроликах), значительное - до 200 мм рт.ст., повышение системного АД, которое возвращается к исходному уровню через 12-15 недель, с развитием коллатерального кровообращения через систему вере-тебральных артерий [Rosenfeld 1952, Сучков 1970, Горькова 1972]. Развитие гипертензии сопровождается четким активированием практически всех систем, обеспечивающих стойкое повышение АД, способного преодолеть и компенсировать метаболические последствия, вызванные ограничением кровоснабжения ткани мозга и связанной с ним гипоксии. Так, становление гипертензии сопровождается развитием гипертрофии коры надпочечников, обеспечивая повышенный синтез и гиперсекрецию кортикостероидных гормонов, усилением активности ренин-ангиотензинной системы, гипертрофией и усилением секреторной активности крупноклеточных не-иросекреторных гипоталамических ядер-супраоптического и паравентрику-лярного, обеспечивая повышенный синтез и секрецию антидиуретического гормона (вазопрессина) и оксиитоцина. Доказано, что эта гипертензия опосредуется через механизм почечного «переключения» (kidney shifting по А. Guyton), что проявляется в структурном ремоделировании почек, в развитии которого играет центральную роль играет симпатическая нервная система.

Хотя попытки рассматривать недостаточность мозгового кровообращения в качестве основного причинного фактора эссенциальной гипертензии человека [Dickinson 1961] в свое время не были признаны состоятельными из-за наличия в мозгу механизма ауторегуляции кровообращения, обеспечивающего максимальную сохранность мозгового кровотока. Многие белее современные исследования определяют этот уровень как определенно более низкий у гипертоников, чем у людей с нормальным артериальным давлением [Shaw 1984; Rodriguez 1987; Nobili 1993; Thulin 1993] и поэтому, соответственно требующим коррекции повышением перфузионного (системного) давления.

Между тем, достаточно определенные указания на наличие изменений в окислительном метаболизме головного мозга при первичной гипертензии следуют из давних исследований, посвященных изучению газового состава притекающей к мозгу и оттекающей от него крови и из расчетов, так называемого, дыхательного коэффициента (ДК) мозга. ДК - отношение образовавшегося количества С02 к количеству потребленного кислорода. Полагают, что ДК определяется главным образом видом «топлива», окисляемого для образования энергии.

Полное окисление глюкозы (основного вида мозгового «топлива» взрослого человека) производит то же количество молекул ССЬ что и количество молекул потребленного 02 и поэтому ДК в этом случае равен или близок к единице. Окисление других энергоносителей дает ДК меньше этого значения (для жиров примерно 0,71 и для аминокислот около 0,81). Приведенные Dickinson, сводные данные по дыхательному коэффициенту мозга (151 больной эссенциальной гипертензией и 223 индивидуума с нормальным давлением) не оставляют сомнения в том, что у лиц с высоким артериальным давлением (гипертоников) дыхательный коэффициент ткани мозга существенно ниже, чем у людей с нормальным давлением (0,91 по сравнению с 0,98, соответственно) [Dickinson, 1995]. Этот факт пытаются интерпретировать как доказательство того, что мозг больного эссенциальной гипертензией до 30% энергии получает за счет окисления жирных кислот и кетонов.

Однако изменения в окислительном метаболизме мозга можно объяснить существованием при первичной гипертензии и выявленных у спонтанно гипертензивных крыс (SHR) нарушений мембранной регуляции внутриклеточного распределения кальция, как фрагмента генерализованных мембранных нарушений [Постнов, Орлов, 1987]. В мозге они проявляются, в частности, в более высокой концентрации свободного кальция цитоплазмы в нейтронах мозга [Орлов 1987], в повышеннойСа - аккумулирующей способности митохондрий, выделенных из ткани мозга, указывающей на существование кальциевой перегрузки митохондрий и условий для нарушений в механизме работы OXPHOSсо снижением энергообразовательной функции. Эти данные указывают на возможность существования дефицита энергообразования в митохондриях клеток мозга, что обусловливает необходимость повышения АД и развития системной гипертензии, в принципе, также как это наблюдается при ишемической церебральной гипертензии, компенсирующей клеточно-тканевый энергетический дефицит, вызванный недостаточностью кровоснабжения мозга.

В подтверждение сказанному имеется ряд косвенных, указывающих на существование отклонений в мозговом кровообращении у животных со спонтанной гипертензией, которые проявляются в ремоделировании сосудистой сети. В частности, капиллярная сеть коры головного мозга у SHR имеет меньшую плотность и даже объем мозга животных с гипертензиеи на 10% меньше такового у животных контрольной нормотензивной группы (WKY) [Sokolova 1985, Nelson 1993]. Проводить параллели с больными эссенциальной гипертензиеи достаточно трудно в связи с отсутствием подобных исследований, хотя известный факт истончения коры головного мозга у гипертоников (leukoaroiosis) может указывать на наличие у них пограничной ишемии мозга.

Почечный механизм стабилизации и поддержания хронической артериальной гипертензии - переключение почечного баростата.

Итак, ключевым звеном патогенеза первичной артериальной гипертензии, опосредующим ее становление и развитие, является симпатическая нервная система, возросшая эфферентная импульсация в которой, адресованная к сосудистой периферии, вызывает повышение артериолярного тонуса и усиление сосудистого сопротивления, включая этим самый мощный - почечный механизм стабилизации и поддержания высокого системного АД, строго обязательный для любой формы хронической гипертензии. Таковым механизмом является особая форма органного структурно-функционального ремоделирова-ния, названная «переключением» почки, в которой в полной мере проявляется баростатная функция этого органа для кровообращения в целом. Физиологическое назначение «переключения» - предотвращение потери солей и воды при повышенном системном артериальном давлении (по механизму pressure diuresis) в различных нестандартных ситуациях жизни организма. Однако этим роль «переключения» не исчерпывается, поскольку величина регулируемого почечного баростатом артериального давления (т.е. set-point) баростата при переключении сдвинута в сторону более высоких значений, и полная экскреция солей и воды происходит при повышенном системном АД. Иными словами, почка, работающая в режиме «переключения», осуществляет достаточную экскрецию лишь при соответственно повышенном уровне АД, а вся сложная система регуляции АД (частные механизмы и операторы АД)поддерживает по принципу обратной связи этот оптимальный уровень путем воздействия на почку и кровообращение в целом.«Переключение» почки осуществляется при участии внутриорганных систем, регулирующих почечный кровоток и канальцевую функцию (ренин-ангиотензиновая система, простагландины, калликреин-кининовая система). Однако главную роль на этапе становления «переключения» играют внепо-чечные системы нейрогормональной регуляции: симпатическая нервная система, гипоталамические центры, осуществляющие секрецию антидиуретического гормона (АДГ или вазопрессина) и натрийуретического гормона. Механизм «переключения» составляют три основные компоненты [Постнов 1995]:• Усиление симпатической импульсации на приводящие артериолы, и тоническим сокращением последних осуществляется ауторегуляция коркового кровотока, благодаря чему от повреждающего влияния высокого системного давления предохраняется клубочковый фильтр и проксимальная реабсорбция.• Влиянием натрийуретического гормона подавляется реабсорбция натрия и воды в восходящем отделе петли Генле, чем вызывается депрессия противоточно-концентрирующей системы почечной медуллы - в ней ослабляется механизм концентрирования.• В связи с тем, что объем фильтра, достигающий собирательных трубок, с развитием гипертонии увеличивается (в силу торможения реабсорб-ции в петле Генле), потеря воды через почку предотвращается усилением ее всасывания в собирательных трубках почечной медулы. Это всасывание воды контролируется АДГ, секреция которого гипоталами-ческими нейросекреторными ядрами при гипертензии усилена.

На ранних стадиях гипертензии «переключение» обратимо, но со временем работа почки в режиме «переключения» закрепляется развитием структурно-морфологических изменений в сосудах коры почек (гипертрофии медии и склероз в приводящих артериолах и мелких артериях), склероз и гиалиноз почечной медуллы. Таким образом, формируясь под влиянием повышенной активности периферического звена симпатической нервной системы, переключение почки, в свою очередь, оказывает по принципу обратной связи активирующее влияние на симпатическую нервную систему, поддерживая оптимальное соотношение между высотой АД и выделительной функцией почки. Это оптимальное соотношение определяется не произвольно, а задается в соответствии с требованиями клеточно-тканевой энергетики.

Каналы (поры) перехода митохондриалъной проницаемости (mitochondrial permiabilitytransition pore).

До последнего времени считалось, что ионы кальция, поступающие в митохондриальный матрикс из цитозоля, покидают его через систему Na /Са обмена во внутренней митохондриалъной мембране в соотношении 2:1, соответственно. Оказалось, однако, что эта система переноса действует медленно, легко насыщается и обеспечить эффективно выведение кальция, при интенсивном его поступлении в матрикс, не в состоянии. Недавно был выявлен другой путь выведения кальция из митохондрий, эффективно действующий при усиленном поступлении иона в клетку (а следовательно, вматрикс этих органелл) и одновременно выполняющий важную роль в механизме действия Са" как мессенджера в фосфоинозитидной системе проведения сигнала в клетке [Miller 1998].

Этот вновь открытый путь выведения Са2+ из матрикса осуществляется специальными каналами во внутренней митохондриальной мембране названными порами - mitochondrial permeability transition pore, mPT. mPT- поры (в дальнейшем везде mPT-каналы), потенциал-зависимые, проницаемые для ионов каналы, открытию которых способствует, в частности, деполяризация мембраны, аккумуляция Са2+ или наличие в матриксе окисляющих агентов. Эти каналы закрываются при повышенной концентрации протонов (низком рН) или повышении концентрации адениннуклеотидов. Важной особенностью этих каналов является блокирование их циклоспорином, что определяется взаимодействием циклоспорина с особым белком циклофили-ном, локализованным в самой белковой сборке mPT-канала. Другим агентом, обладающим значительно более сильным, чем циклоспорин блокирующим действием на mPT-каналы, является убихинон О (Ubo). Механизм этой блокады не изучен, однако сам факт блокады канала неактивным веществом убихинонового ряда, указывает на тесную связь этого вида митохондриальной проницаемости с работой дыхательной цепи [Kristian 2000]. Известно, что mPT-канал может функционировать в двух режимах - в режиме низкой и высокой проводимости. Функционируя в режиме высокой проводимости, канал становится проницаемым для крупных молекул молекулярным весом до 1,5 кД. Именно последнее качество широко дискутируется в контексте участия mPT-каналов в феномене клеточной смерти (апоптоза). (Подробнее ниже).

Модификация mPT-каналов для работы в режиме высокой проводимости (состояния необратимого) возникает в экстремальных для клетки условиях, вызванных, например, ишемией ткани, кальциевой перегрузкой клетки, окислительным стрессом, другими проявлениями парабиоза, сопровождающими ишемию ткани или действия токсических агентов. Структурная основа механизма этой реорганизации и образования высокопроницаемых mPT-каналов (мегапор) до настоящего времени точно не установлена, в то время как структурный ансамбль белковых элементов, составляющих mPT-каналы вообще, изучен достаточно полно.

Известно, что mPT-канал представляет собой белковый комплекс, компоненты которого расположены в месте сближения (юкстапозиции) внутренней и внешней михондриальных мембран. Предполагается, что элементами этого комплекса является адениннуклеотидный переносчик (АТФ/АДФ), ряд белков, выполняющих функцию потенциал-зависимого анионного канала, специализированных рецепторов (циклофилин, бен-зодиазепиновый рецептор), киназы и другие элементы (рис. 41).

Особое значение придается нахождению в составе mPT-канала белка bcl-2, первоначально выделенного из клеток лимфомы 2 типа. Структура белков этого семейства обладает примечательной особенностью - сходством строения структурно пространственной организации поро-образующими доменами бактериальных токсинов, действующих (при встраивании в клеточную мембрану) по типу каналов для проведения ионов и более крупных молекул [Reed 1997]. Последнее делает канал - формирующую роль bcl-2 в обсуждаемой структуре очевидной. Вместе с этим bcl-2 обладает способностью предотвращать наступление клеточной смерти (как собственно апопто-за, так и некротического варианта клеточной смерти) [Reed, 1997]. Экспрессия bcl-2 подавляет открытие mPT-каналов в условиях развития стресса, стабилизируя потенциал митохондриальной мембраны, нормализует Са2+ гомео-стаз, образование побочных продуктов окисления, а также подавляет избыточное образование цитохрома С в дыхательной цепи митохондрий при ее дисфункции [Prehn 1994].

Рисунок 41. Транспорт кальция в митохондрии (адаптировано из http//mitoart.tripol.com/permtran/genschm.htm). Рамкой выделен канал (пора) перехода митохондриальной проницаемости (mitochondrial permeability transition роге)В клетке, работающей в физиологических условиях, митохондриаль-иые mPT-каналы функционируют в режиме низкой (т.е. нормальной) проводимости. Са2' поступающий из цитозоля в митохондриальный матрикс через односторонний вход (по-видимому, канал) во внутренней мембране органеллы, вызывает активное выкачивание из него соответствующего числа протонов, повышая этим рН матрикса. Последнее ведет к открытию mPT-каналов, чем вызывается снижение протонного градиента и электрического потенциала мембраны и следующее за этим обратное движение (сброс) кальция через канал и закисление матрикса, обусловливая закрытие mPT-канала. Вслед за этим дыхательная цепь восстанавливает протонный градиент, восстанавливая также и готовность канала к новому циклу. Таким образом обеспечивается временное пикообраз-ное повышение концентрации Са2+ в цитозоле, в сущности, близкое по механизму регуляции выхода кальция из цитоплазматического ретикулума - так называемому CICR (Са" induced Са release) [Ichas 1994].

Сопоставление этих функциональных особенностей обеих структур помимо внешнего сходства отражает и функциональное их единство. Митохон-дриальный CICR играет, по-видимому, роль усилителя и преобразователя Са" -сигнала в фосфоинозитидной сигнальной системе клетки [Ins (1,4,5)Р3], действующей через цитоплазматический ретикулум [Miller 1991]. Таким образом, через работу тРТ каналов опосредуется связь систем интеграции организ-менного уровня (эндокринная, нервная системы) с энергетическими процессами на уровне клетки. Этой функциональной связью объясняется, по-видимому, нередко наблюдаемое в клетках тесное прилежание структур цитоплазматического ретикулума и митохондрий.

Открытие каналов при их работе в режиме высокой проводимости -явление необратимое. Оно сопряжено с глубокими последствиями для функции и структуры митохондрий и клетки в целом. Этот режим работы каналов приводит к осмотическим изменениям в органеллах и образованию в них зон набухания и деструкции (так называемые, септированные митохондрии, см главу посвященную морфологии митохондрий). Наступающие вслед за набуханием разрывы наружной мембраны обусловливают выход массы детрита из межмембранного пространства митохондрий в цитоплазму [Skulachev 2000]. Вместе с детритом, содержащим фрагменты крупных молекул, в цитоплазму поступает также фактор индукции апоптоза (AIF) и цитохром С, которые являются триггерами программируемой клеточной смерти (апоптоза). В самом начале цепи событий, ведущих к апоптозу, центральное место принадлежит аккумуляции Са2+ в митохондриальном матриксе - стадии, с которой начинается активацияmPT-каналов. Кальциевая перегрузка матрикса резко усиливает выделение транспортной цепью электронов цитохрома С и побочных продуктов аэробного метаболизма - комплекса реактивных окислительных продуктов (ROS), выделяемых, преимущественно, из убихинонового звена, которые являются мощными активаторами mPT-каналов [Zamzami 1997; Ellenby 1997; Skulachev 2000].

Особое место при этом занимает образование высокотоксичных продуктов в результате взаимодействия супероксида с NO с образованием перокси-нитрита, обладающего способностью разрушать белковые, липидные молекулы и нуклеотиды. Хотя в клетке имеются системы защиты против действия реактивных окислительных веществ, они, однако, оказываются недостаточными с развитием неконтролируемого поступления Са в клетку. В результате происходит невосполнимое выкачивание протонов из матрикса митохондрий, падение протонного потенциала внутренней мембраны органелл и резкое сокращение в них синтеза АТФ, вслед за которым развивается полная картина протеолитиче-ской деградации, составляющей сущность апоптоза.

Проявления нарушенной функции митохондриалъных mPT-каналов при первичной гипертензии (ретроспективная оценка).

В самом начале исследований по изучению особенностей клеточных мембран при первичной гипертензии, предпринятых в 1978-80 гг. в лаборатории Ю.В. Постнова, были получены данные, значение которых в тот период не было полностью определено, но современная ретроспективная оценка которых указывает на несомненную связь последних с феноменом нарушения функции mPT-каналов митохондрий клеток.

В этих исследованиях проводилось изучение обмена 45Са в жировой ткани SHR in vitro. Тогда впервые было показано увеличение в 1,5 - 1,7 раза пула внутриклеточного обмениваемого кальция [Postnov 1979], основная принадлежность которого к митохондриям была очевидной из сравнения кальциевого пула митохондрий с другими Са" -депонирующими структурами клетки (цитоплазматический ретикулум, связывание плазматической мембраной) [Кравцов 1979; Орлов 1980). Нарушение внутриклеточного распределения кальция при гипертензии расценивалось авторами как частное проявление генерализованной недостаточности (дефекта) мембранной регуляции цитоплаз-матического свободного кальция с последующей аккумуляцией его избытка митохондриями. Было показано также наличие увеличенных митохондриальных пулов кальция в адипоцитах большого сальника и у больных эссенциальной гипертензией [Postnov 1980].

ВЫВОДЫ.

1. У крыс с моделью спонтанной генетически детерминированной гипертензией линии SHR количественная представительность белков в структуре мембран эритроцитов характеризуется выраженной количественной дезинтеграцией ее основных компонентов. Количественные изменения белкового состава мембран эритроцитов гипертензивной линии затрагивают содержание главных каркасных цитоскелетных элементов спектринов, периферических регуляторных белков полос 4.16, 4.1 (сум.), 4.2 и интегрального анионтранспортного белка 3.

2. У гибридов второго поколения, полученных от скрещивания крыс со спонтанной гипертензией линии SHR и нормотензивных крыс линии WKY, наблюдается зависимость белкового состава мембран эритроцитов, а именно экспрессии спектринов, белка полосы 4.1а, белка полосы 4.5, и тропомиозина, от уровня артериального давления. Для Р спек-трина, и белка полосы 4.1а корреляция с давлением имеет противоположные знаки.

3. У гибридов второго поколения, полученных от скрещивания крыс со спонтанной гипертензией линии SHR и нормотензивных крыс линии

WKY, наблюдается зависимость активности Са -зависимых К -каналов от уровня артериального давления. Эта зависимость имеет выраженную половую особенность, у самок она негативная, а у самцов позитивная.

4. Электрофоретическая картина распределения в геноме кластеров умеренного ID повтора хорошо описывает практически все характерные для крыс SHR гипертензивные фенотипы.

5. Степень гипертрофии миокарда не зависит от уровня артериального давления у крыс гибридов второго поколения, что говорит о наследовании этих признаков по другим генетическим локусам, это позволяет вывести чистую линию крыс с гипертрофией миокарда и без повышенного артериального давления.

6. Спонтанная (первичная) гипертензия крыс (SHR) и некоторые формы вторичной гипертензии (гипертиреоидная, вазоренальная, ДОКА-солевая) сопровождается нарушением энергетического статуса клеток, что проявляется в дефиците энергии, запасаемой в АТФ.

7. Дефицит клеточно-тканевой энергии у крыс со спонтанной гипертензией линии SHR связан со сниженной АТФ-синтетической функцией митохондрий клеток.

8. Понижение синтеза АТФ в митохондриях SHR обусловлено их перегрузкой кальцием.

9. Ранний выход кальция из митохондрий SHR в ответ на меньшую концентрацию поглощенного кальция вызван изменениями в функционировании тРТ-пор.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Постнов А.Ю. Предсердный натрийуретический фактор (морфология и некоторые физиологические характеристики новой системы водно-солевого гомеостаза). Архив патологии. 1987, № 3, с.86-90.

2. Постнов А.Ю., Постнов И.Ю., Волков В.Н., Батурова К.А. Содержание предсердного натрийуретического фактора в плазме крови больных с недостаточностью кровообращения Содержание предсердного натрийуретического фактора в плазме крови больных с недостаточностью кровообращения. Кардиология 1987, № 9, с. 109-110.

3. Постнов А.Ю., Горькова С.И., Вихерт A.M. Морфологические особенности секреции натрийуретического фактора предсердными кардио-миоцитами при спонтанной гипертензии крыс. Бюлл. экспер. биол. и мед., 1987, т. 104, № 7, с. 116-118.

4. Reudelhuber Т. L., Mercure С., Ramla D., Methot, D., Postnov, A. Y. Molecular mechanisms of processing and sorting in renin secretion. In Hypertension: Pathophysiology, Diagnosis, and Management (Laragh, J. H., Brenner, В. M., eds), 1995, p. 1621, Raven Press, New York.

5. Постнов А.Ю. Молекулярная биология ренина: возможности супрессии ренин-ангиотензивной системы. Кардиология, 1995, т. 35, № 10, с. 4651.

6. Максимова Н.В., Постнов А.Ю., Постнов Ю.В. Восстановление нарушений ион-транспортной функции мембраны эритроцитов спонтанно-гипертензивных крыс после лечения лозартаном. Межд. симпозиум по артер. гипертензии, Москва, 1997, с. 45.

7. Бебихов Д.В., Никоненко Т.А., Постнов А.Ю., Постнов Ю.В. Динамическая мутация - возможная геномная причина первичной гипертензии? Кардиология, 1997, т. 37, № 4, с. 80-86.

8. Никоненко Т.А., Постнов А.Ю., Бебихов Д.В. Геномный полиморфизм по умеренному повтору ID у крыс со спонтанной гипертензией (SHR). Кардиология, 1998, № 6, с. 61-62.

9. Бебихов Д.В., Постнов А.Ю., Никоненко Т.А. Ретропозиция и ее роль в саморегуляции геномных процессов. Бюлл. эксп. биол. и мед., 1998, №7, с. 4-14.

10. Писаренко О.И., Студнева И.М., Постнов А.Ю. Особенности энергетического состояния тканей при спонтанной гипертензии крыс (SHR). Кардиология, 1998, т. 38, №12, с. 37-40.

11. Бебихов Д.В., Никоненко Т.А., Постнов А.Ю., Постнов Ю.В. Роль повторяющихся последовательностей генома в первичной гипертензии. Росс, физиол. ж-л им. И.М. Сеченова, 1999, т. 85(7), с. 948-958.

12. Купреева А.Ю., Постнов А.Ю., Иванов В.П., Зарецкий Д.В., Зарецкая М.В. Спонтанная гипертензия крыс: особенности экспрессии белков мембраны эритроцитов у гибридов второго поколения F (SHRxWKY). Кардиология, 1999, т. 39, №4, с. 54-58

13. Grafov М.А., Zaretsky D.V., Postnov A J., Zaretskaja M.V., Rubina AJu., Medvedeva N.A. Vascular reactivity in SHRxWKY F2 hybrids: correlation with blood pressure. 9th Europ. Meet, on Hypert., Milan, 11-15 June, 1999, Abs.P2.28.

14. Pisarenko O.I., Studneva I.M., Postnov A.Y., Postnov Y.V. Alteration of cellular energy state in tissues of spontaneously hypertensive rats. 9th Europ. Meet, on Hypert., Milan, 11-15 June, 1999, Abs.P2.55.

15. Postnov A.J. Kupreeva A.Y., Ivanov V.P., Zaretsky D.V, Zaretskaja M.V. Expression of erythrocyte membrane proteins in F2 (SHRxWKY) hybrids. 9th Europ. Meet, on Hypert., Milan, 11-15 June, 1999, Abs. 9B.2.

16. Постнов Ю.В., Бакеева JI.E., Цыпленкова В.Г., Постнов А.Ю. Нарушение ультраструктуры митохондриального аппарата кардиомиоци-тов крыс со спонтанной гипертензией (SHR). Кардиология, 2000, т. 40,

1, с. 55-63.

17. Pisarenko O.I., Studneva I.M., Postnov A.Y., Postnov Y.V. Alteration of cellular energy state in tissues of spontaneously hypertensive rats. Trace Elements and Electrolytes, 2000, 17: 138-141.

18. Никоненко Т.А., Постнов А.Ю., Бебихов Д.В., Постнов Ю.В. Распределение кластеров умеренного ID повтора в геноме коррелирует с высотой артериального давления при спонтанной гипертензии крыс (SHR). Кардиология, 2000, т. 40, №7, с. 36-41.

19. Nikonenko Т., Postnov A., Budnikov Y., Bebikhov D., Zaretsky D., Zaret-skaja M, Postnov Y.V. The values of certain haemodynamic parameters in SHR are predictable by ID-repeat polymorphism. 10th Europ. Meet, on Hy-pert., Goteborg (Sweden), May 29 - June 3, 2000, Abs. P2.92.

20. Постнов А.Ю., Писаренко О.И., Студнева И.М., Постнов Ю.В. Спонтанная, почечная и тиреоидная гипертензия крыс: общие черты в нарушениях энергетического метаболизма тканей. Кардиология, 2001, т.41, № 5, с. 50-55.

21. Afinogenova Y., Postnov A., Afanasieva G., Hamet P., Orlov S. Swelling-induced K+ influx in vascular smooth muscle cells (VSNC) is mediated by KCa channels and increased in SHR. 9th Europ. Meet. on Hypert., Milan, 1519 June, 2001, Abs. P3.225.

22. Postnov A., Petrukhina V., Hasanova Z., Doroshuk N., Pyhtina A. New model for myocardial hypertrophy: F4 hybrids of SHRxWKY intercross. 9th Europ. Meet, on Hypert., Milan, 15-19 June, 2001, Abs. 9B.2.

23. Бебихов Д.В., Никоненко T.A., Постнов А.Ю., Постнов Ю.В. Неменде-левское наследование артериальной гипертензии: повторяющиеся последовательности ДНК как кандидаты на роль геномных детерминант. Кардиология, 2001, т.41, № 6, с. 34-40.

24. Budnikov E., Postnov A., Pykhtina A., Fomina O. High energy phosphates status in blood cells of spontaneously hypertensive rats. Congress of European Society of Cardiology, Berlin, 2002.

25. Постнов А.Ю., Будников Е.Ю., Дорощук А.Д., Фомина О.П. Доклад: «Дефицит клеточно-тканевого энергообразования при экспериментальной форме первичной гипертензии». Всероссийская научно-практическая конференция «Современные проблемы артериальной гипертонии» Москва, 22-24 апреля 2003.

26. Будников Е.Ю., Постнов А.Ю., Дорощук А.Д., Афанасьева Г.В., Пост-нов Ю.В. Сниженная АТФ-синтезирующая способность митохондрий печени спонтанно гипертензивных крыс (SHR): роль кальциевой перегрузки митохондрий. Кардиология, 2002, т. 42, №12, с. 47-50.

27. Постнов А.Ю., Фомина О.П., Петрухина В.А., Будников Е.Ю., Дорощук Н.А. Генетическая модель гипертрофии миокарда без повышенного артериального давления у крыс. Артериальная гипертензия, 2003, т.9 ,№4:115-116.

28. Budnikov Y., Postnov A., Doroschuk A., Afanasjeva G., Postnov Y. Decreased ATP Synthesis Ability of Liver Mitochondria in Spontaneously Hypertensive Rats. Thirteenth European Meeting on Hypertension, Milan (Italy), June 13-17, 2003.

29. Lakomkin V. L., Studneva I. M.; Pisarenko О. I.; Postnov A. Yu., Kapelko V. I. Altered energy supply to the pump function of isolated heart of spontaneously hypertensiv rats. Experimental and Clinical Cardiology, 2003, 8, №3, 77-82.

30. Дорощук А.Д., Постнов А.Ю., Афанасьева Г.В., Будников Е.Ю., Пост-нов Ю.В. Сниженная АТФ-синтезирующая способность митохондрий клеток головного мозга крыс со спонтанной гипертензией (SHR). Кардиология, 2004, т. 44, №3, с. 64-65.

31. Kiryushina I., Afanasjeva G., Khasannova Z., Postnov A., Chazova I. A therapy influence on Ca dependent К channels of erythrocytes in patients with primary pulmonary hypertension. Fourteenth European Meeting on Hypertension, Paris (France), June 13-17, 2004, SI 19 (P1.353).

32. Blinova E., Fomina O., Budnikov Y., Postnov A. Electrocardiographic signs of left ventricular hypertrophy in nonhypertensive hybrids of spontaneously hypertensive and Wistar-Kyoto rats. Fourteenth European Meeting on Hypertension, Paris (France), June 13-17, 2004, S336 (P3.155).

33. Doroshchuk A., Postnov A., Afanasjeva G., Budnikov Y. Decreased ATP-synthesis ability of brain mitochondria in spontaneously hypertensive rats. Fourteenth European Meeting on Hypertension, Paris (France), June 13-17, 2004, S338 (P3.160).

34. Budnikov Y.Y., Doroshchuk A.D., Afanasjeva G.V., Postnov A.Y., Postnov Y.V. Decreased Ca accumulation ability of liver mitochondria in sponta-neusly hypertensive rats. Fourteenth European Meeting on Hypertension, Paris (France), June 13-17, 2004, S340 (P3.171).

35. Postnov A., Budnikov Y. Cell energy deficiency as a new mechanism in pathogenesis of primary hypertension in SHR. Fourteenth European Meeting on Hypertension, Paris (France), June 13-17, 2004, S340 (P3.168).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В последние два десятилетия в представлениях о патогенезе первичной (эссенциальной) гипертензии произошел отход от абсолютизации причинной роли нарушений в системах частной регуляции артериального давления и сосудистого тонуса. Решающее значение при объяснении проявлений этой патологии приобрело наличие распространенных (т.е. не ограниченных системой кровообращения) нарушений ион-транспортной функции клеточных мембран, проявляющихся нарушением внутриклеточного распределения кальция и стабильном повышение концентрации этого иона в цитозоле клеток. Схема патогенеза первичной гипертензии приобрела в связи с этим четкое метаболическое содержание.

Развитие исследований этого направления показало, что на основе нарушений мембранной регуляции внутриклеточного распределения кальция и стабильного повышения концентрации этого иона в цитозоле, возникает кальциевая перегрузка митохондрий клеток, ведущая к рассеиванию протонного электрохимического градиента на внутренней мембране этих органелл, уменьшению протонной движущей силы (the proton-motive force) и понижению синтеза АТФ с развитием дефицита энергии.

В процессе исследований было выяснено, что критическим фактором возникновения кальциевой перегрузки митохондрий является развитие недостаточности тРТ пор мембраны, осуществляющих выведение повышенных количеств кальция из митохондриального матрикса.

В свете полученных приоритетных данных повышение системного артериального давления при первичной гипертензии стало возможным рассматривать как меру компенсации недостаточности митохондриального образования АТФ в клетках тканей. Последнее подкрепляется тем, что значительная часть энергии АТФ (до 50%) расходуется на обеспечение сохранности трансмембранного градиента концентраций ионов (сниженного при первичной гипертензии), как основы нормального функционирования клеток, в том числе в обеспечении обмена между внутриклеточной средой и кровью.

Существенное изменение представлений о патогенезе первичной гипертензии вызвало необходимость принципиальной коррекции направления поиска геномных детерминант, поскольку ориентация исключительно на «промежуточный фенотип» оказалась несостоятельной, как в силу изменившегося понимания природы гипертензии, так и особенностей наследования.

Первичная гипертензия, будучи генетическим заболеванием, на протяжении многих лет, не обнаруживает геномных детерминант (три исключительно редкие формы моногенной первичной гипертензии служат подтверждением сказанному). Ряд особенностей первичной гипертензии - неменде-левский тип наследования, необычно высокая частота болезни в популяции, очевидная связь с неблагоприятным влиянием среды, ставят первичную ги-пертензию вне ряда классических генетических болезней, обусловленных мутацией в уникальном гене или группе генов. Все сказанное дало основание предполагать, что изменения на уровне ДНК при первичной гипертензии прямо не связаны с нарушениями в уникальных генах, а является результатом изменения копийности (амплификации) или распределения повторяющихся последовательностей ДНК.

Предположение о патогенетически значимой роли подобной перестройки генома при первичной гипертензии подтверждается наличием полиморфизма по распределению копий умеренного повтора ID в ДНК SHR, сонаследуемое™ этих геномных нарушений с уровнем системного АД и другими гемодинамическими характеристиками кровообращения, присущими спонтанной (первичной) гипертензии.

Судя по изучению особенностей экспрессии белков мембраны эритроцитов на гибридах второго поколения F2(SHRxWKY), мишенью, отмеченной выше перестройки генома, является экспрессия актин-связывающих белков цитоскелета. Изменения состава этих белков в клетках различных тканей могут определять ранее выявленные нарушения мембранной регуляции цито-зольного кальция, с последующей кальциевой перегрузкой митохондрий и понижением АТФ-продуцирующей их функции.

В случае первичной гипертензии человека, воздействие неблагоприятной среды усиливает нагрузку на системы кальциевого гомеостаза клетки, усугубляя упомянутый дефицит митохондриального энергообразования. Таким образом, влияние неблагоприятных факторов среды является составной частью этиологии болезни.

Изучение гипертрофии сердца в отношении степени ее зависимости от системного артериального давления на нескольких поколениях гибридов показало геномное происхождение гипертрофии и отсутствие связи этого явления с повышением давления в артериальной системе. Таким образом, экспериментально подтверждается раздельное происхождение гипертрофии миокарда и системной гипертензии. Применяемое в клинической практике определение «гипертоническая кардиомиопатия» обретает тем самым экспериментальное обоснование.

В отличие от эссенциальной гипертензии человека, спонтанная гипертензия крыс формируется без дополнительного влияния внешней среды, поскольку генетическая детерминанта у них резко усилена инбредингом и гипертензия наследуется в 100% случаев.