Автореферат и диссертация по медицине (14.00.11) на тему:Комплексная иммунологическая и молекулярная диагностика папилломавирусной инфекции у больных и определение формирования злокачественной трансформации эпителиальных тканей

на правах рукописи

Кубанов Алексей Алексеевич

КОМПЛЕКСНАЯ ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ И МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА ПАПИЛЛОМАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ У БОЛЬНЫХ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФОРМИРОВАНИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ ТКАНЕЙ

14.00.11. - кожные и венерические болезни

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени доктора медицинских наук

Москва - 2005

Работа выполнена в Государственном Учреждении «Центральный научно-исследовательский кожно-венерологический институт» Росздрава и в отделе молекулярной биологии и генетики Государственного Учреждения «Научно-исследовательский институт физико-химической медицины» Росздрава.

Научные консультанты:

Доктор медицинских наук, профессор

Доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор

Доктор медицинских наук, профессор

Доктор биологических наук, профессор Член-корреспондент РАН

Вера Ивановна Кисина Вадим Маркович Говорун

Владислав Николаевич Гребенюк Лев Андреевич Ашрафяя

Александр Габибович Габибов

Ведущее учреждение: Российский университет дружбы народов, г. Москва Защита состоится декабря 2005 года в 12 часов

на заседании Диссертационного Совета Д 208.115.01 Государственного Учреждения «Центральный научно-исследовательский кожно-венерологический институт» Росздрава по адресу: 107076, г. Москва, ул. Короленко, д. 3,корп.4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ «Центральный научно-исследовательский кожно-венерологический институт» Росздрава

Автореферат разослан •¿005 года

Ученый секретарь диссертационного совета Кандидат медицинских наук

Н.К. Иванова

¿ШО- 2266ÖW

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Аногенитальная папилломавирусная инфекция человека является одним из наиболее распространенных вирусных заболеваний, передаваемых половым путем, и, определяется у 3-10% клинически здоровых женщин, у 50-80% пациентов остроконечными кондиломами, у 12-35% - доброкачественными поражениями шейки матки, у 19-90% дисплазиями шейки матки, у 58-89% внутриэпителиальными карциномами. (Franco E.L. et al., 1999; Brown D.R. et al., Ferlay J., 2001; 2002; Sherman M.E., et al., 2003).

Вместе с тем, несмотря на широкое распространение инфекции и существование большого количества исследований, касающихся эпидемиологии, патогенеза, диагностики и прогноза папилломавирусной инфекции, остается много нерешенных проблем, наиболее важной из которых является проблема ее качественной и своевременной диагностики и определения риска трансформации пораженных тканей в рак шейки матки. (Прилепская В.Н. с соавт., 1999 Александрова Ю.Н. и соавт., 2000, Бебнева Т.Н., 2001, Koutsky L., 1997,, Ferlay J., 2001; McCree D.H., et al., 2003; Sherman M.E. et al., 2003).

Согласно данным Киселева Ф.Л.(2000); Аполихиной И.А.(2002); Хансона К.Щ2002), при раке шейки матки в опухолевом материале в 90-100% случаях обнаруживается ДНК вируса папилломы человека. Постоянное носительство вируса папилломы человека приводит сначала к возникновению дисплазии шейки матки легкой, затем умеренной, и, наконец, тяжелой степени, которая заканчивается развитием инвазивного плоскоклеточного рака (Koutsky L.A, 1997).

Вывод об этиологической роли вируса папилломы человека при раке шейки матки имеет не только важное теоретическое, но и непосредственное практическое значение, папилломавирусная инфекция поражает, в основном, молодых, сексуально активных женщин детородного возраста, приводит к

нарушению их репродуктивного здоровья, оффжржц*бцд0ИШИ»<|ти и родов,

БИБЛИОТЕКА

|ти и

а также к злокачественному перерождению измененных тканей (Bosch F. et al., 1995, Matsura et. al., 1998). В современных условиях России наблюдается падение рождаемости, что ставит под угрозу репродуктивное здоровье и генофонд нации в целом.

Существующие методы диагностики папилломавирусной инфекции (клинический осмотр, колыюскопия, цитологическое, гистологическое исследования) позволяют установить диагноз и, в ряде случаев, (обычно при самостоятельном обращении пациенток) распознать предвестники злокачественного перерождения - дисплазии шейки матки. Представляется совершенно необходимой разработка комплексного подхода к диагностике папилломавирусной инфекции и определению факторов риска злокачественной трансформации пораженных тканей, который должен учитывать целый ряд моментов диагностического и патогенетического характера, касающихся как возбудителя - вируса папилломы человека, так и организма человека.

Для этого необходимо выявление распространенности папилломавирусной инфекции в Российской популяции в целом, и, в группах с риском развития рака шейки матки, к которым относятся широкие слои населения, имеющие особенности сексуального и социального поведения (раннее начало половой жизни, высокая сексуальная активность, частая смена половых партнеров, несоблюдение половой гигиены, наличие других инфекций, передающихся половым путем, вирусных инфекций, а также иммунодефицитное состояние, гормональные сдвиги, курение, использование оральных контрацептивов).

Кроме того, необходимо уточнение частоты ассоциаций вируса папилломы человека с другими возбудителями инфекций, передаваемых половым путем, так как это позволит разработать целевые скрининговые программы, основанные не только на представлении о группах риска, но и на сведениях о выявленных ассоциациях.

Одним из «краеугольных камней» своевременной и качественной диагностики папилломавирусной инфекции, определяющей дальнейшую

тактику ведения больного, является определение генотипа вируса. В настоящее время по способности инициировать диспласгаческие изменения и члокачественную трансформацию вирусы папилломы человека условно разделены на группы высокого, среднего и низкого онкогенного риска. Типы вирусов 6, 11, 42, 43, 44 классифицированы как типы низкого риска развития рака шейки матки, типы 16, 18, 48, 56 - высокого риска. Наиболее часто встречающимся среди вирусов папилломы человека высокого риска определен 16 тип вируса, который выявляется в 50 - 70% случаев рака шейки матки. (Koutsky L., 1997; Zur Hausen Н. 1999, Xi L.F. et al., 2002). В связи с вышеизложенным представляется необходимым разработать адекватную систему генотипирования вируса папилломы, которая позволяла бы в короткий срок определять различные генотипы вируса как у отдельных пациенток, так и при проведении широкомасштабных скрининговых программ.

Кроме того, необходимо изучение целого ряда малоизученных, и, практически не освещенных в отечественной научной литературе, патогенетических аспектов, касающихся прогноза злокачественной трансформации тканей при папилломавирусной инфекции: особенностей иммунного ответа человека на инфекцию, реализуемого через цитокины; физических форм ДНК вируса (эписомальной, интегрированной, смешанной), определяющих вероятность прогрессирования интраэпителиальной неоплазии, нередко предшествующей раку шейки матки; полиморфизма функционально активных областей генома вируса, увеличивающих риск трансформации ДНК вируса в интегрированную форму со встраиванием в геном клетки человека и развитием рака шейки матки; генетической предрасположенности человека к заболеванию путем исследования генов, ответственных за программируемую клеточную гибель - алоптоз, взаимосвязи между этими показателями.

Полученные результаты позволят разработать алгоритм ведения пациентов, позволяющий с высокой степенью вероятности предсказать наступление злокачественной трансформации тканей у больных

папилломавирусной инфекцией. Реализация разработки такого подхода явилась предметом настоящей работы.

Цель исследования. Разработка иммунологических и молекулярных методов диагностики папилломавирусной инфекции у больных и определение формирования злокачественной трансформации эпителиальных тканей. Для реализации цели были поставлены следующие задачи исследования: Задачи исследования:

1. Изучить распространенность папилломавирусной инфекции путем скрининга жителей г. Москвы и Московской области. Установить частоту регистрации генотипов вируса папилломы человека различной степени онкогенного риска. Выявить значимые ассоциации вируса папилломы человека с другими возбудителями инфекций, передаваемых половым путем.

2. Изучить экспрессию цитокинов гамма-интерферона, фактора некроза опухоли, интерлейкинов 4 и 12 и их профиль в секрете цервикального канала пациенток папилломавирусной инфекцией.

3. Разработать метод генотипирования вируса папилломы человека, основанный на твердофазной гибридизации продуктов амплификации с типоспецифическими олигонуклеотидами зондами.

4. Разработать методы оценки физического состояния вирусов папилломы человека и определить с их помощью количественные соотношения форм ДНК вирусного генома в инфицированных тканях пациенток папилломавирусной инфекцией.

5. Изучить полиморфизм основного смыслового участка - 72 кодона гена р53, ответственного за регуляцию нарушений в системе апоптоза у больных различными клиническими формами папилломавирусной инфекции, вызванной 16 типом вируса.

6. Исследовать изменчивость генома 16 типа вируса, выделенного от пациентов с различными клиническими формами инфекции, по

вариациям нуклеотидных последовательностей функционально активных областей ДНК вируса - LCR, Е (гены Е6, Е7).

7. Разработать диагностические критерии риска развития злокачественной трансформации инфицированных тканей пациентов папилломавирусной инфекцией с учетом данных о физическом состояния вируса папилломы человека и изменчивости его генома, полиморфизма гена р53 и цитокинового статуса больных.

Положения, выносимые на защиту:

1. Распространенность папилломавирусной инфекции среди населения Москвы и Московской области, обращавшегося в клинику для исключения инфекций, передаваемых половым путем в период с 1998 по 2003 гг. составляет 14%. В структуре генотипов преобладают типы вируса папилломы человека среднего (31, 33, 35, 52 - 38,6%) и высокого (16, 18 - 29,8%) онкогенного риска. Вирус папилломы человека часто сочетается с облигатными (С .trachomatis) и условнопатогенными (Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealiticum, Gardnerella vaginalis) возбудителями инфекций, передаваемых половым путем.

2. Разработанный метод генотипирования вируса, использующий в своей основе гибридизационный подход с прямой регистрацией флуоресценции типоспецифического зонда, связанного с продуктом, отличается высокой специфичностью и чувствительностью по сравнению с методами, основанными на полимеразно цепной реакции с электрофоретической детекцией ампликонов и иммуноферментного анализа.

3. Экспрессия цитокинов: гамма-интерферона, фактора некроза опухоли, интерлейкинов 4 и 12 в секрете цервикального канала у женщин папилломавирусной инфекцией связана с ее клинико-морфологическими формами: цитокиновый профиль больных манифестными формами инфекции соответствует преобладанию клеточного (Thl) варианта иммунного ответа на инфекцию; с латентными формами преобладающий

вариант цитокинового профиля не определяется. У больных папилломавирусной инфекцией цитологически определяемой интраэпителиальной неоплазией легкой степени преобладает гуморальный (Th2) вариант иммунного ответа, являющийся предиктавным фактором злокачественного перерождения тканей. Наличие цитокинов Thl профиля способствует спонтанной элиминации вируса. Присутствие цитокинов Th2 профиля позволяет прогнозировать длительное рецидивирующее течение инфекционного процесса с вероятным развитием злокачественной трансформации тканей.

4. Метод определения физического состояния ДНК вируса папилломы человека на основе технологии ГТЦР в режиме реального времени с обратной транскрипцией позволяет выявлять одновременное присутствие и количественное соотношение у пациенток с папилломавирусной инфекцией нескольких форм ДНК вируса высокого онкогенного риска: эписомальной, интегрированной и смешанной. У 14,3% пациенток (лица с интраэпителиальной неоплазией - CIN 1) определяется интегрированная, у 33,3% -смешанная и у 52,4% -эписомальная форма ДНК вируса.

5. Присутствие аллеля Арг/Арг в 72 кодоне гена р53 обеспечивает повышенную восприимчивость макроорганизма к инфицированию вируса папилломы 16 типа. Женщины с гетерозиготной формой белка р53 в значительно меньшей степени подвержены инфицированию вирусом, чем женщины, гомозиготные по аргинину (38% против 50% по результатам метода конформационного полиморфизма и 17% против 83% по данным метода аллельспецифической ПЦР).

6. Высокая частота замен нуклеотадов в нуклеотидных последовательностях функционально активных областей генома вируса папилломы человека 16 типа (LCR, Е6 и Е7) свидетельствует об изменениях их свойств, высокой степени вероятности трансформации ДНК вируса в интегрированную форму и зависит от формы

заболевания. Наиболее частым вариантом являются замены Т на G в положении 350.

7. Определяющими критериями риска развития злокачественной трансформации инфицированных тканей пациентов папилломавирусной инфекцией являются: обнаружение вируса 16 типа; цроонкогенный гуморальный (Th2) профиль цитокинов в цервикальном секрете; обнаружение интегрированной формы ДНК вируса; гомозиготность белка р53 по аргинину больных; наличие нуклеотидных замен в функционально активных областях (LCR, Е6, Е7) генома вируса папилломы человека. Научная новизна.

Впервые для иммунологической и молекулярной диагностики папилломавирусной инфекции у больных и определения формирования злокачественной трансформации эпителиальных тканей разработаны и использованы методы генотипирования вируса, определения физического состояния ДНК вируса, изменчивости генома человека и вируса 16 типа, экспрессии цитокинов в содержимом цервикально канала у женщин.

Впервые установлено, что наличие у пациенток папилломавирусной инфекцией аллеля Арг/Арг в 72 кодоне гена р53 позволяет оценить предрасположенность женщин к инфицированию вирусом папилломы.

Впервые доказано, что женщины папилломавирусной инфекцией с цитокинами в секрете цервикального канала, продуцирующими Т-клетками второго порядка относятся к группе риска злокачественной трансформации инфицированных тканей.

Впервые показано, что больные папилломавирусной инфекцией при обнаружении у них вируса 16 типа в интегрированной форме составляют группу риска развития злокачественного новообразования.

Впервые установлено, что у больных папилломавирусной инфекцией имеет место замена нуклеотидной последовательности генома вируса 16 типа, что позволяет оценивать вероятность перехода ДНК вируса в интегрированную

форму и прогнозировать переход инфицированных тканей в злокачественное новообразование.

Впервые определена тактика ведения больных папилломавирусной инфекцией в зависимости от клинических форм, физического статуса ДНК вируса и цитокинового профиля больных. Практическая значимость работы.

На основании проведенных исследований получены сведения об уровне распространенности инфицированности вирусом папилломы человека среди жителей Москвы и Московской области; определены высоко достоверные (Р <0,001) ассоциации между инфицированием вирусом папилломы и распространенными бактериальными возбудителями инфекций, передаваемых половым путем (Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum и Gardnerella vaginalis), что может служить основанием для разработки профилактических мероприятий, направленных на предупреждение развития рака шейки матки.

Впервые разработан и предложен для использования в практике метод типирования папилломавирусов человека, основанный на твердофазном флуоресцентао-гибридизационном анализе продуктов амплификации.

Впервые для нужд практического здравоохранения определены диагностические критерии риска развития злокачественной трансформации инфицированной вирусом папилломы человека ткани с учетом показателей цитокинового статуса полиморфизма генома человека, а также физического статуса ДНК и полиморфизма генома вируса папилломы 16 типа. Определение уровней цитокинов (1 и 2 типов) в цервикальном секрете и физического статуса вируса папилломы является перспективным показателем для прогнозирования риска развития неопластических заболеваний шейки матки.

Определена тактика применения у больных распространенными и рецидивирующими формами инфекции рекомбинантного интерферона (ИНТРОН А).

Апробация материалов диссертации:

Основные положения диссертации обсуждены на:

• Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы вирусных инфекций, передаваемых половым путем» (паиилломавирусы человека, вирусные гепатиты, герпесвирусные инфекции): эпидемиология, клинико-диагностические особенности, принципы ведения больных» (Москва, 2000);

• VIII Всероссийском съезде дерматовенерологов (Москва, 2001); Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы терапии инфекций, передаваемых половым путем и хронических дерматозов» (Екатеринбург, 2002); Всероссийском совещании «По совершенствовании серологической диагностики сифилиса» (Москва, 2003);

• Первом Всероссийском конгрессе дерматовенерологов (Санкт-Петербург, 2003); Всероссийской научно-практической конференции «Современные направления развития диагностики, лечения и профилактики ИПТТП и дерматозов» (Нижний Новгород, 2004);

• 8 ежегодной конференции Европейского филиала Всемирного союза против болезней, передающихся половым путём (Греция, 2004); Всероссийской научно-практической конференции дерматовенерологов «Новые технологии в организации дерматовенерологической помощи населению Российской Федерации» (Москва, 2004);

• IX Всероссийском съезде дерматовенерологов (Москва, 2005). Объём и структура работы.

Диссертационная работа состоит из: введения, обзора литературы, 2 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 209 страницах машинописного текста, иллюстрирована 24 рисунками, имеет 23 таблицы. Указатель литературы включает 26 отечественных и 274 иностранных источника.

Содержание работы

Материалы и методы исследования.

Для изучения распространенности папилломавирусной инфекции и других инфекций, передаваемых половым путем, среди пациентов, обращающихся в лечебно-профилактические учреждения г. Москвы и Московской области в период с 1998 по 2003 год был проведен скрининг 9146 пациентов и проанализирована их медицинская документация. Исследования осуществляли в Центральном научно-исследовательском кожно-венерологическом институте Минздрава России, НИИ физико-химической медицины Минздрава России и научно-производственной фирме «Литех».

В целях скрининга для обнаружения ДНК вируса папилломы человека типов 6, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 42, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 56, 58, 59 использовался набор ВИПАПОЛ на основе ПЦР производства фирмы «Литех» (Москва, Россия).

Выявление ДНК возбудителей различных урогенитальных инфекций (С. trachomatis, M.hominis, M.genitalium, U.urealyticum, G.vaginalis, N.gonorrhoeae, a также Herpes Simplex Virus) в клинических образцах (соскобы с поверхности элементов и цервикального канала) проводили с помощью ПЦР с использованием тест-систем производства ООО НПФ «Литех» (Москва, Россия) согласно инструкциям фирмы - производителя.

Подробное клинико-лабораторное обследование основной группы пациенток (103 больных папилломавирусной инфекцией в возрасте от 18 до 55 лет, отобранных из числа лиц, обращавшихся в научно-консультативное отделение Центрального Научно-Исследовательского кожно-венерологического института МЗ РФ), включало клинический осмотр, проведение кольпоскопии, цитологического и гистологического исследования. Помимо этого, в целях установления факторов риска злокачественной трансформации вируса папилломы - инфицированных тканей и прогнозирования рака шейки матки был разработан и применен комплекс общепринятых и самостоятельно разработанных молекулярно-биологических и

иммуногенетических методов исследования, направленных на установление особенностей возбудителя и организма человека.

Кольпоскопия осуществлялась с использованием кольпоскопа Zeiss FC 150, позволявшего с помощью оптической системы с увеличением 6-40 исследовать поверхность влагалищной части шейки матки, нижней трети цервикального канала, стенок влагалища и вульвы. Для диагностики субклинических форм инфекции применялась расширенная кольпоскопия с постановкой пробы с уксусной кислотой и геста Шиллера. Оценка обнаруженных изменений осуществлялась в соответствии с кольпоскопической терминологией, принятой Международной Федерацией по патологии шейки матки и кольпоскопии (IFCHC).

Цитологическое исследование проводилось на материале мазков-соскобов с поверхности влагалищной части шейки матки, с участка переходной зоны многослойного плоского эпителия, слизистой оболочки цервикального канала и нижней трети эндоцервикса с помощью эндо- и цервикобраптей. Обработка отобранных мазков проводилась путем их регидратации в этаноле нисходящей концентрации, окраски гематоксилином Gill, обезвоживании в спиртах восходящей концентрации, окраски оранжевым G, промывки и обезвоживании препарата растворителями (Лабметод, Москва, Россия). При необходимости использовали метод жидкостной цитологии (Лабметод, Москва, Россия). Критерием обнаружения остроконечных или плоских кондилом при цитологическом исследовании шеечных мазков являлось наличие в них койлоцитов и дискератоцитов из поверхностных ороговевающих слоев многослойного плоского эпителия.

Гистологическое исследование проводилось при необходимости подтверждения плоских кондилом и субклинических форм папилломавирусной инфекции в материале биоптатов шейки матки из переходной зоны и/или эктоцервикса. Взятый материал фиксировался в 40% формалине и подвергался стандартной гистологической обработке. Наличие субклинических форм заболевания подтверждалось обнаружением акантоза, гиперплазии клеток

базального и парабазального слоев эпителия, паракератоза и наличием клеточных элементов типа койлоцитов и дискератоцитов.

Молекулярно-генетические методы исследования возбудителя папилломавирусной инфекции.

Генотипирование вируса папилломы человека. Идентификация генотипов осуществлялась впервые разработанным методом амплификации участка L1 области вирусного генома с последующей гибридизацией с типоспецифическими зондами.

Изучение физического статуса ДНК вируса папилломы человека и количественного соотношения интегрированной и эписомальной форм ДНК вируса папилломы человека. В целях изучения возможности элиминации вируса и выявления риска прогрессирования выявляемой у пациенток папиломавирусной инфекцией дисплазий в дисплазии шейки матки злокачественное новообразование исследовалось состояние физического статуса ДНК вируса 16 типа и количественное соотношение ее интегрированной и эписомальной форм, для чего было использовано два метода: мультипраймерная ПЦР и ПЦР в режиме реального времени.

Методы изучения изменчивости генома человека и вируса папилломы человека 16 типа В целях установления проонкогенной роли генетических факторов человека и вируса папилломы проводилось:

а) изучение полиморфизма основного смыслового участка - 72 кодона гена р 53 человека, ответственного за регуляцию системы апоптоза, двумя методами: конформационного полиморфизма одноцепочечных молекул ДНК (single stranded confirmation polymorphism -SSCP) и аллель-специфической полимеразной цепной реакцией;

б) анализ вариаций нуклеотидной последовательности функционально активных областей генома вируса папилломы человека (3' конца LCR, Е6 и Е7) двумя методами: путем сравнения нуклеотадных последовательностей 3' конца LCR, Е6 и Е7 открытых рамок считывания ДНК (контролем служила каноническая последовательность вируса 16 типа Е-350Т ) и - путем анализа

нуклеотидных замен 350 G/T гена Е6 вируса 16 типа с помощью двух независимых ПЦР с праймерами, позволяющими детектировать только один из двух возможных вариантов Е6: либо G-, либо Т-содержащий.

Для оценки особенностей иммунного ответа пациенток на инфекцию проводили качественное (ПЦР с обратной транскрипцией) и количественное (ПЦР в реальном времени, иммуноферментный анализ) определение цитокинов гамма-интерферона - INF-y, фактора некроза опухоли - TNF-a, интерлейкинов 4 и 12 - IL-4 и IL-12 и их профиля.

Определение экспрессии цитокинов и цитокинового профиля на нестимулированных клетках, полученных из образцов с лущенных (отслоившихся) клеток цервикального канала проводилось методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени. Забор материала осуществляли с помощью цервикальных зондов по методу Sheilmein et al, 1999. Для количественной оценки экспрессии цитокинов использовали наборы компании Applied Biosystems (США): Pre-developed TaqMan Assay Ragents Human INF-y, TNF-a, IL-4 и IL-12. Амплификацию проводили на приборе ABI PRISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, США) в плашках MicroAmp Optical 96-well reaction plate/optical caps (Applied Biosystems, США).. Результаты амплификации обрабатывали с помощью программного обеспечения Sequence Detection System software version 1.6 (Applied Biosystems, США). Для определения относительного количества мРНК использовали сравнительный ДАСт-метод.

Определение цитокинового профиля в цервикальном секрете методом ИФА. Образцы цервикальных секретов отбирались как описано в (Ildesheim А. et al., (1999). До начала исследований образцы замораживались при 70 ОС. Концентрацию IL-4, IL-12, TNF- a, IFN-y определяли с использованием соответствующих количественных ИФА-наборов (BioSource International, Burligame, США) согласно инструкции фирмы-производителя.

Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием программ SPSS 9.0 (SPSS Incorporation), Microsoft Exel с

использованием Student t-теста, у2 - теста. Для работы с нуклеотидными последовательностями применяли программу Vector NTI 8.0 (InforMax Inc, США). Выбор специфических праймеров осуществлялся с использованием программы Primer Express software 1.0 (Applied Biosystems).

В работе были использованы материалы базы данных NCBI (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) Результаты исследования :

1. Разработка системы генотипирования вируса В целях изучения распространенности вируса папилломы человека его отдельных генотипов, в особенности относящихся к категории «высокого» риска злокачественной трансформации тканей, нами совместно с лабораторией иммунногенетики НИИ физико-химической медицины Минздрава России была разработана система, основанная на применении технологии ПЛАТАН и позволяющая с высокой степенью точности идентифицировать вирус папилломы в урогенитальном тракте. Для ее создания были использованы данные Gene Bank о представленных нуклеотидных последовательностях L1 - гена 22-х наиболее распространенных и клинически значимых генотипов вируса: 42, 16, 18, 26, 31, 32,33,44,40,11, 56, 45, 51, 52, 53, 54,39,58, 59, 67.

В качестве основы системы генотипирования с использованием программного продукта Vector Ni Suite6 ( Informax Inc), был отобран участок LI-гена, отличающийся высокой степенью полиморфизма и фланкированный консервативными фрагментами с местами отжига 4-х праймеров (мультипраймерная система амплификации): Gp5 5'-TTTGTTACTGTGGTAGАТАСТАС-3' - прямой праймер Gp5-1 5 '-TTTGTTACTGTGGTAGATACCАС-3' - прямой праймер My 09-15'-CGT CC(A/C)A(A/G)(A/G)GGAAACTGATC-3' - обратный праймер My 09-2 5'-CGTCC(A/C)A(A/G)(A/G)GGATACTGATC-3' - обратный праймер

Для амплификации фрагмента L1 участка вирусного генома использовались препараты ДНК, выделенной из 100 соскобов цервикального канала пациенток. Они вводились в реакцию (ПЦР) и амплифицировались

путем проведения ПЦР на приборе Gen Amp PCR system 9600 (фирма Appliyed Byosystems). Продукты амплификации размером 420 пар нуклеотидов анализировались методом прямой твердофазной гибридизации на сорбированных стрептавидином планшетах (фирма Thermolabsystems) с типоспецифическими зондами, созданными на основе анализа нуклеотидных последовательностей основных аногенитальных типов вируса и меченными флюоресцеином. Результаты оценивали регистрацией флюоресценции на приборе Fluoroscan Ascent (Labsystems, USA). Специфичность связывания зондов с фрагментом LI- гена обеспечивалась 100% гомологией с участком LI -гена вируса данного генотипа.

Чувствительность выявления ДНК вируса пределялась на панелях разведений рекомбинантных плазмид, содержащих фрагменты LI гена генотипов 16, 18, 31, 33, 6, 11. и варьировала для разных генотипов в пределах от 0.05 до 0.77 pg вирусной ДНК, что соответствовало 105 копий вирусного генома.

Специфичность предложенной схемы анализа проверялась путем гибридизации типоспецифичных зондов с продуктами амплификации всех установленных генотипов и составила 100%. Перекрестных реакций не наблюдалось. При этом сигнал, соответствовавший специфичной гибридизации, многократно превышал сигнал других реакций (табл.1).

Таблица 1.

Результаты гибридизации типоспецифичных зондов с продуктами

амплификации всех установленных генотипов.

¡зонд Генотип ВПЧ|ВПЧ16 < зонд ¡зонд ВПЧ18 ¡ВПЧ31 зонд ¡зонд впчзз !впчб зонд ВПЧ11 зонд ¡зонд ВПЧ 58|ВПЧ 52

Blanc ¡8 1 0 |9 11 14 I -9 -4 ¡2 i

К-.............- т--- ВПчГб 12825"'"" ВПЧ18 ¡18 21 7-2 i 9 ¡35" 1341 ~\7 Í2 ;2~5 _____ г15~""" "¡2 -9 54 -16 """ -2 '16 i 2 ¡-б i 11 [-24

ВПЧ31 ¡4 1 24 3463 ¡64 16 ¡-5 1 ;-24 ! 12

впчзз ;0 ¡23 56 ¡3037 -2 ? ¡12 -5

ВПЧ6 1 ',5 1 2 ;-4 1184 И 1 ¡86 1 5

ВПЧ11 ¡'11 1 1-12 1 3 :6 -4 '1441 1 ¡4 1 3

Следует отметить, что до настоящего момента при типировании вируса папилломы человека в исследуемом материале от больных использовались методы так называемой аллель-специфичной ПЦР. При всей простоте их применения они имеют ряд существенных недостатков, главным среди которых является ограничение количества определяемых типов вируса. Использованная в данной работе технология ПЛАТАН, разработанная сотрудниками НИИ физико-химической медицины Миздрава России, позволяет проводить генотипирование практически всех типов вируса. Кроме того, в отличие от иных методов детекции продуктов амплификации, технология ПЛАТАН объективизирует учет, устраняя работу оператора на самом отвественном этапе регистрации результатов. Эти обстоятельства, а также результаты типирования, полученные в нашем исследовании, позволяют рассматривать технологию ПЛАТАН как одну из возможных для проведения массового скрининга населения для выявления папилломавирусной инфекции. Разработанный метод, использующий в своей основе гибридизационный подход с прямой регистрацией флуоресценции типоспецифического зонда, связанного с продуктом, отличается высокой специфичностью и чувствительностью по сравнению с методиками, основанными на ПЦР и электрофоретической детекции ампликонов, повышает специфичность теста и позволяет избежать получения ложнопозитивных результатов.

2. Результаты скрининга населения г. Москвы и Московской области на распространенность вируса папилломы человека. В целях установления распространенности инфекции среди жителей Москвы и Московской области, обращающихся в ЛПУ для диагностики возбудителей инфекций, передаваемых половым путем за период с 1998 по 2003 гг. был проведен скрининг 9146

пациенток с применением методов ПЦР-идентификации вируса папилломы человека и других возбудителей других инфекций, передаваемых половым путем.

Необходимо отметить, что частота выявления вирусов той или иной группы онкогенного риска при положительных результатах верификации вируса отличалась и составила: 13.2% для ВПЧ низкого онкогенного риска (6,11 и 14); 38.6% для вируса папилломы среднего онкогенного риска (31, 33, 35, 52) и 29.8% для ВПЧ высокого онкогенного риска (16, 18).

3. Частота ассоциаций вируса папилломы человека с облигатными и условнопатогенными возбудителями, инфекций, передаваемых половым путем. Результаты исследований показали, что наиболее значительные ассоциации, выражавшиеся в высокой частоте сочетаний выявленных возбудителей, наблюдались между вирусом папилломы человека и Chlamydia trachomatis. Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum и Gardnerella vaginalis, при этом достоверность результатов была очень высокой (Р<0.001). Ассоциации вируса папилломы человека с возбудителями других вирусных инфекций: Herpes simplex virus П, Cytomegalovirus и Epstein-Barr virus были значительно менее выражены, чем с вышеназванными возбудителями. Между вирусом папилломы человека и Neisseria gonorrhoea, Trichomonas vaginalis, -никаких значительных ассоциаций обнаружено не было.

4. Клиническая характеристика пациентов. Клинико-лабораторное и иммуно-генетическое обследование было осуществлено у 103 женщин с папилломавирусной инфекцией человека, отобранных среди лиц, обращавшихся в научно-консультативное отделение ЦНИКВИ МЗ РФ. Критериями включения пациенток в исследуемую группу являлись: репродуктивный возраст; характерные жалобы и клинические признаки, свидетельствующие о наличии папилломавирусной инфекции; верификация ДНК вируса папилломы человека методом ПЦР-анализа с последующим генотипированием и выявлением вируса 16 типа; исключение методом ПЦР-анализа возбудителей инфекций, передаваемых половым путем и других

вирусов (Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum и Gardnerella vaginalis, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis, Herpes simplex vims II, Cytomegalovirus и Epstein-Barr virus); отсутствие в анамнезе указаний на проведение системной и местной противовирусной терапии в течение 1 месяца до настоящего обследования; отрицательный тест на беременность.

В зависимости от особенностей клинических проявлений из включенных в исследование пациенток были сформированы 3 подгруппы: 1(15 человек) -пациентки без наличия каких-либо клинических проявлений заболевания (латентная форма инфекции), 2 (15 человек)- пациентки с различными клиническими проявлениями инфекции (остроконечные кондиломы и др.), 3 (15 человек) - пациентки с наличием цитологически определенной интраэпителиальной неоплазией шейки матки легкой степени (CINI).

Большинство обследованных (почти 2/3) находилось в активном сексуальном возрасте (18 до 30 лет); 17% женщин указали на раннее начало половой жизни (в возрасте от 13 до 15 лет); 53% - на промискуитет и лишь 28% из числа обследованных женщин были замужем. Барьерные средства контрацепции при половых контактах использовали лишь 23% , оральные контрацептивы 24% женщин.

Из числа перенесенных заболеваний у обследованных наиболее часто регистрировались аденовирусные (57 человек) и «детские» (59 человек) инфекции, грипп (33 человек), пневмония (11 человек) и вирусный гепатит (5 человек). Перенесенные инфекции, передаваемые половым путем в анамнезе отмечали 19,7% обследованных женщин (хламидиоз, сифилис, гонорея, трихомониаз, генитальный герпес, урогенитальный кандидоз, бактериальный вагиноз).

Из числа сопутствующих заболеваний регистрировались заболевания женской половой сферы, астеновегетативный синдром, полип прямой кишки, анацидный гастрит, лекарственная и пищевая аллергия, ревматоидный артрит, гипертоническая болезнь. Жалобы при обращении пациенток к специалистам, в

основном, касались наличия высыпаний в области наружных половых органов, они и явились наиболее частыми причинами обращения в клинику. В ранние сроки от начала заболевания (до 1 месяца) для обследования обратилось всего лишь 29,5% пациенток.

Клиническая картина заболевания характеризовалась наличием элементов с экзофитным ростом (остроконечные кондиломы), имевших вид единичных или множественных узелков различной величины, на тонкой ножке или реже -на широком основании, возвышавшихся над поверхностью кожи или слизистых оболочек. Высыпания, как правило, локализовались в области половых губ и вульвы, влагалища, шейки матки, анальной области, были единичными или множественными, имели окраску - от светлой, цвета неизмененной кожи, до коричневой или серой - при локализации на коже и от бледнорозовой до красноватой - при расположении элементов на слизистых оболочках. У части пациентов поверхность кондилом ороговевала, не подвергаясь изъязвлению.

При клиническом осмотре у большинства пациенток (79% ) была выявлена та или иная патология шейки матки, в том числе: клинико-микробиологические признаки цервицита - у 79% пациенток, псевдоэрозии - у 29%, посткоагуляционный синдром - у 14%, ретенционные кисты - у 23%. Нормальная кольпоскопическая картина (слизистая оболочка эндоцервикса представлена многослойным плоским эпителием, достигающим границы наружного маточного зева) наблюдалась у 11, 4% пациенток. У остальных при кольпоскопическом обследовании обнаружены доброкачественные изменения слизистой оболочки шейки матки (фоновые изменения), представленные: цервицитом - 71%, эктопией - 80%, зоной превращения - 7,7%, эндометриозом

- 5,7%, рубцовой дистрофией - у 2,8%, железистым полипом - 2,8%, полипами

— 5,7% женщин.

Кроме этого, у 3 пациенток были выявлены изменения слизистой оболочки, подозрительные на наличие злокачественной трансформации: немые йоднегативные участки и лейкоплакия, атипичные зоны превращения (в

различных сочетаниях), при клиническом исследовании которых (осмотр невооруженным глазом) отмечалась незначительная диффузная гиперемия и «шероховатость» шейки, а при заборе материала - контактная кровоточивость

В результате цитологического исследования у 75% больных выявлены отклонения от нормального эпителиального состава мазка из влагалищной части шейки матки и /или цервикального канала; при этом у большинства пациенток в материале из влагалищной части шейки матки обнаруживались доброкачественные изменения клеток, характерные для эктопии с зоной превращения, реактивного воспаления, воспалительной атипии. Цитологическая картина в мазках характеризовалась вакуолизацией цитоплазмы (койлоцитоз), увеличением размеров ядер клеток, наличием дискератоцитов двух- и многоядерных клеток, существенным утолщением среднего слоя клеток поврежденного эпителия. Гистологическая картина остроконечных кондилом характеризовались наличием папилломатоза и разрастанием дермальных сосочков различной формы и величины, в строме которых наблюдался ангиоматоз различной степени выраженности и периваскулярная инфильтрация гистио-лимфоцитарного характера. Кроме того, отмечалось наличие межсосочковых разрастаний плоского эпителия с сохранением дифференцировки слоев, хорошо выраженными межклеточными мостиками. Акантолитические тяжи эпителия глубоко проникали в дерму, что в некоторых случаях сопровоявдалось признаками дискератоза. В шиповатом слое эпителия часто обнаруживались клетки с перинуклеарной вакуолизацией, сморщенными, пикнотическими ядрами (койлоциты).

Результаты изучения экспрессии цитокинов ШР-у, 11-4, ТЫР - а и II-12 и цитокинового профиля в цервикальном секрете пациенток папилломавирусной инфекцией. Одной из задач настоящего исследования было изучение характерных особенностей регулирования иммунных реакций, связанных с эффекторным звеном (оценка концентрации цитокинов, действующих на «местном» уровне - в цервикальном канале), и с индуцированными в ходе

наблюдения экспрессионными профилями цитокинов, в конечном итоге отображающими активность соответствующих генов.

Известно, что цитокиновый ответ Т-хелперов 1 типа (Thl) характеризуется экспрессией INF-y и отсутствием экспрессии IL-4, являющихся необходимыми факторами для создания условий элиминации вируса из организма человека. При Th2- цитокиновом ответе преобладает экспрессия цитокинов 2 типа, в частности, ИЛ-12, характеризующая неблагоприятный прогноз с персистенцией инфекции и, в дальнейшем, формированием неопластического процесса.

В работе методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени изучены экспрессия четырех цитокинов INF-y, 11-4, TNF-a и 11-12).

Исследования проведены у 45 пациенток, из числа которых были сформированы 3 группы по 15 человек каждая: 1-ая - пациентки без клинических проявлений инфекции с впервые выявленным вирусом паплломы человека; 2-ая - с клиническими проявлениями инфекции; 3-ая -интраэпителиальной неоплазисй легкой степени (CIN I). Группу сравнения составили здоровые женщины, не имеющие клинических проявлений папилломавирусной инфекции, с отрицательными данными ПЦР-анализа и регламентированных микробиологических тестов на вирус и другие урогенитальные инфекции (15 человек). С целью изучения взаимосвязи между динамикой цитокинового профиля и длительностью заболевания исследования проводили каждые 1-1,5 месяца в течение всего срока наблюдения за больной (до 2,5 лет).

В результате проведенных исследований между группами больных папилломавирусной инфекцией были установлены существенные отличия, касавшиеся как уровня экспрессии отдельных цитокинов, так и цитокинового профиля в секрете цервикального канала.

У пациенток 1 группы довольно высокий уровень экспрессии INF-y и TNF-a и средний уровень - IL-4 и - IL-12. Лишь у трех (20%) пациенток данной группы был определен Thl (клеточный) профиль цитокинов и у трех (20%) -

Th2 (гуморальный) цитокиновый профиль, у остальных 9 (60%) пациенток этот показатель не соответствовал ни Thl, ни Th2 типу. Это обстоятельство могло быть обусловлено либо наличием длительно протекающего инфекционного процесса, либо следствием развития относительного биологического «равновесия» между организмом человека и возбудителем.

У пациенток 2-й группы регистрировался высокий уровень экспрессии INF-y и TNF-a наряду с низким уровнем IL-4 и - средним - IL-12. У большинства (9 человек - 60%) больных этой группы определялся Thl (клеточный) цитокиновый профиль, у остальных 5 человек (33%) он был неопределенным, и, лишь у 1 (7%) пациентки соответствовал Th2 - профилю. Сделанные наблюдения позволили заключить, что у пациенток с клинической симптоматикой инфекции на местном уровне преобладали реакции Т хелперов первого порядка, что обусловливает манифестацию инфекции, вследствие, адекватного включения в процесс иммунного ответа Т-хелперов у больных с каноническим вариантом генома, обеспечивающим чувствительность или невосприимчивость к проонкогенному эффекту ДНК вируса.

В 3 группе пациенток (CIN I) экспрессия цитокинов носила принципиально другой характер: у них с одинаковой частотой определялись INF-y и IL-12, отмечался невысокий уровень экспрессии TNF-a и высокий -IL-4. Характер цитокинового профиля свидетельствовал о снижении частоты регистрации Thl цитокинового профиля до 33%, возрастании числа лип с Th2 - профилем до 40%.

Проведенные исследования позволили установить, что уровень экспрессии цитокинов и цитокиновый профиль, определявшийся в содержимом цервикального канала пациентов, являлись факторами, определявшими характер исхода заболевания, что выявлялось при длительном наблюдении за пациентами. Так, из общего числа больных ПВИ, у которых определялся Thl цитокиновый профиль, ассоциированный с эффективным клеточным иммунитетом (17 человек), самоизлечение наступило у 7-ми (41,2%). Основную

массу этих пациентов (9 человек) составили лица 2-й группы (с клиническими проявлениями).

В процессе отдаленных наблюдений за пациентами было установлено, что у ряда из них по мере увеличения давности процесса Thl профиль цитокинов не сохранялся, в то время как экспрессия цитокинов 2-го типа, ответственных за реализацию гуморального иммунитета, увеличивалась, приводя к формированию Th2 профиля. Длительное течение инфекции (более года) у 10 из 11 наблюдавшихся пациенток (91%) сопровождалось отсутствием экспрессии TNF-y при одновременном отсутствии определения IL-4 у 8 больных, что фактически соответствовало Th2 цитокиновому профилю. У 5 пациенток был отмечен выраженный Th2 цитокиновый профиль; у 13 пациенток с длительно протекавшим, рецидивировавшим процессом, характеризовавшимся обширными и распространенными очагами поражения, был установлен высокий уровень экспрессии цитокина, ингибирующе! о клеточно-опосредованного иммунитета, IL-4. Экспрессия INF-у и TNF, напротив, была снижена. Цитокиновый профиль ТЫ в этой группе не наблюдали. И, напротив, у ряда пациентов (5 человек) в начале наблюдения Thl профиль не определялся, но в процессе клинико-лабораторного контроля было констатировано его формирование. Дальнейшее обследование и наблюдение за этими пациентами показало, что у них было установлено самоизлечение, и лабораторными тестами (ПЦР-анализ) вирус не выявлялся.

Исследования по выявлению цитокинов, проведенные у тех же больных в цервикальном секрете методом ИФА, показали, что динамика уровня экспрессии цитокинов, определявшихся обоими методами (ИФА и Real -time ОТ-ПЦР), отражала общую тенденцию, а значения показателей, исследованных этими методами, достоверно не отличались. В то же время, чувствительность метода ОТ-ПЦР в режиме реального времени оказалась выше, чем метода ИФА, и позволяла определять концентрацию матричной РНК вне зависимости от стандартизации метода забора материала. Метод ИФА, напротив, позволял проводить прямое определение экспрессии цитокинов, но

при этом чувствительность метода была ниже, а результаты находились в прямой зависимости от качества и условий забора материала.

Изучение физического статуса ДНК вируса папилломы человека.

Поскольку вирус папилломы человека обладает способностью интегрироваться в геном инфицированных клеток, целесообразно было разработать лабораторный тест для оценки физического состояния ДНК вируса папилломы и затем применить его к образцам, взятым у пациенток с папилломавирусной инфекцией 16 типа.

Для определения физического статуса и количества копий ДНК ВПЧ-16 типа методом ПЦР в режиме реального времени нами совместно с лабораторией иммуногенетики НИИ физико-химической медицины Минздрава России была синтезирована контрольная ДНК, относительно концентрации которой проводилась стандартизация параметров полимеразной цепной реакции. Амплификацию полноразмерной ДНК вируса проводили с использованием ДНК, предварительно выделенной из клинического материала, полученного от пациенток с подтвержденным вирусом папилломы человека 16 генотипа.

Продукт амплификации длиной 7904 нуклеотидов предварительно клонировался в плазмидный вектор рОЕМ-ТеаБу с последующим определением его нуклеотидной последовательности. Далее фрагмент, содержащий полноразмерную последовательность генома вируса, субклонировался в плазмидный вектор рВЯ 322, получивший обозначение рВИ/НРУ. Плазмидную ДНК растворяли в буфере и готовили серийные разведения, содержащие от 104 до 107 копий генома вируса папилломы человека.

Для определения соотношения количества копий генов Е2/Е6 был сконструирован плазмидный вектор рОЕМ-Теаэу/Еб, который содержал полноразмерный ген Е6, и определено пороговое значение, при котором количество копий гена Е2 статистически достоверно отличалось от количества копий гена Е6. Для этой цели были использованы плазмидные векторы

рВИ/НРУ и рСЕМ-Теаву/Еб, первый из которых содержал полноразмерный геном вируса папилломы - 16, а второй - последовательность гена Е6. Смесь векторов готовилась таким образом, чтобы плазмида, содержащая полноразмерный геном вируса, по мере разведения замещалась плазмидой, содержащей ген Е6, с 20%-ным снижением его содержания. В конечном результате полученная смесь плазмид соответствовала эписомальной форме ДНК вируса и содержала только плазмидный вектор рВ 11/1 ТРУ, а интегрированная форма - только плазмидный вектор рОЕМ-Теаву/Еб. В смешанной форме определялось наличие плазмидных векторов обоих типов, определявших как эписомальнуто, так и интегрированную формы состояния ДНК вируса 16 типа в различных соотношениях. Определение количества копий ДНК вируса папилломы проводилось шестикратно, и различия в соотношении копий Е2/Е6 определялись с использованием непарного 1-теста (рис. 1). При увеличении концентрации плазмиды, несущей только ген Е6, количество копий гена Е2 снижалось в линейной зависимости. В то же время, число копий гена Е6 существенно не изменялось.

100 80 60 40 20 0и+вв

(рВГОНРУ)

Рис. 1. Определение количества копий генов Е2 и Е6 с использованием ПЦР в режиме реального времени для подсчета порогового значения. * , Р <0.01.

Статистический анализ результатов исследований показал, что значимые различия между количеством копий генов Е2 и Е6 наблюдались при превышении концентрации плазмиды, несущей ген Е6, не менее, чем на 40%.

Исследование физического статуса ДНК вируса папилломы человека было проведено у 21 женщины с папилломавирусной инфекцией и подтвержденным методом ПЦР наличием вируса 16 типа, в том числе: у 8 - с клиническими проявлениями вируса, у 6 -ти с латентной формой инфекции, у 7 пациенток - с наличием цитологически подтвержденной интраэпителиальной неоплазии легкой степени (CIN I). Для определения физического статуса ДНК вируса папилломы 16 типа, а также количественного соотношения интегрированной и эписомальной форм были использованы методы мультипраймерной ПЦР и ПЦР в режиме реального времени.

Использование первого метода показало, что ДНК вируса у пациентов находилось либо только в эписомальной, либо - в интегрированной форме (у 3-х пациенток), при этом дифференцировать смешанную и эписомальную формы ДНК вируса папилломы не представлялось возможным.

ПЦР в режиме реального времени показала наличие интегрированной формы ДНК вируса папилломы у 3-х, смешанной - у 7 (пороговое значение соотношения Е2/Е6 составило менее 0.6) и эписомальный вирус папилломы 16 типа - у 11 пациенток. Метод позволял достоверно дискриминировать совместное присутствие эписомальной или интегрированной форм ДНК вируса в том случае, если 40% ДНК вируса 16 типа находилась в интегрированной форме с нарушением последовательности гена Е2. Пороговое значение соотношения количества копий Е2/Е6, необходимое для дифференцировки смешанной и эписомальной форм ДНК вируса папилломы человека 16 типа, составило 0.6.

Анализ зависимости физического статуса ДНК вируса 16 типа от клинической картины заболевания (рис. 2) показал, что в интегрированной форме вирус находился в геноме клетки только в трех случаях: у пациентов с интраэпителиальной неоплазией легкой степени (CIN I). В то же время,

смешанная форма ДНК вируса папилломы определялась как у пациенток с латентной формой инфекции, так и у пациентов с CIN I, а также у двух больных с клиническими проявлениями заболевания. Эписомальная форма ДНК вируса обнаруживалась во всех трех группах обследованных.

Таким образом, в результате обследования данным методом у 14,3% пациенток (лица с интраэпителиальной неоплазией - CIN 1) установлено наличие интегрированной, у 33,3% -смешанной и у 52,4% - эписомальной формы ДНК вируса папилломы человека.

7 п

Физический статус ДНКПВЧ 16

□ интегрированная

■ смешанная

■ эписомальная

латентная форма ПВИ

клиническая форма ПВИ

CIN

Рис 2. Физический статус ДНК вируса папилломы человека 16 у пациентов с латентной и клинической формой инфекции, а также у пациентов с CIN I.

Анализ изменчивости генома человека и вируса папилломы человека у пациентов с вирусом 16 типа.

Одним из основных механизмов неопластической трансформации клеток является повреждение генов, контролирующих апоптоз. В нашей работе мы предприняли попытку оценить присутствие значимых мутаций в одном из

основных генов апоптоза р53 и вируса папилломы у пациентов с разными клиническими и морфологическими формами инфекции.

В целях установления критериев риска развития рака шейки матки у пациенток с инфекцией, обусловленной вирусом 16 типа, проводили исследование полиморфизма смыслового участка гена р53 - 72 кодона человека методом конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов ДНК.

Обследовано 45 пациенток с вирусом папилломы разных типов, среди которых у 15-ти была диагностирована клиническая форма инфекции, у 15 -латентная форма инфекции, третью группу составили 15 пациенток с цитологически определяемой интраэпителиалыюй неоплазией легкой степени (CINI). В группу сравнения вошли 15 здоровых вирусоотрицательных женщин. В результате проведенных исследований установлено значительное увеличение доли гомозиготных по аргинину (Арг/Арг) форм гена р53 у вируса папилломы человека - положительных пациентов, которая составила 50% . Частота гомозигот по пролину (Про/Про) была относительно невысокой и отмечена в 16% случаев (таблица 2)

Таблица 2

Результаты конформационного анализа 72 кодона гена р53

Группы пациентов Полиморфизм 72 кодона р53

N j Арг/Ар ; г 1 Арг/Про Про/Пр о

Здоровые лица группы сравнения Пациенты с латентной формой ПВИ 15 14(27%) 1 1 15 [ 7 (47%) 1 i ! iö (67%) 6(40%) 1 (6%) 2(13%)

Пациенты с клиническими проявлениями ПВИ Пациенты с интраэпителиалыюй неоплазией легкой степени 15 16(46%) 1 15 " j 7 (50%) I 1 1 i I 5 (38%) 5 (38%) 2(16%) 2(12%)"

(ciNi) : : 1 T

ill [

У вирус папиллома-отрицательных пациентов преобладали гетерозиготные формы белка р53 (Арг/Про - 67%), в то время как в материале, полученном от вирус папиллома-положительных больных, их доля не превышала 38-40%.

При использовании для оценки полиморфизма гена р53 метода аллельспецифической ПЦР среди здоровых женщин группы сравнения (вируса - 16 отрицательных, п=15) и пациенток с инфекцией (вируса - 16 положительных, п=8) (табл. 4), были получены результаты, аналогичные вышеописанным при использовании метода конформационного полиморфизма: у пациенток с позитивным результатом ПЦР анализа на наличие ВПЧ-16-типа был установлено преобладание в 72 кодоне р53 аллеля Арг/Арг (83%), в то время как гетерозиготная форма (Арг/Про) регистрировалась со значительно меньшей частотой (17%), а форма, гомозиготная про пролину, вообще не регистрировалась (0%). В группе вирус - отрицательных пациенток картина была противоположной: с наибольшей частотой была представлена гетерозиготная форма аллеля Арг/Про (67%), в то время как гомозиготные аллели встречались значительно реже (Арг/Арг-27%; Про/Про- 6%).

Таблица 3

Полиморфизм 72 кодона р53 у пациенток (метод аллельспецифической

ПЦР)

ВПЧ-позитивность Полиморфизм 72 кодона р53

п ; Арг/Ар 1 ! Г Арг/Про Про/Пр 0

ВПЧ-отрицательные образцы 15 ! 4(27%) 10 (67%) 1 (6%)

ВПЧ-16 положительные образцы 6 | 5 (83%) 1 (17%) 0

Для изучения ассоциации полиморфизма 72 кодона гена р53 и характера изменений цитологической картины шейки матки были обследованы пациентки с неизмененной цитологической картиной шейки матки (п=6),

«смешанной» (чередование участков «нормальной» цитологии и CIN1) цитологией и с легкой степенью цервикальной неоплазии CIN I (п=8), Полученные результаты показали отсутствие достоверных различий распределения аллелей в 72 кодоне гена р53 у больных папилломавирусной инфекцией с различными цитологическими изменениями шейки матки (Р>0,1).

Таким образом, как показали исследования, проведенные с использованием двух методов изучения полиморфизма 72 ко дона гена р53, присутствие гомозиготы Арг/Арг в 72 кодоне гена р53 обеспечивает повышенную восприимчивость макроорганизма к вирусам - 16 типа. Вместе с тем, никакой выраженной ассоциации между генотипами р53 и клиническими проявлениями папилломавирусной инфекции, обнаружено не было, что могло быть обусловлено присутствием у обследованных вирусом папилломы разных типов. Достоверной взаимосвязи между наличием аллеля Арг/Арг 72 кодона гена р53 с и характером изменений цитологической картины также не выявлялось. В этой связи на следующем этапе работы было проведено изучение вариаций вирусной ДНК функционально активных областей вируса и взаимодействия гена р53 человека с геномом вируса 16 типа, который, как известно, встречается у 50-80% пациентов с цервикальным раком.

Изучение вариаций нуклеотидной последовательности LCR, Е6 и Е7 вируса папилломы человека 16 типа.

Для изучения проонкогенной роли вируса16 типа был проведен анализ вариаций вирусной ДНК вируса папилломы человека 16 типа, который заключался в сравнении нуклеотидных последовательностей 3' конца LCR и Е6 и Е7 открытых рамок считывания ДНК. Контролем служила каноническая последовательность вируса 16 типа Е-350Т. .В результате проведенного исследования у большинства пациентов было установлено наличие одной или более нуклеотидных замен в функционально активных областях генома вируса 16 типа по сравнению с контрольной нуклеотидной последовательностью: В LCR области вируса нуклеотидные замены обнаруживались в 82% случаев (в основном замены G на А в положении 7521); внутри гена Е6 - в 64% случаев (в

основном представлены замены Т на G в положении 350го нуклеотида). Область гена Е7 оказалась наиболее консервативной с наименьшим количеством замен - 17% случаев (в основном замены Т на G в положении 795 нуклеотида), идентифицированных как «молчащие» мутации, т.к. каких-либо фенотипических изменений или особенностей клинических проявлений инфекции, специфичных для данной мутации, обнаружено не было. Частота замен в нуклеотидных последовательностях исследованных областей генома вируса папилломы 16 типа зависела от формы заболевания и регистрировалась у всех больных с клиническими проявлениями инфекции, у 84% больных с CIN I и у 67% лиц с латентной формой инфекции. Полностью гомологичная нуклеотидная последовательность к вирусу -16 Е-350Т была установлена у 33% пациентов с латентной формой папилломавирусной инфекции, у 16% пациентов с CIN I и ни у одного пациента с наличием клинических проявлений. Наиболее частым вариантом были замены Т на G положении 350 нуклеотида внутри Е6 области, которые регистрировались у всех пациентов с папилломавирусной инфекцией. Варианты с заменами G (350G) были обнаружены у 60% пациентов с клинической формой инфекции, у 33% больных с латентной формой инфекции, у и 33% у пациентов с CIN I. В результате изучения с помощью 2-х вариантов ПЦР (детектировавших ген G, либо Т-содержащий) взаимосвязи между характером цитологических изменений шейки матки и частотой нуклеотидных замен 350 G/T гена Е6 вируса папилломы человека 16 типа, проведенных у пациенток с «нормальной» цитологией шейки матки (п = 6), лиц с CIN I (п=8) и со «смешанной» цитологической картиной, включавшей как «норму», так и участки CIN I (п~8), устойчивой корреляции между полиморфизмом гена Е6 и состоянием цитологических изменений выявлено не было: частота встречаемости вариантов 350Т вируса 16 типа была идентичной у пациенток с неизмененной цитологической картиной и с CIN I (66%) и несколько ниже - у лиц со «смешанной» цитологией (40%). Вместе с тем при изучении возможных коввеляпий между полиморфизмом

350G/T гена Е6 вируса 16-го типа

72 кодона р53 у

пациентов с папилломавируспой инфекцией, проводившемся на пациентках, сгруппированных по аналогичному принципу (12 человек с «нормальной», 10 -со «смешанной» цитологией шейки матки и 12 - с CIN I) был обнаружен ряд «настораживающих» моментов. В исследование были включены 20 женщин, гомозиготных по аргинину и 14 человек, гомозиготных по пролину и гетерозиготных (таблица 4)

Таблица 4.

Частота регистрации 350G/T полиморфизма вируса-16 у пациенток с различной цитологической картиной шейки матки: (а) Арг/Арг и (б)

Арг/Про и Про/Про

А) Цитологические Арг/Арг

исследования

;n i 350T i 350G

Нормальная цитология ; i® j 4 (40%) Г 6(60%)

Смешанная форма ¡4 [2(50%) ¡2(50%)

CIN I | 6 j 4 (66%) I 2(34%)

Б) Цитологические \ Про/Про и Про/Apr

исследования

! 35ÖT 1 35ÖG

Нормальная цитология \i ¡"2 (100%) i 0 i

Смешанная форма ; 6 ; 4(66%) ; 2 (34%)

CIN I I 6 ] 4 (66%) ! 2(34%) l

В результате проведенных исследований установлено, что у пациенток, гомозиготных по аргинину (Арг/Арг 72 кодона р53) при CIN I цитологической форме заболевания наиболее часто регистрировался вариант 350Т гена Е6 вируса 16 типа (у 66% обследованных: для сравнения - вариант 350G в этой группе встречался почти вдвое реже - 34%), тогда как у пациенток с «нормальной» цитологической картиной чаще наблюдался вариант 350G вируса-16 (у 60% больных: для сравнения - частота варианта гена 35 ОТ в этой

группе пациентов составила 40%). Таким образом, у пациенток, инфицированных 16 типом вируса, ассоциация между мутациями в гене р53 (аллель Лрг/Арг), вирусом папилломы человека 16 типа и дисплазией оказалась строго достоверной (р=0,027). Существенной разницы в частоте регистрации полиморфизма 350G/T гена Е6 вируса -16 типа в зависимости от цитологической картины у женщин, гомозиготных по пролину (Про/Про) и гетерозиготных (Арг/Про), установить не удалось.

Лечение пациентов с папилломавирусной инфекцией. Существующие в настоящее время методы лечения папилломавирусной инфекции не всегда оказываются эффективными и не гарантируют наступление клинического излечения или отсутствия появления рецидивов заболевания после завершенного лечения. Принимая во внимание роль выявленных нарушений клеточного иммунитета у пациенток с папилломавирусной инфекцией в прогнозе заболевания, были разработаны подходы к проведению их лечения.

Основными критериями при выборе тактики терапии являлись: особенности клинической картины заболевания, характеризующейся торпидным, длительным течением и частыми рецидивами процесса, и данные иммуно-генетических исследований, прежде всего - обнаружение неблагоприятного в плане прогноза излеченности Th2 цитокинового профиля в клетках цервикального канала.

С целью коррекции выявленных нарушений пациентам назначался препарат ИНТРОН-А (interferon alfa-2b), рекомбинантный интерферон альфа-2Ь в лекарственной форме лиофилизированного порошка для инъекций. Препарат вводили в дозе 3 млн.МЕ внутримышечно, предварительно растворив порошок Интрона-А в 1 мл стерильной воды для инъекций. Инъекции производились 3 раза в неделю (через день), всего на курс 7 инъекций.

При наличии у пациентов остроконечных кондилом перед началом терапии Интроном-А их удаляли с помощью деструктивных методов (криодеструкция, лазеро- и диатермокоагуляция и др.). После завершения

курса лечения за пациентами осуществляли наблюдение сроком от 3 месяцев до 1,5 года.

Лечение Интроном -А было проведено 10 пациентам, в том числе: 3-м - с латентной формой инфекции, одной пациентке с клиническими проявлениями и 6-ти больным с тяжелым течением инфекции, сопровождавшейся наличием интраэпителиальннрй неоплазии легкой степени.

Как показали результаты отдаленных наблюдений, рецидив инфекции был отмечен у 3-х пациенток. У больных с тяжелой формой заболевания, сопровождавшейся частыми рецидивами, уменьшилось число рецидивов. Анализ динамики цитокинового профиля пациенток после окончания терапии показал наличие его трансформации из ТЬ2 в ТЫ - профиль у абсолютного большинства (60% ) больных папилломавирусной инфекцией.

Таким образом, результаты терапии больных тяжелой вирусной инфекцией препаратом ИНТРОН - А являются обнадеживающими, т. к. применение препарата позволяет добиться уменьшения частоты рецидивов и изменяет цитокиновый профиль пациентов на более благоприятный в плане прогноза излеченности. Вместе с тем при определении тактики лечения больным ПВИ нельзя опираться только на результаты клинического обследования. В целях индивидуализации терапии при обнаружении генотипа вируса 16 типа (высокого онкогенного риска) пациенты должны быть подвергнуты всестороннему обследовапию, по возможности, с использованием методов иммунологии, генетики и молекулярной биологии. Доступным и перспективным диагностическим тестом для прогнозирования риска злокачественной трансформации инфицированных тканей, а следовательно, и индивидуального выбора лечебных, диагностических и профилактических мероприятий у каждого конкретного больного может быть изучение корреляции между уровнем цитокинов 1 и 2 типов в цервикальном секрете и физическим статусом ДНК вируса. Практические рекомендации.

Результатом проведенного исследования можно считать разработанный комплексный подход к диагностике папилломавирусной инфекции и определению и своевременному выявлению наиболее значимых факторов риска развития злокачественной трансформации пораженных тканей, основанный на изучении иммуно-генотипических особенностей организма человека и возбудителя.

Одним из существенных этапов диагностики вируса папилломы человека в клинике следует считать выявление типа вируса. Этот подход уже используется в практическом здравоохранении, однако до настоящего времени он не претерпел процедуры жесткой стандартизации. Как следует из результатов нашего исследования, лечение инфекции пациентам без видимых клинических симптомов манифестации инфекции, зависящих от индивидуальных особенностей пациента, вряд ли следует считать показанным, однако необходимо предпринимать меры по усилению контроля за распространением этой вирусной инфекции среди населения, ведущего активную половую жизнь, в целях предотвращения передачи вирусом половым путем. Алгоритм обследования больных с выраженными клиническими проявлениями папилломавирусной инфекции должен базироваться на определении спекгра бактериальных патогенов, типа вируса, особенностей его физического состояния (интегрированная, смешанная или эписомальная формы ДНК), оценке адаптационных ресурсов организма человека (уровень экспрессии м-РНК цитокинов), наличии или отсутствии Тх1 ответа, морфологической оценке степени малигнизации ткани. Таким образом, в процессе обследования пациентов с инфекцией и исследования иммуногенетических параметров вируса накапливаются данные, характеризующие особенности биологии вирусного агента, а также генетические и функциональные особенности организма макроорганизма, определяя тактику ведения пациентов.

К числу наиболее вероятных предиктивных факторов злокачественной трансформации поражаемых при инфекции тканей, как это следует из представленных данных, можно отаести: обнаружение вируса 16 типа, наличие у пациенток интраэпителиальной неоплазии легкой степени - CIN I, проонгкогенный гуморальный (Th2) профиль цитокинов в цервикальном секрете, обнаружение интегрированной формы ДНК вируса папилломы, гомозиготность белка р53 по аргинину больных папилломавирусной инфекцией , наличие нуклеотидных замен в функционально активных областях (LCR, Е6, Е7) генома вируса. Выводы:

1. В результате скрининга на наличие вируса папилломы человека 9146 женщин Москвы и Московской области, обращавшихся в клинику для исключения инфекций, передаваемых половым путем, методом ПЦР установлена высокая степень их инфицированности — 1280 человек (14%) с преобладанием типов вируса среднего (31, 33, 35, 52 - 38,6%) и высокого (16,18 - 29,8%) онкогенного риска и наличием достоверных (р< 0,001) сочетаний вируса папилломы с облигатными (С .trachomatis) и условнопатогенными (Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum, Gardnerella vaginalis) возбудителями инфекций, передаваемых половым путем.

2. Установлено, что у пациенток с отсутствием клинической симптоматики папилломавирусной инфекции зарегистрировано отсутствие преобладающего цитокинового профиля, что может быть обусловлено относительным биологическим равновесием между организмом человека и возбудителем и является показателем благоприятного течения болезни. У больных манифестными проявлениями инфекций преобладают цитокины, продуцируемые Т хеллерами первого порядка, свидетельствующие о благоприятном исходе заболевания.

У пациенток с наличием цитологически определенной интраэпителиальной неоплазией легкой степени наблюдается

значительное повышение экспрессии цитокинов 2-го типа, что является предвестником вероятности развития злокачественной трансформации.

3. Разработал метод генотипирования вируса папилломы человека на основе твердофазной гибридизации с типоспецифическими олигонуклеотидными зондами и прямой регистрацией флюоресценции типоспецифического зонда, связанного с продуктом, имеющий более высокую специфичность в сравнении с ИФА и ПЦР при определении генотипа вируса.

4. Разработан метод определения физического состояния ДНК вируса папилломы человека на основе технологии ПЦР в режиме реального времени с обратной транскрипцией, позволивший выявлять одновременное присутствие и количественное соотношение у пациенток двух форм ДНК вируса: эписомальной и интегрированной. В результате обследования данным методом у 14,3% пациенток (лица с интраэпителиальной неоплазией ) установлено наличие интегрированной, у 33,3% -смешанной и у 52,4% - эписомальной формы ДНК вируса.

5. Методами конформационного полиморфизма и аллельспецифической ПЦР установлено, что присутствие аллели Арг/Арг в 72 кодоне гена р53 обеспечивает повышенную восприимчивость макроорганизма к инфицированию вирусом папилломы 16 типа. Женщины с гетерозиготной формой белка р53 в значительно меньшей степени подвержены инфицированию ВПЧ, чем женщины, гомозиготные по аргинину (38% против 50% по результатам метода конформационного полиморфизма и 17% против 83% по данным метода аллельспецифической ПЦР).

6. В результате анализа вариаций нуклеотидной последовательности областей генома вируса папилломы 16 типа LCR, Е6 и Е7 установлена высокая частота замен нуклеотидов в нуклеотидных последовательностях функционально активных областей генома вируса

папилломы 16 типа, свидетельствующая об изменениях их свойств, высокой степени вероятности трансформации ДНК вируса в интегрированную форму и зависевшая от формы заболевания. Наиболее частым вариантом были замены Т на G в положении 350 (у всех обследованных) и G (350 G), которые регистрировались у 60% пациентов с клиническими проявлениями папилломавирусной инфекции, у 33% латентной формой у 33% - с наличием цитологически определенной интраэпителиальной неоплазией шейки матки легкой степени.

7. Разработаны критерии диагностики риска развития злокачественной трансформации инфицированных тканей пациентов папилломавирусной инфекцией, к которым отпосятся.обнаружение вируса папилломы 16 типа, проонпсогенный гуморальный (Th2) профиль цитокинов в цервикальном секрете, обнаружение интегрированной формы ДНК вируса; гомозиготность белка р53 по аргинину больных; наличие нуклеотидных замен в функционально активных областях (LCR, Е6, Е7) генома вируса папилломы человека.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Применение твердофазного флуоресцентно-гибридизационного анализа в детекции продуктов амплификации С. trachomatis, Micoplasma hominis, Ureaplasma Urealyticum / Кубанов A.A., Ильина E.H., Туркин П.С. и др. // Матер. VIII Всероссийского съезда дерматовенерологов, М., 2001. -С.197.

2. Кубанов A.A., Богатырева И.И.// Особенности клинических проявлений и тактика лечения больных папилломавирусной инфекцией, в сочетании с другими ИППШАктуальные вопросы терапии инфекций, пердаваемых половым путем, и хронических дерматозов: Матер, научн.работ науч.-практ. конф. - Екатеринбург, 2002. - С.116.

3. Кисина В.И.. Кубанов А.А.//Значение урогенитальных инфекций в развитии фоновых и диспластических заболеваний шейки матки./Современные проблемы детской дерматовенерологии и микологии: Матер. Всерос. Конф. М.,2002. - С. 17-19.

4. Дробышева H.H., Кубанов А.А.//Случай сочетагаюй герпесвирусной и папилломавирусной инфекции у девочки 14 лет./Там же. - С.73-74.

5. Кубанов А.А.//Современные методы диагностики папилломавирусной инфекции./Там же. - С.76-77

6. Особенности клинических проявлений и тактика лечения больных аногенитальной папилломавирусной инфекцией, протекающей на фоне других И111111. / Гомберг М.А., Кубанов A.A., Богатырева Ю.Ю. и др.//Матер. I Всероссийского конгресса дерматовенерологов. Санкт-Петербург, 2003. - С. 152.

7. Интрон А в комплексной терапии больных аногенитальной папилломавирусной инфекцией (16,18 типы). / Кубанов A.A., Кисина В.И., Богатырева И.И. и др.// Там же. - С.157.

8. Кубанов A.A. // Идентификация генотипов ПВЧ путем амплификации участка LI области вирусного генома с последующей гибридизацией с типоспецифичными зондами. / Там же. - С. 158.

9. Кубанов A.A. // Определение физического статуса ДНК ПВЧ типа 16. / Там же.-С. 158.

Ю.Кубанов A.A. // Цитокиновый профиль в цервикальном секрете при папилломавирусной инфекции. / Там же. - С. 159.

11.Частота носительства различных серотипов вирусов простого герпеса и папилломавирусов у лиц с урогенитальными инфекциями./Кисина В.И.. Говорун В.М., Кубанов A.A. и др.//Матер. Конгресса «Человек и лекарство», М., 2002. - С.208.

12.Кубанов A.A. // Ассоциации ПВЧ с бактериальной и вирусной микрофлорой урогенитального тракта./Матер. VIII Всероссийской конференции дерматовенерологов., М., 2004. - С.31.

13.Кубанов A.A. // Уровень цитокинов в цервикальном секрете у пациентов с папилломавирусной инфекцией./ Там же. - С.32.

14 Кубанов A.A. // Применение рекомбинантного интерферона - 62В (интрона - а) в терапии пациенток с папилломавирусной инфекцией./ Там же. - С.32/

15.Кубанов A.A., Лазарев В.Н., Ильина Е.И.// Разработка методов для определения физического статуса ДНК ПВЧ/ Матер. VII Всероссийской конференции дерматовенерологов., Нижний Новгород., 2004. - С.69-70.

16.Кубанов A.A.. Лазарев В.Н., Ильина Е.И.// Генотипирование ПВЧ с помощью твердофазной гибридизации с типоспецифическими зондами./ Там же. - С.70.

17.Кубанов А.А.//Исследование цитокинового профиля в цервикальном секрете пациенток с папилломавирусной инфекцией./ Там же. - С.70.

18.Кубанов A.A., Лазарев В.Н., Ильина Е.Н.//Частота выявления ВПЧ среди пациентов с ИППП./ Там же. - С.70.

19.Кубанов А.А.//Анализ полиморфизма гена р53 при различных формах генитальной палилломавирусной инфекции./ Там же. - С.71.

20.Кубанов А.А, Кисина В.И.. Частота и характер фоновых и диспластических процессов шейки матки при бактериальных и вирусных инфекциях.//Вестник дерматологии и венерологии. - 2003. - №2. - С 4346.

21.Кубанов A.A. Современные методы диагностики вируса папилломы человека.// Вестник дерматологии и венерологии. - 2005. - N1. - С.26-35.

22.Кубанов A.A. Результаты генотипирования вируса папилломы человека при скрининговом исследовании в Московском регионе. // Там же. - С.51-55.

23.Кубанов A.A. Характеристика интерферонового и иммунного статуса у больных с папилломавирусной инфекцией. // Вестник дерматологии и венерологии. - 2005. -N2. - С.9-13.

24.Кубанов A.A. Содержание интерферона-у, фактора некроза опухоли-а, интерлейкинов -4 и -12 в цервикальном секрете у пациентов с папилломавирусной инфекцией.//Там же. - С.36-39.

25.Кубанов A.A. Факторы риска инфицирования вирусом папилломы человека и молекулярные механизмы злокачественной трансформации инфицированных тканей.// Вестник дерматологии и венерологии. 2005. - №3. -С.21-23.

26.Кубанов A.A. Изучение физического статуса ДНК вируса папилломы человека.//Там же. - С.50-54.

27.Кубанов A.A. Современные подходы к лечению папилломавирусной инфекции кожи и слизистых оболочек.// Вестник дерматологии и венерологии. - 2005. - N 4 - С.8-11.

28.Кисина В.И., Кубанов A.A. Патологические процессы слизистой оболочки шейки матки, ассоциированные с вирусом папилломы человека.//Там же. - С.29-32.

29.0рганизация специализированной помощи пациенткам с генитальной папилломавирусной инфекцией./Евстигнеева Н.П., Кубанов A.A., Гомберг М.А. и др.//Метод. Письмо Министерства здравоохранения и социального развития РФ, М., 2005. - С. 16.

I»

<

№25081

РНБ Русский фонд

2006-4 29876