Автореферат и диссертация по медицине (14.01.23) на тему:Клиническое значение полиморфизма гена 5α-редуктазы и гена андрогенорецепторов при раке предстательной железы

На правах рукописи

□034Э2320

ТУЗОВ Даниил Юрьевич

КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА 5а-РЕДУКТАЗЫ И ГЕНА АНДРОГЕНОРЕЦЕПТОРОВ ПРИ РАКЕ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

14.01.23. - урология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 в ФЕЗ 2010

Москва-2010

003492320

Работа выполнена в ГОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования Росздрава».

Научный руководитель: член-корреспондент РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Лоран Олег Борисович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Дутов Валерий Викторович

доктор медицинских наук, профессор Винаров Андрей Зиновьевич

Ведущая организация

ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Росздрава»

Защита состоится « »_2010 года в _часов

на заседании Диссертационного совета Д 208.049.01 при ГУ МОНИКИ

им. М.Ф. Владимирского по адресу:

г. Москва, ул. Щепкина, 61/2 корп. 15, конференц-зал

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке ГУ МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского.

Автореферат разослан « »_2010 г.

. Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук,

профессор Астахов П.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблем

Рак предстательной железы - одно из самых распространенных заболеваний в мире. В структуре онкологических заболеваний в ряде стран рак предстательной железы выходит на 2-3 место после рака легких и желудка, а в США - на первое место. Ежегодно в мире выявляется до 400 тыс. случаев рака предстательной железы. Летальность в первый год жизни после верификации диагноза составляет около 30%, что говорит, о низкой выявляемое™ заболевания на начальных его стадиях и поздней обращаемости пациента [Кушлинский Н.Е., Соловьев Ю.Н., Трапезникова М.Ф., 2003].

На основании современных данных об эпидемиологии рака простаты предполагалось, что в 2003 г. в США будет диагностировано 223 000 новых случаев рака предстательной железы, а 28 590 больных погибнут вследствие данного заболевания. В действительности же диагноз «рак простаты» был установлен у 230 110 пациентов, а в 29 900 случаях был констатирован летальный исход [ACS. Statistics. - 2004.]. В настоящее время заболеваемость РПЖ неуклонно растет, в России на 2005 год она составила 17,8 на 100 тыс. мужского населения [Сивков A.B. 2006]. В основе канцерогенеза большинства опухолей человека лежат специфические соматические мутации и рак предстательной железы не является исключением. Однако, несмотря на то, что рак предстательной железы является, пожалуй, наиболее изучаемым злокачественным новообразованием мочеполовой системы, на сегодняшний день не выявлены гены, отвечающие за генетическую предрасположенность к этому заболеванию.

Выявление болезни на ранних стадиях является первоочередной задачей клиницистов. Широкое внедрение в повседневную практику определения простатического специфического антигена (ПСА) в сочетании с тране-ректалыюй мультифокальной биопсией предстательной железы под ультразвуковым наведением позволило выявлять большее количество заболеваний на ранних стадиях, когда применимо радикальное лечение [Лоран О.Б., 2000].

Однако уровень простатического специфического антигена может увеличиваться в силу ряда причин, тем самым в некоторых случаях приводя к гипердиагностике. Таким образом, важно не только своевременное выявление заболевания, но и возможность прогнозировать дальнейшее его течение, выявление потенциально агрессивных его форм.

Поиск генетических маркеров часто основывается на свойствах гена и путях метаболизма его белковой продукции. Таким образом, гены, вовлеченные в каскад биосинтеза и метаболизма андрогенов, можно выделить как вероятные маркеры рака простаты. Основными являются ген андрогенового рецептора (Лй), кодирующий рецепторы к андрогенам, а также ген 5а-редуктазы (SRD5A2), кодирующий фермент 5-а редуктазу, который преобразует тестостерон в гораздо более активный внутриклеточный дегидротестостерон. По данным ряда исследователей, мутации полиморфизмов выше перечисленных генов могут оказывать влияние на канцерогенез [Cynthia А., 2004, Hsing AW., 2000, Lynn N., 2007, Tong M., 2005], однако результаты проведенных исследований весьма противоречивы.

Непосредственными участниками в клеточной регуляции роста и развития предстательной железы, а так же канцерогенеза являются андрогены. Гены и их полиморфизмы, участвующих в каскаде метаболизма и биосинтеза андрогенов, могут быть выделены как вероятные факторы прогноза развития рака простаты.

Полиморфными принято называть гены, которые представлены в популяции несколькими разновидностями — аллелями, что обусловливает разнообразие признаков внутри вида. Ген считают полиморфным, если его самый распространенный аллель встречается менее чем у 99% людей. Это определение отражает только распространенность разных аллелей, а не их функциональные различия. Различия между аллелями одного и того же гена, как правило, заключаются в незначительных вариациях его "генетического" кода. Большинство известных полиморфизмов выражаются либо в заменах одного нуклеотида, либо в изменении числа повторяющихся фрагментов ДНК. Полиморфизмы нуклеотидных последовательностей обнаружены во всех структурных элементах генома: экзонах, нитронах, регуляторных участках и т.д.

Тем не менее вариации, затрагивающие кодирующие фрагменты генов и отражающиеся на аминокислотной последовательности их продуктов, встречаются относительно редко и в существенной степени зависит от того, насколько вариабельны собственные функции белка, кодируемого различными аллелями, что справедливо и в отношении ферментов образования и метаболизма стероидных гормонов. Аллели имеют идентичную локализацию в гомологичных хромосомах.

В ходе эволюции разные аллели произошли в результате мутаций от единого аллеля-предшественника, чаще всего они отличаются друг от друга заменой одного нуклеотида (миссенс-мутации). Мутации изменяют продукт гена, как следствие этого функции продукта гена оказываются неполноценными. Это приводит к изменению фенотипа. Наибольший интерес представляют внутригенные изменения. Обычно белки, кодируемые разными аллелями одного гена, обладают одинаковыми функциональными свойствами, то есть замена аминокислоты нейтральна или почти нейтральна с точки зрения естественного отбора.

О наличии тех или иных аллелей часто судят на основании анализа аминокислотной последовательности соответствующих белков. Судить о наличии в популяции полиморфизма можно по различию в фенотипах, соответствующих разным аллелям, либо по характеру рестрикции ДНК, несущей разные аллели. Понятие полиморфизма расширилось с открытием необычайной изменчивости последовательностей ДНК. В геномах разных людей различается 1 из 100-200 пар нуклеотидов; это согласуется с гетерозиготностью по 1 из 250-500 пар нуклеотидов. Современные методы позволяют выявить замены отдельных нуклеотидов в кодирующих областях, которые могут быть несмысловыми или вызывать изменение аминокислотной последовательности. Полиморфизм ДНК еще более выражен в некодирующих областях генома, влияние которых на экспрессию генов невелико или его нет вообще.

Помимо замены отдельных нуклеотидов в основе полиморфизма ДНК лежат вставки, делеции и изменение числа тандемные повторы. Различают варьирующие по числу (длинные) тандемные повторы (минисателитная ДНК) и

короткие (тетра-, три-, ди- или мононуклеотидные) тандемные повторы (микросателитная ДНК).

Исходя из вышесказанного, очевидно, что изучение роли аллельных полиморфизмов принимающих участие в патогенезе РПЖ имеет большой научный и практический интерес, так как, неблагоприятные аллели, по-видимому, участвуют в патогенезе подавляющего большинства случаев РПЖ. В настоящей работе приведены результаты распределения полиморфизмов гена 5а-редуктазы и гена андрогенового рецептора у пациентов страдающих раком предстательной железы в зависимости от стадии заболевания и оценка прогностической значимости.

Цель работы:

Определить клиническое и прогностическое значение полиморфизмов генов 81Ю5А2 и ЛЯ при раке предстательной железы.

Задачи исследования:

1. Проанализировать распределение полиморфизма А49Т гена 51Ю5А2 при раке предстательной железы в зависимости от стадии заболевания.

2. Определить особенности аллельного распределения полиморфизма У89Ь гена Б1Ю5А2 при раке предстательной железы, а так же в зависимости от стадии заболевания.

3. Изучить влияние аллельного распределения полиморфизмов гена АЯ при раке предстательной железы в зависимости от стадии заболевания, оценить риск развития рака предстательной железы.

4. Оценить распространенность носительства сочетания полиморфизмов генов 5'Ш)5А2 и А Я, у пациентов РПЖ в зависимости от стадии заболевания. Оценить риск развития РПЖ у пациентов с данным сочетанием.

Научная новизна.

В клинических условиях, на кафедре урологии Российской Медицинской Академии Последипломного Образования на базе ГКБ им. С.П. Боткина совместно с отделением наследственных эндокринопатий и лабораторией

молекулярной диагностики Эндокринологического научного центра Росмед-технологий, проведена оценка распределения полиморфизмов А49Т и У89Ь гена 5-а редуктазы при раке предстательной железы. Выявлены различия изучаемых факторов при локализованном и метастатическом раке предстательной железы. Проведен анализ распределения полиморфизмов гена андрогенового рецептора при раке предстательной железы, а так же в зависимости от стадии заболевания.

Выявлена закономерность распределения полиморфизма СЛО<20 гена АЯ у пациентов страдающих РПЖ и группы контроля.

Определена частота носительства сочетания гомозиготной аллели УУ, гена 5-а редуктазы и полиморфизма САС<20 гена андрогенового рецептора у пациентов страдающих раком предстательной железы.

Практическая ценность.

В клинических условиях на кафедре урологии Российской Медицинской Академии Последипломного Образования на базе ГКБ им. С.П. Боткина совместно с отделением наследственных эндокринопатий и лабораторией молекулярной диагностики Эндокринологического научного центра Росмедтехнологий, впервые оценена практическая значимость распределения полиморфизмов гена 5-а редуктазы и гена андрогенового рецептора.

Полученные данные о носительстве полиморфизма У89Ь гена и

полиморфизма САй<20 гена андрогенового рецептора, а так же их сочетания, позволяют использовать их при ранней диагностике РПЖ и планировании тактики лечения пациентов/

Основные положения, выносимые на защиту.

1. При РПЖ гомозиготный УУ вариант гена ЗШ)5А2 встречается чаще чем в группе контроля (РПЖ-63% уб Контроль-43%). У пациентов носителей генотипа УУ риск развития метастатического рака предстательной железы в 1,7 раза выше.

2. Носительство полиморфизма САС<20 гена ЛЯ выявляется во всех группах пациентов РПЖ и повышает риск развития метастатического рака простаты в 3 раза.

3. Сочетание носительства полиморфизмов УУ+СЛС<20 генов Ж£)5Л2 и АК встречается у пациентов страдающих РПЖ чаще чем в группе контроля и характерно для пациентов с генерализованной формой РПЖ. Носительство сочетания УУ+САС<20 является прогностически значимым неблагоприятным фактором риска развития метастатического рака предстательной железы.

Апробация диссертации.

Апробация работы состоялась 24 октября 2008 г. на заседании кафедры урологии и хирургической андрологии ГОУ ДПО «РМАПО Росздрава».

Результаты диссертационного исследования доложены в докладах:

- на конкурсе молодых ученых Московского общества урологов,

23 декабря 2008г., г. Москва

- совместной научной конференции урологической клиники и кафедры урологии ФУВ МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского от 15.07.2009.

Внедрение в практику.

Результаты исследования внедрены в практику 20, 21, 41 урологических отделений ГКБ им. С.П. Боткина.

Положения и выводы диссертации используются в учебном процессе кафедры урологии ГОУ ДПО «РМАПО Росздрава».

Публикации.

По теме диссертации опубликованы 3 научных работы, одна из которых в центральной печати.

Объем и струю-ура диссертации.

Диссертация изложена на 103 страницах машинописного текста, состоит из 3 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы, включающего 6 отечественных и 133 зарубежных источников. Работа содержит 18 таблиц и 15 рисунков.

Материалы и методы исследования.

Кафедрой урологии Российской Медицинской Академии Последипломного Образования на базе ГКБ им. С.П. Боткина, совместно с отделением наследственных эндокринопатий и лабораторией молекулярной диагностики Эндокринологического научного центра Росмедтехнологий, в период с октября 2005 г. по январь 2008 г., проводилось научное исследование, по изучению влияния генетических факторов на течение рака предстательной железы. Материалы диссертации объединили результаты клинических, лабораторных и морфологических исследований у 180 человек, из которых 90 составили больные, находившиеся на лечении в стационаре и поликлиническом отделении клиники урологии Российской Медицинской Академии Последипломного Образования на базе ГКБ им. С.П. Боткина, и 90 человек представляли собой здоровых добровольцев, которые сформировали группу контроля.

Группу контроля составили молодые добровольцы в возрасте от 18 до 32 лет (26,5 ± 3,7) у которых при клинико-лабораторном и инструментальном обследовании (ПСА, ПРИ, УЗИ) данных за РПЖ получено не было.

В зависимости от результатов клинического обследования все больные РПЖ были разделены на 3 группы. В первую группу вошли 30 больных с локализованным раком предстательной железы T1-2N0M0. Вторую группу составили 30 пациентов с местнораспространенным процессом T3-4N+M0. Больные с метастатическим РПЖ T3-4N+M+ вошли в третью группу. Диагноз рака предстательной железы (РПЖ) был установлен на основе комплексного обследования (общий клинический осмотр, лабораторная диагностика, определение ПСА, ПРИ, ТРУЗИ с мультифокальной трансректальной биопсией

простаты) и последующего гистологического исследования с определением степени дифференцировки опухоли по шкале Глисона.

Для определения клинической стадии болезни выполнялись компьютерная томография (КТ) или магнитно-резонасная томография (МРТ) малого таза, обзорная рентгенография грудной клетки, УЗИ органов брюшной полости, сцинтиграфия костей скелета. 41 больному была выполнена радикальная позадилонная простатэктомия (РПЭ). Из них 30 больных составили первую исследуемую группу, а остальные 11 человек, перенесших РПЭ, вошли в состав второй группы, из которых у б больных - T3bN0M0, у 5 - T3aN0M0. У 17 больных выполнена билатеральная орхэктомия, у 2-х пациентов произведена медикаментозная кастрация (МАБ).

В третьей группе 21-му больному выполнена билатеральная орхэктомия с последующим назначением антиандрогенов, 4-м двусторонняя орхэктомия с последующей лучевой терапией, 5-ти пациентам проводилась медикаментозная кастрация.

В исследуемых группах наблюдались больные РПЖ в возрасте от 53 до 79 лет (67,5 ± 5,7 года) (таблица 1).

Таблица 1.

Распределение пациентов по возрасту

Стадия РПЖ Группа 1 Группа 2 Группа 3

локализованный РПЖ местнорасп-ространенный РПЖ метатстатичес кий РПЖ

Возраст, годы miii 53 56 58

max 76 78 79

М±5 65,1 ±5,6 68,2 ±5,8 68,4 ±5,5

Из представленных в таблице данных следует, что больные 1,2 и 3 группы статистически не отличались по возрасту (р = 0,05).

При обследовании всем больным определялся уровень общего ПСА, который составлял от 4,5 до 1001 нг/мл. Сравнения значений общего ПСА в

исследуемых группах представлены в таблице 2.

Таблица 2.

Показатели общего ПСА у обследованных больных

Показатели Группа 1 Группа 2 Группа 3

пнп 4,50 4,40 18,0

шах 21,5 100,0 1001,0

ПСА М ± 5 9,74 ±4,8 (нг/мл) 29,89 ±24,9 128,71 ±180,4 р=0,0001 (1,3) р=0,0001 (1,2)

У больных 3 группы уровень общего ПСА был достоверно выше ПСА у больных 1 и 2 групп (128,7 нг/мл против 29,9 нг/мл и 9,7 нг/мл, соответственно, р=0,0001). Учитывая клиническую стадию, уровень ПСА крови и степень дифференцировки опухоли по Глисону, исследуемые больные были разделены на группы риска в соответствии с критериями, предложенными Бсагёто Р.Т. и соавт. на третьей международной консультации по раку предстательной железы, состоявшейся в Париже в 2002 г. (таблица 3).

Таблица 3.

Распределение больных по группам риска

Группы риска Больные РПЖ

п %

Низкий риск 7 8

Средний риск 23 26

Высокий риск 22 24

Очень высокий риск 38 42

ВСЕГО 90 100

Всем больным была выполнена трансректальная мультифокальная биопсия предстательной железы. В таблице 4 показаны различные

морфологические варианты РПЖ по градации Глисона у различных групп больных.

Таблица 4.

Характеристика больных по градации Глисона

Степень злокачественности по Глисону группа 1 группа 2 группа 3

% п % п % п

микрофокусы 10 3 0 0 0 0

<4 10 3 0 0 3 1

5-7 77 23 87 26 53,5 16

>7 3 1 13 4 43,5 13

ВСЕГО 100% 30 100% 30 100% 30

Как следует из представленных данных, в группе больных с локализованным РПЖ низкодифференцированные формы (более 7 по шкале Глисона) встречались в 3% случаев, в то время как в группах местнораспростаненного и метастатического РПЖ низкодифференцированные формы рака определялись в 13% и 43,5 %, соответственно.

Диагноз рак предстательной железы был установлен на основании комплексного обследования. Основное внимание при сборе жалоб и анамнеза обращалось на семейный анамнез заболеваемости РПЖ. Также немаловажную роль играло наличие жалоб, характерных для местного и общего распространения рака предстательной железы (гематоспермия, гематурия, боли в костях).

Оценка выраженности симптоматики производилась с использованием Международной системы суммарной оценки заболеваний простаты в баллах (I-РББ) с определением индекса качества жизни (<ЗоЬ). У всех пациентов собирались сведения о сопутствующих заболеваниях.

При физикальном обследовании помимо данных об общем состоянии больного, особое внимание уделялось проведению пальцевого ректального исследования. В процессе исследования осуществлялись оценка размеров, формы, консистенции, четкости контуров простаты, особое внимание уделялось наличию очаговых или тотальных уплотнений ее ткани,

выраженности срединной борозды, наличию болезненных при пальпации участков, наличию спаянности простаты с окружающими тканями, уплотнений в зоне семенных пузырьков.

Трансректальное ультразвуковое исследование выполнялось на аппарате «BruelKjaer 1846» с использованием сканера и 7,0 MHz-преобразователя в В -режиме и с применением цветного допплеровского сканирования. Измерялись линейные размеры, объем предстательной железы, оценивалась ее эхогенность, кровоснабжение, состояние перипростатических тканей. Выявленные гипоэхо-генные зоны расценивались как подозрительные на РПЖ и подвергались обязательной пункции при трансректальной мультифокальной биопсии.

Кроме того, оценивались состояние верхних мочевых путей, мочевого пузыря и объем остаточной мочи, проводилось исследование печени с целью исключения метастатического поражения с использованием абдоминального датчика аппарата «LOGIQ 400» фирмы «General Electric».

Всем пациентам, у которых ПСА превышал 20 нг\мл, с целью исключения метастатического поражения скелета выполнялось радионуклидное сканирование костей скелета. Для исследования использовалась гамма-камера «Siemens ZLS-7500» с активностью 370 МБк, Tc-99-технефор, лучевая нагрузка по скелету - 3 мЗв.

Всем пациентам определялся уровень простат-специфического антигена (ПСА). Чтобы исключить возможность ложноположительных результатов, забор крови на исследование производился либо до, либо не ранее, чем через 7 дней после таких манипуляций, как ПРИ, ТРУЗИ, а также любые другие механические воздействия на предстательную железу.

Забор крови для молекулярно-генетических исследований осуществлялся в пробирки, содержащие ЭДТА. Выделение ДНК из цельной крови проводилось с использованием коммерческих наборов Wizard Genomic DNA Purification Kit (Промега, США).

Определение полиморфных аллельных вариантов А49Т и V89L в гене 5а-редуктазы II типа (SRD5A2) проводилось методом аллель-специфической ПЦР с использованием следующего протокола амплификации геномной ДНК в 2 этапа:

При проведении I этапа ПЦР использовался следующий состав реакционной смеси: деионизированная вода, 1х ПЦР-буфер с 17,5 шМ хлорида магния, смесь дезоксинуклеотидгрифосфатов (200 цМ каждый), олигонуклеотиды (0,2 цМ каждый), Taq-ДНК-полимераза 1 ед, геномная ДНК 100 нг. Общий объем реакции 25 мкл.

При проведении II этапа ПЦР использовался следующий состав реакционной смеси: деионизированная вода, 1х ПЦР-буфер с 17,5 шМ хлорида магния, смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (200 цМ каждый), олигонуклеотиды (0,2 цМ каждый), Taq-ДНК-полимераза 1 ед, продукт I этапа ПЦР в разведении 1:500,1 мкл. Общий объем реакции 25 мкл.

ПЦР проводилась на ДНК-амплификаторе Perkin Elmer 2400.

Визуализация продуктов ПЦР проводилась методом электрофореза в 2% агарозном геле. При амплификации с использованием обратных праймеров А49 или Т49 длина ампликона составляла 153 н.п., при амплификации с использованием обратных праймеров V89 или L89 длина ампликона составляла 273 н.п.

Определение числа CAG-повторов в экзоне 1 гена рецептора андрогенов (AR) проводилось методом прямого секвенирования.

Качество ампликона оценивалось при проведении электрофореза в 1% агарозном геле. При удовлетворительном качестве ПЦР-продуктов проводилась их очистка с использованием наборов PCR Purification Kit (Promega). Концентрация очищенных, ПЦР-продуктов оценивалась с помощью спектрофотометра Biophotometr (Eppendorf). -10 нг очищенного ПЦР-продукта использовались в последующем для секвенирования.

Статистический анализ проводился на персональном компьютере с использованием пакета статистических программ SPSS для Windows 95, версия 13. Для сравнения средних двух независимых выборок использовались t-критерий Стьюдента, непараметрический критерий Манна-Уитни и родственный ему парный критерий Уилкоксона. Достоверность между частотными показателями оценивалась при помощи критерия х2-Достоверными считали различия при р<0,05. Корреляционный анализ проводили методом Spearman.

Расчет относительного риска (ЯК) производили по формуле Ш1=(а/(а+Ь))/(с/(с+с1)).

Для вычисления вероятности развития заболевания при наличии нескольких параметров, дихотомических переменных и независимых переменных, использовался метод бинарной логистической регрессии.

Вероятность наступления события для некоторого случая рассчитывается по формуле 1

где т= Ъ!*Х! + Ь2хХ2+ ...+ ЬпхХ„+ а,

XI - значения независимых переменных, Ы - коэффициенты, расчёт которых является задачей бинарной логистической регрессии, а -некоторая константа. Если для р значение меньшее 0,5, то можно предположить, что событие не наступит; в противном случае предполагается наступление события.

Результаты и обсуждение.

Первым этапом анализа результатов проведенного исследования была оценка распределения полиморфизма А49Т гена БК05А в группе больных РПЖ и группе контроля. В группе пациентов РПЖ генотип АА определялся в 99 %, в группе контроля 96,7 %, р=0,06, генотип АТ в 1 % и в 3,3 % соответственно, р=0,07, генотип ТТ не определялся как у больных страдающих РПЖ, так и у здоровых добровольцев.

Анализ наблюдаемых и ожидаемых частот показал, что среди пациентов РПЖ частота встречаемости аллелей полиморфизма А49Т гена 67?/}5А2 статистически не отличалась от показателей контрольной группы.

Далее мы проанализировали взаимосвязь между полиморфизмом А49Т гена БЯБ5А2 у больных раком предстательной железы и стадией заболевания.

Таким образом, при анализе распределения частот полиморфизма А49Т гена БЯВ5А2 у больных, страдающих раком предстательной железы,

и в группе контроля, не получено статистически достоверных данных, свидетельствующих о взаимосвязи исследуемого полиморфизма и развития РПЖ. Так же можно сказать, что носительство генотипа А49Т не изменяется в зависимости от стадии заболевания.

Полученные данные приведены в таблице 5.

Таблица 5.

Аллелышс распределение полиморфизма А49Т гена 8М)5А2 при РПЖ и в

группе контроля

А49Т Больные РПЖ Здоровые добровольцы

% п % п

АА 99 89 96,7 87

АТ 1 1 3,3 3

ТТ - - - -

ВСЕГО 100 90 100 90

Вторым этапом мы так же проанализировали аллелыюе распределение полиморфизма У89Ь гена Б]№5А2 у пациентов РПЖ и в группе контроля.

Генотип УУ полиморфизма У89Ь гена 5ЯП5Л2 определялся у 55 больных РПЖ, что составило 61%, и у 40 здоровых добровольцев, что составило 44%.

Генотип УЬ встречался у 30 пациентов, что составило 33% в группе больных и у 41 человека (46%) в контрольной группе. Генотип ЬЬ выявлен у 5 больных в группе РПЖ, что составило 6% и у 9 человек в группе контроля, что составило 10%. Таким образом, при анализе распределения генотипа УУ полиморфизма У89Ь гена БЯ05А2 у больных РПЖ и здоровых добровольцев мы получили достоверное различие в частоте встречаемости данного гомозиготного полиморфизма (р=0,04). Распределение в частоте носительства генотипов УЬ и ЬЬ статистически не отличалось от контрольной группы р=0,1 и р=0,4 соответственно. Расчет относительного риска (Ш1 - 1,95, ДИ 1,08-3,52)

показал, что носительстно гомозиготного варианта УУ связано с развитием рака предстательной железы по сравнению с носительством VI, и П. аллелей. Полученные данные приведены в таблице 6.

Таблица 6.

Аллслыюе распределение полиморфизма У89Ь гена БМ)5А2 при раке предстательной железы и в группе контроля

У89Ь Больные РПЖ Здоровые добровольцы

% п % л

\У 61 55 44 40

\ь 33 30 46 41

ЬЬ 6 5 10 9

ВСЕГО 100 90 100 90

Для изучения частоты встречаемости полиморфизма У89Ь, был проведен анализ в зависимости от стадии заболевания в исследуемых группах.

При анализе распределения частот носительства генотипов УУ, УЬ и ЬЬ в первой группе не получено статистически значимой разницы по сравнению с контрольной группой (р=0,08).

Расчет относительного риска (Ш1) в группе пациентов с локализованной формой РПЖ с УУ, УЬ и ЬЬ генотипом по сравнению с контрольной группой показал, что наличие полиморфизма У89Ь у такой группы больных не связано с развитием рака предстательной железы. Для генотипа УУ- Ш1=1, ДИ 0,69-1,57, для генотипа УЬ- Ш1=0,95, для генотипа ЬЬ - Ш1=0,85.

Во второй группе при анализе распределения частот носительства гетерозиготного генотипа УЬ не получено статистической разницы по сравнению с контрольной группой (р=0,09).

Расчет относительного риска показал, что гомозиготные аллели УУи Ы и гетерозиготная аллель УЬ не связаны с развитием местнораспространенной формы РПЖ, для генотипа УУ-1111=0,9, Ы генотип - 1*11=1, УЬ - Ш1=1,0.

При анализе распределения частот носительства генотипов УУ в третьей группе получена статистически значимая разница по сравнению с контрольной группой (р=0,004).

Таблица 7.

Аллельное распределение полиморфизма У89Ь гена 5Ш)5А2

при РПЖ в зависимости от стадии заболевания.

Больные РПЖ (%) Здоровые добровольцы

Группа 1 Группа 2 Группа 3

УУ 46,7 (п=14) 53,4 (п=16) 83,4 (11=25) р=0,004 44 (п=40)

УЬ 46,7(п=14) 40,0 (п=12) 133 (п=4) р=0,03 46 (п=41)

IX 6,6 (о=2) 6,6 (п=2) 3,3 (п=1) 10 (п=9)

В то же время при расчете относительного риска (М1), мы пришли к выводу, что у пациентов носителей аллели УУ гена 51Ю5А2 риск развития метастатического рака предстательной железы в 1,7 раза выше, чем у пациентов с гетерозиготной формой УЬ (ДИ 1,3-2), и в 1,5 раза выше чем у пациентов с гомозиготной формой Ы (ДИ 1,2-2,1).

Вследствие того, что длина полиморфного тринуклеатидного С АС полиморфизма обратно пропорциональна трансактивационной активности андрогеновош рецептора, было сделано предположение, что пациенты с короткими повторами могут иметь повышенный риск развития рака простаты.

Среди наблюдаемых больных полиморфизмы САС7<17 и САС1<20 наиболее часто встречаются у пациентов в группе РПЖ по сравнению с группой контроля. Нами было проанализировано распределение САС тринуклеатидных полиморфизмов при РПЖ и в группе контроля, данные представлены в таблице 8.

Таблица 8.

Распределение САв тринуклеатидных полиморфизмов при раке предстательной железы и в группе контроля

Показатели Больные РПЖ (п = 90) Здоровые добровольцы (п = 90)

% 11 % п

СЛСг <17 7 6 0 0

САв<20 18 16 7 6

р = 0,04

При анализе результатов выявлено, что полиморфизм САО<17 в группе с РПЖ встречаются у 6 пациентов, что составило 7%, в группе контроля носителей с таким тринуклеатидным полиморфизмом выявлено не было.

При оценке результатов у больных, страдающих РПЖ, и здоровых добровольцев, тринуклеатидный полиморфизм САС<20 встречался у 16 больных страдающих раком простаты (18%), в то время как в группе контроля 6 человек были носителями тринуклеатидного полиморфизма САО<20, что составило 7%.

При анализе распределения частот, носительства генотипа САй<20 получена статистически значимая разница в сравнении с контрольной группой, р=0,04.

Таким образом, можно констатировать, что наличие тринуклеатидных полиморфизмов САС<17 и САС<20, связано с развитием рака предстательной железы. Анализ относительного риска показал, что при наличии тринуклеатидного полиморпфизма САС<20 риск развития рака предстательной железы в 1,7 раза выше (ДИ 1,12-3,2).

Мы так же проанализировали распределение тринуклеатидных полиморфизма СЛ<?<20 в группах пациентов РПЖ и в группе контроля (таблица 9).

Таблица 9.

Распределение тринуклеатидных полиморфизмов САв<20 в зависимости от стадии заболевания при раке предстательной железы и в группе

контроля.

Показатели Группа 1 (п = 30) Группа 2 (п = 30) Группа 3 (п = 30) Здоровые добровольцы (п = 90)

% п % п % п % п

САО<2в 3 1 10 3 40 12 7 6

1 ДИ 0,46-3,1 0,48 ДИ 0,11-4,0 3,3 ДИ 2,6-4,14 р=0,03

В группе с локализованным РПЖ у 1 пациентов выявлен полиморфизм САС<20, что составило 3%. В группе контроля у 6 человек определяется данный полиморфизм - 7%. В группе с диссеминированной формой РПЖ полиморфизм ЛЯ САй<20 был выявлен у 3 больного, что составило 10%.

При анализе распределения частот, носительства генотипа САС<20 в первой и второй группах по сравнению с контрольной статистически значимой разницы не получено, р=0,8. В группе с метастатической формой РПЖ отмечалось увеличение количества пациентов с носительством полиморфизма САС<20 гена АН по сравнению с первой и второй группами: данный полиморфизм был выявлен у 12 больных, что составило 40%. При анализе распределения частот носительства генотипа САС<20 в третьей группе получена статистически значимая разница по сравнению с контрольной группой (р=0,03). Расчет относительного риска (Ш^) показал, что, носительство полиморфизма САБ<20 гена АЯ в первой (М1=1, ДИ 0,46-3,1) и второй (Ш1=0,48, ДИ 0,11-4,1) группах не связано с риском развития РПЖ. В третьей группе риск развития метастатической формы рака предстательной железы втрое выше, 1111=3,3, ДИ 2,6-4,14.

Учитывая то обстоятельство, что мы не получили статистически достоверных данных свидетельствующих о влиянии полиморфизма А49Т гена ЗИ05А2 на развитие РПЖ, мы проанализировали частоту распределения данного сочетания полиморфизма У89Ь и полиморфизмов гена андрогенового рецептора САО<17 и САС<20 в зависимости от стадии заболевания. В таблице 10 показаны сочетание носительства генотипа У89Ь и тринуклеатидного полиморфизма САС<20 у больных РПЖ и группе контроля.

Таблица 10.

Сочетание носительства генотипа У89Ь и тринуклеатидного поламорфизма САС<20 в зависимости от стадии заболевания при раке предстательной железы и в группе контроля.

Носительство УУ+САС<20 Группа 1 (п = 30) Группа 2 (п = 30) Группа 3 (п = 30) Здоровые добровольцы (а = 90)

% п % п % п % п

7 2 3 1 33 р=0,02 10 3 3

УЬ+САв<20 3 1 3 1 3 1 2 2

Ы+САв<20 0 0 0 0 0 0 1 1

К11 4,7 ДИ 2-8,2

При анализе распределения носительства генотипа получены следующие данные. В группе с локализованным раком предстательной железы генотип УУ+САО<20 встречался у 2 пациентов, что составило 7%. Генотип УЬ+САй<20 выявлен у 1 пациента, что составило 3%. Генотип ЬЬ+САС<20 в первой группе не определялся.

Вторая группа представлена 1 больным с генотипом УУ+САС<20, и 1 пациентом с носительством УЬ+САО<2в, что составило 3%.

В группе с метастатической формой РПЖ у 10 пациентов встречался генотип УУ+САО<20, что составило 33%. Генотип УЬ+САй<20 выявлен у одного больного, что составило 3%.

В группе контроля у 3 человек определялось сочетание полиморфизмов УУ+САС<20, что составило 3%, два человека имели носительство УЬ+САС<20 - 3%, у одного человека выявлен генотип ЬЬ+САС<20, что составило 1%. При анализе распределения частот носительства генотипа УУ+САС<20 в третьей группе получена статистически значимая разница по сравнению с контрольной группой, р=0,02. Расчет относительного риска (Ш1) показал, что во всех группах пациентов, страдающих РПЖ, при носительстве генотипа УЬ+САС<20, риск развития той или иной формы заболевания отсутствует (1 группа 1111=0,18,2 и 3 группа 1Ш.=0,62 соответственно). При наличии сочетания генотипа Ы+САО<20 риск развития метастатической формы РПЖ так же отсутствует. Однако при наличии генотипа УУ+САС<20, риск развития метастатической формы рака предстательной железы возрастает более чем в 4,7 раза ДИ 2-8,2.

Одним из доказанных параметров, характеризующих злокачественность опухоли, является степень дифференцировки опухоли, определяемая при РПЖ как сумма Глисона. Мы проанализировали распределение УУ полиморфизмов гена 8М)5А2 и САС<20 гена АЯ в зависимости от суммы Глисона а также связь носительства сочетания генотипов генов £Л£>5Л2 и АЯ и уровнем ПСА. Полученные результаты представлены на рисунке 1.

УУ+САв<20 У1.+САС<20

1 - вЬ 0-4 II - 5-6

III-в!. 7-10 IV-ПСА 0-10

V - ПСА 10-20 VI - ПСА >20

Рис. 1. Зависимость аллельного распределение сочетания гена УУ+САС<20 от степени дифференцировки опухоли.

При анализе распределения сочетания полиморфизмов УУ+САС<20 в группе пациентов с суммой Глисона до 4, один пациент имеет данное сочетание - 6%, у 2 больных с исследуемым генотипом уровень ПСА от 0-10, что составило 12%.

В группе пациентов с Глисоном от 5-6 у 3 больных отмечено данное сочетание, что составило 19%, у 1 больного с ПСА от 10-20 нг\мл определялось сочетание УУ+САС<20, что составило 6%.

В группе пациентов с низкодифференцированным РПЖ у 10 больных определялся генотип УУ+САС<20 - 63%, и такое же количества пациентов с генотипом УУ+САО<20 входит в группу с ПСА >20.

При оценке распределения сочетания генотипа УЬ+САС<20 у двух пациентов определяется умереннодифференцированная форма РПЖ, что составило 13%. При этом уровень ПСА от 0-10 нг/мл выявлен у одного больного - 6%, ПСА от 10-20 нг/мл у двух пациентов, что составило 13%.

Таким образом, при анализе распространения частот носительство генотипа W+CAG<20 ассоциируется с низкодифференцированными формами РПЖ и высоким уровнем ПСА, р=0,02.

В нашем исследовании мы проанализировали, возможно, ли развитие заболевания при наличии нескольких параметров. При расчете бинарной логистической регрессии мы получили следующие результаты. В группе пациентов с генерализованной формой рака предстательной железы при сочетании гомозиготного генотипа VV гена SRD5A2 и полиморфизма CAG<20 гена АЛ: const.B0=l ,225485, VV=0,767907, VL=0,415490, LL=1,962573, p=0,79.

Таким образом, полученное значение р=0,79 больше, чем 0,5 и, следовательно, с большей долей вероятности можно утверждать, что носительство сочетания генотипов W+CAG<20 может привести к развитию метастатического рака предстательной железы.

Проведенное нами исследование показало, что полиморфизмы генов участвующие в метаболизме тестостерона причастны к развитию агрессивных форм РПЖ. Полученные данные свидетельствуют о том, что полиморфизм А49Т гена SRD5A2, не оказывает влияния на риск развития рака предстательной железы. В свою очередь наличие гомозиготной аллели W гена SRD5A2 увеличивает риск развития РПЖ. Преобладание коротких тринуклеатидных полиморфизмов CAG, усиливает транскрипциональную активность, гена AR приводя, к повышенной чувствительности к андрогенам, хронической андрогенной стимуляции и тем самым повышая риск развития РПЖ. Сочетание W аллели гена SRD5A2 и полиморфизма CAG<20 может влиять на развитие агрессивных форм РПЖ.

Выводы.

1. Распределение полиморфизма А49Т гена SRD5A2 не отличаются при раке простаты и в группе контроля. Носительство данного полиморфизма не влияет на риск развития РПЖ.

2. При РПЖ гомозиготный W вариант гена SRDSA2 встречается чаще чем в группе контроля (РПЖ-83% vs Контроль-44%). У пациентов носителей

генотипа УУ риск развития метастатического рака предстательной железы в 1,7 раза выше, [ДИ 1,3-2], чем у носителей аллели УЬ.

3. Носительство полиморфизма САС<20 гена АЯ вьивляется во всех группах пациентов РПЖ и повышает риск развития метастатического рака простаты в 3 раза.

4. Сочетание носительства полиморфизмов УУ+САО<2() генов 8ЯВ5А2 и АЯ. встречается у пациентов страдающих РПЖ чаще чем в группе контроля (РПЖ-33% ув Контроль-3%) и характерно для пациентов с генерализованной формой РПЖ. При данном сочетании риск развития метастатической формы рака предстательной железы возрастает в 4,7 раза [ДИ 2-10].

Практические рекомендации

1. При обследовании больных с симптомами нижних мочевых путей наряду с определением уровня простат специфического антигена, целесообразно выявлять носительство гомозиготного полиморфизма У89Ь гена Б1Ю5А2, который является врожденным предиктором в развитии генерализованной формы рака предстательной железы.

2. Пациентам с верифицированным раком предстательной железы необходимо определение полиморфизма САС<20 гена АЯ, частота которого увеличивается в зависимости от стадии заболевания и служит прогностическим фактором в диагностике агрессивных форм рака простаты.

3. При подозрении на генерализацию процесса у пациентов страдающих раком предстательной железы наряду с общепринятыми методами исследования целесообразно определять сочетание гомозиготного полиморфизма У89Ь гена 8ЯЛ5А2 и полиморфизма САС<20 гена АЯ, указывающие на развитие метастатической формы рака предстательной железы.

Список опубликованных работ

1. Клиническое значение полиморфизмов А49Т и V89L гена 5 альфа-редуктазы 2 типа при раке простаты // Материалы пленума правления Российского общества урологов. - Москва. - 2007. - С.470-471.(Лоран О.Б., Тюльпаков А.Н., Тузов Д.Ю., Серёгин А.А.)

2. Клиническое значение полиморфизмов генов 5а-редуктазы и андрогенорецепторов при раке предстательной железы // Онкоурология. - 2009. - №1. - С.48-53. (Лоран О.Б., Лукьянов И.В., Тузов Д.Ю., Тюльпаков А.Н)

3. Влияние полиморфизмов генов 5а-редуктазы и андрогенорецепторов на риск развития рака предстательной железы // Тезисы в материалах Российской научной конференции «Фундаментальные исследования в уронефрлогии». - Саратов. - 2009. - С.424-425. (Лоран О.Б., Тузов Д.Ю, Серегин А.А)

Список сокращений

AR - ген андрогенового рецептора

CAG - полиморфизм гена андрогенового рецептора

SRD5A2 - ген 5а-редуктазы

А49Т - полиморфизм гена 5а-редуктазы

V89L - полиморфизм гена 5а-редуктазы

КТ - компьютерная томография

МАБ - максимальная андрогенная болкада

МРТ - магнитно-резонансная томография

ПРИ - пальцевое ректальное исследование

ПСА - простатический специфический антиген

РПЖ - рак предстательной железы

РПЭ - радикальная простатэктомия

ТРУЗИ - трансректальное ультразвуковое исследование

Изд. лиц. № 05322 от 09.07.2001 Сдано в набор 11.02.10. Формат 60x90/16 Бумага офсетная № 1. Гарнитура «Times». Объем 1,3 печ. л. Тираж 100 экз. Заказ № 17

Отпечатано в издательстве «Готика» Тел.: (495) 268-53-73 e-mail :gotika@rambler.ru