Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Генетический полиморфизм тромбоцитспецифических антигенов

На правах рукописи

Головкина Лариса Леонидовна

Генетический полиморфизм тромбоцитспецифических

антигенов

14.00.29 - гематология и переливание крови

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва-2008

003453217

Работа выполнена в Государственном учреждении Гематологический научный центр Российской Академии Медицинских Наук

Научные консультанты:

академик РАМН, профессор

Е.А.Зотиков

член-корреспондент РАМН, профессор В.Г. Савченко

Официальные оппоненты:

профессор, доктор медицинских наук Масчан Алексей Александрович

доктор медицинских наук Василенко Ирина Анатольевна доктор медицинских наук Байрамалибейли Имнара Энвер кызы Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт скорой помощи им. Н.В. Склифосовского МЗСР РФ

Защита состоится « декабря 2008 г. в «_» часов на

заседании диссертационного совета Д 001.045.01 в ГУ Гематологический научный центр РАМН (125167, Москва, Новозыковский проезд, 4-а)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Гематологический научный центр РАМН

Автореферат разослан »

_2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат медицинских наук Зыбунова Е.Е.

Актуальность проблемы.

Значение генов и антигенов системы НРА (Human Platelet Antigens) в различных областях медицины, в том числе трансфузиологии и трансплантологии (в частности при алломиелотрансплантации), определяется их разнообразием и высокой иммуногенностыо.

Накопленные и обобщенные к настоящему времени данные по частоте генов НРА свидетельствуют о наличии расовых и популяционных особенностей их распространенности. Иммуногенетические характеристики НРА хорошо изучены у населения большинства стран Западной и Восточной Европы [Reviron D. et al., 1992; Sitnsek S. et al., 1993; Holensteiner A. et al, 1995; Kekomaki S. et al, 1995; Legier T.J. et al, 1996; Steffensen R. et al, 1996; Merieux Y. et al, 1997; Drzewek K. et al., 1998; Rozman P. et al, 1999; Jones D.C. et al, 2003], Африки [Mojaat N. et al, 1999; Ferrer G. et al, 2002; Halle L. et al, 2004; Paola J.D. et al, 2005], Азии [Santoso S. et al, 1993; Kim H.O. et al, 1995; Urvvijitaroon Y. et al, 1995; Tanaka S. et al, 1996; Chang Y.W. et al, 1998; Seo D.H. et al, 1998; L>ou J.Y. et al, 2002; Halle L. et al, 2004; Kulkami B. et al, 2005; Al-Subaie A.M. et al, 2006; Feng M.L. et al, 2006], Северной и Южной Америки [Covas D.T. et al, 1997; Chiba A.K. et al, 2000, Cardone J.DB. et al, 2004, Toralles-Pereirac C. et al, 2005], Австралии [Bennett J.A. et al, 2002]. У населения Российской Федерации сведения об иммуногенешческих параметрах НРА отсутствуют.

Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) широко применяется в лечении больных заболеваниями системы крови, прежде всего, гемобластозами. После пересадки ГСК необходимо проводить мониторинг за их приживлением. Для этих целей используют различия реципиентов и их доноров по многим маркерам, так называемым «меткам». Маркерами могут быть гипервариабельные участки ДНК - тандемные повторы с изменяющимся количеством копий и короткие тандемные повторы [Демидова H.A. и Савченко В.Г, 1995; Демидова НА, 1997; Демидова H.A. с соавт, 1997], половые хромосомы (если донор и реципиент являются разнополыми) [Виноградова O.A., 2001], эритроцитарные антигены различных систем [Зотиков Е.А. с соавт, 1996; Порешина Л.П, 2004] и др. Различия по перечисленным маркерам удается найти только у 80°/о близкородственных пар донор-реципиент [Bryant Е, Martin P.J, 2004], поэтому поиск новых «меток» представляется весьма ак1уальным. В шшижцсе ьрсыя интенсивно разрабатываются .методические приемы, позволяющие изучать замены единичных нуклеотидов в генах (SNP - single nucleotide polymorphism). Эти методы позволяют быстро и качественно использовать полученные результаты для оценки приживления трансплантированных ГСК [Hochberg Е.Р. et al, 2003]. Полиморфизм НРА-генов обусловлен, в основном, заменой одного нуклеотида в структуре аллель-специфических сайтов. Фенотипнческая экспрессия антигенов системы НРА

определяется несколькими генами, локализованными на длинном плече 5, 17 и 22 хромосом. Гены системы HLA расположены на 6 хромосоме. В соответствии с законом Моргана локализация генов на разных хромосомах предполагает их независимое наследование. Таким образом, HLA-идентичные сибсы могут различаться друг от друга по НРА-генам. Изучение распределения НРА-генов у HLA-идентичных сибсов, один из которых болен онкогематологическим заболеванием и является потенциальным реципиентом близкородственных ГСК, позволит использовать различия по НРА для проведения мониторинга за приживлением алломиелотрансплантата.

Внутривидовые различия людей по антигенам систем НРА и главного комплекса гистосовместимости - HLA (Human Leukocyte Antigens), их иммуногенность, являются причиной аллоиммунизации пациентов при проведении трансфузионной терапии компонентами крови, прежде всего тромбоцитами. В то же время, совершенствование программ цитостатической полихимиотерапии больных гемобластозами немыслимо без трансфузионного обеспечения. Переливания тромбоцитов являются эффективным методом лечения и профилактики геморрагических осложнений, обусловленных дисфункцией, снижением количества тромбоцитов периферической крови вследствие аплазии кроветворения или замещения нормального гемопоэза опухолевыми клетками. Аллойммунизация пациентов, являясь основной причиной развития иммунологических реакций негемолитического типа, может привести к полному отсутствию клинического эффекта от переливания тромбоцитов. Иногда после трансфузий тромбоцитов доноров, несовместимых с реципиентом как по НРА, так и HLA. в организме больного происходят тяжелые нарушения в иммунной системе, проявляющиеся в срыве иммунологической толерантности и развитии аутоиммунного процесса (аутоиммунной тромбоцитопении), приводящие к тяжелым геморрагическим проявлениям.

Проведенные ранее исследования больных с множественными трансфузиями тромбоцитов были посвящены аллоиммунизации преимущественно к антигенам главного комплекса гистосовместимости [Компанеец М.А. с соавт., 1992; Зотиков Е.А с соавт., 1996], в то время как за рубежом подход к проблеме был комплексным - вместе с анти-HLA антителообразованием изучали и аллоиммунизацию к антигенам системы НРА [Kickler T.S. et al„ 1990; Chow M.P. et al., 1992; Wernet D. et al„ 1993; Novotny V.M.J. et al, 1995; Zimmerman R. et al., 1999]. Изучение частоты аллоиммунизации антигенами системы НРА и HLA больных гематологическими заболеваниями с множественными трансфузиями компонентов крови необходимо для правильного выбора доноров тромбоцитов. Доноров обычно выбирают из регистра, в который внесены данные по гено(фено)типу форменных элементов крови -эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов. Для вычисления числа НРА-типированных доноров,

достаточного для трансфузионного обеспечения пациентов с заболеваниями системы крови, необходимо знание иммуногенетических параметров НРА здорового населения в локальной популяции или конкретной местности, в нашем случае представителей восточно-европейской популяции Российской Федерации, самоидентифицирующих себя как русские.

Цель исследования:

Изучить генетический полиморфизм тромбоцитспецифических антигенов и его значение при алломиелотрансплантации и в клинической трансфузиологии (при переливании тромбоцитсодержащих сред) у больных с заболеваниями системы крови. Задачи исследовании:

1. Определить иммуногенетические характеристики НРА представителей восточноевропейского региона России, самоидентифицирующих себя как русские: частоты генов, аллелей, генотипов, гаплотипов, величину гаметной ассоциации и генетической дистанции, выявить особенности распределения НРА. Изучить распределение НРА-генов у НЬА-идентичных сибсов в семьях, где один из детей болен гемобластозом.

2. Оценить возможность проведения мониторинга приживления близкородственного алломиелотрансплантата по генам НРА.

3. Определить частоту аллоиммунизации к антигенам систем НРА и НЬА у гематологических больных после терапии компонентами крови. Изучить частоту реагирования анти-НРА антител у аллоиммунизированных больных.

4. Оценить влияние подбора доноров тромбоцитов иммунологическими методами аллоиммунизированным больным на эффективность трансфузий.

5. Определить величину контингента НРА-типированных доноров, необходимого для трансфузионного обеспечения совместимыми по антигенной структуре тромбоцитами первичных больных с аплазией кроветворения.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Применение молекулярных методов исследования позволяет изучить все иммуногенетические иарамсхры НгА представителен восточно-СБропейского решена России, самоидентифицирующих себя как русские, выявить особенности распределения НРА русских по сравнению с представителями иных популяций. 2. Независимое наследование НЬА и НРА генов позволяет использовать имеющиеся различия по НРА между донором и реципиентом в качестве «метки» при оценке приживления близкородственного НЬА-идентичного алломиелотрансплантата.

3. Частота аллоиммунизации к антигенам системы НРА у больных заболеваниями системы крови после множественных трансфузий тромбоцитов высока и превалирует над частотой аллоиммунизации к антигенам системы Ш,А.

Научная новизна исследования

Исследования по изучению полиморфизма НРА представителей восточно-европейского региона России, самоидентифицирующих себя как русские, проводились впервые. Рассчитаны все иммуногенетические характеристики НРА - частоты генов, аллелей, гено- и гаплотипов, величина неравновесного сцепления. Впервые по собственным данным частотных распределений аллелей НРА и литературным данным частоты НРА у представителей разных популяций вычислена величина генетической дистанции между русскими и иными народами. Впервые представлены данные по особенностям распределения НРА у русски при сравнении с результатами исследования зарубежных авторов. Впервые проведены исследования семей, доказано наследование генов ОР2В и ОРЗА гаплотипами, выявлен кроссинговер между генами ОР2В и ОРЗА материнской 17 хромосомы с формированием нового генотипа у одного из пяти детей.

Впервые показана частота и характер отличий по НРА НЬА-идентичных сибсов.

Впервые в практике мировой трансплантологии доказана возможность проведения мониторинга приживления близкородственного алломиелотрансплантата по НРА-генам. Проведено сопоставление результатов мониторинга приживления стволовых гемопоэтических клеток по молекулярным и цитогенетическим маркерам, доказано, что критерии идентификации ремиссии и рецидива основного заболевания после алломиелотрансплантации совпадают.

Впервые в стране на большом материале представлена частота аллоиммунизации больных заболеванием системы крови после трансфузии тромбоцитов. Впервые проведен детальный анализ структуры аллоиммунизации у больных разными нозологическими формами заболеваний системы крови, определена частота реагирования анти-НРА антител.

Впервые подбор доноров тромбоцитов аллоиммунизированным больным выполнен двумя серологическими методами - методом иммупоферментпого анализа и в лимфоцитотоксическом тесте. Предложен алгоритм и обоснована целесообразность проведения подбора донора тромбоцитов аллоиммунизированным больным по антигенам двух систем - НРА и НЬА, который приводит к увеличению эффективности трансфузий тромбоцитов.

Практическая значимость

Полученные сведения по распространенности НРА-генов у русских использованы для вычисления величины контингента НРА-типированных лиц, необходимого для трансфузионного обеспечения больных с заболеваниями системы крови.

Собранные образцы ДНК доноров с установленным НРА - генотипом использованы как стандарты для создания отечественной системы генотипирования НРА.

Генетические различия гемопоэтических стволовых клеток реципиента и донора по НРА могут быть использованы для оценки приживления костного мозга.

Генотнпнрование по НРА можно применять в практической работе учреждений службы крови для трансфузионного обеспечения совместимыми по антигенной структуре тромбоцитами аллоиммунюированных больных.

Разработан алгоритм подбора доноров тромбоцитов больным, аллоиммунизированным к антигенам систем НРА и HLA.

Внедрение в практику

Результаты исследования внедрены в практику ГУ ГНЦ РАМН. Результаты работы используются при чтении лекций врачам, проходящих усовершенствование по специальностям «Иммуногематология», «Клиническая лабораторная диагностика», «Клиническая трансфузиология».

Работа выполнена в рамках следующих тем НИР: «Иммунологическая диагностика тромбоцитопений» (1997-1999) JV« гос регистрации 01970000925 (Рук. академик Е.А. Зотиков), «Изучение цммуногенетических параметров тромбоцитспецифическнх антител (анти-НРА) у больных, сенсибилизированных в результате тромбоцнто-, миело-, гемотрансфузий или иным путем» (2000-2002) № гос.регистрации 01200001737 (Рук. академик Е.А. Зотиков), «Изучение цммуногенетических параметров тромбоцитспецифическнх антигенов (НРА)» (2003-2005) № гос.регистрации 01200301548 (Рук. академик Е.А. Зотиков, канд мед.наук Л.Л. Головкина).

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на научно-практических конференциях «Новое в трансфузиологии» (Москва, 2000 г ), «Актуальные вонри^ы icwaïujioîuH и траксфуз;:слог;;;:;> (Са;::гг Петербург, 2000 г.), "Клиническая и производственная трансфузиология - единство целей» (Москва, 2001 г.), Пятой научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2001 г.» (г. Санкт-Петербург, 2001 г.), II Всероссийском съезде по трансплантологии и разработке искусственных органов (Москва, 2002 г.), V съезде аллергологов и иммунологов СНГ (Санкт-Петербург, 2003 г.), VIII Европейском конгрессе международного общества трансфузиологов

(Стамбул, Турция, 2003), на 8 Европейском симпозиуме по иммунобиологии тромбоцитов и гранулоцитов (Руст, Австрия, 2004), научно-практической конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (Санкт-Петербург, 2004 г.), XIX Европейской конференции по иммуногенетике и гистосовместимости (Стамбул, Турция, 2005 г.), XXVIII конференции «Лейкозы и лимфомы. Терапия и фундаментальные исследования» (Москва, 2005 г.), XX Европейской конференции по иммуногенетике и гистосовместимости (Осло, Норвегия, 2006), 9 симпозиуме по иммунобиологии тромбоцитов и нейтрофилов (Тромсе, Норвегия, 2006), XXI Европейской конференции по иммуногенетике и гистосовместимости (Барселона, Испания, 2007 г.), Второй конференции иммуногенетиков «Восток-Запад» (Прага, Чехия, 2007), конференции «Актуальные вопросы трансфузиологии» (Москва, 2007 г.), Ученом Совете ГУ ГНЦ РАМН (22 мая 2007 г.), 10 симпозиуме по иммунобиологии тромбоцитов и нейтрофилов (Тун, Швейцария, 2008). Апробация диссертации состоялась на заседании проблемной комиссии Гематологического научного центра РАМН «Гемопоэз, молекулярная биология, биотехнология, иммуногематология; гемобластозы и депрессии кроветворения» (16 июня, 2008).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 50 печатных работ, в том числе: монография «Тромбоциты и антитромбоцитарные антитела», глава в монографии «Основы трансфузионной иммунологии», 2 главы в монографии «Очерки по производственной и клинической трансфузиологии», статья в Российской энциклопедии, 8 статей (перевод одной статьи опубликован в США) и 12 тезисов в центральных российских журналах, рекомендованных ВАК; 2 статьи за рубежом и 10 тезисов в материалах Международных симпозиумов и конференций, в том числе 4 в иностранных журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации

Работа изложена на 273 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 47 таблицами, 9 рисунками. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов исследования, трех глав, отражающих результаты собственных исследований, обсуждения, выводов и практических рекомендаций. Список цитируемой литературы включает 50 отечественных и 308 зарубежных источников.

Данное исследование проведено в лаборатории иммуиогематологии Гематологического научного центра РАМН (директор - академик РАН и РАМН, профессор А.И. Воробьев), а также в институте трансплантации костного мозга и молекулярной гематологии ГНЦ РАМН (директор - член-корр. РАМН, профессор В.Г. Савченко), в лаборатории молекулярной

гематологии (зав. - к.б.н. А.Б. Судариков), в кариологической лаборатории совместно с к.м н. O.A. Виноградовой (зав. - профессор, д.м.н. Е.В. Домрачева), в отделении экстракорпорального очищения крови (зав. - профессор, д.м.н. H.H. Калинин) и в научном содружестве с другими лабораториями и отделениями ГУ ГНЦ РАМН. Расчет величины НРА-типированпых доноров выполнен совместно с заведующим лабораторией биостатистики к.т.н. С.М. Куликовым.

Содержание работы Общая характеристика материала и методов исследования Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток выполнена в институте трансплантации костного мозга и молекулярной гематологии ГНЦ РАМН (директор - член-корр. РАМН, профессор В.Г. Савченко) 50 больным с заболеваниями системы крови: хроническим миелолейкозом (ХМЛ) в хронической фазе - 17, в фазе акселерации - 1; миелодиспластическим синдромом - 9, из них рефрактерной анемией с избытком бластов - 8, хроническим миеломонобластным лейкозом - 1; острым лимфобластным лейкозом (OJIJ1) - 7; острым промиелоцитарным лейкозом (ОПЛ) - 3; острым миелобластным лейкозом - 6, острым миеломонобластным лейкозом - 3; острым недифференцированным лейкозом - 3; альвеолярной рабдомиосаркомой - 1. Возраст больных - от 15 до 64 лет (медиана 29,7 лет), из них 23 женщины и 27 мужчин. Трансплантация от донора противоположного пола осуществлена 28 пациентам: 13 женщинам и 15 мужчинам, от донора одного пола - 22 (10 женщинам и 12 мужчинам). Источником гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) у 46 больных были стволовые клетки костного мозга, у 4 -периферической крови. Кондиционирование перед трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток проводили в миелоаблативном режиме (35 больным) или режиме пониженной интенсивности (15 больным). Приживление пересаженных гемопоэтических стволовых клеток донора наблюдали в соответствии с протоколом: на +30™, +60—, +90Ь1е сутки, затем каждые 3 месяца в течение первого года, затем 1 раз в полгода. Самый длительный период наблюдения составил 4 года. Донорами ГСК были HLA-идентичные сибсы, лимфоциты которых были ареактивны в смешанной культуре с лимфоцитами больного. Возраст доноров колебался от 9 до 56 лет (медиана 28,4 лет). Тканевое типирование пар донор-реципиент серологическим методом выполняли совместно со старшим научным сотрудником лаборатории иммуногематологии к.б.н. P.M. Кутьиной. Реакцию смешанной культуры лимфоцитов проводила ведущий научный сотрудник лаборатории клинической иммунологии к.м н. А.П. Шпакова (зав. лабораторией - профессор, д.м.н. Т.II Булычева).

Исследованы 724 образца ДНК 576 человек Типировано по НРА-генам: 17 сотрудников ГНЦ РАМН, 120 человек разных национальностей, 217 членов 80 семей, в которых один ребенок страдал заболеванием системы крови. После алломиелотрансплантации мониторинг приживления гемопоэтических стволовых клеток проводили на 173 образцах ДНК, полученных от 30 больных. Генотипирование выполняли с помощью коммерческой тест-системы фирмы «РгоЬ"ап5» (ФРГ). НРА-генотипирование отечественными праймерами выполнили 197 донорам ТИЦ РАМН совместно со старшим научным сотрудником лаборатории молекулярной гематологии к.м.н. Т.В. Макарик и заведующим лабораторией молекулярной гематологии, к.б.н. А.Б Судариковым.

Для серологического НЬА-типирования и определения анти-НЬА антител в сыворотках больных применяли микролимфоцитотоксический тест. Лимфоциты выделяли из гепаринизированной крови на градиенте плотности (смесь фиколла и верографина) с удельной плотностью 1.077 г/мл. Серологическое типирование локусов НЬА-А, -В, -С проводили с помощью гистотипирующих сывороток фирмы «Гисанс» (г. Санкт-Петербург) и сывороток Республиканской станции переливания крови г. Минск (Республика Беларусь). Определяли 21 антиген локуса НЬА-А, 43 антигена локуса НЬА-В и 8 антигенов локуса НЬА-С. Для идентификации специфичности анти-НЬА антител в сыворотках больных использовали лимфоциты доноров, типированных по системе НЬА.

Скрининг антитромбоцитарных антител у больных с разными формами тромбоцитопении был выполнен в 1950 образцах сывороток от 866 больных; из них было отобрано 950 образцов сывороток от 385 больных с повторными трансфузиями компонентов крови, находившихся на лечении в ГНЦ РАМН в периоды с 2000 г. по 2002 г. и с 2005 г. по 2007 г. Больные были разделены на группы в зависимости от диагноза: с апластической анемией (АА) - 100, острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ) - 50, острым миелобластным лейкозом (ОМЛ) - 77, миелодиспластическим синдромом (МДС) - 67, хроническим лимфолейкозом (ХЛЛ) - 39, хроническим миелолейкозом (ХМЛ) в бластном кризе - 28, анемиями различного генеза (кроме АА) - 8, после трансплантации костного мозга (ТКМ) - 16. Для скрининга антител в сыворотках больных использовали лимфоциты и тромбоциты 4000 доноров.

Для определения антитромбоцитарных антител в сыворотках больных проводили иммуноферментный анализ (ПФА) в 96-луночных планшетах с плоским дном с использованием нативных и модифицированных (с инактивированными НЬА) тромбоцитов доноров. Все исследования выполняли в трех дублях. В качестве отрицательного контроля применяли пул сывороток от 10 доноров-мужчин АВ(1У) группы. Положительным контролем

служили сыворотки с антн-НЬА антителами и аутоиммунными или аллоиммуными антитромбоцитарнымн антителами. Положительный результат контрольных сывороток с антитромбоцитарнымн антителами свидетельствовал об активности конъюгатов. Количественную оценку окрашивания оценивали на ридер-мультнскане при длине волны 492 нм. Показатель оптической плотности пула сывороток ДВ(1\') группы соответствовал значению 0,2. Активность исследуемых сывороток определяли путем сравнения с активностью пула сывороток АВ(1У) группы: коэффициент активности вычисляли путем деления показания оптической плотности исследуемых сывороток на показание оптической плотности отрицательного контроля. Положительным результатом считали значение коэффициента равное или более 1,5 [Зтййсокаэ К.. е1а1., 1987].

Результаты исследования сыворотки пациента в ИФА трактовали после получения результатов выполняемого параллельно лимфоцитотоксического теста с лимфоцитами доноров, от которых были получены тромбоциты. Исследования проводили в динамике и заключение о наличии анти-НРА и/или антя-НЬА антител делали после повторного исследования сывороток больных через 7-10 дней.

Для постановки полимеразной цепной реакции с праймерами фирмы «Рго^аш» использовали ДНК, которую выделяли из лейкоцитов цельной периферической крови и ядросодержащих клеток костного мозга после селективного лизиса эритроцитов по авторской методике и на специальных фильтрах фирмы «Ргойапь». Концентрацию и чистоту ДНК определяли на спектрофотометре: одна оптическая единица (00) соответствовала 50 мкг/мл, чистоту определяли соотношением показателей при 260 нм и 280 нм (00260/00280): в реакции использовали только ДНК с показателями 00260/00280 в диапазоне 1,65 - 1,8.

Полимеразную цепную реакцию с аллель-специфичными праймерами (АБР-РСЯ) фирмы «Рго^аш» выполняли по методике, предложенной производителем. Регистрацию результатов осуществляли в ультрафиолетовых лучах с длиной волны 312 нм после прокрашивания ДНК 1% бромистым этидием и проведения электрофореза в 2% агарозном горизонтальном геле. Продукты амплификации визуализировались в виде полос красно-оранжевого цвета. Постановку реакции считали корректной при получении двух полос - внутреннего коммерческою кишрилм н испытуемого образца ДНК. Длины амплифпцпроваипих. участков ДНК были следующими: для НРА-1 - 190 пар нуклеотидов (п.н.), НРА-2 - 240 п н., НРА-3 -290 п.н, НРА-4 - 120 п.н., НРА-5 - 260 п.н., НРА-6\у -260 п.н.

Для постановки ПЦР с модифицированными отечественными праймерами ДНК доноров выделяли из лейкоцитов по модифицированному «солевому» протоколу [\'Шег Б. с соавт., 1988]. Для каждого НРА антигена использовали два аллель-специфичных праймера,

различающихся одним нуклеотидом на 3' конце, последовательности которых соответствовали последовательности геномной ДНК. кодирующей искомые белки. С целью оптимизации условий и температурного режима амплификации праймеры для НРА-3,-5 локусов были модифицированы (к.б.н. А.Б. Судариковым) таким образом, чтобы все праймеры работали при температуре отжига 68°С.

Каждую реакцию контролировали включением пары праймеров, которые амплифицировали фрагмент размером 434 п.н. гена фактора роста человека [Olerup О. et al, 1992]. Для каждого образца выполняли десять отдельных реакций. Каждая пробирка ПЦР реакции содержала аллель-специфичный праймер, общий праймер и пару праймеров положительного внутреннего контроля. Программа амплификации адаптирована для прибора Perkin Elmer: 95°С, 5 минут; 25 циклов: 95°С, 30 секунд; 68°С,1 минута; 72°С, 45 секунд. Электрофорез проводили при 200 вольт в течение 15 мин в 2% агарозном геле и буфере TBE.

В методе флюоресцентной гибридизации in situ (FISH) использовали зонды CEPXSG/CEPY(a)SO (к центромерным участкам X/Y хромосом) (Vysis, США) и LSI BCR-ABL DCDF (Vysis, США). Гибридизацию исследуемой ДНК с ДНК-зондом проводили по протоколу и совместно с научным сотрудником лаборатории кариологии к.м.н. O.A. Виноградовой (зав. -профессор, д.м.н. Домрачева Е.В.) [Виноградова O.A. с соавт., 2001]. Результаты анализировали на эпифлюоресцентном микроскопе Zeiss Axioplan с тройным фильтром (DAP/FITC/Texas Red). Статистическая обработка данных

Экспериментально полученные частоты кодоминантно наследуемых диаллельных генов

НРА считали непосредственно по результатам генотипирования обследуемых лиц (метод

прямого подсчета генов по Фишеру).

Расчет частот НРА-генов проводили по формуле [Фогель Ф., Мотульски А., 1989]:

Pi= D + Dd/2 (1),

где Pi - частота первого гена, D - частота гомозиготных особей по первому гену,

Dd - частота гетерозиготньгх особей.

Р2 = d +Dd/2 (2),

где ?2 - частота второго гена.

Коррекцию экспериментально полученных генных частот не проводили, поскольку использовали прямой подсчет результатов генотипирования.

На основе экспериментально полученных генных частот рассчитывали ожидаемые частоты генотипов по формуле:

p2AA+2pqAB+q2BB (3),

где р2АА - число лиц, гомозиготных по первому гену

С|2ВВ - число лиц, гомозиготных по второму гену

2рцАВ - число лиц, гетерозиготных по обоим генам диаллельнон системы Частоту особей гомозиготных по первому гену вычисляли по формуле:

АА= р2 х N (4),

гомозиготных по второму аллельному гену - по формуле: В!^2 х N (5),

часто гу гетерозиготных ипдивидумов - по формуле: АВ=2рц х N (6),

где N -число исследованных лиц, р - частота первого аллельного гена, ц - частота второго аллельного гена.

Коррекцию ожидаемых генных частот проводили после определения значения Г) = 1 — (р! + рз). Тогда скорректированная частота гена р[ = р1 (1+ Т)!2), рз = р:> (1+ 0/2), где Р1 и рг -ожидаемые некорректированные генные частоты [Фогель Ф., Мотульски А., 1989].

Степень достоверности существующего распределения генов в популяции устанавливали при сравнении экспериментально полученных и расчетных данных путем определения показателя по формуле: = X (0 - Е)"/Е (7), где

2. - сумма разностей, 0 - экспериментально полученные значения, Е - расчетные данные. Вероятность Р для отклонения от ожидаемого значения брали из таблицы значения %' (таблица Фишера) с соответствующей степенью свободы. Число степеней свободы равно числу классов минус 1. Для 5°о-го уровня значимости при одной степени свободы %2 = 3,84, при двух степенях свободы %2 = 5,991 [Гланц С , 1999]

Для таблицы 2x2 или при степени свободы у=1 добавляли поправку Иетса:

х2 = 2 (/0 - Е/ -0,5)2/Е (8)

Полученные значения генных частот применяли для определения частоты гаплотипов и величины гаметной ассоциации.

Экспериментальные частоты гаплотипов НРА-1,-3 определяли непосредственно из результатов НРА-генотипирования. Ожидаемую частоту указанных гаплотипов рассчитывали по формуле: Н= р1 х р2 + Д (9), где

Р1 и рг - ожидаемые частоты аллелей генов в популяции, Н - частота гаплогипа при свободной рекомбинации, Д - величина неравновесного сцепления или гаметная ассоциация. Величину неравновесного сцепления Д вычисляли по формуле:

д = л/а/ N - ^/(Ь+ахс+ауы2 (ю), где

Ь, с - число индивидумов с одним из рассматриваемых генов, <1 - число индивидумов без обоих генов, а - число людей с обоими генами, N - сумма данных по таблице 2x2 или а+Ь+с+с).

Коэффициент корреляции вычисляли по формуле: г = (11), где

N - сумма данных по таблице 2x2 или а+Ь+с+<1. X2 = (ас!-Ьс)2 х№ [(а+с)(с+с1)(а+с)(Ь+с1)]

Генетическую дистанцию между народами (популяциями) рассчитывали по формуле [Зарецкая Ю.М., Абрамов В.Ю, 1986]: (1 и (р1~р;):/п (12),

где (11,2 - генетическая дистанция между популяциями I и 2, р[ и рз - частота аллеля в популяциях, п - количество сравниваемых пар аллелей.

Проверка нулевой гипотезы о совпадении наблюдаемой (выборочной) и ожидаемой (популяционной) частот осуществляли по значению критерия ъ [Реброва О Ю, 2002] с последующим вычислением значения р при помощи программы БЮвТАТ.

Анализ количественных значений скорректированного посттрансфузионного прироста тромбоцитов проводили с помощью параметрического ^критерия Стъюдента [Гланц С, 1999].

Анализ качественных признаков проводили с помощью непараметрического критерия %2 путем построения четырехпольной таблицы сопряженности 2x2. При ожидаемых значениях в любой из клеток таблицы меньше 5 использовали точный критерий Фишера. Сравнение двух количественных выборок (количество доз перелитых тромбоцитов, количество трансфузий тромбоцитов, длительность нейтропении и тромбоцитопении после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток) проводили при помощи непараметрического Т-критерия Манна-Уитни [ГланцС, 1999].

Для оценки величины необходимого донорского контингента были сделаны следующие допущения:

1. Доноры и реципиенты однородны в генетическом аспекте, то есть принадлежат одной локальной популяции.

2. Совместимость реципиента и донора определялась по локусам НРА 1, 2, 3, 5 по следующему правилу: а) гомозиготный по гену конкретного локуса реципиент совместим только с гомозиготным по тому же аллельному гену донором; б) гетерозиготный по аллельным генам конкретного локуса реципиент совместим (по этому локусу) с донором, имеющим гены в гомо- или гетерозиготном состоянии; в) донор и реципиент должны быть совместимы по всем клинически значимым генам локусов НРА (НРА- 1,2,3,5).

3. Создание контингента НРА-типированных доноров считали практически целесообразным, если удавалось подобрать необходимую для курса терапии группу доноров для одного реципиента с 90% вероятностью.

4. Для обеспечения курса трансфузионной терапии одному больному апластнческой анемией необходимо в среднем не менее 100 потенциальных доноров, количество которых было взято с учетом вероятного отказа донора от изъятия у него тромбоцитов или его временной недосягаемости.

Для обозначения генотипа донора'реципиента использовали следующую форму: G = gi,g2.g3,gs (13), где g,- генотип по i-локусу, т.е. g, = {aa,ab,bb}, i={ 1,2,3,5}. Весь список возможных комбинаций генотипа по 4 локусам выглядел следующим образом: Gi=aa аа аа аа, G2=ab аа аа аа, G3=bb аа аа аа, Gj=aa ab аа аа ... Gsi=bb bb bb bb.

Пусть P={pi, p;, ..., Psi} - распределение вероятности генотипа в исследуемой популяции. Вероятность НРА совместимости реципиента с генотипом G^ и случайного донора вычисляли si

по формуле: St -dh (14), где

I=/

р, - вероятность генотипа G„ dt, - индикатор совместимости генотипа реципиента G* и генотипа донора G,(to есть: dh =1, если генотипы совместимы, <4,= О-в противном случае).

Считали, что доноров отбирают из популяции случайно, т.е. без плановой селекции по генотипам. В этом случае распределение генотипов в группах доноров и реципиентов будет популяционным.

Вероятность того, что в банке доноров объема N число совместимых с генотипом Gk меньше чем га, вычисляли в соответствии с биноминальным распределением:

xi = b(m,N,St)=\^-Sril-Siy-m (15), где

Sk - условная вероятность совместимости с генотипом реципиента Gt вычисляемая по формуле (14).

Если реципиентов выбирают из той же популяции, что и доноров, то общая вероятность неудачи подбора необходимого числа m доноров из пула объема N будет складываться из

g!

вероятностей частных неулач лля конкретных генотипов (Gt): (16).

к=1

Зависимость вероятности неудачи подбора НРА доноров рассчитывали для различных объемов банка доноров с помощью формул (13-16), в которые, вместо теоретического распределения {рьк=1, ,81}, подставляли полученные нами значения частот генотипов у доноров (использовали программу на MS EXCELL).

Основные результаты исследования

Генотипирование по системе НРА выполнено у 297 индивидумов, идентифицирующих себя как русские. Установлено, что все доноры были гомозиготны по аллельному гену «а» локусов НРА-4 и НРА-6\у (таблица 1). Аллельные гены "а" и "Ь" локуса НРА-1 обнаружены у 95,62% и 27,61% доноров, соответственно; генотипы НРА-1а/1а встречались у 72,39%, НРА-1а/Ь - у 23,23%, НРА-1Ь/Ь - у 4,38%. Аллельный ген НРА-2а был обнаружен у 97,98%, НРА-2Ь - у 23,57%, генотип НРА-2а/а - у 76,43%, НРА-2а/Ь - у 21,55%, ген НРА-2Ь в гомозиготном состоянии (НРА-2Ь/Ь) был выявлен у 2,02° о обследованных лиц. Частота генов локуса НРА-3 составила: аллеля НРА-За - 80,81%, аллеля НРА-ЗЬ - 69,70%. Генотип НРА-За/а обнаружен у 30,64% людей, НРА-3 а'Ь - у 50,17%, НРА-ЗЬ/Ь - у 19,19%. Частота генотипа НРА-5а/а составила 83,165%, НРА-5аУЬ - 15,49%, НРА-5Ь/Ь - 1,346%. В целом наши сведения о частоте аллелей и генотипов НРА у русских оказались сопоставимы с частотами генов у представителей некоторых европейских популяций (словенами, македонцами, поляками, нидерландцами, финнами, австрийцами, британцами). Выявлены достоверные различия в частоте генов НРА-1 локуса между русскими и жителями Марокко, Туниса, Юго-Восточной Азии (Кореи, Китая, Японии), в частоте генов НРА-2 локуса - с немцами, нидерландцами, корейцами, в частоте НРА-3 локуса - с марокканцами и японцами, в частоте НРА-5 локуса - со всеми представителями Юго-Восточной Азии.

Таблица 1.

Частота аллельных генов и генотипов НРА у обследованных лиц

Локусы НРА Частота аллелей (%) Частота генотипов (%)

а Ь аа аЬ ЬЬ

НРА-1 95,62 27,61 72,39 23,23 4,38

НРА-2 97.98 23.57 76,43 21,55 2,02

НРА-3 80,81 69,70 30,64 50,17 19,19

НРА-4 100 0 100 0 0

НРА-5 98,65 17,85 83,165 15,49 1,346

НРА-6 100 0 100 0 0

Генные частоты «а» и «Ь» аллелей НРА определены как 0,84 и 0,16 для локуса НРА-1; 0,87 и 0,13 для НРА-2; 0,557 и 0.443 для НРА-3; 0,91 и 0,09 для НРА-5. Частота генов НРА-4а и

НРА-ба составила 1,0, то есть доноры с редким аллельным геном «Ь» указанных локусов в исследованной выборке не встретились (таблица 2). Таблица 2.

Частота аллельных генов и генотипов НРА у обследованных лиц (в долях единицы)

Локусы НРА Генная частота аллелей Частота генотипов

а Ь а/а а/Ь b/b

НРА-1 0.84 0.16 0.7239 0.2323 0.0438

НРА-2 0. 87 0. 13 0.7643 0.2155 0.0202

НРА-3 0. 557 0.443 0.3064 0.5017 0.1919

НРА-4 1.0 0 1.0 0 0

НРА-5 0.91 0.09 0.83165 0.1549 0.01347

НРА-6 1.0 0 1.0 0 0

Полученные данные по частоте генов и генотипов хорошо согласовывались с частотой, предсказанной на основе закона Харди-Вейнберга, что свидетельствовало об адекватности и корректности проведенных исследований.

Продемонстрировано, что гены локусов НРА-1 и НРА-3, локализованные на одной хромосоме в одном сегменте, наследуются сцепленно гаплотипами. На основании экспериментально полученных данных из популяционных и семейных исследований по количеству индивидуумов с разными сочетаниями аллельных генов локусов НРА-1 и НРА-3 вычисляли частоту гаплотипов аллельных генов НРА-1/3. Частота гаплотипа НРА-1аУЗа составила 45,76%; НРА-1а/ЗЬ -36,23%; НРА-1ЬЗа - 11,23% , HPA-lb/ЗЬ - 6,78%. Вычисленные ожидаемые частоты гаплотипов полностью соответствовали экспериментально полученным данным.

Неравновесное сцепление генов означает, что некоторые аллели, расположенные рядом в гене, могут появляться вместе в одном и том же гаплотипе более часто, чем это можно было ожидать при случайном их появлении. На гены НРА этот феномен может также распространяться, ибо является установленным факт, что гены, кодируюшие синтез аллоантигенов локусов НРА-1 и НРА-3, локализованы в одном сегменте длинного плеча 17ой хромосомы - 17q21-32. Известно, что ген GP2B, с локализованным внутри него геном, кодирующим синтез аллоантигенов локуса НРА-1, находится со стороны З'-конца гена GP3A, внутри которого находится ген, кодирующий синтез аллоантигенов локуса НРА-3, причем физически эти два гена картированы внутри 260-килобазного Sfi I фрагмента [Bray P.F. et al, 1988]. Вычисление величины неравновесного сцепления генов с учетом частоты аллеля в

популяции показало наличие незначительной гаметной ассоциации между генами НРА-1а и НРА-ЗЬ, НРА-1Ь и НРА-За (таблица 3).

Таблица 3.

Величина гаметной ассоциации между аллельными генами локусов НРА-1 и НРА-3

Гаплотипы Величина гаметной ассоциации

НРА-1 а/За -0.018

НРА-1а/ЗЬ 0,01474

НРА-1Ь/За 0.0081

HPA-lb/3b -0. 0071

В литературе недостаточно полно освещены вопросы, касающиеся наследования HP А-1/3, локализованных на гликопротеидах IIb и Illa. На основании проведенных нами семейных исследований продемонстрировано, что гены, кодирующие синтез НРА-1 и НРА-3, наследуются сцепленно гаплотипами, аналогично генам системы HLA и Резус.

Для установления закономерностей наследственного формирования иммуногенетической характеристики представляло интерес исследовать частоты аллельных генов и генотипов НРА локусов 1-5 у HLA-идентичных сибсов. В исследование были включены 142 HLA-идентичных сибсов - здоровых (74 человека) и больных (68 человек) с разными формами лейкозов. HLA-идентичные братья и сестры составили между собой 71 пару: из 136 человек было сформировано 68 пар больной ребенок - здоровый ребенок, 6 здоровых детей составили 3 пары.

Анализ распределения НРА-генов показал полную их идентичность у 17 пар сибсов (23,94%) (таблица 4). Тридцать две пары сибсов (45,07%) имели отличия по одному аллельному гену, четырнадцать пар (19,72%) - по двум и семь пар (9.86%) - по трем аллельным генам разных локусов НРА. Всего было выявлено 79 различий по НРА. По аллельным генам первого локуса имели отличия 17 пар сибсов (21,52%), по генам второго локуса - четырнадцать пар (17,72%), третьего локуса (НРА-3) - тридцать две пары (40,51%), пятого локуса (НРА-5) -шестнадцать пар (20,25%)

Изучение симметрии процесса распределения аллельных генов по гаметам отцов и матерей показало отсутствие преобладающего наследования детьми какого-либо аллельного гена или генотипа НРА, что доказывает сохранение равновесия генных концентраций у представителей исследуемой популяции. Ни в одном случае мы не получили статистически достоверных различий между частотой аллельных генов и генотипов у родителей и их детей,

что указывает на случайный выбор генотипов и генов из общего пула, то есть отсутствие избирательной селекции каких - либо гамет. Таблица 4.

Различия НРА-генов у сибсов. идентичных по антигенам системы НЬА

Число пар сибсов (п=71)

идентичных Отличающихся полокусам НРА Отличающихся по аллельным генам локусов (абсолютное количество различий равно 79)

по НРА одно му двум трем четырем НРА-1 НРА-2 НРА-3 НРА-5

абс. число 17 32 14 7 1 17 14 32 16

% 23,94 45,07 19.72 9.86 1.41 21.52 17.72 40,51 20.25

Изучение генетической дистанции между народами по НРЛ показало близость русских к таким славянским народам как македонцы (с1=2.36х10""). поляки (11=2.786x10"). словены ([1=3,54x10""). Нидерландцы оказались в генетическом аспекте ближе к русским (с1=3.87x10""). чем финны (с!=4,842х10"~). хотя известно, что в этногенезе великорусского народа принимали участие финно-угорские племена, проживавшие на Восточно-европейской равнине [Гумилев Л.Н., 2004]. Наибольшая величина генетической дистанции определена при сравнении генных частот НРА русских и представителей монголоидной расы - корейцев, китайцев и японцев (таблица 5).

Таблица 5.

Генетическая дистанция между русскими и представителями иных популяций

Популяции Генетическая дистанция, рассчитанная по генам системы НРА

Абсолютная (х 10"") Относительная

Русские - словены 3,546 1

Русские - македонцы 2.36 0.67

Русские - поляки 2.786 0.79

Русские - нидерландцы 3.8725 1.09

Русские - финны 4.842 1.365

Русские - аьстрницы Л Л1 1 1 3ос

Русские - британцы 5.145 1.45

Русские - немцы 8.636 2.44

Русские - берберы 8.775 2.475

Русские - корейцы 10.08 2.82

Русские - китайцы 11.21 3.16

Русские - японцы 14.65 4,13

Полиморфизм генов, основанный на замене единичных нуклеотидов, является основным источником разнообразия человеческого генома [Hochberg Е Р. et al., 2003]. Существование аллельных вариантов НРА-генов основано, как правило, на замене одного нуклеотида в аллель-специфических сайтах. Вследствие различной хромосомной локализации генов HLA и НРА передача их детям от родителей будет происходить независимо. Следовательно, HLA-идентичные сибсы могут иметь отличия по НРА-генам, что и было показано нашими исследованиями: 76,06% HLA-идентичных сибсов различались по НРА. При близкородственной HLA-идентичной трансплантации гемопоэтических клеток эти различия могут служить информативными маркерами, которые позволят следить за судьбой трансплантированных клеток в организме реципиента.

Информативными считали те аллели НРА, которые не совпадали у реципиента и донора костного мозга. Среди них таковыми оказались аллельные гены локусов НРА-1, НРА-3, НРА-5 и НРА-2, поскольку чаще отличия между сибсами касались аллельных вариантов именно этих генов. Поскольку при приживлении гемопоэтических клеток происходит смена кроветворения реципиента на гемопоэз донора, то исчезновение маркеров реципиента и появления «метки» донора, свидетельствовало о репопуляцин пересаженных стволовых клеток. Появление маркеров реципиента после их отсутствия свидетельствовало, как правило, о рецидиве заболевания.

Различия по НРА-генам нам удалось обнаружить у 37 из 50 (74%) пар сибсов, взятых на трансплантацию ГСК. Тринадцать пар HLA-идентичных сибсов были идентичны и по НРА. Информативность HP А-маркеров могла быть двунаправленной (то есть донор и реципиент имели различия по двум или более гетерозиготным аллелям НРА) или однонаправленной. Однонаправленные маркеры могли быть двух типов: 1) реципиент имел отличающийся аллель в гетерозиготном, а донор ГСК - в гомозиготном состоянии; 2) реципиент имел отличающийся аллель в гомозиготном, а донор ГСК - в гетерозиготном состоянии. Выборочные данные представлены в таблице 6. Двунаправленные НРА-маркеры были выявлены у 12 из 37 (32,4%) пар сибсов (например, № 1-5). Однонаправленный НРА-маркер первого типа был выявлен у 13 (32,5%) пар сибсов (например, № 6-8). По исчезновению клеток с собственным маркером НРА можно было судить о типе химеризма. То есть, у 27 пар донор-реципиент (в 67,5% случаев) мы могли достоверно идентифицировать донорский тип кроветворения - по исчезновению собственных маркеров реципиента и/или появлению «метки» донора. Однонаправленный НРА-маркер второго типа был выявлен у 12 (32,4%) пар сибсов. При репопуляции пересаженных стволовых клеток мог проявляться только маркер гетерозиготного донора (например, № 9-12) Положительным моментом таких сочетаний аллелей являлась возможность

идентифицировать отторжение трансплантата по исчезновению продукта амплификации аллельного гена НРА донора. Таблица 6.

НРА-метка при оценке приживления близкородственного алломиелотрансплантата (выборочные данные).

№ НЬА-идентичные сносы Генотип НРА Метка по генам НРА у реципиента после ТКМ

1 Аб-ва (больная) la'a, -2а'а, -За/b. 5-а'а Появление 1Ь+, 2Ь+ и исчезновение ЗЬ+ клеток

Аб-в (брат) la/b, -2а. b, -За/а, -5а/а

2 Т-в(больной) la'a. -2а'а, -За/а. -5а/Ь Появление ЗЬ+ клеток и исчезновение 5Ь+

Т-в (брат) 1а/а. -2а'а, -За/'b. -5а/а

3 Кур-на(больная) 1а/Ь. -2а/а, -За/а. -5а а Появление ЗЬ+ клеток и исчезновенне 1Ь+

Кур-на (сестра) 1а/а, -2а/а. -ЗЬ/Ь. -5а'а

4 Шт-ва (больная) 1а/а, -2а а, -За'Ь, -5а'а Появление 1Ь+ клеток и исчезновенне 1а+ . ЗЬ+

Шт-в (брат) lb/b. -2а'а. -За'а. -5а'а

5 Ш-ков (больной) 1а Ь. -2а Ь, -За/а. -5а а Появление ЗЬ+ клеток и исчезновенне 2Ь+и

Ш-кова (сестра) 1а/'Ь, -2а/а, -За Ъ, -5а'а

6 Ш-на (больная) 1а/а, -2а/а, -За'Ь, -5а Ъ Исчезновенне ЗЬ+ и 5Ь+ клеток

Ж-кин (брат) la'a, -2а/а. -За'а, -5а'а

7 Аб-на больная) la'a, -2а/а. -За Ъ. -5а/Ь Исчезновение 5Ь+ клеток

Гул-в (брат) 1а/а, -2а'а, -ЗаЪ, -5а/а

8 Кел-н(больной) la'a. -2a/b, -За/b, -5з/а Исчезновение 2Ь+ клеток

Куд-ва(сестра) la'a. -2а'а, -За/b. -5а'а

9 3-цев (больной) 1Ь'Ъ. -2а<Ъ, -За'Ь, -5а/а Появление 1а+ клеток

М-на (сестра) la/b, -2а b. -За/b, -5а'а

10 Ов-ва (больная) la/a, -2а/а, -3b/b, -5а,b Появление За+ клеток

Ов-в (брат) la/a, -2а/а, -За'Ь. -5а'Ь

11 Зин-ва (больная) la'a, -2а'а, -ЗЬ/Ь, -5а/а Появление За+5Ь+ клеток

Зин-ва(сестра) la/a, -2а'а, -ЗаЬ, -5а/Ь

12 Шт-рев (больной) la/a, -2а Ь, -За'а. -5а/а Появление 5Ь+ клеток

Шт-рев (брат) 1а/а, -2а Ь. -За'а, -5а/Ь

Мониторинг приживления ГСК по изменению НРА-генотипа ядросодержащих клеток провели 30 больным, которым была выполнена алломиелотрансплантация: 24 после миелоаблативного режима кондиционирования и 6 после режимов кондиционирования пониженной интенсивности. Применение молекулярного метода позволило следить за приживлением алломиелотрансплантата, определять тип кроветворения в конкретные сроки

после трансплантации ГСК. Полный донорский химеризм на +30 и +60 дни достоверно чаще выявляли у больных после применения миелоаблативных режимов кондиционирования по сравнению с больными после проведения режимов кондиционирования пониженной интенсивности. Сопоставление результатов мониторинга приживления ГСК по молекулярным и цитогенетическнм маркерам у больных позволило диагностировать молекулярную и цитогенетическую ремиссию в 38 случаях, предполагать рецидив в 6, выявить персистенцию клеток с маркерами реципиента в 10 случаях. В целом результаты молекулярного исследования по НРА совпали с критериями идентификации ремиссии или рецидива по цитогенетическнм маркерам.

Изучение факторов, влияющих на восстановление показателей периферической крови, особенно количество нейтрофилов и тромбоцитов, у больных после трансплантации ГСК, имеет большое значение. Восстановление показателей периферической крови напрямую зависит от приживления трансплантированных ГСК, что, в первую очередь, определяется степенью совместимости донора и реципиента по антигенам главного комплекса гистосовместимости [Debili N е.а, 2001; Emambokus N.R, Frampton J, 2003]. При выборе донора гемопоэтнческих стволовых клеток, как правило, не учитывают соответствие антигенной структуры эритроцитов и тромбоцитов донора и реципиента.

Влияние несовместимости по НРА-генам донора н реципиента на восстановление показателей нейтрофилов и тромбоцитов периферической крови не изучено. Под несовместимостью понимают привнесение с трансплантированными клетками тромбоцитарных антигенов, отсутствующих у реципиента. Можно предположить, что различия реципиента и донора по НРА тромбоцитарных гликопротеидов, являющихся адгезивными молекулами и экспрессированными на CD34+ и более зрелых клетках миелогемопоэза [Debili N. et al, 1992, 2001; Gomez-Espuch J. et al, 1999; Lepage A. et al, 2000; Kanaji T. et al, 2004; Taichman R.S, 2005], могут оказывать влияние на плотность контакта стволовых клеток и некоммитированных клеток-предшественниц гемопоэза с клетками микроокружения и внеклеточным матриксом костного мозга. От плотности этого контакта будет зависеть пролиферативный потенциал стволовых клеток и некоммитированных клеток-предшественниц гемопоэза, а, следовательно, и сроки восстановления количества нейтрофилов и тромбоцитов периферической крови у больных после алломиелотрансплантации

Больные были разделены на группы - НРА-идентичные (1-ая группа, 11 человек), НРА-совместимые (2-ая группа, 12 человек) и НРА-несовместимые (3-я группа, 17 человек). Совместимыми с реципиентом считали доноров ГСК с точки зрения непривнесения нового антигена системы НРА с трансплантированными клетками, то есть имеющих различающиеся

аллельные НРА-гены в гомозиготном состоянии, в то время как реципиенты имели гетерозиготные варианты аллелей НРА. В группу больных, НРА-несовместимых с донором, вошли гомозиготные реципиенты с трансплантированными ГСК от гетерозиготных доноров и реципиенты, отличающиеся от доноров по аллелям целого локуса. О начале восстановления нейтрофнлов после трансплантации ГСК судили по достижению ими значения более или равного 0,5х109 кл/л. Началом восстановления количества тромбоцитов в периферической крови считали достижение значение 50х109 кл'л после прекращения трансфузий тромбоцитсодержащих сред. № подсчета были исключены больные (10 человек) с ранним рецидивом после трансплантации ГСК, с фиброзом стромы костного мозга, с несостоятельностью трансплантата, со смешанным химеризмом на +30 день, а также больные, получавшие противовирусные препараты в лечебных дозах из-за их миелотоксического эффекта. Различий в клинической характеристике между больными выделенных групп не было.

Полученные данные представлены в таблице 7. из которой следует, что сроки восстановления нейтрофилов до значения 0,5хЮ9 кл'л у больных 1-ой и 2-он групп были достоверно короче, чем у больных 3-ей группы. У реципиентов первых двух групп этот срок составлял 13,45 и 14,3 дней, у реципиентов 3 группы - 19.0 дней (р<0,001 и р=0.003. соответственно). Таблица 7.

Длительность восстановления количества нейтрофилов до значения 0,5х109 кл'л у больных в зависимости от совместимости по НРА-генам реципиента и донора (количество дней)

Показатели Группы больных

НРА-идентичные (п=11) НРА-совместимые 01=12) НРА-несовместимые (п=17)

средние 13.45 14.3 19.0

колебания значений 10-19 10- 18 14-26

достоверность р=0.302 -

р=0,003

* р<0,0001

НРА-несовместимого донора п - число больных

После проведения кондиционирования перед трансплантацией ГСК происходит снижение показателей тромбоцитов в периферической крови. Восстановление количества тромбоцитов до значения 50х109кл/л происходило в более короткие сроки у больных 1-ой (16.2 дня) и 2-ой

групп (18,2 дня) по сравнению с пациентами 3-й группы (24,2 дня) (р=0,012 и р=0,037, соответственно) (таблица 8) Таблица 8.

Длительность восстановления количества тромбоцитов до значения 50х109 кл/л у больных после алломиелотрансплантации в зависимости от совместимости по НРА-генам с донором (количество дней)

Показатели Группы больных

НРА-идентичные (п=9) НРА-совместимые (п=10) НРА- несовместимые (п=15)

средние 16,2 18.2 24,2

колебания значений 10-21 12-30 12-38

достоверность Р>0,05 -

р=0,037

* р=0,012

^Различия в длительности восстановления тромбоцитов у больных, имеющих НРА-идентичного и НРА-несовместсшого донора п - число больных

Проведен сравнительный анализ количества выполненных трансфузий и количества доз перелитых тромбоцитов во время агранулоцитоза и тромбоцитопении у 12 больных без геморрагических осложнений, имеющих НРА-идентичного/совместимого или НРА-несовместимого донора ГСК. В указанный период больным было проведено 55 трансфузий и перелито 246 доз тромбоцитов. Изучаемые параметры не имели достоверных различий у больных 1-ой и 2-ой групп: в среднем им потребовалось 14 доз и 3,4 трансфузии тромбоцитов. Больным 3-ей группы потребовались большие дозы тромбоцитов - в среднем 29,4 и 6 трансфузий. Количество доз перелитых тромбоцитов достоверно отличалось в сравниваемых группах больных, количество трансфузий тромбоцитов достоверных отличий не имело (таблица 9).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что сроки восстановления количества нейтрофилов до значения 0,5х109 кл/л и количества тромбоцитов до значения 50х109 кл'л. количество доз переливаемых тромбоцитов зависят от совместимости сибсов по НРА-генам.

Приживление ГСК, рассматриваемый как кульминационный эффект комплекса событий, при которых циркулирующие клетки приобретают статус оседлых тканевых клеток костного мозга, представляет собой сложный, динамичный, многоступенчатый процесс, который регулируется совокупностью взаимодействия различных клеток с адгезивными молекулами и

их лигандами, ростовых факторов, белков внеклеточного матрикса [N¡15011 Б.К.е! а1.. 2006]. Нарушение в любом звене этой кооперации может привести к изменению последующих событий, вплоть до их полной блокировки. Полагаем, что несовместимость по НРА. может привести к изменению адгезивного профиля трансплантированных клеток-предшественниц гемопоэза, снижению их пролнфератнвной активности и удлинению времени приживления, что в совокупности с другими факторами отражается на длительности восстановления количества нейтрофилов и тромбоцитов в периферической крови. Таблица 9.

Количество доз и трансфузий тромбоцитов, необходимых больным в период тромбоцитопенни после алломиелотрансплантации, в зависимости от совместимости по НРА-гепам с донорами ____

Группы больных Среднее количество доз тромбоцитов Диапазон Среднее количество трансфузий тромбоцитов Диапазон

НРА-идентичные/ совместимые (п= 19) 14.1 12-27 3,4 2-7

НРА-несовместимые (п= 15) 29.4 20-40 6.0 3-9

достоверность Р<0,05 Р>0.05

В настоящее время в Российской Федерации отсутствуют сведения о частоте комплексной аллоиммуннзации больных с заболеваниями системы крови к антигенам системы НРА и НЬА.

Наши исследования, выполненные на 950 образцах сывороток от 385 больных с разными нозологическими формами заболеваний системы крови, показали, что аллонммунные антитромбоцитарные антитела достоверно чаще выявляли у больных АА (70%) и МДС (67.16%), чем в группе больных ОМЛ (35.06%) и ОЛЛ (12 %) (таблица 10). Больные ХЛЛ (53,8%) и ХМЛ в фазе бластного криза (64,3%) были более часто подвержены аллоиммуннзации, чем больные ОЛЛ (12° о). Частота аллоиммуннзации различалась среди больных острым лейкозом: у больных ОМЛ частота выявления аллоиммунных антител составила 35,1%, у больных ОЛЛ - 12%.

Таким образом, больные ОЛЛ были менее подвержены аллоиммуннзации по сравнению с перечисленными выше группами пациентов, у которых лимфоидный росток кроветворения не затронут патологическим процессом. Причина, видимо, заключается в нарушении созревания клеток иммунной системы при ОЛЛ или их функциональной неполноценности.

При изучении структуры аллоиммуннзации было выявлено следующее. У больных АА (49%), ОМЛ (51,85%) и ХЛЛ (62%) частота обнаружения изолированных анти-НРА достоверно

превышала частоту выявления изолированных анти-НЬА-антител (26%, 7,4%, 14,3%, соответственно) Среди больных ОЛЛ пациенты с изолированными анти-НЬА антителами нам не встречались. Больные МДС были одинаково часто иммунизированы к антигенам системы НРА и III,Л В группе больных ХМЛ в фазе бластного криза изолированные анти-НРА встречались в два раза чаще анти-НЬА антител, у 44,5% и 22,2% пациентов, соответственно, однако эти различия не были статистически достоверны из-за малого числа наблюдений. Таблица 10.

Частота аллоиммунизации к антигенам систем НРА и НЬА у гематологических больных, получавших компонентную терапию

Диагнозы больных Общее число больных Число больных без антител (%) Число аллоиммунизированных больных (%) Число больных с антителами (%)

анти-НРА анти-НРА + анти- НЬА анти- НЬА

АА 100 30 (30)* 70 (70)* 34 (48,57)** 18 (25,7)** 18 (25,7)**

ОЛЛ 50 44 (88)* 6 (12)* 5 1 0

ОМЛ 77 50 (64.94) 27 (35.06) 15 (55.56) 10 (37.04) 2 (7.4)

МДС 67 22 (32.8)* 45 (67.2)* 14 (31,1)** 16 (35.5)** 15 (33.3)**

хлл 39 18 (46.2)* 21 (53,8)* 13 (61.9)** 5 (23.8)** 3 (14.3)**

ХМЛ, бластный криз 28 10 (35,7) 18 (64,3) 8 (44,5)** 6 (33,3)** 4 (22,2)**

Анемии 8 0 8 3 1 4

Состояние после ТКМ 16 7 (43.75%)* 9 (56.25)* 7 2 0

Всего 385 181 (47,01)* 204 (52,99)* 99 (25,71)* (48.53)** 59 (15,325)* (28,92)** 46 (11,95)* (22,55)**

* - процент от общего числа больных

** - процент от числа аллоиммунизированных больных

Нами впервые получены сведения о комплексной аллоиммунизаии больных заболеваниями системы крови. Аллонммунные изолированные анти-НРА антитела были обнаружены у 25,7% от общего количества больных, в сочетании с анти-НЬА антителами - у 15.33%, изолированные анти-НЬА антитела выявляли у 11,95% пациентов. Аллоиммунизация к

НРА в 30° о случаев была обусловлена присутствием у реципиентов антител с высокой частотой реагирования и в 70° о случаев - антител с низкой частотой реагирования.

Сравнительный анализ выявления антитромбоцитарных антител после трансфузий тромбоцитов на протяжении трех лет (2000 - 2002 гг.) у всех групп больных выявил следующие закономерности:

1) уменьшение числа пациентов с анти-НЬА антителами (с 35,71% до 11.5°о), связанное с усовершенствованием методов очистки тромбоцитного концентрата от примеси лейкоцитов, являющихся основными носителями НЬА антигенов:

2) увеличение числа больных с анти-НРА антителами (с 21,43% до 70.5%). которое обусловлено усовершенствованием методических приемов их тестирования (применение при тестировании не пула, а единичных донорских тромбоцитов) и сроками обследования больных после очередной трансфузии. У значительной части больных, выбранных из разных групп (59 человек), просматривалась явная приуроченность выявления анти-НРА антител к ранним периодам после начала трансфузий тромбоцитов (после 6-8 трансфузий тромбоцитов);

3) уменьшение числа больных с сочетаннымн анти-НЬА и анти-НРА антителами (с 42,86% до 18%).

Изучение частоты аллоиммунизации больных гематологическими заболеваниями с множественными трансфузиями компонентов крови к антигенам систем НРА и ША необходимо для правильного выбора доноров тромбоцитов. Мы впервые в России начали подбирать доноров тромбоцитов аллоиммунизированным больным с использованием одновременно двух иммунологических методов в зависимости от направленности выявленных антител - в лимфоцитотоксическом тесте и иммуноферментным методом. Донор, чьи лимфоциты и тромбоциты не реагировали с сывороткой пациента в серологических реакциях, считался совместимым, и его тромбоциты рекомендовали для переливания.

Полученные данные позволили сделать заключение о том. что переливание совместимых тромбоцитов аллоиммунизированным больным приводило к отсутствию посттрансфузионных реакций негемолитического типа и большему скорректированному посттрансфузионному приросту тромбоцитов (СПТ-18), чем при использовании тромбоцитов от произвольно взятых доноров (14.51х109 кл'л и 6.54х109 кл/л. соответственно) (р<0.05). Такая зависимость была установлена у больных, имеющих часто реагирующие антитела (более 40° о) в высоком титре (более 1:16), но не у больных, имеющих антитела с низкой активностью (титр 1:2-1'4 и частоту реагирования менее 20%). Количество эффективных трансфузий, оцениваемых по СПТ не менее 4,5х109 кл/л через 18 часов (СПТ-18). составило 86% при использовании тромбоцитов от НРА- и НЬА-совместимых доноров, по сравнению с 46° о при

переливании тромбоцитов от произвольных доноров. Эффективность трансфузий тромбоцитов прямо коррелировала с частотой реагирования антитромбоцитарных антител у больных при переливании им тромбоцитов от произвольно взятых доноров. Отсутствие достаточного СПТ-18 в 14% случаев свидетельствовало о присутствии у больных неиммунологических факторов рефрактерности, в основном синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания.

Наши данные о повышении частоты анти-НРА аллоиммунизации у больных заболеваниями системы крови при проведении трансфузий тромбоцитов, а также сведения литературы о незначительной первичной иммунизации к антигенам системы НЬА (2,7%) [Иоуо1пу \'Д[..[. et а1., 1995] и о снижении аллоиммунизации к НЬА при использовании тромбоцитов, обедненных от примеси лейкоцитов, с 45% до 2,6% [Еп§е1Ше1 С.Р., Яеевшк Н.\У., 2003]. позволяют предложить формирование контингента доноров, типированных в первую очередь по антигенам системы НРА.

По данным частотных распределений генотипов в исследованной группе доноров была рассчитана величина контингента НРА-типированных лиц, необходимого для обеспечения трансфузиями совместимыми тромбоцитами с целью предупреждения сенсибилизации первичных больных с аплазией кроветворения на время проведения трехмесячного курса иммуносупрессивной терапии. Рассчитывали зависимость вероятности неудачи в подборе 100 НРА совместимых доноров для одного случайного первичного реципиента от числа типированных людей. Если задаться пороговым уровнем неудачи в подборе группы из 100 доноров равным 10%, то такой уровень обеспечивается контингентом в 1300 доноров (рис.1), то есть в 90% случаев удастся сформировать группу НРА-совместимых с больными доноров, необходимых для продолжительного курса трансфузионной терапии тромбоцитами больных с аплазией кроветворения.

о й3 а. 0 С. 5 „ С 1 0.1 С с я (НА Ё О О. И о

О 1000 15 Объем банка доноров

Рисунок 1. Расчетная зависимость вероятности неудачн в подборе 100 НРА-совместимых доноров для одного случайного реципиента в зависимости от объема банка доноров.

Таким образом, проведенное впервые в России исследование позволило установить иммуногенетические характеристики НРА представителей восточно-европейского региона России, самоидентифицирующих себя как русские, выявить значение полиморфизма НРА при алломиелотрансплантации и в трансфузиологии. Выводы:

1. Установлено, что у представителей восточно-европейской части России, самоидентифицирующих себя как русские, гены локусов НРА-1.-2.-3.-5 являются полиморфными. Гены локусов НРА-4,-6 не полиморфны.

2. Рассчитаны иммуногенетические характеристики НРА представителей исследуемой популяции. Установлено, что частота аллелей «а» локусов НРА-1.-2.-5 (95.62%. 97.98° о и 98.65%, соответственно) превалирует над частотой аллелей «Ь» (27,61%. 23.57%, и 17,85%, соответственно); частота генотипов, гомозиготных по «а» аллелю локусов НРА-1,-2,-5 (1239%, 76,43%, 83.165%. соответственно), превалирует над частотой гетерозиготных и гомозиготных по «Ь» аллелю генотипов (23.23%. 21.55%, 15.49%. соответственно, и 4,38%, 2,02%, 1,346%, соответственно). Гетерозиготные варианты генотипов локуса НРА-3 превалируют над частотой гомозиготных по «а» и «Ь» аллелям генотипов (50,17%. 30,64% и 19.19%, соответственно). Частота гаплотипов НРА-1а'За и НРА-1а/ЗЬ (45,76% и 36,23%, соответственно) превалирует над частотой гаплотипов НРА-1Ь/За и НРА-1Ь/ЗЬ (11,23% и 6,78%, соответственно).

3. Частоты аллелей и генотипов НРА у русских, сопоставимы с частотами генов у представителей ряда европейских популяций (Словении. Македонии. Польши. Финляндии, Австрии. Великобритании). Выявлены достоверные различия в частоте генов НРА-1 локуса между русскими и представителями Марокко, Туниса. Юго-Восточной Азии (Кореи, Китая, Японии), в частоте генов НРА-2 локуса - с представителями Германии, Нидерландов, Кореи, в частоте НРА-3 локуса - с представителями Марокко и Японии, в частоте НРА-5 локуса - с представителями Кореи. Китая. Японии. Генетическая дистанция между русскими и представителями иных славянских популяций минимальна.

4. Установлено, что частота идентичности по НРА у Н1,А-иттентичнт,тх сибсои гогглигягг 23.94%. Генетические различия по НРА могут быть использованы в качестве «метки» при проведении мониторинга приживления близкородственного алломиелотрансплантата у 76,06% НЬА-идентичных сибсов, что подтверждается сопоставлением результатов молекулярных и цитогенетических методов исследования.

5. Совместимость реципиента и донора по НРА-генам влияет на сроки восстановления нейтрофилов (до 0,5х109/л) и тромбоцитов (до 50х109/л) после алломиелотрансплантации. Обнаружено, что сроки восстановления тромбоцитов н нейтрофилов короче у реципиентов, имеющих НРА-ндентичного или НРА-совместнмого донора, чем у реципиентов, которым трансплантировали гемопоэтические стволовые клетки от НРА-несовместимого донора (16, 18 и 24 дня, соответственно, и 13, 14 и 19 дней, соответственно). После трансплантации гемопоэтических стволовых клеток от НРА-несовместимого донора больным требуется в два раза больше доз тромбоконцентратов по сравнению с больными, у которых доноры ГСК были НРА-идентичны/совместимы (29 и 14 доз, соответственно).

6. Трансфузии тромбоцитов без учета антигенной структуры реципиента и донора способствуют образованию у больных как изолированных, так и сочетанных анти-НРА и анти-НЬА антител. Отмечено возрастание частоты анти-НРА иммунизации и снижение частоты анти-НЬА аллоиммунизации. Высокая частота изолированных анти-НРА антител по сравнению с частотой выявления изолированных анти-НЬА антител при компонентной терапии тромбоцитами выявлена у больных апластической анемией (48,57% и 25,7%, соответственно), острым миелобластным лейкозом (55,56% и 7,4%, соответственно) и хроническим лимфолейкозом (61,9% и 14,3%, соответственно). У 30% больных выявлены антитела с высокой частотой реагирования, у 70% - антитела с низкой частотой реагирования.

7. Подбор доноров тромбоцитов с использованием иммунологических методов повышает эффективность трансфузий тромбоцитов у больных с высоко активными антителами.

8. Рассчитано, что величина контингента НРА-типированных доноров, достаточного для обеспечения совместимыми по антигенной структуре тромбоцитами первичных больных с аплазией кроветворения, должна составлять не менее 1300 человек.

Практические рекомендации

1. Данные по распределению аллельных генов НРА русских рекомендуется использовать в качестве контрольной группы при популяцнопных исследованиях и в работе по направлению «НРА и склонность к тромбозам».

2. Проведение НРА-генотипирования в этнических группах жителей России позволит установить их иммуногенетические параметры и определить величину когорты доноров

тромбоцитов, необходимых для трансфузионного обеспечения больных с заболеванием системы крови.

3. Силами штатного персонала СПК регионов рекомендуется проводить НРЛ-генотипирование доноров с использованием отечественных пранмеров для создания местного контингента типированных доноров.

4. Различия между реципиентом и донором по НРА-генам целесообразно использовать для проведения мониторинга приживления гемопоэтических стволовых клеток, особенно в случаях, когда иные генетические маркеры отсутствуют.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Красникова H.A., Порешина Л.П., Головкина Л.Л, Зотиков Е.А. Выявление антитромбоцитарных антител у больных с тромбоцитопенней. // Новое в трансфузиологии,- 1999,- выпуск 24,- с.44-49

2. Головкина Л.Л. Значение антигенов тромбоцитов в трансфузиологии и педиатрии (обзор литературы). // Новое в трансфузиологии.- 2000.- вып.25,- с.93-101

3. Головкина Л.Л., Стремоухова А Г, Кутьина P.M.. Зотиков Е.А. Подходы к выбору доноров больным с иммунологической рефрактерностью к трансфузиям тромбоцитов. // Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии (Материалы научно-практической конференции, г. Санкт-Петербург. 6-8 июня. 2000 г.).- 2000.-

с.241-242

4. Головкина Л.Л, Стремоухова А.Г.. Кутьина P.M.. Зотиков Е.А. Тактика выбора доноров сенсибилизированным больным с тромбоцитопениями. // Проблемы гематологии и переливания крови - 2000,- № 2.- с.16

5. Головкина Л.Л, Стремоухова А.Г., Кутьина P.M.. Зотиков Е А.. Устинова Е.Н Аллоиммунизация к антигенам тромбоцитов и иммунологическое обеспечение трансфузиями тромбоцитов сенсибилизированных больных. /V Новое в трансфузиологии.-2000,- вып. 26,- с.45-54

6. Красникова H.A., Порешина Л.П., Головкина Л.Л., Долгопольская Т.П., Зотиков Е.А. Антитела, реагирующие с тромбоцитами. // Клиническая лабораторная диагностика.-2000,- № 5,- с.40-43

7. Михайлова Е.А, Ядрихинская В.В, Вернюк М.А.. Устинова ЕН, Исаев В.Г, Штырева Е.М, Головкина Л.Л, Стремоухова А.Г, Калинин Н Н, Савченко В Г. Плазма- и лимфоцитаферез в комплексной терапии апластической анемии. // Сборник трудов 8-ой конференции Московского общества гемафереза. г. Москва.- 2000,- с.39

8. Порешина Л.П. Красникова H.A., Головкина Л.Л, Кутьина P.M.. Васильева М Н. Стремоухова А.Г.. Зотиков Е.А. Идентификация тромбоцитспецифических аллоиммунных антител у сенсибилизированных больных. // Проблемы гематологии и переливания крови.-20ПП - .No ? - с 35

9. Головкина Л.Л, Стремоухова А.Г, Кутьина P.M.. Штырева Е.М, Калинин H.H.. Михайлова Е.А, Зотиков Е.А. Влияние плазмафереза на динамику активности анти-HLA антител у больной апластической анемией. // Труды девятой конференции Московского общества гемафереза, г. Москва.- 2001,- с.67-68

10. Головкина Л.Л, Стремоухова А.Г, Михайлова Е.А, Штырева Е.М, Калинин H.H., Зотиков Е.А. Появление полиспецнфических антитромбоцитарных антител у больного с

септическим осложнением. // Проблемы гематологии и переливания крови.- 2001.- № 3.-с.49

11. Головкина Л .Л., Зотиков Е.А. Антигены тромбоцитов (обозначения, молекулярные основы построения, частота встречаемости в популяциях). // Клиническая лабораторная диагностика,- 2002,- № 3.- с.23-24, 33-35

12. Головкина ЛЛ, Кутьина Р.М, Зотиков Е.А., Калинин Н.Н., Штырева Е.М., Михайлова Е.А. Влияние плазмафереза, проводимого в сочетании с трансфузиями тромбоцитов, на активность антитромбоцитарных антител. // Новое в трансфузиологии.- 2002,- Вып.29,-с.57-65

13. Головкина Л.Л., Кутьина P.M., Зотиков Е.А., Февралева И.С., Пичковская В.А., Судариков А Б Генотипирование тромбоцитспецифических антигенов НРА-1,-2,-3,-5 у доноров и HLA-идентичных сибсов. /7 Вестник трансплантологии и искусственных органов,- 2002,-№ 3,- с. 14

14. Зотиков Е.А., Головкина Л.Л., Кутьина P.M., Калинин Н.Н., Штырева Е.М., Михайлова Е.А. Влияние плазмафереза на активность антитромбоцитарных (анти-НРА) антител. // Клиническая лабораторная диагностика,- 2002.- № 4,- с.54-55

15. Головкина Л.Л., Зотиков Е А. Особенности аллоиммунизации к тромбоцитспецифическим антигенам (НРА) у больных аплазией и депрессией кроветворения с множественными трансфузиями компонентов крови. // Проблемы гематологии и переливания крови,- 2003.- № 1,- с 41

16. Головкина Л.Л., Зотиков Е.А. Аллоиммунизация к антигенам НРА и HLA у гематологических больных с множественными трансфузиями компонентов крови. // Новое в трансфузиологии.- 2003.- Вып.34,- с.12-22

17. Головкина Л.Л., Зотиков Е.А., Красникова Н.А., Кутьина P.M., Стремоухова А.Г. Значение антигенов тромбоцитов систем HLA и НРА в трансфузиологии. // Проблемы гематологии и переливания кровн,- 2003.- JV» 1,- с.41

18. Головкина ЛЛ, Зотиков Е.А., Кутьина РМ., Красникова НА, Стремоухова А.Г, Михайлова Е А, Устинова Е.Н. Иммунологическое обеспечение трансфузиями тромбоцитов гематологических больных. // Гематология и трансфузиология.- 2003,-

№ 6 - с.5-15

19. Golovkina L.L.. Zotikov Е.А, Ragimov А.А. The specificity of alloimmunization to human platelet antigen (HPA) following multiple blood transfusions in oncological and haematological patients. // Abstract book of VIII European congress of the International Society of Blood Transfusion 5-9 July, Istanbul, Turkey.- 2003,- p. 115 (P-324)

20 Головкина Л Л, Кутьина Р М, Зотиков Е.А, Любимова Л.С, Савченко В.Г. Генотипирование тромбоцитспецифических антигенов (НРА) у HLA-идентичных сибсов. // Иммунология и аллергология.- 2003.- том 4.- № 2.- с.75

21. Головкина Л.Л, Кутьина P.M., Зотиков Е.А, Любимова Л.С, Савченко В.Г, Февралева И.С, Пичковская В.А, Судариков А.Б. Полиморфизм НРА-генов у россиян и его значение при близкородственной алломиелотрансплантации. // Проблемы гематологии и трансфузиологии,- 2003.- № 2 - с.36-37

22. Зотиков Е А, Бабаева А.Г, Головкина Л.Л. Тромбоциты и антитромбоцитарные антитела. // Москва,- 2003 - 125 с.

23. Golovkina L.L. НРА genes at inhabitants of Russia. // Abstracts book of 8-th European symposium on platelet and granulocyte immunibiology.- Austria, Rust.- 2004.- p.19

24. Головкина Л.Л, Зотиков Е.А, Февралева И.С, Пичковская В.А, Зарецкая Ю.М. Распространенность генов НРА в российской популяции. // Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии, С-Петербург.- 2004.- с. 141

25. Макарик Т.В, Головкина Л.Л, Орлова Г.К, Шумилова Л.Л, Судариков А.Б. Генотипирование антигенов тромбоцитов человека методом полимеразной цепной

реакции с использованием аллель-специфических пранмеров. // Проблемы гематологии и переливания крови,- 2004,- № 3.- с.27-31

26. Golovkina L.L., Kutyina R.M. Poljmorphism of human platelet antigens in HLA-identical siblings. // Bone marrow transplantation.- 2004,- V.33 supplement 1.- P.S309 (R1108a)

27. Головкина Л.Л., Кутьина P.M., Зотиков E.A., Февралева II.C., Пичковская В.А., Любимова Л.С., Савченко В.Г. Полиморфизм генов ИРА и его значение при миелотрансплантации от HLA-идентичного снбса. // Гематология и трансфузиологня,-

2004,-№1,- с.11-14

28. Рагимов А.А., Дашкова Н.Г., Головкина Л.Л., Зотиков Е.А. Пострансфузнонные реакции и осложнения негемолитического типа. // В кн. «Основы трансфузионной иммунологии» Рагимов А.А., Дашкова Н.Г., МИА, Москва,- 2004,- стр 243-255

29. Головкина Л.Л., Зотиков Е.А., Макарик Т.В., Судариков А.Б. Распространенность тромбоцитспецифических антигенов у россиян как основа формирования контингента типнрованных доноров. // Сб.: «Актуальные вопросы трансфузиологни и клинической медицины», г. Киров,- 2005.- с.145-148

30. Головкина Л.Л., Макарик Т.В., Судариков А.Б. Пммуногенетические параметры тромбоцитспецифических антигенов - основа для формирования контингента типнрованных доноров. // Проблемы гематологии и переливания крови,- 2005,- № 1.- с.29

31. Golovkina L.L. Human platelet antigen gene's single nucleotide polymorphism in the engraflment's monitoring of bone marrow transplant. // Genes & Immunity; genetics, genomics and function.- 2005.- V.6 supplement 1.- S. 76 (P-249)

32. Golovkina L.L., Makarik Т., Sudarikov A.B. Distribution of HPA-genes and genotypes in the population of Russian unrelated donors. // Genes & Immunity; genetics, genomics and fiinction.-

2005,- V.6 supplement 1,- S. 22 (P- 36)

33. Красникова H.A, Головкина Л Л. Методический подход для выявления антитромбоцитарных антител аллогенной природы. // Новое в трансфузиологни,- 2005.-выпуск 40,- стр.53-62

34. Кутьина P.M., Головкина Л.Л., Желнова Е П.. Любимова Л.С. Антилейкоцитарные антитела у реципиентов аллогенного костного мозга. // Проблемы гематологии и переливания крови,- 2005,-№ 1,- с. 41

35. Головкина Л.Л., Кутьина P.M.. Виноградова О.А., Неунылова М.В.. Любимова Л С.. Савченко В.Г. Внутривидовой полиморфизм НРА-генов при оценке приживления алломиелотрансплантата. // Проблемы гематологии и переливания крови,- 2006,- № 1,-с.21

36. Головкина Л.Л., Кутьина P.M., Неунылова М.В., Любимова Л.С., Савченко В.Г. Влияние несовместимости донора и реципиента по НРА на длительность аплазии кроветворения после алломиелотрансплантации. // Проблемы гематологии и переливания крови.-2006.-№ 1,- с.21

37. Головкина Л Л., Кутьина P.M., Савченко В.Г. Генетические рахтичия по тромбоцитспецифическим антигенам при мониторинге приживления алломиелотрансплантата. // Клеточные технологии в биологии и медицине - 2006.-№ 2- с. 77-83

38. Головкина Л.Л., Кутьина P.M., Савченко В.Г. Новый маркер определения типа химеризма после алломиелотрансплантации. // Новое в гематологии и трансфузиологни. г. Киев,-2006 - выпуск 4,- с. 61-65

39. Головкина Л.Л., Макарик Т.В., Судариков А.Б., Куликов С.М., Волкова О.Я., Савченко В.Г., Зотиков Е.А. Расчет контингента доноров, необходимого для обеспечения трансфузиями тромбоцитов, типнрованных по антигенам системы НРА // Гематология и трансфузиология -2006.-№ 3,-с. 38-42

40. Головкина Л.Л., Макарик Т.В., Судариков А.Б, Куликов С.М., Савченко В.Г. Иммуногенетические параметры тромбоцитспецифических антигенов - основа для расчета величины контингента типированных доноров // Новое в гематологии и трансфузиологии, Киев,- 2006.- выпуск 4.- с. 66-71

41. Golovkina L. Crossingover of allelic HPA-1,-3 genes. // Tissue Antigens.- 2006.-V.67 n.6.-

p. 475 (P-041)

42. Golovkina L.L., Kutyma R.M., Savchenko V.G. Genetic differences by platelet-specific antigens used for monitoring allomyelotransplant engraftnient. // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. Springer. New-York.- 2006,- V.141 n.4.- p.507-512

43. Golovkina L.L., Savchenko V.G. Single nucleotide polymorphism of human platelet antigens in the engraftment's monitoring of bone marrow transplant. // Vox Sanguinis - 2006,- V.91 suppl. 2.- p.25 Abstr.88

44. Головкина Л.Л., Зотиков E.A. Мегакариоцитопоэз. // В кн. «Очерки по производственной и клинической трансфузиологии» под ред. академика А.И. Воробьева, Ньюдиамед, М. -2006. -С.339- 345

45. Донсков С.П, Мороков В.А., Дубинкин И.В., Порешина Л.П., Зарецкая Ю.М , Головкина Л.Л., Рузанов Д.Е. Группы крови. // В кн. «Очерки по производственной и клинической трансфузиологии» под ред. академика А.И. Воробьева, Ньюдиамед, М. - 2006. - с.123-209

46. Golovkina L.L. Influence of HPA-differences of patients and their stem cell donors on duration of thrombocytopenia after myelotransplantation. // Abstract book of the second East-West Immunogenetics Conference (Czech Republic).- 2007.- p.37

47. Головкина Л.Л. Группы крови. // Российская энциклопедия, Москва.- 2007.- том 8 - с. 8990

48. Головкина Л.Л., Савченко В.Г. Влияние различий донора и реципиента по НРА на длительность агранулоцнтоза и тромбоцитопении у больных после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток. // Аллергология и иммунология.- 2007.- том 8 № 1,- с. 18-19

49. Golovkina L.L., Savchenko V.G. Influence of donor's and recipient's HPA-differences on duration

of aplasia after allomyelotransplantation. // Tissue Antigens.- 2007.- V.69 n. p. 510 (P-281)

50. Golovkina L.L., Zotikov E.A., Lubimova L.S., Savchenko V.G. Influence of donor's and recipient's HPA-differences on duration of aplasia after allomyelotransplantation. // Bone marrow transplantation.- 2007,- V. 39 suppl. 1.- p.S305, R1121a

Подписано в печать 02.10.2008 г. Тираж 100 экз. Заказ № 2522 Отпечатано в типографии «АллЛ Принт» 1 ел.: (4У>) Ь21-86-и/ Факс: (4УЗ) ЬЛ-/и-иу www.allaprint.ru