Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Генетическая устойчивость к заражению ВИЧ и развитию СПИД в популяциях России и сопредельных государств

1/

□□3166954

На правах рукописи

Кофиади Илья Андреевич

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ УСТОЙЧИВОСТЬ К ЗАРАЖЕНИЮ ВИЧ И РАЗВИТИЮ СПИД В ПОПУЛЯЦИЯХ РОССИИ И СОПРЕДЕЛЬНЫХ

ГОСУДАРСТВ

14 00 36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 6 АПР 2008

Москва, 2008

003166954

Работа выполнена в ГНЦ «Институт иммунологии ФМБА России» и ЗАО «НПФ ДНК-Технология»

Научные руководители:

Доктор медицинских наук, профессор Алексеев Леонид Петрович Кандидат биологических наук Ребриков Денис Владимирович Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Кадагидзе Заира Григорьевна Доктор биологических наук Филатов Александр Васильевич Ведущая организация:

Научно исследовательский институт вакцин и сывороток имени ИИ Мечникова РАМН

Защита состоится «<?3» л 2008 года в 14.00 на заседании совета по

защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208.017 01 в ГНЦ «Институт иммунологии ФМБА Россию) по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, дом 24, корп 2.

Автореферат разослан «соу> 2008 г

Ученый секретарь совета,

Доктор медицинских наук

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Пандемия ВИЧ остается одной из самых серьезных проблем здравоохранения в области инфекционных заболеваний В мире насчитывается около 33 миллионов человек живущих с ВИЧ/СПИД и в день происходит примерно 6800 новых заражений [UNAIDS, 2007] Общая иммуносупрессия, вызываемая инфекцией, повышает риск развития инфекционных и онкологических заболеваний и, в подавляющем большинстве случаев, приводит к летальному исходу через 10-12 лет после заражения Тем не менее, динамика развития заболевания может варьировать на индивидуальном уровне В немалой степени, на устойчивость к ВИЧ и предрасположенность человека к развитию СПИД влияет аллельное состояние ряда генов В том числе, к ним относятся гены рецепторов хемокинов CCR5 и CCR2 и ген хемокина SDF1 [Fauci А, et al, 1996, Dean М, et al, 1996] Наиболее достоверная ассоциация генотипа с устойчивостью или восприимчивостью к ВИЧ-инфекции показана для аллелей CCR5delta32 (номер полиморфизма в базе данных NCBI - rs333), CCR2-64I (rs 1799864) и SDFI-3 'A (rs 1801157)

Защитный эффект аллелей CCR5delta32 и CCR2-64I носит доминантный, а SDFl-3'A - рецессивный характер [Winkler С, et al, 1998] Эффект проявляется в повышенной устойчивости носителей определенных комбинаций аллелей указанных генов к развитию симптомов СПИД Зная частоты встречаемости трехлокусных генотипов (для генов CCR5, CCR2 и SDF1) и общие для представителей различных этнических групп коэффициенты относительного риска развития СПИД (РР) и смерти в результате СПИД (PC), можно оценить относительную опасность развития СПИД (OOP) и смерти в результате СПИД (ООС) для данной популяции Применимость этого подхода подтверждена результатами пятнадцатилетнего исследования нескольких эпидемиологических когорт, включающих здоровых, относящихся к группе повышенного риска, и ВИЧ-

инфицированных представителей различных этнических групп с известными генотипами по трем перечисленным выше локусам [по данным Winkler С , et al, 1998]

В человеческих расах и популяциях защитные аллели представлены гетерогенно, поэтому выяснение особенностей их распределения является одним из важных параметров, характеризующих эпидемиологические особенности данного региона или этнической группы

Сравнительный популяционно-генетический анализ - наиболее адекватный способ оценки вклада наследственной составляющей в формирование устойчивости или восприимчивости популяций к инфекционному фактору Современные методы молекулярно-генетического анализа и существующие представления о структурно-функциональной организации генома многоклеточных организмов позволяют вплотную подойти к выяснению закономерностей влияния отдельных полиморфизмов на устойчивость или восприимчивость человека к ВИЧ Цель исследования

Охарактеризовать 10 популяций Российской Федерации и сопредельных государств с точки зрения генетической устойчивости к заражению ВИЧ и развитию СПИД Задачи исследования

1 Разработать комплекс ПЦР-тест-систем для определения аллельного состояния генов CCR5, CCR2, SDF, ассоциированного с повышенной устойчивостью или восприимчивостью к ВИЧ-инфекции

2 С помощью разработанных тест-систем установить частоты исследуемых аллелей у здоровых (без известной истории ВИЧ/СПИД) представителей 10 популяций

3 Охарактеризовать особенности распределения аллелей и гаплотипов исследуемых полиморфных локусов

4 Оценить относительную опасность развития СПИД и смерти в результате СПИД в исследованных популяциях

5 Оценить влияние генетического фактора (в пределах исследуемых полиморфизмов) на динамику основных эпидемиологических показателей в изученных регионах Новизна исследования

Впервые проведен комплексный анализ полиморфизма генов ССЯ5, ССЯ2, и в 10 популяциях, проживающих на территории России и

сопредельных государств, дана характеристика генетической структуры популяций Оценена доля предрасположенных (не несущих ни одного протективного генотипа) индивидуумов Оценена относительная опасность развития СПИД и смерти в результате СПИД в исследованных популяциях Практическая значимость

Разработаны методологические подходы для эффективного генотипирования

Разработаны и внедрены в лабораторную практику тест-системы для определения аллелей ССК5(1еИа32, ССК2-641 и БОР 1-3 'А методом ПЦР в режиме «реального времени» Тест-системы просты в использовании, экономичны, обладают высокой пропускной способностью и полностью адаптированы к производимому в Российской Федерации оборудованию Это создает потенциал для использования данных тест-систем в клинической практике, в качестве инструмента для оценки предрасположенности человека к ВИЧ-инфекции, и динамики развития СПИД у ВИЧ-инфицированных

Разработанные методики могут быть использованы в учебном процессе при подготовке специалистов медицинского и биологического профиля

Полученные данные могут служить теоретической основой при рассмотрении особенностей распространения ВИЧ-инфекции в исследованных популяциях, а так же при прогнозировании дальнейшего развития эпидемии.

Характеристика геномного полиморфизма в исследованных популяциях имеет общее популяционно-генетическое значение и служит вкладом в развитие фундаментальной науки Публикации и апробация работы

Диссертация апробирована на заседании секции № 2 Ученого совета ГНЦ «Института иммунологии ФМБА России» от 14 декабря 2007 г и рекомендована к защите на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности «14 00 36 - аллергология и иммунология» Результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на двух отечественных и двух международных конференциях XVIII зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии (2006 г), 16 европейском конгрессе по иммунологии (Париж, Франция 2006 г), XI всероссийском научном форуме с международным участием имени В И Иоффе (2007 г), 21 европейской конференции по иммуногенетике и гистосовместимости (Барселона, Испания, 2007 г)

Материалы диссертации изложены в 9 публикациях, в том числе 4 журналах, рекомендованных ВАК для опубликования научных результатов диссертационных работ на соискание ученой степени кандидата и доктора наук

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В ходе работы были обследованы 960 здоровых (не имеющих известной истории ВИЧ/СПИД), взрослых представителей 10 этнических групп (по 96 человек для каждой группы), не связанных кровным родством, проживающих в определенных регионах России, Украины, Казахстана, Киргизстана и Молдовы (рис 1) Образцы крови для исследования были получены из разных источников биоматериал от гагаузов (Молдова), украинцев из Львовской области и чеченцев (республика Чечня), полученный в результате этнографических и медико-генетических экспедиций были переданы д б н Балановской Е В (Медико-генетический

научный центр РАМН), биоматериал от русских поморов (Архангельская область), передан д м н Евсеевой И В (Северный госмедуниверситет, г Архангельск), биоматериал от удмуртов, собранный в различных районах республики Удмуртия передали к м н Поздеева ОС и Ганичева JIЛ (Ижевская государственная медакадемия), биоматериал от русских из Вологодской области передан Кашининым М Н (Вологодская областная больница), биоматериал от татар (потомков переселенных в годы отечественной войны из Казани) был собран в Кировской области и передан проф Зайцевой Г А (Кировский НИИ гематологии и переливания крови), биоматериал от тувинцев из разных районов республики Тыва был передан д м н Осокиной И В (Институт медицинских проблем Севера СО РАМН)

Сотрудниками ГНЦ «Института иммунологии ФМБА России» был собран биоматериал от казахов (Актюбинская область, Казахстан) и киргизов из разных районов Киргизстана

По географическому принципу выбранные популяции можно сгруппировать в восточно-европейскую (русские, украинцы, гагаузы, и субэтническая группа поморов), центрально-азиатскую (казахи, киргизы и тувинцы) и Волго-Уральскую (татары и удмурты) группы Кроме того, в исследование была включена популяция чеченцев, представляющая северокавказский регион

Очистку ДНК проводили методом высаливания по стандартной процедуре [Miller S А, et al, 1988]

Генотипирование образцов проводили методом аллель-специфичной полимеразной цепной реакции (ПЦР) с детекцией накопления продуктов реакции «в реальном времени» (точность использованных систем была подтверждена повторным генотипированием выборки образцов методом секвенирования по Сэнгеру [Sanger F , et al, 1975]) Для каждого из аллель-специфичных праймеров проводили отдельную реакцию Каждый образец тестировали в двух повторностях Визуализацию накопления продуктов ПЦР проводили с использованием линейных разрушаемых

гибридизационных проб. ПЦР проводили в детектирующем амплификаторе ДТ-96 (ЗАО «НПФ ДНК-Технология», Россия) по следующей программе: 94°С - 10 е., 64°С - 20 е., 72°С - 10 с. в течение 40 циклов, с измерением флуоресценции при 64°С.

Рисунок I. Географическое расположение исследованных популяций. 1. поморы, 2. русские (Вологодская область), 3. гагаузы, 4. украинцы, 5. татары, 6. удмурты, 7. чеченцы, 8. казахи, 9. киргизы, 10. тувинцы.

Статистическая обработка данных

Частоту аллелей вычисляли по формуле:

где п - встречаемость аллеля. Отклонение от теоретически ожидаемого распределения оценивали методом %2 (р > 0,05). Оценку OOP и ООС в исследованных популяциях проводили на основании коэффициентов, предложенных Su В. с соавторами [Su В., et al., 2000]. 27 возможных генотипов по трем полиморфным локусам, в соответствии с данными литературы, разделили на 4 группы. Для каждой группы использовали свой коэффициент относительного риска развития СПИД и смерти в результате

/= n/2N,

СПИД (табл 1) Расчет ООР и ООС проводили по формуле

ООР(ООС) = Е щр„ где р, — частота встречаемости данной комбинации аллелей, а уу, -коэффициент РР (относительного риска развития СПИД) или РС (относительного риска смерти в результате СПИД) для данной группы Таблица 1 Возможные варианты генотипов по трем исследованным локусам, объединенные в четыре группы, каждой из которых соответствует общий коэффициент относительного риска развития СПИД (РР) и смерти в результате СПИД (РС) А, В и С - не протективные аллели генов ССК5, ССЯ2, и ££>/7, соответственно, а, Ь и с - протективные аллели соответствующих генов Прочерк означает любой из аллелей

Генотип Возможное число генотипов РР РС

ААВВС- 2 1 0 1 0

а-Ь-С-

а-ВВС- 16 0 65 06

ААЬ-С-

ААВВсс 1 0 63 0 23

а-Ь-сс

а-ВВсс 8 0 55 00

ААЬ-сс

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Разработка лабораторного варианта тест-систем для определения аллелей ССЯ5(1ека32, ССЯ2-641 и £07*7 методом ПЦР «в реальном времени».

В ходе работы созданы тест-системы для определения аллелей ССЯ5с1е11а32, ССЯ2-641 и Ж/7/-5 'А в геноме человека методом ПЦР «в реальном времени» Регистрация накопления ДНК в ходе реакции позволяет избежать отдельной стадии определения результатов, исключить

загрязнение лаборатории продуктами реакции, проводить количественный анализ нуклеиновых кислот

Из существующего разнообразия флуоресцентных методик нами был выбран наиболее эффективный, на наш взгляд, метод определения полимофизмов с помощью аллель-специфичной ПЦР Для идентификации аллелей проводили ПЦР с праймерами, каждый из которых полностью совпадает только с одним из вариантов последовательности Вариабельный нуклеотид располагали в 3'-концевой части аллель-специфичного праймера Условия реакции подбирали так, чтобы максимизировать разницу в эффективности удлинения «правильно» и «неправильно» гибридизованного праймера Таким образом, если анализируемый образец содержит только один вариант последовательности (то есть гомозиготен по данному полиморфизму), продукт, синтезируемый с полностью комплементарного матрице праймера, образуется в ПЦР существенно раньше, нежели продукт с частично некомплементарного праймера (рис 2А) Если же анализируют гетерозиготный образец, и тот и другой праймер дадут примерно одинаковый результат (рис 2Б) Регистрацию сигнала осуществляли при помощи линейных олигонуклеотидных проб, несущих молекулы флуорофора и гасителя В данном случае пробы применяли только для проявки накопления ДНК в ходе ПЦР, разделение же аллелей происходило за счет аллель-специфичных праймеров Такой подход позволил существенно упростить условия проведения реакции в части подбора концентрации матричной ДНК Получаемые в результате реакции графики накопления ДНК можно однозначно трактовать даже в том случае, если к моменту окончания реакции продукт образовался во всех пробирках Использованный нами подход продемонстрировал высокую точность анализа и достаточную пропускную способность

Рисунок 2. Графики накопления ДНК, полученные с помощью детектирующего амплификатора ДТ-96 (ЗАО «НПФ ДНК-Технология»). А - результат исследования гомозиготного образца. Темная кривая соответствует накоплению продукта реакции с частично некомплементарного праймера; Б - результат исследования гетерозиготного образца.

2. Генотипирование образцов.

С помощью разработанных тест-систем были определены генотипы представителей 10 исследованных популяций по трем полиморфным локусам: ССЯ5с1е11а32, ССЯ2-641 и 'А. Результаты приведены в

таблице 2.

3. Проверка соотношения Харди-Вайнберга для исследованных аллелей.

, Селективный отбор в отношении индивидуумов, несущих защитный

генотип, может влиять на представленность аллелей в популяции. Для проверки этой гипотезы сравнивали полученные результаты с равновесным распределением Харди-Вайнберга. Для сравнения использовали критерий X

Для 10 популяций отклонения частот генотипов от равновесия Харди-Вайнберга были незначимы на 5% уровне значимости (табл. 3). Эмпирически установленные частоты генотипов аллелей СС7?5с/е//а52, ССЯ2-641 и >57Ж/-3 'А соответствовали распределению Харди-Вайнберга.

Популяция п Частота генотипов (%) ССЯ5 Частота генотипов(%) ССЯ2 Частота генотипов(%) да/у

+/+ +Ш ¿е1Ш О/в О/А А/А ею в/А А/А

Поморы 96 67 30 3 82 18 0 69 28 3

Вологодцы 96 79 21 0 83 17 0 69 28 3

Гагаузы 96 78 20 2 76 23 1 60 33 7

Украинцы 96 77 21 2 82 16 2 68 30 2

Татары 96 88 11 1 89 11 0 72 28 0

Удмурты 96 87 13 0 88 11 1 72 26 2

Чеченцы 96 94 6 0 72 23 5 64 36 0

Казахи 96 94 6 0 45 47 8 78 21 1

Киргизы 96 95 5 0 54 38 8 76 24 0

Тувинцы 96 98 2 0 91 9 0 69 28 3

Таблица 3 Значения х2(р)> полученные для теоретических (в соответствии с распределением Харди-Вайнберга) и эмпирических частот генотипов генов ССЯ5, ССЯ2 и 5ДР7 в исследованных популяциях

Популяция ССЯ5 ССК2

Поморы 0 01(0 92) 1 17(0 28) 0 01(0 92)

Вологодцы 1 5(0 22) 0 8(0 37) 0 01(0 92)

Гагаузы 0 36(0 55) 0 26(0 61) 0 69(0 4)

Украинцы 0 27(0 61) 1 45(0 23) 0 37(0 54)

Татары 0 7(0 40) 0 32(0 57) 2 8(0 09)

Удмурты 0 54(0 46) 0 67(0 41) 0 21(0 65)

Чеченцы 0 05(0 82) 2 56(0 И) 2 73(0 1)

Казахи 0 12(0 73) 0 63(0 43) 0 11(0 74)

Киргизы 0 15(0 7) 0 25(0 62) 1 77(0 18)

Тувинцы 0 01(0 92) 0,22(0 64) 0 01(0 92)

4. Изучение особенностей частотного распределения аллелей генов ССЯ5, ССИ2, и /У в исследованных популяциях. 4.1 Распределение аллеля ССЛ5(1е11а32

Частоты ССК5с1е11а32 представлены на рисунке 3 Аллель ССЯ5с1е11а32 наиболее представлен в выборке поморов Его частота достоверно выше, чем в других, изученных в данной работе, выборках Кроме того, частота аллеля в популяции русских поморов превышает частоты для изученных ранее популяций северных регионов Западной и Восточной Европы [Кожекбаева Ж М, и др, 2004] Распределение частот варианта ССЯ5с1еиа32 в изученном регионе характеризуется отрицательным градиентом в направлении с севера на юго-восток (рис 4)

Аллель ССЯ5с]е11а32 наименее представлен в популяции тувинцев, казахов, киргизов и чеченцев (центрально-азиатская и северо-кавказская группы) Казахи и киргизы принадлежат южно-сибирской этнической группе - промежуточной между европеоидной и монголоидной расами, а тувинцы являются представителями монголоидной расы В этих случаях полученные нами данные соотносятся с проводимыми ранее исследованиями, демонстрирующими низкую распространенность полиморфизма ССЯ5Лека32 в азиатских популяциях [Би В , е1 а1, 2000]

На границах ареала монголоидной расы имеются плавные переходы в европеоидную, уральскую и южносибирскую расы Примесь монголоидной составляющей в южных популяциях большой европеоидной расы (чеченцы) и переходной уральской (туранский тип) группе (татары, удмурты) могла повлиять на формирование генофонда, характеризующегося пониженной представленностью аллеля ССЯ5с1е11а32 по сравнению с популяциями восточно-европейского региона

В изученных нами восточно-европейских популяциях частота аллеля ССЯ5с!еиа32 повышена Аллель одинаково представлен в выборках украинцев, русских и гагаузов

Общая картина распределения аллеля ССК5с1е11а32 позволяет предположить, что рассматриваемая мутация могла возникнуть и закрепиться в популяциях северной части Европы и уже затем постепенно распространиться в соседние регионы [Лимборская С А, и др , 2002]

Таким образом, гетерогенность в распределении протективного аллеля СС115с}е11а32 на территории изученных регионов связана, в первую очередь, с участием европеоидного и монголоидного компонентов в этногенезе народов, проживающих на территории России Полученные нами результаты подтверждают и дополняют существующие данные молекулярно-генетического анализа пространственной структуры генофонда восточно-европейских и центрально-азиатских народов

СС/?5с7е/(а32

0 2502 ■ 01501 • 0 05- Л [Ь 1*1 I*] 1*1 1*1 л.

Поморы Русские Молдаване Украинцы Татары Удмурты Чеченцы Казахи Киргизы Тувинцы

Рисунок 3 Распределение частот аллеля ССЯ5с1еНа32 в исследованных популяциях

Рисунок 4. Распределение частот аллеля ССЯ5ёе1ш32 характеризуется градиентом в направлении с севера на юго-восток, с максимальной частотой в популяции поморов.

4.2 Распределение частот аллеля ССЯ2-641

В отношении аллеля ССЯ2-641 нами были обнаружены достоверные отличия для чеченцев, казахов и киргизов (северо-кавказская и центрально-азиатская группы) относительно других рассмотренных групп (рис. 5,6).

В пределах восточно-европейской и Волго-Уральской этнографических групп обнаружены достоверные отличия для гагаузов относительно других популяций. Эти данные коррелируют с данными о миграционных потоках со стороны южных (Греция, Болгария) регионов Европы, где частота аллеля ССЯ2-641 демонстрирует повышенные значения. Значимых отличий в других этнических группах восточноевропейского региона обнаружено не было.

Отдельного упоминания стоит рассмотренная выборка из популяции

тувинцев. Здесь частота аллеля ССЯ2-641 зафиксирована па самом низком

уровне. Причиной этому могла послужить географическая изолированность

республики. Полученные нами данные позволяют предположить, что

формирование генофонда тувинской популяции находилось под влиянием

миграционных потоков, проникавших на территорию восточной Сибири из

15

южных областей азиатского региона, где частота полиморфизма ССЯ2-641 ниже, относительно центральной Азии.

Рисунок 5. Распределение частот аллеля ССЯ2-641 на территории изученного региона. Для центрально-азиатских популяций характерна повышенная частота.

0.4 п 0.35 -0.3 -0.25 -0.2 -0.15 -0.1 -0.05 ■ ССЯ2-641 А А 111*1 й й 1*1 А

Поморы Русские Молдаване Украинцы Татары Удмурты Чеченцы Казахи Киргизы Тувинцы

Рисунок 6. Распределение частот аллеля ССЯ2-641 в исследованных популяциях. 4.3 Распределение частот аллеля БВП-З 'А

Аллель Ж/7/-^ 'А для всех исследованных популяций распространен равномерно (рис. 7). Обнаруженные отличия не достоверны и не позволяют выявить тенденций в его распространенности. Единственное значимое

16

отличие отмечено нами для популяции гагаузов, где частота аллеля достоверно выше, чем у представителей популяций Украины и европейского региона России К сожалению, в доступной литературе отсутствуют сведения о представленности варианта БОР 1-3'А на территории Европы и ближневосточного региона и мы не можем делать предположений о путях его распространения

Однако если сопоставить данные по частоте аллелей ССЯ2-641 и 5Бр]-3 'А с основными путями миграции в азиатском регионе, видно, что изменение частот аллелей совпадает с направлением миграционных потоков По одной из существующих на сегодняшний день гипотез, современные люди попали на территорию центральной Азии примерно 50000-70000 лет назад с юга, вероятно из юговосточной Азии (где частота аллеля Я ИР 1-3 'А высокая), и в дальнейшем распространились на север Азии Вместе с тем, следующие 7000 лет миграции на территории Китая были направлены с севера на юг - из области с высокой частотой ССЯ2-641. Противоположная направленность в распределении частот протективных аллелей ССЯ2-641 и 'А на территории азиатского региона отчасти

подтверждает эту гипотезу

0.3 п 0 25

0 2 Н 0 15

01

0 05 Н 0

4

4

4

1

4

4

А

а о 2 О С

а> 5 X О

и >»

а.

а х га

а га

ч с о

л Л л Л 8 Л Л

а X Я С1 19 п а

X ч а. X 5 X

5 га а н га Н >» с! а т ® и а 5 5 а >1

5£ 5к > У I-

Рисунок 7 Распределение частот аллеля 5ЭР1-3 'А в исследованных популяциях

5. Распределение протективных генотипов

Распределение генотипов в изученных популяциях по каждому локусу представлено в таблице 3

При анализе распределения протективных генотипов было выявлено 3%, 2%, 2% и 1% индивидуумов, гомозиготных по аллелю CCR5delta32, в популяциях поморов, гагаузов, украинцев и в татар, соответственно Показано, что носители такого генотипа практически не восприимчивы к ВИЧ-инфекции при половом способе передачи вируса [Dean М, et al, 1996]

Гомозиготы по аллелю CCR2-64I не найдены среди поморов, русских из Вологодской области, татар и тувинцев Показано, что, как у гомозигот, так и у гетерозигот по аллелю CCR2-64I пролонгирован период между сероконверсией и проявлением симптомов СПИД, однако аллель не влияет на продолжительность жизни ВИЧ-инфицированных с симптомами СПИД [Ioannidis J Р, et al, 2001]

Гомозиготы по SDFl-3'A обнаружены во всех популяциях кроме киргизов, чеченцев и татар Протективный эффект этой мутации, в отличие от предыдущих двух, рецессивный и ассоциирован с увеличением продолжительности жизни ВИЧ-инфицированных с симптомами СПИД Наибольшее снижение риска связано с сочетанием гомозиготности по SDF1-3 'А и наличием хотя бы одного протективного аллеля по генам CCR2 и CCR5 [Winkler С , et al, 1998]

6. Оценка доли предрасположенных индивидуумов

Важной оценочной характеристикой при определении динамики развития эпидемии в популяции служит доля предрасположенных (не несущих ни одного протективного генотипа) индивидуумов Наибольшее количество незащищенных генотипов обнаружено в популяции тувинцев, наименьшее - в центрально-азиатских популяциях (казахи, киргизы) и в популяции поморов (рис 8)

90% л 80% ■ 70% 60% ■ 50% • 40% 30% 20% -10% ■ 0%'

77%

65%

61% 60% ,.„.

|—| I—, 56/0 53% 52%

л З' X 5

Ш >>

I-

л о. я I-

га

л

I-

о.

>, 5

г

л

X

ф

у ф

т

л ах

5 га о.

х >.

Ф X ж о и >. о.

о

X и а

и «

с о

г

л

Г)

5 и

а х

Л

а о 5 О

с

х

X

га с*

га ^

Рисунок 8 Доля индивидуумов, не несущих ни одного протективного генотипа

7. Связь генетического фактора и динамики основных эпидемиологических показателей в изученных популяциях.

Для проверки гипотезы о влиянии протективных полиморфизмов на динамику ВИЧ/СПИД, мы соотнесли полученные нами результаты с доступными статистическими данными по эпидемиологической обстановке в исследованных регионах Проводили сравнение статистических данных с частотой протективных генотипов, ассоциированных с естественной устойчивостью носителя к ВИЧ/СПИД (таб 1) Корреляции генетических параметров популяций с динамикой основных эпидемиологических параметров на данном этапе исследования обнаружено не было (данные не приведены) Возможно, это обусловлено широким спектром факторов (помимо генетического), оказывающих существенное влияние на динамику основных эпидемиологических показателей Тем не менее, можно рекомендовать продолжать мониторинг эпидемиологических параметров и совершенствовать методологию сбора данных, а так же пополнять информацию относительно распределения протективных аллелей в мировых популяциях с целью выявления таких зависимостей

8. Определение относительной опасности развития СПИД и смерти в результате СПИД в исследованных популяциях

На основе частот трехлокусных генотипов в изученных популяциях рассчитаны значения относительной опасности развития СПИД у ВИЧ-инфицированных (OOP) и смерти от СПИД (ООС) Данные представлены на рисунках 9 и 10

В рассмотренных нами выборках значения OOP и ООС попадают в интервал 0 79-0 94 и 0 76-0 93, соответственно В целом они соответствуют данным, полученным для других европейских и азиатских популяций Широкое распространение аллеля CCR2-64I в центрально-азиатскиой группе обусловило пониженные значения OOP и ООС Напротив, в выборке тувинцев и популяциях Волго-Уральской группы относительный риск демонстрирует повышенные значения, что связано с низкой частотой протективных аллелей CCR5delta32 и CCR2-64I У восточно-европейских народов и выборки чеченцев выявлен средний уровень OOP и ООС Можно предположить, что в первом случае оказывает влияние распространенность варианта CCR5delta32, а во втором - CCR2-64I

OOP

1 -I

0.95 -0.9 ■ 0.85 -08 -0 75 -07

¿1

il

Jl

Jl

fl

Jl

ifl

л л л — л Ф

3" X S a > a га t-ю 1- ь a >< г ч Чеченць я X S <0 a S X о и >> а.

н >

0) i со m ш Et С

о

л to

Q. S

Л

a о 2 О С

x

CO п со

Рисунок 9 Относительная опасность развития СПИД (OOP) у ВИЧ инфицированных индивидуумов в исследованных популяциях

оос

11

0.95 -

09 -

0 85 -

08 -

0.75 -

07-

4

4

|Ь |Ь |Ь

А

л л л

Я О. Н

х га Р-

х н >

а « 2

>. I- Ч

ь- >

л ■з

X

ф

7 0) т

л я-

X 5

п

а

*

о о >. о.

ш X га а го Ч с о

л а о 5 О

с

л

г>

X X

Л) п <9

ьй

Рисунок 10 Относительная опасность смерти в результате СПИД (ООС) у ВИЧ-инфицированных индивидуумов в исследованных популяциях

ВЫВОДЫ

1 Разработан лабораторный вариант тест-систем, позволяющих определять аллели ССИ.5с1еИа32, ССЯ2-641 и 8йР1-3'А методом ПЦР «в реальном времени» Данный подход точен и прост в применении и может быть рекомендован для использования в лабораторной практике

2 Наиболее генетически устойчивы к заражению ВИЧ, среди обследованных выборок представители популяции русских поморов, ареал обитания которых близок к предполагаемому месту происхождения делеционного полиморфизма ССЯ5ёеиа32

3 Наиболее генетически устойчивы к развитию заболевания представители центрально-азиатских популяций, вследствие широкого распространения протективных аллелей, связанных с замедленной прогрессией СПИД

4 Частота аллеля ССЯ5йеНа32 снижается с северо-запада на юго-восток России с максимальной частотой в популяции русских поморов

5 Частота аллеля ССЯ2-641 демонстрирует изменчивость в распространении на территории России с максимальной частотой в центрально-азиатских популяциях

6 Достоверного влияния генетического фактора на динамику основных эпидемиологических показателей ВИЧ/СПИД не обнаружено СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Основное содержание диссертационной работы приведено в следующих публикациях Статьи:

1 Елов А А, Федоров Н А, Жибурт Е Б, Кофиади И А, Трофимов Д10 Количественная флуоресцентно-гибридизационная ПЦР на основе отечественной аппаратуры и тест-систем // Здравоохранение и медицинская техника 2005-№2-С 10

2 Боринская С А , Ребриков Д В , Нефедова В В , Кофиади И А , Соколова М В , Колчина Е В , Куликова Е А, Чернышов В Н, Куцев С И, Полонников А В, Иванов В П , Козлов А И, Янковский Н К Молекулярная диагностика и распространенность первичной гиполактазии в популяциях России и сопредельных стран // Молекулярная биология 2006 - Т 40 № 5 -С 1-6

3 Кофиади И А, Ребриков Д В Методы детекции однонуклеотидных полиморфизмов аллель-специфичная ПЦР и гибридизация с олигонуклеотиднойпробой //Генетика 2006 -Т42 №1 -С 22-32

4 Кофиади И А, Ребриков Д В , Трофимов Д Ю , Алексеев Л П, Хаитов Р М Распределение аллелей генов ССЯ5, ССК2, и БЭР! ассоциированных с устойчивостью к ВИЧ-инфекции в российских популяциях // Доклады Академии Наук 2007 -Т 415 №6 - С 320-3

5 Черноусов А Д, Петрова Т В , Пичугина Л В , Литвина М М , Донецкова А Д, Кофиади И А, Ребриков Д В, Апарин П Г Посттерапевтическая клеточная латентность ВИЧ у пациента с исходной развернутой картиной СПИДа // Иммунология 2007 - №6 - С 327-331

Материалы отечественных и международных конференций:

6 Кофиади И А Частоты связанных с тромбофилией аллелей генов F5, F2 и MTHFR у представителей евразийской этнической группы, проживающих на территории России и Беларуси. // Материалы XVIII зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» 2006 -С 14

7 Kofiadi I, Trofimov D, Gudima G, Alexeev L Genetic susceptibility to HTV-infection m 4 populations from Russia // 16 European Congress of Immunology. 2006 Book of abstracts, P 129

8 Ребриков Д В, Кофиади И А, Алексеев JIП, Хаитов Р М Полиморфизм генов CCR5, CCR2, и SDF1, ассоциированных с устойчивостью к ВИЧ-инфекции среди этнических групп проживающих на территории России и сопредельных государств // Медицинская иммунология 2007 - Т 9 №2-3 - С 309

9 Kofiadi IА, Trofimov D Yu, Rebrikov D V Genetic susceptibility to HTV-1 infection in Russian populations // The official journal of the European Federation for Immunogenetics. 2007 P 430

Подписано в печать 17 03.08 Формат 60x84/16 Бумага офсетная _Тираж 100 экз Заказ № 223_

печатано в службе множительной техники ГУ РОНЦ им Н Н Блохина РАМН 115478, Москва, каширское ш, 24

Актуальность работы.

Первый случай СПИД был зарегистрирован в США в 1981 году. Через два года исследователям из института Пастера (Франция) удалось выделить вирус, принадлежащий семейству Яе&оуМс1ае, который, по их мнению, был связан с развитием СПИД [30]. Впоследствии он получил название вируса иммунодефицита> человека (ВИЧ). Пандемия ВИЧ остается одной из самых серьезных проблем для здравоохранения в области инфекционных заболеваний. В мире насчитывается около 33 миллионов человек, живущих с ВИЧ/СПИД, и в день происходит примерно 6800 новых заражений [23, 25]. Общая иммуносупрессия, вызываемая инфекцией, повышает риск развития инфекционных и онкологических заболеваний и, в подавляющем большинстве случаев, приводит к летальному исходу через 10-12 лет после заражения [10, 157]. Тем не менее, динамика развития заболевания может варьировать на индивидуальном уровне. На предрасположенность человека к ВИЧ-инфекции влияет аллельное состояние ряда генов. В частности, к ним относятся гены рецепторов хемокинов ССВ.2 и ССЯ5 и ген хемокина Наиболее достоверная ассоциация показана для аллелей ССК5йеЫа32 (номер полиморфизма в базе данных Ж:В1 - гбЗЗЗ), ССЯ2-641 (ге 1799864) и 5ЮГ1-3'А (ге1801157) [61, 66, 93, 141, 147-149, 168]. Распределение таких аллелей в популяциях или выборках является одним из важных параметров, характеризующих эпидемиологические особенности, специфичные для данного региона или этнической группы. Сравнительный популяционно-генетический анализ - наиболее адекватный способ оценки вклада наследственной информации в формирование устойчивости и восприимчивости к-инфекционному фактору.

Цель исследования:

Охарактеризовать 10 популяций Российской Федерации и сопредельных государств с точки зрения генетической устойчивости к заражению ВИЧ и развитию СПИД.

Задачи исследования.

1. Разработать комплекс ПЦР-тест-систем для определения аллельного состояния генов ССЯ5, ССЯ2, ассоциированного с повышенной устойчивостью или восприимчивостью к ВИЧ-инфекции.

2. С помощью разработанных тест-систем установить частоты исследуемых аллелей у здоровых (без известной истории ВИЧ/СПИД) представителей 10 популяций.

3. Охарактеризовать особенности распределения аллелей и гаплотипов исследуемых полиморфных локусов.

4. Оценить относительную опасность развития СПИД и смерти в результате СПИД в исследованных популяциях.

5. Оценить влияние генетического фактора (в пределах исследуемых полиморфизмов) на динамику основных эпидемиологических показателей в изученных регионах.

Научная новизна работы.

Впервые проведен комплексный анализ полиморфизма генов ССЯ5, ССЛ2, и £/Ж/ в 10 популяциях, проживающих на территории России и сопредельных государств, и дана характеристика их генетической структуры. Оценена доля предрасположенных (не несущих ни одного протективного генотипа) индивидуумов. Оценена относительная опасность развития СПИД и смерти в результате СПИД в исследованных популяциях.

Практическая значимость работы.

Разработаны и внедрены в лабораторную практику тест-системы для определения аллелей ССК5йеЫа32, ССЯ2-641 и БОЕ 1-3'А методом ПЦР в режиме «реального времени». Тест-системы просты в использовании, экономичны, обладают высокой пропускной способностью и полностью адаптированы к производимому в Российской Федерации оборудованию. Это создает потенциал для использования данных тест-систем в клинической практике, в качестве инструмента для оценки предрасположенности человека к ВИЧ-инфекции, и динамики развития СПИД у ВИЧ-инфицированных.

Разработанные подходы могут быть использованы в учебном процессе при подготовке специалистов медицинского и биологического профиля.

Полученные данные могут служить теоретической основой при рассмотрении особенностей распространения ВИЧ-инфекции в исследованных популяциях, а так же при прогнозировании дальнейшего развития эпидемии.

Характеристика геномного полиморфизма в исследованных популяциях имеет общее популяционно-генетическое значение и служит вкладом в развитие фундаментальной науки.

Основные положения, выносимые на защиту.

- Аллели ССЯ5йеЫа32 ССЯ2-641 и А распределены в исследованных популяциях неравномерно.

- Распределение аллелей ССЯ5с1еЬа32, ССЯ2-641 и А носит закономерный характер и совпадает с основными путями миграции человеческих сообществ на территории восточно-европейского и азиатского регионов.

- С точки зрения генетической устойчивости к ВИЧ, наиболее защищенными являются представители популяции поморов, ареал обитания которых близок к предполагаемому месту происхождения делеционного варианта ССК5йеЫа32.

- Вследствие широкого распространения протективных аллелей, связанных с замедленной прогрессией СПИД, наиболее генетически устойчивы к развитию заболевания представители центрально-азиатских популяций.

- Примененный в работе вариант метода генотипирования «в реальном времени» обладает рядом преимуществ преред другими распространенными подходами и может быть рекомендован для использования в лабораторной практике.

Личный вклад автора.

Автору принадлежит решающая роль в разработке дизайна экспериментов, отработке методик и обобщении полученных результатов. Личный вклад автора в данном исследовании составляет около 80%.

Публикации.

Материалы диссертации изложены в 9 публикациях, в том числе 4 журналах, рекомендованных ВАК для опубликования научных результатов диссертаций на соискание ученой степени кандидата и доктора наук.

Апробация диссертации.

Диссертация апробирована на заседании секции № 2 Ученого совета ГНЦ «Института иммунологии ФМБА России» от 14 декабря 2007 г. и рекомендована к защите на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности «14.00.36 - аллергология и иммунология».

Структура и объем работы.

Работа изложена на 100 страницах, состоит из введения, обзора литературы, раздела «Материалы и методы», раздела «Результаты и обсуждение», выводов и списка литературы. Работа включает 22 рисунка и 15 таблиц.

4. ВЫВОДЫ.

1. Разработан лабораторный вариант тест-систем, позволяющих определять аллели CCR5delta32, CCR2-64I и SDFl-3'A методом ПНР «в реальном времени». Данный подход точен и прост в применении и может быть рекомендован для использования в лабораторной практике.

2. Наиболее генетически устойчивы к заражению ВИЧ представители популяции поморов, ареал обитания которых близок к предполагаемому месту возникновения аллеля CCR5delta32.

3. Вследствие широкого распространения протективных аллелей, связанных с замедленной прогрессией СПИД, наиболее генетически устойчивы к развитию заболевания представители центрально-азиатских популяций.

4. Распределение частот аллеля CCR5delta32 демонстрирует изменчивость в распространении на территории России с северо-запада на юго-восток с максимальной частотой в популяции поморов.

5. Распределение частот аллеля CCR2-64I демонстрирует изменчивость в распространении на территории России с максимальной частотой в центрально-азиатских популяциях.

6. Достоверного влияния генетического фактора на динамику основных эпидемиологических показателей обнаружено не было.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Основное содержание диссертационной работы содержится в следующих публикациях: Статьи:

1. Елов A.A., Федоров H.A., Жибурт Е.Б., Кофиади И.В., Трофимов Д.Ю. Количественная флуоресцентно-гибридизационная ПЦР на основе отечественной аппаратуры и тест-систем. // Здравоохранение и медицинская техника, 2005; 2: 10.

2. Боринская С.А., Ребриков Д.В., Нефедова В.В., Кофиади H.A., Соколова М.В., Колчина Е.В., Куликова Е.А., Чернышов В.Н., Куцее С.И., Полонников A.B., Иванов В.П., Козлов А.И., Янковский Н.К. Молекулярная диагностика и распространенность первичной гиполактазии в популяциях России и сопредельных стран. // Молекулярная биология. 2006; 40(5): 1-6.

3. Кофиади H.A., Ребриков Д.В. Методы детекции однонуклеотидных полиморфизмов: аллель-специфичная ПНР и гибридизация с олигонуклеотидной пробой. //Генетика. 2006; 42(1): 22-32.

4. Кофиади H.A., Ребриков Д.В., Трофимов Д.Ю., Алексеев Л.П., Хаитов P.M. Распределение аллелей генов CCR5, CCR2, и SDF1, ассоциированных с устойчивостью к ВИЧ-инфекции в российских популяциях. // Доклады Академии Наук. 2007; 415(6): 320-3.

5. Черноусое А.Д., Петрова Т.В., Пичугина JI.B., Литвина М.М., Донецкова АД., Кофиади И.А., Ребриков Д.В., Апарин П.Г. Посттерапевтическая клеточная латентность ВИЧ у пациента с исходной развернутой картиной СПИДа. // Иммунология. 2007; 6: 327-331.

Материалы отечественных и международных конференций:

6. Кофиади H.A. Частоты связанных с тромбофилией аллелей генов F5, F2 и MTHFR у представителей евразийской этнической группы, проживающих на территории России и Беларуси. // Материалы XVIII зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». 2006; С. 14.

7. Kofiadi I., Trofimov D., Gudima G., Alexeev L. Genetic susceptibility to HIV-infection in 4 populations from Russia. //16 European Congress of Immunology. Book of abstracts. 2006; P. 129.

8. Ребриков Д.В., Кофиади И.А., Алексеев Л.П., Хаитов P.M. Полиморфизм генов CCR5, CCR2, и SDF1, ассоциированных с устойчивостью к ВИЧ-инфекции среди этнических групп проживающих на территории России и сопредельных государств. // Медицинская иммунология. 2007; 9(2-3): 309.

9. Kofiadi I.A., Trofimov D. Yu., Rebrikov D. V. Genetic susceptibility to HIV-1 infection in Russian populations. // The official journal of the European Federation for Immunogenetics. 2007; P. 430.