Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Генетическая нестабильность и аллельный полиморфизм у больных с дисплазиями и раком шейки матки, вызванными персистенцией ДНК вируса папилломы человека

На правах рукописи

Биджиева Белла Азановна

Генетическая нестабильность и аллельный полиморфизм у больных с дисплазиями и раком шейки матки, вызванными персистенцией ДНК вируса папилломы человека

(14.00.14 - онкология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва, 2008

003450948

Работа выполнена в лаборатории иммунологии онкогенных вирусов (руководитель - доктор биологических наук H.H. Мазуренко) НИИ канцерогенеза ГУ Российского онкологического научного центра имени H.H. Блохина Российской Академии Медицинских Наук.

Научный руководитель:

доктор биологических наук H.H. Мазуренко

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор В.Э. Гурцевич

доктор биологических наук Э.А. Брага

Ведущая организация: Московский онкологический институт им. П.А. Герцена.

научно-исследовательскии

Защита состоится « » ИОс С 6 2QoJг. в__ часов на

заседании Диссертационного совета при ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН, у Г

Автореферат разослан « 7-5 » /s/У?//Ьо? 20Qjr.

Ученый секретарь Диссертационного совета ГУ РОНЦ / им. H.H. Блохина РАМН, - 7

доктор медицинских наук, профессор

Ю.В. Шишкин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1. Актуальность проблемы.

Рак шейки матки (РШМ) занимает третье место в мире по заболеваемости (500 тыс./год) и смертности (233 тыс./год) женщин от онкологических заболеваний [Parkin et al., 2006]. Несмотря на успехи в изучении механизмов канцерогенеза и усилия по разработке методов ранней диагностики и профилактики, РШМ остается одной из важнейших проблем современной онкологии. Основополагающий вклад в решение проблемы РШМ внесли труды проф. X. Цур Хаузена и его коллег [1974, 1983, 1996], открывших вирусы папиллом человека (HPV) и доказавших, что HPV высокого риска, в первую очередь HPV 16 и 18 типа, являются этиологическим фактором развития дисплазий (CIN I-III, cervical intraepithelial neoplasia) и рака шейки матки

Инфекция HPV достаточно широко распространена и у подавляющего большинства женщин проходит транзиторно. Однако у части инфицированных женщин возникают дисплазии шейки матки, которые чаще всего регрессируют и лишь 1% легких дисплазий переходит в рак. Персистенция вируса с длительной активной экспрессией вирусных онкогенов инициирует многостадийный процесс, в результате которого клетки эпителия шейки матки приобретают генетические и эпигенетические нарушения, способствующие опухолевой прогрессии. Эти нарушения затрагивают гены, контролирующие иммунный ответ, регуляцию клеточного цикла, апоптоз. В связи с этим особое значение приобретает изучение ранних генетических изменений с целью выявления маркеров, позволяющих прогнозировать развитие дисплазий. Метод анализа потери гетерозиготности (LOH, loss of heterozygosity) -распространенный способ выявления участков хромосом, повреждаемых в процессе канцерогенеза. Наиболее высокая частота LOH в дисплазиях и РШМ была показана для хромосом 3,4, 6 и 11 [Kisseljov et al., 1996; Rader et al., 1998; Kersemaekers et al., 1999; Mazurenko et al., 1999; Chatteijee et al., 2001; Мазуренко с соавт., 2003; Braga et al., 2003]. При этом отдельный интерес вызывает короткое плечо хромосомы 6, где располагаются гены главного комплекса гистосовместимости (HLA).

Гистологическая верификация серийных срезов диагностических или операционных биопсий позволяет изучать множественность фокусов патологически измененного эпителия шейки матки у больных CIN и РШМ. Подробный молекулярный анализ всех фокусов дисплазий различной степени тяжести и/или РШМ у больных с использованием микродиссекционной техники делает возможным выявление генетической и вирусной гетерогенности неоплазий.

Особенности иммунной системы организма хозяина, способствующие выживанию HPV-инфицированных, а также неопластических клеток эпителия шейки матки, могут влиять на развитие РШМ. Активная роль иммунной системы в канцерогенезе РШМ подтверждается тем, что больные с иммуносупрессивными состояниями, в частности, ВИЧ инфицированные, часто имеют HPV-ассоциированные дисплазии и рак шейки матки. Поскольку гены, отвечающие за иммунный ответ (гены HLA, цитокинов) являются высокополиморфными, представлялось актуальным изучить генетический полиморфизм этих генов у больных с дисплазиями и РШМ.

2. Цели и задачи исследования.

Целью данного исследования является сравнительное изучение генетической нестабильности и аллельного полиморфизма в районе генов HLA III класса (6р21.3), а также в промоторных областях генов цитокинов при дисплазиях и раке шейки матки, связанных с персистенцией ДНК HPV.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1) создание банка препаратов ДНК, полученных из всех доступных фокусов патологически измененного и нормального эпителия, а также стромы методом множественной микродиссекции биопсий больных дисплазиями и РШМ; i -

2) определение типа вируса папилломы человека в образцах ДНК из каждого фокуса патологически измененной ткани;

3) исследование потери гетерозиготности в локусе 6р21.3, содержащем микросателлитные маркеры D6S273, TNFa и D6S291 в образцах ДНК дисплазий и РШМ;

4) выявление возможной ассоциации аллелей и генотипов микросателлитных маркеров D6S273, TNFa и содержащих функциональные однонуклеотидные замены последовательностей в промоторной области генов цитокинов TNFa, IL-10 и IL-6 с развитием дисплазий и РШМ.

3. Научная новизна.

Впервые проведен детальный анализ препаратов ДНК, выделенных из каждого фокуса патологически измененной и нормальной ткани шейки матки от больных с дисплазиями (CIN I-III). Показана высокая частота аллельных делеций в области генов HLA класса III в локусах D6S273 и TNFa (33,3%-42,9%) в легких дисплазиях CINI. Постепенное увеличение частоты потери гетерозиготности при прогрессии CIN II в РШМ с маркером D6S291 указывает на то, что LOH в локусе D6S291 может служить маркером плохого прогноза дисплазий. Сопоставление данных типирования HPV и анализа потери гетерозиготности во всех фокусах

патологически измененной ткани выявило случаи независимых клонов дисплазий и РШМ.

Впервые проведено исследование полиморфизма микросателлитных маркеров D6S273 и TNFa и точечных полиморфизмов в промоторах генов цитокинов TNFa, IL-10 и IL-6 у женщин больных дисплазиями и РШМ. Выявлены аллели и генотипы, ассоциированные как с низким, так и с повышенным риском развития дисплазий и РШМ.

4. Научно-практическая значимость работы.

Данное исследование имеет теоретическое значение. Показано, что прогрессия дисплазий в рак сопровождается накоплением аллельных делеций, что создает возможности для выявления прогностических маркеров развития РШМ. Таким маркером прогрессии дисплазий может быть потеря гетерозиготности в локусе D6S291. Изучение функционального полиморфизма в промоторных областях генов цитокинов TNFa, IL-10 и IL-6 позволяет предполагать роль и степень их вовлеченности в противовирусный и противоопухолевый иммунный ответ.

5. Апробация работы.

Диссертационная работа была апробирована 17 сентября 2008 года на совместной конференции лабораторий иммунологии онкогенных вирусов, молекулярной биологии вирусов, регуляции клеточных и вирусных онкогенов и вирусного канцерогенеза НИИ канцерогенеза ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН. Материалы диссертации были представлены на отечественных и международных конференциях. По теме диссертации опубликовано тринадцать печатных работ.

6. Структура и объем работы.

Диссертация состоит из следующих частей: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы, библиографии и приложения. Материалы диссертации изложены на 132 страницах машинописного текста, включая 23 таблицы, 15 рисунков и список литературы (201 ссылка на работы отечественных и зарубежных авторов).

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Обзор литературы.

Обзор литературы посвящен молекулярно-генетическим аспектам развития рака шейки матки. Описана эпидемиология и этиология дисплазий и рака шейки матки. Подробно описана структура HPV и

функции вирусных онкогенов. Рассматриваются такие аспекты патогенеза РШМ, как генетическая нестабильность и особенности иммунного контроля. Описано явление естественного генетического полиморфизма и его вклад в развитие заболеваний различного генеза, в том числе и РШМ.

2. Материалы и методы.

Исследование генетической нестабильности проведено на препаратах ДНК, полученных с помощью микродиссекции парафиновых срезов диагностических или операционных биопсий от 61 больной дисплазиями и плоскоклеточным раком шейки матки, проходивших лечение в 19982004гг. в отделении гинекологии ФГУ ЦКБ УДПРФ (руководитель д.м.н. Савинова Е.Б). Гистологическая верификация архивных образцов биопсий была проведена доктором Д.Ю. Песковым в отделении патологической анатомии ФГУ ЦКБ УДПРФ (зав. отделением проф. Ю.П. Трибунов). В работе также были использованы образцы микродиссекционной ДНК от 38 больных дисплазиями и РШМ, полученные ранее в группе д.б.н. Н.Н. Мазуренко. Для изучения аллельного полиморфизма дополнительно были использованы образцы тотальной ДНК из нормальной ткани 58 больных РШМ, любезно предоставленные лабораторией молекулярной биологии вирусов ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН (руководитель проф. Ф.Л. Киселев). В качестве контрольных препаратов были использованы образцы ДНК из лейкоцитов цельной крови от 148 женщин без каких-либо онкологических и аутоиммунных заболеваний в анамнезе, любезно предоставленные к.м.н. Т.Ф. Маливановой.

В работе были использованы следующие методы: микродиссекция участков клеток с парафиновых срезов; выделение ДНК с использованием протеиназы К; типирование вирусов папиллом HPV16 и HPV18 типов; полимеразная цепная реакция (ПЦР); аллель специфическая ПЦР (PCR-SSP methodology); анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (PCR-RFLP methodology); электрофорез в 2% агарозном геле, высоковольтный электрофорез в денатурирующем 6% полиакриламидном геле (ПААГ); блот-гибридизация с радиактивно-меченным олигонуклеотидным зондом; серебрение продуктов ПЦР в ПААГ. Статистическая обработка данных проводилась при помощи точного критерия Фишера и критерия хи-квадрат. Оценку отношения шансов (ОШ) и 95% доверительный интервал (95% ДИ) вычисляли по методу Woolf.

3. Результаты и обсуждение.

Характеристика клинических материалов.

Нами была произведена множественная микродиссекция депарафинизированных срезов со 107 парафиновых блоков с диагностическими и/или послеоперационными биопсиями, в результате которой было получено 293 пробы ДНК из всех доступных участков патологически измененного эпителия шейки матки от 31 одной больной CIN I-III и 30 больных с РШМ стадии I-IV.

Распределение больных по стадиям было следующим: у 5 женщин была диагностирована CIN I (16,1%), у 20 женщин - CIN II (14,5%) и у 6 женщин (19,4%) была диагностирована стадия CIN III, в которую входят тяжелые дисплазии и CIS (carcinoma in situ). Среди 30 женщин оперированных по поводу РШМ, стадия I была диагностирована в 66,7% случаев (20/30) и 10 женщин имели РШМ стадии I-IV. Согласно классификации FIGO РШМ I стадии разделяют на микрокарциномы (стадия Ial), РШМ 1а2 и Ib в соответствии с гистологическими данными о глубине инвазии и протяженности опухоли. У 14 из 31 женщин с диагнозом дисплазия шейки матки при микродиссекции выявлено несколько фокусов дисплазий различной степени тяжести. Из 30 больных РШМ у 8, преимущественно I стадии, наряду с фокусами рака были выявлены фокусы сопутствующих дисплазий различной степени тяжести. Использование техники микродиссекции позволило минимизировать контаминацию при выделении ДНК, а также дало возможность оценить гетерогенность дисплазий и рака.

Определение и титрование вирусов папиллом в клинических материалах.

Во всех полученных нами образцах ДНК из фокусов дисплазий и рака шейки матки, а также нормального эпителия мы определяли тип HPV. Для этого была проведена ПЦР с типоспецифическими праймерами к гену Е6 двух наиболее распространенных среди европейской популяции типов HPV высокого риска, а именно HPV 16 и HPV 18. Последовательности и положения праймеров приведены в Табл.1.

Таблица 1.

Ха рактеристика типоспецифических праймеров к HPV 16 и 18.

Тип вируса Последовательность праймеров (5'-3') Положение OPC Размер продукта п.о.

HPV 16 ТСА AAA GCC ACT GTG TTC TG CGT GTT CTT GAT GAT CTG CA 421-440 521-540 E6 120

HPV 18 GAC АСА TTG GAA AAA СТА AC TAG TGC CCA GCT ATG TTG TG 365-385 485-505 E6 140

Примеры определения HPV 16 и 18 типа приведены на рис. 1.

Рис. 1. Выявление продуктов амплификации образцов ДНК с типоспецифическими праймерами к Е6 HPV 16 (А) и к Еб HPV 18 (Б). В качестве положительного и отрицательного контроля использовали ДНК из клеточной линии рака шейки матки SiHa, содержащей геном HPV16 типа и ДНК из клеточной линии Р111М HeLa, содержащей геном HPV18 типа и воду (К-). М - маркеры молекулярного веса. Обозначения: S -строма, N - нормальный эпителий, Са„ - РШМ, Dm/n -дисплазия шейки матки, где т - стадия заболевания и п - номер фокуса. Слева указан размер амплифицированного продукта, справа - размеры маркеров молекулярного веса.

Результаты типирования вирусов папиллом у больных дисплазиями и раком шейки матки отображены на рис.2.

Последовательности Е6 HPV 16 типа обнаружены в 18 (60%), а HPV 18 в 7 (23,3%) случаев РШМ. В 5 случаях наряду с HPV 16 типа обнаруживался другой тип вируса, в частности, HPV 18. В дисплазиях HPV 16 был обнаружен в 24 случаях (74%), а HPV 18 - в 4 случаях (13%).

А)

CIN I-III

HPV16+HPV18; 3,2%

Б)

HPV16+HPV18; 10,0%

РШМ

i HPVlö+др. тип; 6,7%

Рис. 2. Распространенность вируса папиллом человека в исследованных образцах CIN I-III (А) и РШМ (Б).

Таким образом, суммарное распространение HPV 16 и HPV 18 типов составляет 90,3% в CIN I-III и 83,3% в РШМ. Поскольку почти всегда в опухолевых клетках шейки матки обнаруживаются последовательности HPV высокого риска, мы предполагаем, что некоторое количество HPV 16 и 18 негативных случаев содержали HPV другого типа.

Изучение ранних генетических изменений в прогрессии рака шейки матки.

Предпосылкой данного фрагмента работы явились исследования по изучению генетических нарушений, выявляемых в микродиссецированных препаратах рака и сопутствующих дисплазиях шейки матки в локусах на коротком плече хромосомы 6, для которых был показан высокий процент ЬОН в районе 6р22-21.3, содержащем гены основного комплекса гистосовместимости (НЬА) [Мазуренко с соавт., 2003; 2006]. В связи с этим представлялось важным провести поиск ранних генетических изменений в неопластических клетках шейки матки у больных с диагнозом С1Ш-3 и РШМ I в локусе НЬА с микросателлитными маркерами 068273, Т№а и 068291, располагающимися внутри или вблизи генов ЬубйбО, ШРа и Р№РЬА-1, соответственно. Выявление потери гетерозиготности в препаратах ДНК из всех доступных фокусов патологически шмененной ткани шейки матки проводилось посредством ПЦР с праймерами к маркёрам 068273, ТОТа и 068291 содержащим повторы (СА)П (Табл.2).

Таблица 2.

Маркёр Локус Последовательность праймеров (5' - 3') MgCl2 (мМ) т°с отжига Размер продукта п.о.

D6S273 6р2133 GCAACrnTCTOTCAATCCA АСС AAA СГГ САА АТГТГС GG 2 55 128 -140

D6S291 6р2131 CTCAGA GGA TGC CATGTC ТААААА GGG GAT GAC GAATTA TTC ACT AAC Т 4 51 198-210

TNFa 6q2133 GCACTCCAGCCTAGGCCACAGA-IRl ССГСГС ТСС CCTGCA ACACAC A-R4 CACAGGAAGCCTTTAAAGGICGIC-1R3 1 60 97-121

Продукты амплификации разделяли в 6% ПААГ с последующей визуализацией серебрением (ТОТа и 068291) или гибридизацией с [у-32Р] меченым олигонуклеотидом (СА)^. Примеры таких экспериментов показаны на рис. 3.

№ 25 № 24 Б Э, Б О,

№55

8 Ом 02п $ В2/з 02/4 8 Бзл 03/2 Са

\\ \\ м

№24 №259 N N Са

068291

TNFa

№ 29 № 30 8 Э3 N Т>г Б3

Рис. 3 Результаты исследования потери гетерозиготности в образцах рака и дисплазий шейки матки с использованием микросателлитных маркеров 068273, 068291 и ТИРа. Сверху указаны номера случаев, буквенные обозначения как на рис.1. Пунктиром и черными стрелками обозначены случаи аллельных делеций.

Потеря гетерозиготности (аллельная делеция) регистрируется как полное или частичное (не менее 50%) отсутствие одного из аллелей в треке, соответствующем ДНК из патологической ткани, по сравнению с

треком ДНК из нормальной ткани, где сохраняются оба аллеля. При сохранении гетерозиготности в препаратах нормальной и опухолевой ДНК присутствуют оба полиморфных аллеля, как в случаях №25 и №30 на Рис.3. В случае гомозиготных аллелей выявляется лишь одна полоса, соответствующая двум аллелям одного размера (проба № 259 на Рис. 3). Такие пробы признаются неинформативными, поскольку делению одного из аллелей обнаружить невозможно.

Суммарные результаты анализа LOH по маркерам D6S273, TNFa и D6S291 в дисплазиях без РШМ (самостоятельных), РШМ стадии I и в дисплазиях, сопутствующих раку представлены в Табл. 3.

Таблица 3.

Анализ потери гетерозиготности на хромосоме 6 в CIN I-III, в РШМ и

сопутствующих дисплазиях.

Маркер Локус LOH, % (количество случаев LOH / количество инфо рмативных случаев)

CIN I-III РШМ стадии I CIN, сопутствующие РШМ

D6S273 602133 33,3 (13/39) 51,0(26/50) 53,8 (14/26)

TNFa 6р2133 22,6 (7/31)* 54,8 (23/42) 47,6(10/21)

D6S291 602131 20,8 (5/24) 51,0 (26/50) ** 69,2 (18/26)***

'* достоверное увеличение частоты случаев ЬОН в РШМ I стадии, по сравнению с дисплазиями (р=0.007);

** достоверное увеличение частоты случаев LOH в РШМ по сравнению с самостоятельными дисплазиями ф=0,023);

*** достоверное увеличение частоты случаев LOH в сопутствующих дисплазиях, по сравнению с самостоятельными дисплазиями (р=0,0008).

Частота LOH в РШМ стадии I с тремя исследованными маркерами оказалась довольно высокой (более 50%). Суммарные данные анализа LOH в CINI-III варьируют от 20,8-33,3%. Частота LOH в РШМ I стадии достоверно выше, чем в дисплазиях по маркеру TNFa (р=0,007) и D6S291 (р=0,023). Интересно отметить, что в сопутствующих РШМ дисплазиях частота LOH с маркерами D6S273 и D6S2916bma даже выше, чем в раке. При анализе нарушений в локусах, содержащих маркеры TNFa и D6S273, была отмечена синхронность появления LOH в большинстве случаев РШМ, из чего можно предположить, что аллельная делеция на поздней стадии заболевания охватывает оба маркера.

Опираясь на данные, от том что аллельные делении накапливаются в ходе прогрессии заболевания [Larson et al., 1997], мы провели сравнительный анализ потери гетерозиготности с маркерами D6S273,

068291 и Т№а для каждой стадии, предшествующей раку шейки матки. Полученные данные представлены в виде линейных графиков на рис. 4.

Б68273 Т№а

стадии стадии

D6S291

стадии

Рис.4. Кривая изменения частоты потери гетерозиготности при прогрессии рака шейки матки с маркером D6S273, D6S291 и TNFa.

Динамика появления аллельных делеций сходна для маркеров D6S273 и TNFa. Высокий процент потерь наблюдался у пациентов с диагнозом CIN I (42,9% и 33,3% соответственно). Однако у женщин с CIN II-III частота LOH по этим маркерам несколько снижалась, что может отражать регрессию заболевания на ранних стадиях, связанных с иммунным контролем. Иной характер имеет картина изменения частоты LOH по маркеру D6S291: аллельные делеции не выявляются на стадии CIN I (0%), однако накапливаются при прогрессии дисплазий CIN II-III, достигая максимального значения у пациенток с диагнозом РШМI стадии.

Таким образом, генетическая нестабильность в локусе 6р21.3 характерна уже для ранних дисплазий, а нарушения в локусе D6S291, могут служить маркером плохого прогноза для развития дисплазии в РШМ.

Изучение генетической гетерогенности дисплазий и рака шейки матки.

Как известно, моноклональность предполагает развитие опухоли из единого предшественника. Множественность вирусной инфекции допускает образование одновременно ряда фокусов патологически измененной ткани. Представлялось важным выяснить, все ли они моноклональны. Суммарный анализ молекулярно-генетических данных по типированию HPV и анализу потери гетерозиготности позволил выявить гетерогенную природу развития различных фокусов дисплазий и РШМ от одной больной.

Таблица 4.

Гетерогенность дисплазий и РШМ по типу вируса и анализу потери

гетерозиготности.

№ Гистологическая характеристика HPV тип LOH гетерогенность

D6S273 TNFa D6S291

7 СШ1 16+ о о -

СШ1 16+ о о о

СШI 18+ © о -

сшп 18+ в о -

43 СА 16+ Hm Hm о

СА 18+ Hm Hm в

48 СА 18+ Hm Hm —

СА 16+ Hm Hm —

СА 16+ Hm Hm О

СА 16+ Hm Hm о

СА 16+ Hm Hm о

54 С1Ш 16- 0 0 в

СШ I 16+ 0 0 в

сшш 16+ 0 о О

СМ111 16+ 0 0 о

сшш 16+ о 0 о

СА 16+ 0 о в

СА 16+ о о о

61 СШП 18+ о - в

СШШ 18+ О - в

сшш 16-18- в в -

СА 16+ в в -

В Табл. 4 приведены 4 случая с диагнозом РШМ и один случай с диагнозом CIN II, где мы наблюдали смешанную инфекцию в разных микродиссецированных фокусах При этом для всех случаев приведены данные LOH по трем исследованным маркерам.

У больной с диагнозом CIN II (№7) обнаружено два клона клеток дисплазий, содержащих разные типы HPV и отличающихся по потери гетерозиготности с маркером D6S273. Случай РШМ под №43 явно имеет мультифокальность, вызванную вирусной инфекцией: в одном из фокусов рака с HPV 18 типа имеется LOH по маркеру D6S291, тогда как фокус, где был типирован HPV 16 потери гетерозиготности не выявил. Два случая РШМ имели помимо фокусов рака сопутствующие дисплазии, которые имели другой тип вируса и лишь в одном случае (№61) нам удалось достоверно подтвердить гетерогенность патологически измененных фокусов клеток с помощью метода LOH.

Изучение микросателлитного полиморфизма в области генов HLA III класса.

Как показало проведенное исследование, развитие РШМ не всегда сопровождается аллельными делециями в зоне HLA. Одним из малоизученных является вопрос о генетической предрасположенности к развитию РШМ, в частности, обусловленный полиморфизмом генов HLA. Мы исследовали распределение аллельных вариантов микросателлитов D6S273 и TNFa, находящихся в одной группе сцепления с генами HLA II класса. Для данного исследования важно, чтобы исследуемые группы были этнически однородными, т.к. было показано, что распределение частот аллелей этих маркеров в разных этнических группах различается [Турецкая, 2001]. Поэтому в исследуемые группы больных и здоровых доноров вошли женщины, относящиеся к восточно-славянской группе. Пример исследования полиморфизма длин аллелей маркеров D6S273 и TNFa представлен на рис. 5.

Полиморфизм маркера D6S273 изучен в основном при аутоиммунных заболеваниях. Данный аллельный полиморфизм был исследован в препаратах ДНК от 93 женщин с РШМ, 40 женщин с CIN I-III и 59 женщин контрольной группы. Данные по частоте распространения аллелей маркера D6S273 представлены на рис.6.

Нами впервые описано распределение аллельных вариантов маркера D6S273 для российской популяции: выявлены семь аллелей (128 п.о. - 140 п.о.). При сравнении распределения аллелей D6S273 в контрольной группе и группах больных РШМ и CIN достоверных различий не выявлено.

Аллели -13 (121п.о.) -12 (119п.о.) -11 (117п.о.) . 10(115п.о.)

■ 9 (113п.о.)

- 8 (llln.o.)

- 7 (109п.о.)

■ 6 (107п.о.)

- 5 (105п.о.)

- 4 (ЮЗп.о.)

■ 3 (101п.о.)

- 2 Г99п.оЛ

- 1 (97п.о.)

Б) D6S273

1 2 3 4 5 6 7 8

6 6 5 - 5 5 6 5 4 4 5 - 2 5 6 2

Аллели _ 140 п.о. -138 и.о. —136 и.о. -134 п.о. ~ 132 и.о. Z130 п.о. 128 п.о.

Рис.11. Пример аллелотипирования микросателлитых маркеров TNFa (А) и D6S273 (Б) в образцах ДНК больных РШМ. Разделение ПЦР продуктов в 6% ПААГ и визуализация серебрением.

и

ш > ¡1 ш

а2

аЗ

а4

а5

аб

а7

□ Контр, группа И CIN 1-Ш ■ РШМ I-IV

Рис. 6. Распределение аллелей D6S273 в контрольной группе, у больных РШМ и CIN.

Результаты анализа полиморфизма микросателлитного маркера TNFa у 107 женщин с РШМ, 43 женщины с CIN и 139 женщин контрольной группы представлены на рис.7.

al а2 аЗ а4 а5 аб а7 а8 а9 alO all а12 а13

□ Komp. группа И CIN I-Ш ■ РШМ I-IV

Рис. 7. Распределение аллелей TNFa в контрольной группе, у больных РШМ и CIN. * - достоверное снижение частоты встречаемости аллеля 7 TNFa в РШМ по сравнению с CIN.

При рассмотрении распределения аллелей маркера TNFa наблюдалась более высокая частота встречаемости аллелей 6 и 11 у больных РШМ, чем у больных CIN и женщин контрольной группы, хотя эти отличия и оказались статистически не значимы. Однако получены статистически значимые различия в частоте встречаемости аллеля 7 TNFa у больных CIN, чем у больных РШМ. Учитывая тот факт, что далеко не все дисплазии прогрессируют в рак шейки матки, можно предполагать протективный характер аллеля 7 TNFa для больных CIN.

Изучение точечных полиморфизмов, связанных с продукцией иитокинов.

К настоящему времени накоплено большое количество данных о связи функциональных точечных полиморфизмов в генах различных цитокинов с развитием злокачественных новообразований. Механизм такого влияния понятен больше, чем в случае с микросателлитными полиморфизмами. Для многих из точечных полиморфизмов стали известны транскрипционные факторы, уровень активации которых напрямую зависит от генетически детерминированной последовательности

промоторов генов цитокинов. Поскольку все цитокины взаимосвязаны и формируют так называемую иммунорегуляторную сеть, наличие индивидуального, генетически обусловленного профиля цитокинов, его особенности и нарушения могут способствовать развитию заболеваний различного генеза. Целью данного этапа работы было исследование точечного полиморфизма в промоторах генов TNFa, IL-10 и IL-б у здоровых женщин, больных CIN и РШМ, относящихся к восточнославянской национальной группе.

Анализ точечного полиморфизма проводили двумя принципиально разными способами. Для изучения полиморфизма (-308G/A)77VFa и (-174C/G)/I-<5 в промоторах генов, кодирующих провоспалительные цитокины TNFa и IL-6 был использован метод аллель специфической ПЦР, заключающейся в проведении двух параллельных амплификаций ДНК с двумя отличающимися на один нуклеотид прямыми праймерами. Изучение точечного полиморфизма (-1082G/A) в промоторе гена противовоспалительного цитокина IL-10 проводилось путем анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (Табл.5).

Таблица 5.

Характеристика праймеров для анализа точечных полиморс ШЗМОВ.

Маркер Последовательность праймеров (5' - 3') MgCI2 (MM) T°C отжига Размер продукта, по.

(-308G/A) TNFa ATA GGT ТТТ GAG GGG CAT GG AAT AGG TTT TGA GGG GCA TGA TCT CGG TTT OTT CTC CAT CG 1 MM 59 186

(-174C/G) IL-6 CCC TAG TTG TGT CTT GCG CCC TAG TTG TGT CTT GCA TGG AAA GCC CCT GTT TCA TA 1,5 MM 54 230

(-1082G/A) IL-10 TCT TAC СТА ТСС СТА CTT СС CTC GCC GCA ACC CAA CTG GC 1,5 MM 58 136

Полиморфизм в промоторе гена TNFa. Одним из функционально значимых точечных полиморфизмов является замена нуклеотида G на А в промоторной области в -308 положении от начала транскрипции гена TNFolK?lk было показано, данная замена усиливает экспрессию гена TNFa в несколько раз [Wilson et al., 1997]. Так, выделяют высоко - (АА), средне-(GA) и низко- (GG) секретирующие генотипы.

Мы провели исследование полиморфизма (-308G/A)TNFa у 102 больных РШМ, 39 женщин с CIN и у 139 женщин контрольной группы. Пример исследования полиморфизма (-308G/A)TNFa представлен на рис.8.

аллель А

аллель G

1 2 3 4 5 К- М

§щт

я

¡Mlli

200 п.о. 100 п.о.

Рис.8. Пример аллелотипирования (-308G/A)TNFa в ДНК из крови доноров и ДНК больных CIN и РШМ, полученной при микродиссекции биопсий. Образцы: 1-AG, 2-GG, 3-АА (контрольные образцы). 4-GG (CIN III), 5-GG (РШМ). К -отрицательный контроль, М - маркер.

Таблица 6.

Распределение частоты генотипов и аллелей (-308G/A)TNFa в группе

Аллели Контрольная группа (п=278) CIN (п=78) РШМ (п=204)

G 243 (87,2%) 58 (74,4%) 166(81,4%)

А 35 (12,8%) 20 (25,6%)* 38 (18,6%)

Генотипы Контрольная группа (п=139) CIN (п=39) РШМ (п=102)

GG 108 (77,7%) 22 (56,4%)** 70 (68,6%)

GA 28 (20,1%) 14 (35,9%)*** 26 (25,5%)

АА 3 (2,2%) 3 (7,7%) 6 (5,9%)

* - достоверно более высокая частота встречаемости аллеля А в группе больных CIN по сравнению с контрольной группой (р = 0,007, 0111=2,31, 95% ДИ 1,23-4,34);

** - достоверно более низкая частота встречаемости генотипа GG в группе больных CIN по сравнению с контрольной группой (р=0,008, ОШ=0,37, 95% ДИ 0,17-0,79);

*** - достоверно более высокая частота встречаемости генотипа AG в группе больных CIN по сравнению с контрольной группой (р=0,041, ОШ=2,22, 95% 1,024,84).

При сравнении женщин контрольной группы с больными РШМ (Табл.6) было отмечено снижение частоты встречаемости GG генотипа, ассоциированного с низким уровнем транскрипции гена TNFa с 77,7% до 68,6% и, соответственно, повышение встречаемости AG и АА средне- и высоко секретирующих генотипов, хотя эти различия оказались не достоверны. Однако нами выявлено статистически значимое снижение частоты встречаемости низко секреторного генотипа GG в группе больных дисплазиями (56,4%) по сравнению с контрольной группой (77,7%), что может говорить о некотором протективном эффекте данного генотипа для его носителей.

С другой стороны частота встречаемости генотипа AG оказалась достоверно выше в группе больных CIN, чем в группе здоровых женщин и составила 35,9% и 20,1% соответственно. Таким образом, вероятность развития дисплазий у носителей данного генотипа выше. Поскольку имело место достоверное повышение частоты встречаемости аллеля А с 12,8% до 25,6%, то очевидно наличие этого аллеля, ассоциированного с высоким уровнем экспрессии гена TNFa, является одним из факторов риска развития дисплазий.

Поскольку из 39 исследуемых случаев дисплазий, 26 были CINI-CIN И, которые регрессируют в высоком проценте случаев [Ostor et al., 1993], можно полагать, что генетически обусловленное повышенная экспрессия TNFa может способствовать усилению апоптоза диспластических клеток.

Полиморфизм в промоторе гена IL-10. Нами был исследован полиморфизм промоторной области гена IL-10 в положении -1082(G/A) от начала транскрипции. Точечная замена в этом сайте формирует 3 генотипа, ассоциированных с различным уровнем продукцией IL-10: GG (высоко-), AG (средне-) и АА (низко секреторный). Такой эффект связывают с различной степенью связывания транскрипционного фактора Ets [Rees et al., 2002]. Для выявления распределения аллелей и генотипов по данному полиморфизму были проанализированы 136 женщин контрольной группы, 42 больных CIN и 116 больных РШМ. Пример исследования полиморфизма (-I082G/A)IL-10 представлены на рис. 9.

Определение аллельных вариантов в -1082 положении промотора гена IL-10 проводили с использованием рестриктного анализа ферментом Mnll. Наличие нуклеотида G в -1082 положении промоторной области обнаруживали по наличию продуктов рестрикции размером 106п.о. и 30 п.о., а наличие аллеля А выявляли при сохранении размера ПЦР продукта в 136 п.о. Данные по распределению аллелей и генотипов по (-1082G/A)IL-10 представлены в Табл.7.

К- 123456 789 ЮМ

Рис 9. Пример аллелотипирования (-1082G/A)IL-10 в ДНК от больных CIN и РШМ, полученной при микродиссекции биопсий. Образцы: 1 - GG; 2 - AG (контрольные образцы); 3, 6, 8, 9-AG; 4, 5, 7, 10-АА, 5-GG (РШМ).

В результате исследования выявлено достоверное повышение частоты встречаемости низко секреторного генотипа АА с 29,4% до 41,4% у больных РШМ по сравнению со здоровыми донорами. Такие данные могут говорить о том, что у женщин с низко секреторным аллелем А, риск развития РШМ в полтора раза выше, чем у носительниц аллеля в.

Полученные результаты позволяют предполагать, что 1Ь-10 действует как опухолевый супрессор для клеток эпителия шейки матки и генетически обусловленный низкий уровень данного цитокина может прогнозировать неблагоприятный исход.

Таблица 7.

Распределение частоты генотипов и аллелей (-10820/А)И-10 в группе

больных CIN, РШМ и в контрольной группе.

Аллели Контрольная группа (п=272) CIN (п=84) РШМ (п=232)

G 124 (45,6%) 38 (45,2%) 82 (35,3%)

А 148 (54,4%) 46 (54,8%) 150 (64,7%)*

Генотипы Контрольная группа (п=136) CIN (п=42) РШМ (п=116)

GG 28 (20,6%) 6 (14,3%) 14(12,1%)

GA 68 (50,0%) 26 (61,9%) 54 (46,6%)

АА 40 (29,4%) 10(23,8%) 48 (41,4%)*

* - достоверно более высокая частота встречаемости аллеля А в группе больных РШМ по сравнению с контрольной группой (р = 0,02, ОШ=1,53, 95% ДИ 1,07-2,2); ** - достоверно более высокая частота встречаемости генотипа АА в группе больных РШМ по сравнению с контрольной группой (р = 0,047, ОШ=1,69, 95% ДИ 1,003-2,86).

Полиморфизм в промоторе гена IL-6. Проведен анализ точечного полиморфизма промотор ной области гена IL-6 в положении -174 от начала транскрипции. Замена основания G на С ассоциирована со сниженной продукцией IL-6 [Fishman et al., 1998]. Полиморфизм (-174C/GJIL-6 при раке шейки матки был изучен лишь в одной работе, несмотря на его ключевую роль медиатора воспаления при гинекологических заболеваниях. Анализ полиморфизма (-174C/G)IL-6 исследовали в контрольной группе (139 женщин), в группе больных CIN и РШМ, состоящих из 42 и 111 женщин соответственно. Примеры исследования полиморфизма (-174G/QIL-6 представлены на рис. 10.

аллель С

аллель G

Рис. 15. Пример аллелотипирования (-174G/QIL-6 в образцах ДНК больных РШМ, полученных при микродиссекции биопсий. Образцы: 1-CG, 2-GG (положительный контроль), 4-CG, 5-CG, 3,6-ПЦР продукт отсутствовал.

Аллели, имеющие нуклеотид С или G в положении (-174) в промоторе гена IL-6 выявлялись в виде полос, соответствующих ПЦР -продукту размером 230 п.о., в геле в двух параллельных рядах.

Частота встречаемости генотипов GG и GC, ассоциированных с высокой экспрессией IL-6, и генотипа СС, ассоциированного с низкой экспрессией гена, а также аллелей G и С представлены в Табл.8. Наблюдаемая более высокая частота встречаемости генотипа GG в группах CIN (33,3%) и РШМ (34,2%), достоверно не отличалась от контрольной группы (26,6%). Выявлено повышение частоты встречаемости генотипа С С, ассоциированного с низкой экспрессией 1L-6, в группе больных РШМ по сравнению с группой больных дисплазиями с 11,9% до 22,5%, которое также оказалось недостоверным. Статистически значимые различия выявлены только с генотипом CG при сравнении групп больных РШМ и здоровых доноров, где частота встречаемости генотипа была 43,2% и 56,1% соответственно.

Таблица 8.

Распределение частоты генотипов и аллелей (-174G/QIL-6 в группе _ больных CIN, РШМ и в контрольной группе._

Аллели Контрольная группа (п=278) CIN (п=84) РШМ (п=222)

G 152 (54,7%) 51 (60,7%) 124 (55,9%)

С 126 (45,3%) 33 (39,3%) 98(44,1%)

Генотипы Контрольная группа (п=139) CIN (п=42) РШМ (п=111)

GG 37 (26,6%) 14 (33,3%) 38 (34,2%)

GC 78 (56,1%) 23 (54,8%) 48 (43,2%)*

СС 24 (17,3%) 5 (11,9%) 25 (22,5%)

* - достоверно более низкая частота встречаемости генотипа GC в группе больных РШМ по сравнению с контрольной группой (р = 0,043, 0ш=0,59, 95% ДИ 0,36-0,99).

Исходя из полученных данных, можно говорить, что риск развития РШМ у носителей генотипа CG (-174)Д-6 достоверно ниже. Также, учитывая провоспалительную активность IL-6, можно предполагать, что для большинства больных дисплазиями скорее характерна высокая секреция данного цитокина, которая может способствовать их регрессии.

Обобщая полученные результаты можно сказать, что:

- HPV 16 и HPV 18 являются основными типами, которые персистируют в диспластических и опухолевых клетках у больных с онкопатологией шейки матки, при этом различные фокусы патологически измененного эпителия шейки матки могут содержать свой тип HPV и прогрессировать по своему уникальному пути развития, формируя опухолевые клоны;

- генетическая нестабильность в локусе 6р21.3 характерна для дисплазий и рака шейки матки; D6S291 может служить прогностическим маркером для развития дисплазий шейки матки в РШМ;

- генетический полиморфизм генов цитокинов, регулирующих иммунный ответ организма, требует дальнейшего изучения, поскольку в определенной степени может быть ассоциирован с развитием дисплазий и рака шейки матки.

выводы

1. Анализ 293 образцов ДНК, полученных с помощью микродиссекции из фокусов патологически измененной ткани и нормального эпителия шейки матки от 61 больных CIN I-III и РШМ выявил преимущественное присутствие HPV 16 и 18 типов как у больных CIN I-III (90,3%), так и РШМ (83,3%). Показана смешанная инфекция и существование клонов опухолевых клеток с различными типами HPV.

2. Установлена сходная картина изменения частоты LOH в локусе HLA III класса (6р21.3) в образцах ДНК от больных CIN I-III и РШМ с маркерами D6S273 и TNFa: частота LOH выше на стадии CIN I, чем в CIN II и CIN III, что отражает процесс регрессии части дисплазий. Постепенное повышение частоты LOH с маркером D6S291 (6р21.31) при прогрессии CIN II в РШМ указывает на плохой прогноз развития дисплазий с нарушениями в этой области.

3. Впервые показано распределение аллельных вариантов маркера D6S273 у восточно-славянских женщин. Не обнаружено достоверных различий в частоте распределения аллелей D6S273 у больных CIN и РШМ по сравнению с донорами. Анализ полиморфизма маркера TNFa показал достоверно более низкую частоту встречаемости аллеля 7 у больных РШМ в сравнении с группой больных CIN I-III (р=0,027).

4. Показано, что функциональный полиморфизм в промоторах генов TNFa, 1L-10 и IL-6 может быть ассоциирован с развитием дисплазий и РШМ, поскольку при сравнении с контрольной группой:

а) у больных CIN повышена частота высоко секреторного аллеля (-308А) и снижена частота низко секреторного генотипа (-308GG) провоспалительного цитокина TNFa (р=0,007 и /?=0,008, соответственно);

б) у больных РШМ снижена частота низко секреторного генотипа (-174GC) провоспалительного цитокина IL-6 {р=0,043);

в) у больных РШМ повышена частота низко секреторного аллеля (-1082А) противовоспалительного цитокина IL-10 (р=0,02).

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Мазуренко Н.Н., Беляков И.С., Блиев А.Ю., Винокурова С.В., Биджиева Б.А. Молекулярные маркеры клональности и прогрессии рака шейки матки.// Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы, 2002,6 (1), 184.

2. Мазуренко Н.Н., Беляков И.С., Блиев А.Ю., Биджиева Б.А.. Винокурова С.В. Идентификация локусов хромосомы 6, вовлеченных в прогрессию рака шейки матки.// Сборник трудов «Технологии генодиагностики в практическое здравоохранение», Москва, 2002, 156-158.

3. Мазуренко Н.Н., Беляков И.С., Блиев А.Ю., Гуо Ж., Ху К., Винокурова С.В., Биджиева Б.А.. Павлова JI.C., Понтен Я., Киселев Ф.Л. Генетические изменения на хромосоме 6, ассоциированные с прогрессией рака шейки матки.// Молекулярная биология, 2003,38(3), 472-481.

4. Биджиева Б.А.. Блиев Ю.А., Песков Д.Ю., Снигур Н.В., Савинова Е.Б., Мазуренко Н.Н. Инфекция HPV и генетическая гетерогенность дисплазий и рака шейки матки.// Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы, 2004, 8(1), 56.

5. Мазуренко Н.Н., Блиев А.Ю., Биджиева Б.А.. Песков Д.С., Снигур Н.В., Савинова Е.Б., Киселев Ф.Л. Генетические изменения на хромосоме 6, ассоциированные с прогрессией рака шейки матки.// Молекулярная биология, 2006,40(3), 1-12.

6. Bidzhieva В.. Tsiganova I., Mazurenko N. Genetic polymorphism in the HLA class III region in CIN and cervical cancer patients from Russia.// FEBS-18,2006, Istanbul, Turkey, The FEBS Journal, 273, Suppl. 1, 315-316.

7. Биджиева Б .А.. Осташкин A.C., Снигур H.B., Савинова Е.Б., Мазуренко Н.Н. Полиморфизм в районе генов HLA III класса у больных с дисплазиями и раком шейки матки.// Материалы IV съезда онкологов и радиологов СНГ, 2006, Баку, Азербайджан, с. 38.

8. Bidzhieva В.. Tsiganova I., Mazurenko N. Genetic polymorphism within the Human Leukocyte Antigen class III region in patients with cervical intraepithelial neoplasia ans cervical cancer from Russia. Proceedings of the 19 Congress of EACR, 2006, Budapest, Hungary, p. 245.

9. Биджиева Б.А.. Снигур H.B., Песков Д.Ю., Савинова Е.Б., Мазуренко Н.Н. Особенности полиморфизма генов цигокинов у больных раком шейки матки.//Кремлевская медицина, 2007,14(3), 63-65.

10. Bidzhieva В.. Snigur N., Mazurenko N. Genetic polymorphisms of TNF- alpha and IL10 in Russian CIN and cervical cancer patients.// ECCO-14, 2007, Barcelona, Spain, European Journal of Cancer, Suppl. 5(4), p.316.

11. Биджиева Б.А.. Осташкин A.C., Мазуренко H.H. Особенности полиморфизма генов цитокинов у больных раком шейки матки.// Вопросы онкологии, 2007,53(1), 7.

12. Биджиева Б.А.. Осташкин A.C., Цыганова И.В., Снигур Н.В., Савинова Е.Б., Мазуренко H.H. Полиморфизм в локусе гена TNF-a у больных с дисплазиями и раком шейки матки.// Молекулярная медицина, 2008, 5(1), 45-50.

13. Bidzhieva В.. Snigur N., Mazurenko N. Genetic polymorphism in the promoters of IL-6 and IL-10 in CIN and cervical cancer patients.// EACR-20, 2008, Lyon, France, p. 176.

Подписано п печать. /] QQ 8 г- Формат 60x84/16. Тираж 100 экз. Заказ 67 А Отпечатано в службе множительной техники ГУ РОЩ РАМН им. H.H. Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш., 24

Рак шейки матки (РШМ) занимает третье место в мире по заболеваемости (500 тыс.жен./год) и смертности (233 тыс.жен./год) от онкологических заболеваний [Parkin et al., 2000; Мазуренко, 2003]. Несмотря на успехи в изучении механизмов канцерогенеза шейки матки и усилия по разработке методов ранней диагностики, РШМ остается одной из важнейших проблем современной онкологии. Известно, что вирусы папиллом человека (HPV) высокого риска, в первую очередь HPV 16 и 18 типов, являются наиболее значимыми факторами риска возникновения дисплазий различной степени тяжести (CIN I-III) и рака шейки матки. В подавляющем большинстве случаев инфекция HPV проходит транзиторно, однако примерно у одной десятой части инфицированных женщин возникают дисплазии шейки матки и лишь 1% легких дисплазий переходит в РШМ.

Персистенция вируса с длительной активной экспрессией вирусных онкобелков инициирует многостадийный процесс, в результате которого клетки эпителия шейки матки приобретают генетические и эпигенетические нарушения, способствующие опухолевой прогрессии. Эти нарушения могут затрагивать гены, ответственные за злокачественную трансформацию. В связи с этим особое значение приобретает изучение ранних генетических изменений с целью выявления маркеров, позволяющих прогнозировать развитие дисплазий. Метод анализа потери гетерозиготности (LOH, loss of heterozygosity) - это распространенный способ выявления участков хромосом, повреждающихся в процессе канцерогенеза. Наиболее высокая частота LOH была показана для хромосом 3, 4, 6 и 11 [Kisseljov et al., 1996; Larson et al., 1997; Wistuba et al., 1997; Rader et al., 1998; Evans et al., 1998; Kersemaekers et al., 1999; Mazurenko et al., 1999; Chatterjee et al., 2001; Мазуренко с соавт., 2003]. При этом отдельный интерес вызывает короткое плечо хромосомы 6, где располагаются гены главного комплекса гистосовместимости (HLA).

Гистологическая верификация послойных срезов операционного или биопсийного материала, выявляет множественность фокусов патологически измененного эпителия шейки матки в ряде случаев CIN и РШМ, Подробный молекулярный анализ всех таких фокусов дисплазий различной степени тяжести и/или РШМ у больных с использованием микродиссекционной техники, делает возможным выявление генетической и вирусной гетерогенности неоплазий.

Особенности иммунной системы организма хозяина, способствующие выживаемости HPV-инфицированных, а также неопластических клеток эпителия шейки матки, могут влиять на развитие РШМ. Активная роль иммунной системы в канцерогенезе РШМ подтверждается тем, что больные с иммуносупрессивными состояниями, в частности, ВИЧ инфицированные, часто имеют HPV-ассоциированные дисплазии и рак шейки матки [Tindle et al., 1994; BouwesBavinck et al., 1997; Frisch et al., 2000]. Поскольку гены, отвечающие за иммунный ответ (группа генов HLA, гены цитокинов) являются высокополиморфными, представлялось актуальным изучить генетический полиморфизм этих генов у больных с дисплазиями и РШМ.

Целью настоящей диссертационной работы является сравнительное изучение генетической нестабильности и генетического полиморфизма в локусе 6р21.3 хромосомы 6, а также в промоторных областях генов цитокинов при дисплазиях и раке шейки матки, связанных с персистенцией ДНК HPV.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1) создание банка препаратов ДНК, полученных из всех доступных фокусов патологически измененного и нормального эпителия, а также стромы методом множественной микродиссекции биопсий больных дисплазиями и раком шейки матки;

2) определение типа вируса папилломы человека в образцах ДНК из каждого фокуса патологически измененной ткани;

3) исследование потери гетерозиготности в локусе 6р21.3, содержащем микросателлитные маркеры D6S273, D6S291 и TNFa в образцах ДНК дисплазий и плоскоклеточного рака шейки матки;

4) выявление возможной ассоциации аллелей и генотипов микросателлитных маркеров D6S273, TNFa и содержащих функциональные однонуклеотидные замены последовательностей в промоторной области генов цитокинов TNFa, IL-10 и IL-6 с развитием дисплазий и РШМ.

Научная новизна. Впервые проведен детальный анализ препаратов ДНК, выделенных из каждого фокуса патологически измененной и нормальной ткани шейки матки от больных CIN I-III. При помощи метода потери гетерозиготности была показана высокая частота аллельных делеций в области генов HLA класса III в локусах D6S273 и TNFa (33,3%-42,9%) на стадии CIN I. Постепенное увеличение частоты потери гетерозиготности с маркером D6S291 при прогрессии CIN II в РШМ указывает на то, что LOH в локусе D6S291 может служить маркером плохого прогноза дисплазий.

Сопоставление данных типирования HPV и анализа потери гетерозиготности во всех фокусах патологически измененной ткани выявило случаи независимых клонов дисплазий и РШМ.

Впервые проведено исследование полиморфизма микросателлитных маркеров D6S273 и TNFa и точечных полиморфизмов в промоторах генов цитокинов TNFa, IL-10 и IL-6 у женщин больных дисплазиями и РШМ. Выявлены аллели и генотипы, ассоциированные как с низким, так и с повышенным риском развития дисплазий и РШМ.

Практическое значение исследования состоит в выявлении аллельных делеций, сопровождающих прогрессию дисплазий в рак, что создает возможности для выявления прогностических маркеров развития РШМ. Таким маркером прогрессии дисплазий может быть потеря гетерозиготности в локусе D6S291. Изучение функционального полиморфизма в промоторных областях генов цитокинов ТОТа, 1Ь-10 и 1Ь-6 позволяет предполагать роль и степень их вовлеченности в противовирусный и противоопухолевый иммунный ответ.

Рис. 9 Результаты исследования потери гетерозиготности в образцах рака и дисплазий шейки матки с использованием микросателлитных маркеров D6S273, D6S291 и TNFa . Сверху указаны номера случаев, буквенные обозначения: S - ДНК из стромы, N -пробы нормального эпителия, Са„ - ДИК из очагов РШМ, Dm<„ - ДНК из очагов дисплазий шейки матки, где т - стадия заболевания и п — номер фокуса. Пунктиром и черными стрелками обозначены случаи аллельных делеций. Детекция ПЦР продуктов методом гибридизации с радиоактивно-меченным зондом (9а) и методом серебрения (96, в).

MapicepD6S291) и № 210 (маркер TNFa). Утраченные аллели обозначены черными стрелками. Зачастую при визуализации ПЦР-продуктов в 6% ПААГе ниже исследуемого аллеля мы наблюдали небольшой фронт из сателлитных полос, уменьшающихся в длине с шагом в 2 нуклеотида. Это явление связывают с так называемым «недочитыванием» Taq-полимеразы.

Все данные по исследованию потери гетерозиготности с маркером D6S273 и маркером D6S291 представлены в Табл.8, где даны результаты анализа потери гетерозиготности по маркерам D6S273 и D6S291, полученные для каждого имеющегося препарата микродисекциированной ДНК из дисплазий и рака от 61 пациентки. Как видно, все случаи дисплазий и РШМ, за исключением одного (№ 49) удалось протестировать на наличие LOH с маркером D6S273. В исследуемой выборке 12 случаев были гомозиготны по этому маркеру и являлись неинформативными. Информативные по D6S273 препараты ДНК принадлежали 27 женщинам с диагнозом дисплазии различной степени тяжести и 21 женщине с РШМ. Поскольку проводилась множественная микродиссекция, в препаратах ДНК из отдельных участков опухоли и/или фокусов дисплазии от одной и той же больной, нередко наблюдалась различная картина LOH, как например в случаях под №№ 7, 27, 43, 44, 54, 55 и др. Поскольку среди материалов, полученных от пациенток с РШМ, было много случаев, где удавалось получить только ДНК из фокусов дисплазий, а опухолевая ДНК была недоступна, мы считали РШМ LOH-позитивным при обнаружении потери в препарате ДНК из любого фокуса патологической ткани от одной больной, тем более что в нашей выборке не было ни одного случая, где бы мы наблюдали LOH в сопутствующих дисплазиях при отсутствии LOH в раке.

Потеря гетерозиготности в локусе D6S273 хотя бы в одном участке патологически измененной ткани наблюдалась у 37,5% (18/48) женщин. При этом процент аллельных потерь в CIN примерно сходен с таковым в РШМ, 37% (10/27) и 38,1% (8/21) соответственно. Среди информативных случаев рака шейки матки был только один (№ 32),