Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Генетические факторы предрасположенности к курению

На правах рукописи

МИТЮШКИНА Наталья Владимировна

ГЕНЕТИЧЕСКИ Е ФАКТОРЫ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К КУРЕНИЮ

14.01.12 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2011

1 7 [.1ДР 2011

4840643

Работа выполнена в ФГУ «НИИ онкологии им. H.H. Петрова» Минздравсоцразвития России

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Иминитов Евгений Наумович Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Забежинский Марк Абрамович доктор биологических наук, профессор Комо в Вадим Петрович

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицине! университет имени академика И.П. Павлова Министерства здравоохранения и социальн го развития Российской Федерации»

Защита диссертации состоится <'//»//^рГ^ 2011 г. в «_» часов на заседании диссер

тационного совета Д 208.052.01 при ФГУ «НИИ онкологии им. H.H. Петрова» Минздрав соцразвития России по адресу: 197758, Санкт-Петербург, п. Песочный-2, ул. Ленинградская, д. 68.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «НИИ онкологии им.Н.Н. Пет] ва» Минздравсоцразвития России (197758, Сннкт-Петербург, п. Песочный-2, ул. Ленинградская, д. 68) и на сайте (www.niioncologii.mV

Учёный секретарь диссертационного совета, д.м.н.

Е.В. Бахидзе

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Курение является фактором риска для многих сердечно-сосудистых, бронхо-лёгочных и онкологических заболеваний, и вносит значительный вклад в смертность от них. Рак лёгкого, благодаря распространению табакокурения в XX веке, сейчас находится на первом месте по частоте среди онкологических заболеваний в мире. До 90% всех случаев рака лёгкого обусловлено курением (Имяиитов E.H., Хансон К.П., 2007).

Целью антитабачной политики, проводимой многими странами, является снижение заболеваемости и смертности от заболеваний, связанных с курением. Предупреждение инициации курения, особенно среди подростков, а также формирование мотивации у курильщиков к отказу от курения - основные направления такой политики. Однако, несмотря на значительные успехи в борьбе с курением в первые годы проведения антитабачных кампаний, процент курящих даже в развитых странах остаётся довольно высоким. Почти все курящие осведомлены о губительном воздействии курения табака на здоровье, тем не менее большое количество людей не может отказаться от этой привычки. Установление причин, заставляющих людей принимать то или иное решение в отношении курения, является на сегодняшний день весьма актуальной задачей.

В исследованиях на близнецах была установлена высокая степень наследственной предрасположенности к курению (Maes H.H. et ah, 2004; Kendler K.S. et al, 2000). Однако, какие гены и полиморфизмы являются субстратом для этой предрасположенности, до сих пор не вполне ясно. В последнее время всё больший интерес у исследователей вызывают полиморфизмы генов ацетилхолиновых никотиновых рецепторов. Вклад полиморфизмов генов никотиновых рецепторов в риск развития зависимости от табака представляется вполне логичным, так как никотин - основной аддиктив-ный компонент табачного дыма - осуществляет свои эффекты в головном

мозге через связывание с этими рецепторами. Результаты широкомасштабных исследований генома показали, что некоторые из этих полиморфизмов, в частности те, которые расположены в кластере CHRNA5/CHRNA3/CHKNA4, модифицируют риск развития рака лёгкого (Amos C.I. et al., 2008; Hung RJ. et al., 2008). В целом ряде работ была подтверждена роль этих полиморфизмов в развитии никотиновой зависимости (Saccone S.F. et al, 2007;Bierut L.J. et al., 2008; Weiss R.B., 2008; CaporasoN. et al, 2009).

Достаточно давно была высказана мысль о значении дофаминергиче-ской нейротрансмиссии в развитии разных видов зависимости. Функциональная недостаточность дофаминергической нейропередачи может служить нейрохимической основой синдрома дефицита удовольствия - состояния, характеризующегося высоким порогом эмоционального реагирования на естественные вознаграждающие стимулы, и способствующего зависимости (Головко А. с соавт., 2006). Полиморфизмы генов, продукты которых участвуют в дофаминергической нейротрансмиссии, могут быть факторами, регулирующими функциональную активность системы вознаграждения и модифицирующими предрасположенность к развитию аддиктивных состояний (зависимостей).

Цели и задачи исследования

Цель данной работы - оценить влияние функциональных полиморфизмов генов системы дофаминергической нейротрансмиссии и никотиновых ацетилхолиновых рецепторов на инициацию курения, развитие никотиновой зависимости и способность к отказу от курения.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1) Провести сравнение частот полиморфизмов генов-кандидатов у людей с различным анамнезом курения (никогда не пробовавшие курить; некурящие, но пробовавшие курить хотя бы однажды; курящие в настоящее время; бросившие курить). Оценить, насколько вероятно, что все полученные различия случайны; на основании этого сделать вывод о том, влияют ли какие-либо из выбранных полиморфизмов на статус курения.

2) Провести анализ корреляций полиморфных аллелей этих генов со степенью никотиновой зависимости, оцениваемой при помощи теста Фагер-стрема.

3) Выявить возможные взаимодействия генных полиморфизмов, показавших наиболее достоверные ассоциации со статусом курения и/или с никотиновой зависимостью.

Научная новизна полученных результатов

В данной работе впервые осуществлён систематический анализ всех известных функциональных полиморфизмов генов системы дофаминергиче-ской нейротрансмиссии у лиц с различным анамнезом курения.

Практическая значимость

В целом, работа носит характер фундаментального исследования; однако её результаты могут быть полезны для понимания механизмов, лежащих в основе инициации курения и развития никотиновой зависимости и, в дальнейшем, быть востребованы при разработке подходов, направленных на снижение распространённости курения. Результаты работы имеют значение также для идентификации факторов предрасположенности к раку лёгкого, так как позволяют выделить ряд кандидатных генетических полиморфизмов для последующих исследований.

Основные положения, выносимые на защиту

1) Носительство коротких аллелей полиморфизмов тандемных повторов в гене ОАТ1 способствует успешному отказу от курения, а также препятствует проявлению интереса к курению, что выражается в повышенной частоте носителей коротких аллелей среди никогда не пробовавших и бросивших курить, по сравнению с остальными индивидуумами.

2) Аллельные варианты, связанные с повышенной активностью генов метаболизма дофамина - МАОА, СОМТ и БВН, способствуют приобретению привычки к регулярному курению и мешают успешно бросить курить.

3) Аллель А полиморфизма rs 16969968 в гене CHRNA5 ассоциирован с более высокой степенью никотиновой зависимости среди курящих. В исследуемой выборке данная ассоциация имела место только среди носителей коротких аллелей полиморфизмов гена DAT1.

4) В исследуемой выборке было обнаружено взаимодействие между полиморфизмами в генах ТН и DAT1 в отношении статуса курения.

Апробация работы

Результаты работы были представлены на конференциях по фундаментальной онкологии «Петровские чтения - 2008» (18 апреля 2008 г., г. Санкт-Петербург), «Петровские чтения - 2009» (17 апреля 2009 г., г. Санкт-Петербург) и «Петровские чтения - 2010» (16 апреля 2010 г., г. Санкт-Петербург), а также на VI съезде онкологов и радиологов стран СНГ, (1-4 октября 2010 г., г. Душанбе, Такжикистан).

По теме диссертации опубликовано 7 работ, в том числе 5 в рецензируемых научных журналах.

Структура и объём диссертации

Диссертация изложена на 115 страницах и состоит из введения, обзора литературы, глав материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 10 рисунками, содержит одно приложение. Библиографический указатель включает 237 публикаций, в том числе 4 отечественных и 233 зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы

Материалом для данного исследования служила ДНК, полученная из лейкоцитов периферической крови людей. Набор образцов крови для исследования проводился на донорских пунктах и в больницах Санкт-Петербурга с 2007 по 2009 год. Забор периферической крови у добровольцев осуществлялся при наличии добровольного информированного согласия на включение их в проводимое исследование.

Всем людям, согласившимся принять участие в исследовании, предлагалось заполнить анкеты. Всего в исследование вошло 1230 человек. На основании анкетных данных, выборка была поделена на 4 группы:

1. никогда не пробовавшие курить

2. некурящие, пробовавшие курить хотя бы однажды (но никогда не курившие регулярно)

3. курящие в настоящее время

4. бросившие курить

При сравнении курящих с бросившими курить, 54 человека, бросившие меньше 6 месяцев назад, были исключены из анализа. На основании вопросов теста Фагерстрема, входящих в анкеты для курящих и бросивших курить, производился подсчёт очков, характеризующих тяжесть никотиновой зависимости (НеаЛеПоп Т.Р. еЛ а1., 1991),

Выбор полиморфизмов для исследования

Выбор полиморфизмов для исследования осуществлялся на основании литературных данных о влиянии их на функции генов, в которых (либо рядом с которыми) они расположены. Существование таких данных считалось достаточным критерием для включения полиморфизма в исследование вне зависимости от того, насколько воспроизводимыми были результаты в ряде опубликованных работ. Поиск статей, посвященных полиморфизмам в генах системы дофаминовой нейротрансмиссии, проводился в электронной базе данных ЕпЬ-ег-РиЬтес! (ЬНр:/Лто^.псЫ.п1т.пЛ1.яоу/5{1е5/еп^е7?с1Ь^риЬтес1)

путём введения в поле запроса названий гена и термина "polymorphism" и последующего просмотра найденных публикаций. В работу вошли функциональный полиморфизм rsl6969968 в гене, кодирующем субъединицу никотинового рецептора CHRNA5 и 20 функциональных полиморфизмов в генах системы дофаминовой нейротрансмиссии (DRD1-5, ТН, МАО А, МАОВ, СОМТ, DAT1, DBH).

Выделение ДНК

Выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови проводилось при помощи модифицированного соль-хлороформного метода (MiiUenbach R. etal., 1989).

Генотипирование

Генотипирование каждого полиморфизма проводилось одним из следующих методов: при помощи аллель-специфической ПЦР в реальном времени (DRD1, rs4532; DRD2, rsl801028; DRD3, rs6280; СОМТ, rs4680; МАОА, rs 1137070), при помощи метода дискриминации аллелей с использованием флюоресцентно-меченых зондов (DRD1, rs686; DRD2, rs6277; DRD2, rsl 799732; DRD4, rs 1800955; МАОВ, rs 1799836; CHRNA5, rs 16969968), при помощи анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (DRD2, rsl800497; DRD2, rsl079597), либо, в случае полиморфизмов числа тандем-ных повторов - при помощи ПЦР-амплификации с последующим разделением фрагментов в полиакриламидном геле. Не удалось оптимизировать условия ПЦР-реакции для генотипирования 16-нуклеотидного повтора в гене DRD4, поэтому в дальнейшем этот полиморфизм не упоминается.

Генотипирование полиморфизмов в гене DBH осуществлялось в Finnish Institute of Occupational Health (Хельсинки) при помощи метода дискриминации аллелей с использованием специфических TaqMan-зондов (Applied BioSystems).

Статистический анализ данных

Соответствие распределения генотипов закону Харди-Вайнберга оценивалось при помощи теста Хи-квадрат с одной степенью свободы.

При обработке результатов генотипироваиия аллели полиморфизмов числа тандемных повторов были разбиты на две группы: длинные аллели и короткие аллели. Для того, чтобы разделить аллели на эти две группы, выбирались два самых частых в популяции аллеля, и к длинным аллелям относился более длинный из «частых» аллелей, а также все те, которые длиннее его. К коротким, соответственно, причислялись все остальные (см. таблицу 1).

Таблица 1. Полиморфизмы числа тандемных повторов: длинные и короткие аллели

Ген Полиморфизм Длинные аллели Короткие аллели

DATl 40-нуклеотидный повтор 10R, 11R 6R, 7R, 8R, 9R

DAT1 30-нуклеотидный повтор 6R,7R 5R

МАОА 30-нуклеотидный повтор 4R, 5R 2R, 3R, 3.5R

TH ТСАТ-повтор 10R, 11R 6R, 7R, 8R, 9R

При попарном сравнении групп индивидуумов с разным статусом курения в качестве значения статистики использовалось максимальное значение, полученное при помощи аллельного тренд-теста и двух Хи-квадрат тестов, одним из которых сравнивались частоты гомозигот по первому аллелю с частотами носителей второго аллеля, а другим - частоты гомозигот по второму аллелю с частотами носителей первого аллеля (исходя из предположений об аддитивной, доминантной или рецессивной форме наследования аллеля соответственно). Из трёх полученных значений статистики выбиралось наибольшее. Этот подход признан оптимальным в том случае, когда тип наследования признака заранее неизвестен (Zheng G. et al., 2006).

Анализ с использованием процедуры пермутирования осуществлялся при помощи компьютерной программы Presto

(http://www.stat.auckland.ac.nz/~browning/presto/presto.htmn (Browning B.L. et al, 2008). Статистический анализ данных с использованием порядковой регрессии проводился при помощи программы SPSS v.13.0. Частоты гаплотипов рассчитывались при помощи программы Haploview v. 4.1 (http://www.broadmit.edu/mpg/haploview/') (Barrett J. С. et al., 2005).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристики изучаемых групп

В таблице 2 представлены основные характеристики изучаемых групп. Сравниваемые группы различались по возрасту (Н-тест по методу Крускала и Уоллиса, р<0,001), в частности, бросившие курить оказались значительно старше представителей всех остальных групп. Сравниваемые группы различались и по половому составу (хи-квадрат тест, р<0,001), что, скорее всего, является отражением того факта, что курение среди женщин в российской популяции традиционно менее распространено, чем среди мужчин.

Результаты теста Фагерстрема показали, что в исследуемой популяции большая часть курящих (примерно 68%) имеет низкую степень никотиновой зависимости (3 балла и меньше).

Соответствие распределения генотипов закону Харди-Вайнберга

Первым этапом анализа полученных генетических данных стала проверка соответствия распределения генотипов закону Харди-Вайнберга. Оказалось, что для двух изученных полиморфизмов закон Харди-Вайнберга не соблюдается, а именно для дупликации 120 пар оснований в гене 01Ю4 и для однонуклеотидного полиморфизма гб627 1 в гене БВН. Не исключено, что эти отклонения являются результатами систематических ошибок, допущенных при генотипировании или формировании выборки. Поэтому к результатам, полученным для этих двух полиморфизмов следует относиться с осторожностью.

Проверка гипотезы о связи изучаемых полиморфизмов со статусом курения

Для изучения влияния выбранных полиморфизмов на статус курения, были проведены следующие сравнения: 1) сравнение никогда не пробовавших курить со всеми остальными индивидуумами - с целью выявить факторы, влияющие на интерес к курению, 2) сравнение некурящих, но пробовав-

Таблица 2. Характеристики изучаемых групп.

Бросив-

шие ку-

рить 6 ме-

бросив- сянеи н Не пробо-

шие. ку- более на- Некуря- вавшие ку-

jCypiFUHíe р!М !. (все) зад щие рить

Всего 570 246 192 267 147

Bú'jpacr

мешана 46 34 37

ИНТСрВйЛ IS - 69 18-82 18-82 18-79 18-80

Колачс-« «о не»-»;-

щип S7 '35%) 69 (36%) 125 (47%) 92 (63%)

fíoipaa т мачмли

KJ-pí.4!lH

медиана KS Г ,s 18

нитсраал 6 -44 7-40 7-35

Продолжитель-

ность курения

12 пет ! 5 лет 15 лет

3 месяца - 2 месяца - 2 месяца -

интервал 51 год 61 год 61 год

Písy.u.ijtu (бал-

лы) тесга Фагер-

стрмза

0 99 (17%) 65 (27%) 49 (26%)

Í-3 29! (5i%) 110(45%) 91 (48%)

4-íT1 143 ( 26%) 52(21%) 41 (22%)

7-10 28 (5%Я 16 (7%) 8 (4%)

данные отсутствуют 4 3 3

Возраст отказа от

курения

медиана 35 34

интерчал ¡4-75 14-75

Период времени г

момента опшя от

курения

медиана¡ 3 года 6 лет

1 день- 6 месяцев -

интервал 49 лет 49 лет

ших курить, с курящими и бросившими - с целью выявить факторы, влияющие на возникновение привычки к курению, 3) сравнение курящих с бросившими курить - с целью выявить факторы, способствующие или препятствующие успешному отказу от курения. Результаты всех тестов представлены

в таблице 3.

Таблица 3. Результаты статистического анализа.

Значения р для проведённых сравнений

Полиморфизм П роводимые сравнения

Не пробовавшие курить против всех остальных Некурящие против курящих и бросивших Курящие против бросивших курить

БЯт, гс68б 0,056 0,128 0,240

01ТО1, «4532 0,215 0,170 0,274

БШ)2, ге1800497 0,575 0,192 0,164

БШ>2, г$1079597 0,845 0,089 0,330

ОЩ)2, «1801028 0,692 0,567 0,723

ОШ)2, «6277 0,124 0,156 0,527

БШ)2, гв1799732 0,274 0,008 0,608

ШШЗ, ге6280 0,709 0,021 0,504

БМ)4, дупликация 120 пар оснований 0,111 0,271 0.065

Б1Ш4, г$1800955 0,084 0,348 0,487

СОМТ, ге4680 0,149 0,148 0,161

МАОА, «1137070 0,062 0.132 o.ïi'J

МАОВ, гс1799836 0,041 0,009 0,670

БВН, «6271 0,079 0,284 0,155

БВН, «1611115 0,511 0,643 0,311

СНШЧА5, «16969968 0,012 0,598 0,798

ОАТ1,40- нуклеотидный повтор 0,010 0,026 0,038

ОАТ1,30- нуклеотидный повтор 0,000 0,259 0,123

ТН, ТСАТ-повтор 0,055 0,322 0,122

МАОА, 30- нуклеотидный повтор 0,009 0,004 0,025

Анализ с использованием процедуры пермутнро-вания 0,021 0,029 0,238

Очевидно, что в данной работе было проведено большое количество равнений, а это, как известно из статистики, неизбежно приводит к появле-ию ложноположительных результатов, то есть к констатации различий там, де их нет, в случае, если исследователь игнорирует данную проблему. Потому следующим этапом анализа результатов, в связи с наличием множест-енных сравнений, стала проверка нулевой гипотезы о том, что все значения <0.05, представленные в таблице 3, могли быть получены случайно. Извест-о, что если исследователь принимает уровень значимости равным 0,05, то, iO определению, вероятность ошибочно отклонить верную нулевую гипотезу то есть гипотезу об отсутствии ассоциации) равна 5%. Таким образом, среди 1 тестируемых нулевых гипотез 5% будуг ошибочно отклонены, так как зна-ение р для них окажется меньше 0,05. Если же число полученных значений <0,05 значительно превышает 5%, то это свидетельствует о присутствии реди них некоторого количества достоверных ассоциаций. На основании тих рассуждений Carvajal-Rodríguez A. et al. (2009) предложили статистический тест SGoF, посредством которого можно сравнить наблюдаемое количество значений р<0,05 с ожидаемым, тем, которое может быть получено при отсутствии значимых различий между группами. Распределение статистики (в данном случае, количества значений р<0,05) при верной нулевой гипотезе было получено при помощи процедуры пермутирования для каждого из трёх попарных сравнений. Для двух из этих сравнений - никогда не пробовавших курить с остальными индивидуумами и некурящих с курящими/курившими -результаты оказались статистически значимыми (р=0,021 и р=0,029, соответственно). Эти данные говорят в пользу того, что по крайней мере некоторые из наблюдаемых статистически значимых различий в распределении генотипов между группами являются достоверными, то есть получены не случайно. Можно сделать вывод о том, что предпосылки, на основании которых отбирались генетические факторы для включения в работу, были сделаны правильно и, по крайней мере в исследуемой популяции, наследственные осо-

бенности системы дофаминовой нейротрансмиссии оказывают значительно влияние на поведение, связанное с курением.

Наиболее вероятные генетические факторы, влияющие на стату курения

Дальнейший анализ результатов был основан на изучении распределе ния генотипов в исследуемых группах и на данных литературы о функцио нальном значении полиморфизмов и ассоциациях их с курением. Этот анали позволил выделить ряд представляющих интерес результатов.

Полиморфизмы в генах ОАТ1 и МАОА показали статистически значи мые различия во всех проведённых сравнениях, и, следовательно, представ ляют для нас наибольший интерес.

Оба полиморфизма в гене ОАТ1 могут оказывать влияние на функци обратного транспортёра дофамина. Был проведён анализ гаплотипов в это гене, на основании которого показалось разумным в дальнейшем объединит гомозигот по длинным аллелям в одну группу, а носителей хотя бы одног короткого аллеля - в другую. Наблюдалась повышенная частота носителе! хотя бы одного короткого аллеля среди никогда не пробовавших, а такж бросивших курить, по сравнению с двумя другими группами (см. рис. 1).

Имеющиеся литературные данные, в целом, согласуются с тем, что ко роткие аллели полиморфизмов гена ОАТ1 способствуют успешному отказ от курения (ЪЬлрШоп З.А. е/ а!., 2007). Особый интерес представляет, на на взгляд, распределение генотипов в группе никогда не пробовавших курит людей: как и среди бросивших курить здесь преобладают носители коротки аллелей. Работа Оио б. а!. (2010), посвящённая исследованию широког спектра видов рискованного поведения, показала протективный эффект гено типа 9ЯУ9Я 40-нуклеотидного повтора в гене БАТ1 по отношению к каждом из них. Склонность к рискованному поведению, таким образом, оказалас связана с длинным аллелем (1011), а конвенциональность, законопослушност - с коротким аллелем (9Я) гена ОАТ1. Возвращаясь к результатам проведён

ной работы, можно предположить, что очень высокая частота носителей коротких аллелей гена БАИ среди никогда не пробовавших курить объясняется меньшей склонностью к рискованному поведению у этой категории людей. Ещё одно интересное наблюдение, касающееся полиморфизмов в гене ОАТ1, заключалось в том, что курящие носители коротких аллелей гораздо чаще давали на вопрос «Почему Вы собираетесь бросить курить?» ответ «Это вредит здоровью», чем гомозиготы по длинным аллелям (р=0,013). Та же тенденция, хоть и не значимая статистически, наблюдалась и для бросивших курить: на вопрос «Почему Вы бросили курить?» носители коротких аллелей чаще отвечали, что «не хотели нанести вред здоровью», чем гомозиготы по длинным аллелям полиморфизмов в гене ОАТ1. Это может косвенно свидетельствовать о том, что носители коротких аолелей гена БАТ1, как правило, больше озабочены проблемой сохранения собственного здоровья, по сравнению с гомозиготами по длинным аалелям.

□ Гомозиготы по длинным повторам

□ Носите™ коротких повторов

Курящ« Бросившие Некурящее Не

пробовавшие Хи-квадрат тест: курить

р=0,00005, <Н'=3

Рисунок 1. Распределение генотипов ОАТ1 в изучаемых группах.

Распределение генотипов 30-нуклеотидного повтора в гене МАОА в изучаемых группах можно видеть на рис. 2. Данные представлены отдельно для мужчин и женщин, так как этот полиморфизм находится на Х-хромосоме и объединение частот генотипов, полученных для мужчин и женщин, было бы некорректным. Наблюдалась тенденция к возрастанию частоты длинных аллелей, связанных с более эффективной транскрипцией гена МАОА, в ряду: (1) никогда не пробовавшие курить, (2) некурящие, пробовавшие курить, (3) бросившие курить, (4) курящие в настоящее время. Количество длинных (411, 5К) аллелей 30-нуклеотидного повтора в гене МАОА статистически значимо влияло на статус курения (порядковая регрессия с полом и возрастом в качестве ковариат, р=0,004). То есть можно предположить, что генотипы, связанные с большей активностью моноаминоксидазы А, способствуют инициации курения и снижают вероятность успешно бросить курить.

МАОА - лишь один из генов метаболизма дофамина. Полиморфизмы в других генах, продукты которых метаболизируют дофамин (МАОВ, СОМТ, БВН), также могут оказывать влияние на статус курения, поэтому было изучено распределение их частот в изучаемых группах.

Аллели полиморфизма гз1799836 в гене МАОВ, по-видимому, не влияют на статус курения (порядковая регрессия с возрастом и полом в качестве ковариат, р=0,105).

Аллель О полиморфизма гз4680 в гене СОМТ кодирует более активный вариант катехол-О-метилтрансферазы (КОМТ). Наблюдалась статистически достоверная корреляция количества аллелей в со статусом курения (порядковая регрессия с полом и возрастом в качестве ковариат, р=0,012; рис. 3).

В гене БВН изучались два полиморфизма: один из них (гэ 1611115), по литературным данным, оказывает влияние иа экспрессию гена, а другой (гзб271) - на ферментативную активность генного продукта. Аллели С и Т этих полиморфизмов, соответственно, связаны с повышенной экспрессией и ферментативной активностью дофамин-бета-гидроксилазы. Анализ гаплоти-пов гена БВН показал, что среди курящих, по сравнению с остальными груп-

г

Мужчины

100%-

90%- /

80%-

70%- 65%

60%- / А

50%- / / 1 - ~

40%- I/

зо%- / /!

20%- X '•35%1

10%- /

о%- ------

Куряиуе Бросившие Некурящие Не

пробовавшие курить

Женщины

100%-г 90% 80% 70% 60% 50%-40%-30% 20% 10% 0%

/ /

41%

48%

щ.ш

13%

1

35% |

49%

26%

56%

32%

53%

Курящие Бросившие Некуряи^е Не

пробовавшие курить

О Гемизиготы по длинным

О Гемизиготы по коротким

□ Гомозиготы по длинным аллелям

В Гетерозиготы

О Гомозиготы по коротки«

Порядковая

регрессия

р=0,004

Рисунок 2. Распределение генотипов 30-нуклеотидного повтора в гене МАОА в изучаемых группах.

Рисунок 3. Распределение генотипов полиморфизма гИ6#0 и геве СОМТ в изучаемых группах, ,

пами, чаще встречается гаплотип rs 1611115 С - rs6271 Г, который, согласно i данным функциональных исследований (Zabetian С.Р. et а/., 2001; Tang Y. et al, 2005), должен приводить к высокой экспрессии высокоактивного фермента. Порядковая регрессия с полом и возрастом в качестве кизариаг продемонстрировала, что во всей выборке генотип rsl'Sl 1115 СС / rs627I ТТ/ТС являлся фактором, статистически значимо влияющим на статус курения (р=0,006, рис. 4).

Полученные данные свидетельствуют о том, что в исследуемой попу- i ляции высокий уровень катаболизма дофамина, осуществляемого фермента- , ми монбаминоксидазой А, КОМТ и дофамин-бета-гидроксилазой, связан с J повышенным риском инициации курения и сниженной верою яосгью успей?- ■ но бросить курить.

Полиморфизм гена синтеза дофамина, ТН, в настоящей работе не пока- I зал значительных ассоциаций со статусом курения.

!

пробовавшие р=0,006 курить

Рисунок 4. Распределение генотипов, характеризующихся высокой активностью гена 1)ВН в изучаемых группах.

Что касается дофаминовых рецепторов, и, в частности, самого изучаемого из них - рецептора ОК1)2, полученные данные в сочетании с данными литературы не позволяют сделать удовлетворительных выводов об их влиянии на предрасположенность к курению.

Связь изучаемых полиморфизмов со степенью никотиновой зависимости

Влияние полиморфизмов на степень никотиновой зависимости, оцениваемую при помощи теста Фагерстрема, анализировалось при помощи метода порядковой регрессии со стажем курения и полом в качестве ковариат во всей выборке, а также отдельно для курящих и бросивших курить.

Использование метода SgoF для сравнения количества полученных значений р<0,05 с ожидаемым, показало, что нет оснований говорить о том, что в исследуемом сете полиморфизмов есть такие, которые действительно ассоциированы с никотиновой зависимостью. Однако ассоциация полимор-

физма в гене СШША5 с никотиновой зависимостью и раком лёгкого была убедительно продемонстрирована в нескольких работах. Поэтому ассоциацию аллеля А полиморфизма ге16969968 с большими значениями теста Фа-герстрема среди курящих, наблюдаемую в настоящей работе, нельзя отнести к случайным наблюдениям. Вероятно, аллель А полиморфизма гб 16969968 в изучаемой популяции также является фактором риска рака лёгкого, что требует дальнейшего научного обоснования. К представленным же далее ассоциациям следует относиться лишь как к гипотезам, поскольку они не имеют подтверждения в литературе.

Среди факторов, связанных со степенью никотиновой зависимости среди курящих, оказались и генотипы гена БАТ1, которые, как выяснилось ранее, ассоциированы со статусом курения. Наличие коротких аллелей хотя бы одного из полиморфизмов тандемных повторов в гене БАТ1 способствовало большей зависимости от курения (р=0,021).

В объединённой выборке курящих и бросивших, только полиморфизмы гена БВН оказывали влияние на степень никотиновой зависимости. Сам по себе, лишь полиморфизм ге6271 слабо ассоциировался с изучаемым параметром (р=0,049). Однако при выделении определённых генотипов (гэ 1611115 СС, Г56271 ТТ/ТС), предположительно связанных с наибольшей активностью фермента дофамин-бета-гидроксилазы, так же, как и в случае со статусом курения, оказалось, что комбинация полиморфизмов имеет большее значение для детерминации никотиновой зависимости (р=0,007), чем каждый полиморфизм в отдельности.

В результате исследования полиморфизмов генов СН1ША5, ОАТ1, БВН, а также МАОА и СОМТ, были обнаружены достоверные ассоциации с курением и никотиновой зависимостью, а, следовательно, они могут служить кандидатами для работ по поиску факторов предрасположенности к раку лёгкого.

Взаимодействия изучаемых полиморфизмов

Очевидно, что в единой системе дофаминовой нейротрансмиссии огромную роль будут играть различные взаимодействия. Хотя до сих пор каждый полиморфизм рассматривался отдельно, их комбинации должны играть большую роль в детерминации эффективности функционирования системы вознаграждения и в предрасположенности к курению.

Обнаружилось, что форма ассоциации полиморфизмов гена БАТ1 со статусом курения очень зависела от полиморфного ТСАТ-повтора в гене ТН. А именно, среди носителей коротких аллелей полиморфизма в гене ТН частота носителей коротких аллелей полиморфизмов в гене ОАТ1 была значительно выше среди никогда не пробовавших курить (61%) и бросивших курить людей (54%) в сравнении с курящими (41%) и некурящими, но пробовавшими курить (36%) индивидуумами (р=1,2-10"6). Среди гомозигот по длинным аллелям полиморфизма в гене ТН, напротив, были видны явные тенденции к инверсии этих эффектов гена БАТ1: частота носителей коротких аллелей гена ОАТ1 была меньше в группах никогда не пробовавших курить (17%) и бросивших курить (38%), чем в группах курящих (46%) и некурящих, пробовавших курить (48%) (р=0,273).

Ассоциация полиморфизма СШША5 с никотиновой зависимостью наблюдалась только среди носителей коротких аллелей полиморфизмов тан-демных повторов (р=0,0001 среди курящих), но не среди гомозигот по длинным аллелям полиморфизмов в гене БАТ1 (р=0,999 среди курящих).

Необходимо отметить, что данные о взаимодействиях в настоящей работе носят характер гипотез и нуждаются в дополнительной проверке на независимой выборке.

выводы

1) Среди всех изученных генетических факторов полиморфизмы тандем -ных повторов в гене обратного транспортёра дофамина (DAT1) наиболее значимо ассоциированы со статусом курения в исследуемой популяции. Короткие аллели этих полиморфизмов чаще встречаются в группах никогда не пробовавших курить и бросивших курить индивидуумов, по сравнению с другими группами.

2) Аллельные варианты, связанные с высоким уровнем активности генов, принимающих участие в метаболизме дофамина (МАОА, СОМТ и DBH), ассоциированы с повышенным риском инициации курения и сниженной вероятностью успешно бросить курить.

3) Среди курящих наблюдалась ассоциация аллеля А полиморфизма rs16969968 в гене никотинового рецептора CHRNA5 с более высокой степенью никотиновой зависимости. Вероятно носительство этого аллеля также ассоциировано с повышенным риском развития рака лёгкого.

4) Ассоциация аллеля А полиморфизма rs16969968 в гене никотинового рецептора CHRNA5 с более высокой степенью никотиновой зависимости имела место только среди носителей коротких аллелей полиморфизмов гена DAT1, что говорит о возможном взаимодействии между двумя генетическими факторами.

5) В исследуемой выборке было обнаружено взаимодействие между полиморфизмами в генах ТН и DAT1 в отношении статуса курения.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1) Митюшкина Н.В.. Суспицын E.H., Улыбина Ю.М., Розанов М.Е., Катанугина A.C., Зайцева O.A., Яцук О.С., Antikainen М., Суховская O.A., Сизов A.B., Колосков A.B., Того A.B., Hirvonen А., Имянитов E.H. Генетические факторы предрасположенности к курению: полиморфизмы генов метаболизма дофамина, дофаминовых рецепторов и CHRNA5 // Вопросы онкологии. - 2010. - Т. 56. - № 2. - Приложение: Тезисы 6-й Российской конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения - 2010», Санкт-Петербург, 16 апреля 2010 г. - С. 34-35.

2) Ulybina Y.M., Kuligina E.S., Mitiushkina N.V.. Sherina N.Y., Yanus G.A., Gorodno-va T.V., Katanugina A.S., Koloskov A.V., Togo A.V., Imyanitov E.N. Evidence for depletion of CASP5 Ala90Thr heterozygous genotype in aged subjects // Experimental Gerontology. - 2010. - V. 45. - P. 726-829.

3) Ulybina Y.M., Kuligina E.S., Mitiushkina N.V.. Rozanov M.E., Ivantsov A.O., Pono-mariova D.N., Togo A.V., Levchenko E.V., Shutkin V.A., Brenister S.I., Devilee P., Zhivo-tovsky В., Hirvonen A., Imyanitov E.N. Coding polymorphisms in Casp5, CaspB and DR4 genes may play a role in predisposition to lung cancer // Cancer Letters. - 2009. - V. 278. - P. 183-191.

4) Митюшкина H.B.. Суспицын E.H., Улыбина Ю.М., Розанов М.Е., Зайцева O.A., Яцук О.С., Antikainen М., Сизов A.B., Колосков A.B., Того A.B., Hirvonen А., Имянитов E.H. Роль функциональных полиморфизмов генов метаболизма дофамина и его рецепторов в формировании склонности к курению // Вопросы онкологии. - 2009. - Т. 55. - № 2. -Приложение: Тезисы 5-й Российской конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения - 2009», Санкт-Петербург, 17 апреля 2009 г. - С. 26-27.

5). Улыбина Ю.М., Кулигина Е.Ш., Митюшкина Н.В.. Розанов М.Е., Зайцева O.A., Яцук О.С., Того A.B., Devilee Р., Имянитов E.H. Роль полиморфизмов генов апоптоза в формировании предрасположенности к раку лёгкого // Сборник материалов научно-практической конференции с международным участием «Совершенствование медицинской помощи при онкологических заболеваниях, включая актуальные проблемы детской гематологии и онкологии. Национальная онкологическая программа», Москва, 29-30 октября 2009 г. - Том I. - С. 273.

6). Митюшкина Н.В.. Суспицын E.H., Улыбина Ю.М., Розанов М.Е., Зайцева O.A., Яцук О.С., Сизов A.B., Колосков A.B.,Того A.B., Hirvonen А., Имянитов E.H. Роль функциональных полиморфизмов генов метаболизма дофамина и его рецепторов DRD1 -48A/G, DRD2 TaqlA, DRD2 TaqlB и СОМТ Vall58Met в формировании склонности к курению // Вопросы онкологии. - 2008. - Т. 54. - №2. - Приложение: Тезисы 4-й Российской конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения - 2008», Санкт-Петербург, 18 апреля 2008 г. - С. 18.

7). Antikainen М., Mitiushkina N.. Imyanitov Е., Hirvonen A. Role of CYP2D6 gene polymorphism in individual's ability to quit smoking // Abstract Book: Joint IARC-EACR-AACR-Pre Conference Symposium "Integrative Molecular Cancer Epidemiology", France, Lyon, July 3-5, 2008. - 53-POS.

БЛАГОДАРНОСТИ Выражаю глубокую признательность научному руководителю диссертационной работы, доктору медицинских наук, профессору Имянитову Евгению Наумовичу за ценные советы и помощь в организации работы. Выражаю искреннюю признательность сотрудникам пункта переливания крови Городской многопрофильной больницы №26, а также доктору биологических наук, заведующей лаборатории медико-социальных проблем НИИ пульмонологии СПбГМУ им. И.П. Павлова Суховской Ольге Анатольевне за помощь в анкетировании и сборе биологического материала. Приношу глубокую благодарность сотрудникам Finnish Institute of Occupational Health (Хельсинки) Ari Hirvonen и Miia Antikainen, за обучение методам и помощь в генотипирова-нии образцов. Приношу сердечную благодарность всем сотрудникам лаборатории молекулярной онкологии за поддержку и помощь в выполнении работы.

Подписано в печать «16» февраля 2011 г. Формат 60x84/16 Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,5. Тираж-100 экз. Заказ № 052

Типография «Восстания -1» 191036, Санкт-Петербург, Восстания, 1.

Актуальность проблемы

Курение является фактором риска для многих сердечно-сосудистых, бронхо-лёгочных и онкологических заболеваний, и вносит значительный вклад в смертность от них. Рак лёгкого, благодаря распространению табакокурения в XX веке, сейчас находится на первом месте по частоте среди онкологических заболеваний. До 90% всех случаев рака лёгкого обусловлено курением [1].

Целью антитабачной политики, проводимой многими странами, является снижение заболеваемости и смертности от патологий, связанных с курением. Предупреждение инициации курения, особенно среди подростков, а также мотивация курильщиков к отказу от курения и оказание им в этом соответствующей помощи - основные направления такой политики. Но несмотря на значительные успехи в борьбе с курением в первые годы проведения антитабачных кампаний, процент курящих даже в развитых странах остаётся довольно высоким [1]. При этом почти все курящие осведомлены о губительном воздействии курения табака на здоровье. И всё же большое количество людей продолжает курить или начинает курить заново. Поэтому установление причин, заставляющих людей принимать то или иное решение в отношении курения, является на сегодняшний день весьма актуальной задачей.

В исследованиях на близнецах была установлена высокая степень наследственной предрасположенности к курению [2,3]. Однако, какие гены и полиморфизмы являются субстратом для этой предрасположенности, до сих пор не вполне ясно. Достаточно давно была высказана мысль о значении дофаминергической нейротрансмиссии для развития разных видов зависимости. Функциональная недостаточность дофаминергической нейро-передачи может служить нейрохимической основой синдрома дефицита удовольствия — состояния, характеризующегося высоким порогом эмоционального реагирования на естественные вознаграждающие стимулы, и способствующего зависимости [4]. Полиморфизмы генов, продукты которых регулируют дофаминергическую нейротрансмиссию, могут быть факторами, регулирующими функциональную активность системы вознаграждения и модифицирующими предрасположенность к развитию аддиктивных состояний (зависимостей).

Хотя предметом изучения настоящей работы стали преимущественно полиморфизмы генов дофаминергической системы, другие виды нейропередачи, такие как серотонинер-гическая, ГАМК-ергическая, глутаматергическая, также могут оказывать влияние на функционирование системы вознаграждения головного мозга и участвовать в формировании предрасположенности к курению.

В последнее время всё больший интерес у исследователей вызывают полиморфизмы генов ацетилхолиновых никотиновых рецепторов. Вклад полиморфизмов генов никотиновых рецепторов в риск развития зависимости от табака представляется вполне логичным, учитывая, что никотин - основной компонент табачного дыма, вызывающий привыкание, осуществляет свои эффекты в головном мозге через связывание с этими рецепторами. Результаты широкомасштабных исследований генома показали, что некоторые из этих полиморфизмов, в частности те, которые расположены в кластере СНЯКА5/СНЯКАЗ/СНККЛ4, модифицируют риск развития рака лёгкого [5,6]. Кроме того, в целом ряде исследований была подтверждена роль этих полиморфизмов в развитии никотиновой зависимости [7, 8, 9, 10].

Так как предметом настоящей работы стали полиморфизмы, для которых было показано влияние на функцию генов, в которых (или рядом с которыми) они расположены, для изучения был выбран лишь один полиморфизм в генах никотиновых ацетилхолиновых рецепторов — 6969968 в гене СНЮЧЛ5, влияние которого на функционирование рецептора было показано на клеточной линии [8]. Другие полиморфизмы, идентифицированные в широкомасштабных геномных исследованиях, хотя и представляют несомненный интерес, как потенциальные факторы риска курения и рака лёгкого, к сожалению, ещё не исследовались на предмет их функциональной значимости.

Цели и задачи исследования

Цель данной работы - оценить влияние функциональных полиморфизмов генов системы дофаминергической нейротрансмиссии и никотиновых ацетилхолиновых рецепторов на инициацию курения, развитие никотиновой зависимости и способность к отказу от курения.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1) Провести сравнение частот полиморфизмов генов-кандидатов у людей с различным анамнезом курения (никогда не пробовавшие курить; некурящие, но пробовавшие курить хотя бы однажды; курящие в настоящее время; бросившие курить). Оценить, насколько вероятно, что все полученные различия случайны; на основании этого сделать вывод о том, влияют ли какие-либо из выбранных полиморфизмов на статус курения.

2) Провести анализ корреляций полиморфных аллелей этих генов со степенью никотиновой зависимости, оцениваемой при помощи теста Фагерстрема.

3) Выявить возможные взаимодействия генных полиморфизмов, показавших наиболее достоверные ассоциации со статусом курения и/или с никотиновой зависимостью.

Научная новизна работы

В данной работе впервые осуществлён систематический анализ всех известных функциональных полиморфизмов генов системы дофаминергической нейротрансмиссии у лиц с различным анамнезом курения.

Практическая значимость

В целом, работа носит характер фундаментального исследования; однако её результаты могут быть полезны для понимания механизмов, лежащих в основе инициации курения и развития никотиновой зависимости и, в дальнейшем, быть востребованы при разработке подходов, направленных на снижение распространённости курения. Результаты работы имеют значение также для идентификации факторов предрасположенности к раку лёгкого, так как позволяют выделить ряд кандидатных генетических полиморфизмов для последующих исследований.

Основные положения, выносимые на защиту

1) Носительство коротких аллелей полиморфизмов тандемных повторов в гене БАТ1 способствует успешному отказу от курения, а также препятствует проявлению интереса к курению, что выражается в повышенной частоте носителей коротких аллелей среди никогда не пробовавших и бросивших курить, по сравнению с остальными индивидуумами.

2) Аллельные варианты, связанные с повышенной активностью генов метаболизма дофамина - МАОА, СОМТ и БВН, способствуют приобретению привычки к регулярному курению и мешают успешно бросить курить.

3) Аллель А полиморфизма гб16969968 в гене СНШчГА5 ассоциирован с более высокой степенью никотиновой зависимости среди курящих. В исследуемой выборке данная ассоциация имела место только среди носителей коротких аллелей полиморфизмов гена БАТ1.

4) В исследуемой выборке было обнаружено взаимодействие между полиморфизмами в генах ТН и БАТ1 в отношении статуса курения.

Апробация работы

Результаты работы были представлены на конференциях по фундаментальной онкологии «Петровские чтения-2008» (18 апреля 2008 г., г. Санкт-Петербург), «Петровские чтения-2009» (17 апреля 2009 г., г. Санкт-Петербург) и «Петровские чтения -2010» (16 апреля 2010 г., г. Санкт-Петербург), а также на VI съезде онкологов и радиологов стран СНГ, (1-4 октября 2010 г., г. Душанбе, Такжикистан).

Структура и объём диссертации

Диссертация изложена на 115 страницах и состоит из введения, обзора литературы, глав материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 10 рисунками, и содержит 1 приложение. Библиографический указатель включает 237 публикации, в том числе 4 отечественных и 233 зарубежных.

Выводы

1) Среди всех изученных генетических факторов полиморфизмы тандемных повторов в гене обратного транспортёра дофамина (БАТ1) наиболее значимо ассоциированы со статусом курения в исследуемой популяции. Короткие аллели этих полиморфизмов чаще встречаются в группах никогда не пробовавших курить и бросивших курить индивидуумов, по сравнению с другими группами.

2) Аллельные варианты, связанные с высоким уровнем активности генов, принимающих участие в метаболизме дофамина (МАОА, СОМТ и БВН), ассоциированы с повышенным риском инициации курения и сниженной вероятностью успешно бросить курить.

3) Среди курящих наблюдалась ассоциация аллеля А полиморфизма гэ 16969968 в гене никотинового рецептора СНЮМА5 с более высокой степенью никотиновой зависимости. Вероятно носительство этого аллеля также ассоциировано с повышенным риском развития рака лёгкого.

4) Ассоциация аллеля А полиморфизма ге 16969968 в гене никотинового рецептора СН1ША5 с более высокой степенью никотиновой зависимости имела место только среди носителей коротких аллелей полиморфизмов гена БАИ, что говорит о возможном взаимодействии между двумя генетическими факторами.

5) В исследуемой выборке было обнаружено взаимодействие между полиморфизмами в генах ТН и БАТ1 в отношении статуса курения.