Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Гемопоэз в условиях естественной инволюции тимуса и при его экспериментальном дефиците

АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СССР

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЙ научный ЦЕНТР

На правах рукописи

ТОДРИЯ Тамара Владимировна

ГЕМОПОЭЗ В УСЛОВИЯХ ЕСТЕСТВЕННОЙ ИНВОЛЮЦИИ ТИМУСА И ПРИ ЕГО Э КС П Е Р И М Е Н ТАЛ Ь Н ОА1 ДЕФИЦИТЕ

(14.00.29 — гематология и перелипапие кропи)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

) ^ / /

Москва 1991

Работа выполнена во Всесоюзном ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени гематологическом научном центре Академии медицинских наук СССР.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Т. И. Булычева,

доктор биологических наук В. М. Манько,

доктор биологических наук, профессор

А. Г. Конопляшшков.

Ведущая организация — Всесоюзный онкологический научный центр АМН СССР.

защита состоится « /9. » .^(¡¿ШАЯ . . 1992 г.

в « ./У» час., (на заседании специализированного совета

Д 074.08.02 при Всесоюзном ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени гематологическом научном центре Академии медицинских наук СССР (125167, Москва, Новозыковский проезд, д. 4а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всесоюзного гематологического научного центра.

Автореферат разослан «

г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

В. Д. РЕУК

fHJitcfiUtt

ИШД f ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

■V P j

.1Ле^ктгадьность проблемы. Последнее тридцатилетие ознаменова-дстазйЬуительннм ус эхом в развитый тиыологии - неуки, изучаю-0й фиьиологт тимуса. Описаны первые этапы дифферь.щирвки рвтимоцитов в тимусе, охарактеризованы раз: ш^ыв субпопуляида Т-леток, их маркерный.репертуар, отражающий разные стадии врутри-1!мич9ской дафференцировки, и показана эссенциальная роль Т-кле-ок в становлении ишунного ответа (На:пез, 1990; Miller, 1990).

Вместе с тем, физиологическая роль тимуса в организме июкогштающих и человека гораздо шире и выходит за рамки [сключитально его иммунологических функций, старение организма -«на : i трудно разрешимых загадок не только геронтологии, но и 'ематологии. Старение сопровождается инволюцией тимуса и юзрастннми изменениями нормального кроветворения. отсюда юзникает ряд проблем: как связаны эти два процесса, что является фичиной возрастных изменений функционирования кроветворной скани, например, анемии у старых особей. Вызвана ли она зарушением имманентных свойств стволовых кроветворных клеток 1СКК), или в основе наблюдаемых лзменешй лежат возрастные зсобености функционирования кроветворного микроокружения, возможно, нвклиниче .кие изменения гёмопоэза у старых особей -зледствие нормального физиологического процесса, вызванного аоараст-зависимым изменением баланса ростовых факторов, регулирующих запрос-чувствительную категорию предшественников задела стволовых клеток.

В свпзи с важным значением исследований нормального' гёмопоэза, в последние года особое внимание удьляется лимфоидным клеткам тимусного троисхоэдгняя как регуляторам гёмопоэза. основанием этому послужил накопленный эксшришнтал: ннй и к/чнич^'чай материал, по вяшзнни! исследованию свойств СКК. Л числу OCHOF'MX достш. лгой гоматолот относится доказательство существсзания СКК, в результате пролиферации й дайеренцировки которых образуется многообразие клеток крови. Установл ше факта существования запрос-независимы^ и запрос-чувствительных категорий предшественников, т.е. иерархии СК::, позволило прклти г принципиальному заключению о том, что процессы дифференцировки т4 кроветворной системе сопровождаются сменой типов регуляции.

Регуляция запрос-независимой: категории СКК носит локальн характер и связана с функционированием стромы кроветворн органов' (Чертков И.Л., Гуревич O.A., 1984). Количественная ; регуляция основана на функционировании системы спецнальн гормонов и происходит на уровне коммитированн клеток-предшественников соответствующих, рядов кроветворен (Metcali, 1989).

К семейству ростовых факторов относятся лимфоки (интерлейкины), продукты активированных Т-лимфоцитов нелимфоидаых клеток, в том чиоле моноцитов, $ибробластов эцдотелиэльных клеток, являющихся компонентами кроветворно микроокружения.

Удобной моделью для изучения неканонических, ч. неиммукологических функций тимуса, . являются . мши тимэктомированные в период максимальной активности тимуса, У - через 1 месяц после удаления тимуса у таких «ивотных исчезает периферической крови фракция корогкоживущих .■ лимфоцг тов тимическиэ гуморальные факторы. Через 6-г мес. отмечайся стойн нарушение иммунореактивности, вызванное дефицитом субпопуляш зрелых т-клеток (Taylor, 1966). Таким образом, у тимусдефицита мышей искусственно нарушена связь между тимусом ч СКК, с ода стороны, и тимусом и кроветворным микроокружением, - с друге Удаление тимуса у молодых животных в период его максимальв активности более адекватно отражает процессы естественно старения организма, чем неонатальная тимэктсмия. В последа случае изучение свойств СКК затруднено из-за практически полис отсутствия иммунологической защиты и ранней смерти опэрированк мышей.

Целью настоящей работы явилось изучение физиолог кроветворных и стромалыш клеток-предшественников и взаимодействий при стареют, с акцептом на одно из регулируют кроветворение звеньев, триаду "тимус - строма - СКК".

Задачи ^сслеловагаш,

1. Изучить основные свойства стволовых кроветворных клеч (их содержание в костном мозге, пролиферативный потенциг характер дафференцировки) у тимэктомнрованкых мышей i

внове.сном кроветворении.

2. Установить причину слабой защитной способности костного зга тиыэктомированных мышей в условиях запросного оветворения, т.е. в процессе восстановления кроветворения у лученных реципиентов.

3. Исследовать особенности формирования кроветворного [кроокружения стромвльннми клетками-предшественниками из четного мозга тимэктомированннх мышей.

4. Сравнить свойства клеток кроветворной стромы (свойства ¡етск, переносящих кроветворное микроокружение и индуцибельшх фомалышх предшественников) тшэкто>.шрованннх мншей с таковыми

г нормальных животных.

5. Сравнить особенности формирования эктопических очагов юветворения костномозговыми я циркулирующими в периферической

стволовыми кроветворными клетками тимэктомированных мышей.

6. Изучить способность к репарации сублетальных радиационных )врездений в стволовых кроветворных клетках в период цре- и зстнатального развития мшта (ембрионалы "я печень, костный эзг).

?. Оценить способность к внутриклеточной репарации ублетальннх радиационных повреждений клетками-предшествонниками ровэтворного микроокрукения, и установить зависимость изучг :?мого вления от факторов химической природы.

Вечная новизна.

описаны особенности функционирования стволовые кроветворных латок и -стромальных клеток-предшественников при ршюпсном роветворении на протяжении всей жизни животного и показана ависшость ряда генопоэтичоских параметров от факторов имической природа.

При стабильном гемопоэзэ выявлено ингиоирущее действие имуса на мегакариоцитопоэз.

На модели радиационных химер установлено, что в у ловиях опросного кроветворения такой в^кный показатель как гролиферативный потенциал СКК находится под контролен факторов ■имической природы.

Выявлена сложная регуляторная роль тимуса в функционировании гроветворного микроокружения. Непосредственно тимус не в лило г на

стромальные клетки-предшественники, способные к перенос; кроветворного микроокрукения. Вместе с тем, показано, чт< циркулирующие СКК из периферической крови являете; тимус-зависимыми, а от качества гемотоэтических клеток, в сво! очередь, зависчт характер функционирования стромы.

впервые показано, что строиальные '• летки-предшественнию восстанавливают суСлетальные радиационные повреждения; способность к репарации не зависит от функциональной активности тимуса

Практическая ценность.

Получены резульгы принципиального характера, расширящи! наши представления о функциях тимуса в оргашзме млекопитающих 1 о физиологии нормального кроветворения в прог.зссе старения Участие тимуса и его дериватов в регуляции кроветворения носи1 сложный характер: опосредованный - на строму кроветворных • органов и непосредственный - на разные категории стволовш кроветворных : теток.

Доказательство участий, тимуса в регуляции пролиферативног« потенциала КОЕс имеет важное значение для клшшческо! гематолог™, так как позволяет приблизиться к пониманию причи неудачных трансплантаций костного мозга и неуспешной терапии ряд; гематологических заболег-чай, вызванных облучением и протекающие на фоне тимус-дс ¿идитшх состояний.

Данные о регуляции мегакариоцитопоэза о-кривают новый подхо; к изучению механизмов тромОощйшений у больных с различным! гематологичезким.: заболеваниями.

Внутриклеточная репарация сублеталеных радиационше повреждений - один из процессов, определяющих степень поражени; тканей от воздействия ионизирующих иг тучений. Доказательс в< высокой способности к гчпарации сублеталей ] клэтках-нредживекниках кровгтвордой стромы имеет. теоретичесш и практическое значение. Понимание механизмов восс ?аноЕлени! от радиационных повреждений в рэзннх клеточных системах важно' дл; разработки методов терапии последствий облучения.

Внедрение, в практику. '

Основные результаты работы, имеющие общебиологич<" ко< значение, внедрены в курс лекций для студентов биологов и 1учны:

сотрудников кафедры цитолигш, гистологии эмбриологии Тбилисского Государственного Университета. Итоги диссертационной работы доложены на конференциях и Всесоюзных симпозиумах. Проведено обучение научных сотрудников из различных институтов страны медико-биологического профиля.

05ЖМ_й_ст2укт2ва_диссертации.

Диссертация изложена на 309 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литьратуры, описания материалов и методов и 4-х глав результатов собственных исследований, заключения, выводов. Работа иллюстрировала 4? таблицами и 27 рисунками. Список литературы содержит 530 отечественнх и зарубежных источников.

Основные_полокенил_ррботг1_винес81шые_на_защитх.

Изучена свойств стволовых кроветворных и стромальных клеток-предшественников ни модели взрослых тимэктомированных мзшей позволило получить некоторые принципиально новне данные, которые выносятся на защиту:

- показало, что при равновесном кроветворении стволовые кроветворные клетки не чувствительны к Фактора!/ тимической природы; содержание селезеночных колониеобразующих единиц (КОЕс), их пролиферативный потенциал и дифферевцировочные свойства возраст- й тимус-независими; •

- на основании описания, морфологического состава селезеночных колоний установлена роль тимуса в регуляции мегакариоцитарного ростка кроветворения;' удаление тимуса стимулирует пролиферацию мвгакариоцктарных" колоний, способствует увеличв! м пролифератиВной активности и скорости согревания мегакариоцитов;

получены чвткчв доказательства зависимости г^олиферативного потенциала КОЕс от факторов тимической природа в условиях,- запросного кроветпорв! г;;; у радиационных химер, ьог-тановленннх костнш мозгом тимэкгомировашиг мышей, снижение защитной способности кос юго ы.шзгзно уменьы&шем проЛифератишого пстнидавла КОЕс;

- етромалыше клбтки-иредавстьемнпки из ксстн'-го мозга тимэктомироьашшх инысй в условиях геторотслпюп трансплантации

костного мозга стро..г полноценное кроветворное микроокружение обеспечивающее нормальные условия для функционировани репопулируквдх стволовых кроветворных клеток; обе категори стромальннх клеток-предшественников - "роветворное миклэокружени переносящие единицы и индуцибельные предшественники функционируют нормально, и, следовательно, регуляция стромг"ьны клеток-предшественников тимус-независима;

- на модели гетеротопной трансплантации костного мозг получено доказательство зависимости функционирования СКК "о тимуса (второе четкое доказательство в системе ин вивс.); нарушен содержание ранних гемопоэтических предшественников ^К0Ес-11 сут. в очагах гетеротопного кроветворени,., репопулярованны циркулирующими СКК тимэктомированных мыш^й; частично восстановление нормального уровня НОЕс в очагах происходи! поел имплантации тимуса тимэктомированшм реципиентам;

доказано, что механизмы репарации сублегальны радиационных повреждений формируются в период змориснальног рг. вития мыши, но максимальной реализации достигают во взросло« костном мозге; степень репарации субл^тальных радиационнн п вреждений различна для клеток-предшественников, находядахс? на разных уровн; х в иерархии .стволовых клеток;

- стромальные клерки-предшественники способны репарировач сублетальные радиационные по: рездения; тим^ктомия не нарушае процессы внутриклеточной репарагм.

В целом представленна" 'работа две? новые сведения свойствах и кооперативных взаимодействиях стволовых' кроветворнь и стромальных клеток-предшественников. Впервые получен один V немногих четких эффектов тммэктомии в системе ин виво. частности, у -имэктомированных животных нарушена регул,¡щ пролифепативного потенциала КОЬо. В условиях стабильно! кроветворени?. и в процессе старения животного, сопровоадаэдегос инволюцией тимуса, фундаментальные свойства стьолов! кроветворных клеток, регулируеше кроветворным микроокрувениеь не изменяются.

Работа выполнена в лаборатории физиологии кроветворен! (заведующий -- профессор ИЛ. ЧЕРТКОВ) ВГНЦ АМН СССР.

В работе использованы данные, полученные автором совместно с другими специалистами

Изучение внутриплете юй репарации сублетальных радиационных повреждений в стволовых кроветорных клетках выполнено . совмести со старшим научным сотрудником лаборатории $ экологии нроветвореяы, канд. биол. лаук О.И. ГАН.

материмы и метода исследования

Работа БУолнена на линейных мышах (С57В1/6хСВА)Р1, самках, в возрасте от 8-10 ьеде :ь (в начале опыта) до 25-26 мес.

"ксперимонталыше группы животных:

- гимэктомированые мыши (ТЭ) - тимэктомию осуществляли в 8-10-недельном возрасте по методу Воузе и соавторов (1971). Полноту удаления тимуса проверяли перед взятием костного м.-зга;

- - че^зз 1-2 мес. после удаления тимуса наркотизированным шшам имплантировали под капсулу л зой почки одну долю тимуса сингэнтах новорожденных мышей (группа: "ТЭ+тимус"). Аналогичной операции подвергали контрольную группу льготных (группа: "ШТ+тимус") в том же возрасте, что и ош'^ную:

-. радиационные химеры - облученным в летальной дгзе шшам (исходно интактиам) через 2-3 часа после облучения вводили внутривенно вавесь костномозговых клеток в дозе БхЮ6 клеток/мышь. Были получены две rpjjnu химер: а) восстановленные костным мозгом от тимэктомироващшх мышей (возраст доноров костного мозга - 11 мес.; после тимэь.томии г^ошло ' мес.); б) восстановленные костным мозгом интактных мышей (возраст доноров костного мозга - 11 мае.).

2бл^ченивмш§й "роЕодаиш на у-^становке ИПК (13?Cs) в дозах от 8 дс 13 Гр, при мощности дозы 0,18 Гр/мин..

f i

Мвтоаы_опЁеаеления_КОЕс. Длг определения колониеоСразуюцих тдиниц селезеночных (КОЕс) был гжшьзован f-етод Lili и McO'illceh (1961/. гЛншей-ре киша нтов облучали максимально переносим^! дозой, ари которой число эндогенны., колоний не превыша,..! 0,2 на

селезэнку. Такая доза составляла 11-13 Гр.

Меюд экзогенных селезеночных колоний определяет только ту часть популяции СКК, которая при внутривенном введении попадает в сэлезенку (КОЕс). Эта часть может меняться в зависимости от качества вводимых клеток и в результате различных воздействий на них. Фактор оседания КОЕс (Г2час; определяли методом, предложенным Slmlnovltch с соавторами в 1963 году.

Пролиферативный потенциал КОЕс определяли по числу дочерних КОЕс в 11-сут. селезеночных колониях. Летально облученным мышам вводили внутривенно клетки тестируемого костного мозга. Через 11 сут. пул гомогенизированных селееэночных клеток инъецировали летально облученным вторичным реципиентам в количестве, эквивалентном 0,1-0,2 • колоний/мышь. Число колоний у вторичных реципиентов с.хределяли через 8 сут. Путем соответствующих расчетов определяли пролиферативный потенциал, т.е. число . дочерних КОЕс на одау первичную колонию.

Для гистологического анализа колоний селезенки фиксировали в жидкости Буэна; заливали в парафин и после рутинной обработки полученнце серийные срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилин-эозином.

Гетерогопная___трансплантация _кдотного____мозг§. Очаги

эктопического кроветворения получали путам имплантации костного мозга под капсулу почки мышей-реципиентов, как описано (Чертков И.Л., Гуревич O.A., 1984).

Основные варианты имплантации костного мозга:

- для изучения способности стромальных клеток предшественников из костного мозга тимэктомированных мышей формировать кроветворное микроокружение, костный мозг тимэктомированных мышей имплантировали под капсулу почки интактщх мышей (ТЭ •* ИНТ);

- для изучения способности циркулирующих кроветворных клеток тимэктомированных мышей заселять очаги эктопического кроветворения, костный мозг интактных мышей имплантировали под капсулу почки тимэктомированых реципиентов (ИНТ ТЭ);

- для изучения способности костномозговых КОЕс формировать эктопические очаги кроветворения у радиационных химер, мышей с предварительно образованными очагами, облучали в летальной дозе и половину из них восстанавливали костным мозгом тимэктомированных

< !

лей, а половину - костным мозгом интактных мышей (табл.1).

Таблица 1

ема получения радиационных химер, содержащих разные по оисхоадению очаги эктопического кроветворения.

й этап 2-й втап 3-й этап

(плантация кост-iro мозга (онор -» реципиент) Облучение мышей летальной дозой (12 Гр) Восстановление облученных мышей костным мозгом в дозе Б млн. клеток/мышь

ИНГ ИНГ Через Z мес. а) от ИНТ мышей

после образова- б) от ТЭ мышей

ния эктопичес-

ТЭ * ИНГ ких очагов а) от ГО мышей б) от ТЭ мышей

Величину и качество образовавшихся очага эктопического роветворения оценивали через 1,6-2 мес. после имплантации остного мозга по числу содержащихся в них кроветворных клеток, о числу КОЕс и их ттролифератив''ому потенциалу.

Наличие индуцибвльных стромалышх предшественников пределяли по индексу стимуляции, который, вычисляли как отношение азмера эктопического. очага, рбразованного в облученном ©ципиенте к таковому в.необученном реципиенте.

Фракщюшюе облучение 'клеток костного мозга и эмбриональной Внутриклеточную' репарацию сублетальных радиационных говреждений в СКК из костного мозга й эмбриональной печени штей, а также в стромалышх клетках-предшественниках изучали на «одели Элкиндовского восстановлений (ЕШпй, Sutton, 195Э; Till, icCulloch, 1963).

SQC™HfLMOBr. Облученным в дозе 6 Гр мышам-ре^шиентам зводали внутривенно взвесь костномозговых клеток в дозе йхШ6 / ■шшъ, Через i час после инъекции клеток часть подопытных мишей дополнительно облучали однократно в дозе 6 Гр . (группа рефракционного облучения - НФ) или фракциошго с интервалом в 1-6

час между равными дозами облучения, по 3 Гр каждая (фракционное . облучение - ФО).

Эмбриональная___печень____мышей____14-18___сут.___развития«

Применялась такая же схема фракционирования дозы облучения, как для костного мозга. Дозы вводимых клеток ембриональной печени были подобраны в-соответствии с показателями радиочувствительност субпопуляций КОЕс (3x10® и бхю^клеток/мшпь для КОЕ-8 су т. и КОЕс-11 сут., соответственно).

Способность к внутриклеточной репарации определяли как отношение числа колоний, полученных при г0 костного мозге (эмбриональной печени), к числу колоний, образованных при однократном (ИВ) облучении, т.е. го индексу репарации (ИР).

Клетки-предшественники' кроветворной: стромы. Мышей-доноров костного мозга облучали однократно в дозе .10 Гр' и фракционно с интервалом от 1 до 7 час мезду факдаямл облучения (в двух дозах , - по 5 Гр). После облучения мюцей костный мозг бедренной кости немедленно имплантировали под капсулу почки нэоблученных сингенных реципиентов. Размер возникавдего эктопического, очаг« определяли до числу кроветворных клеток в нем через 4-6 недель после имплантации костного мозга.

Способность стромальных ' клсток-предшестввнников в внутриклеточной репарации сублэталышх радиационных повревдениг оценивали как отношение числа клеток в очагах, сформировании фракционно облученным коотшш мозгом к4 количеству клеток I трансплантатах, образованных 'однократно облученным . костшл мозгом. , . ' •

Статистическую обработку основного ыаосива результатов проводили по 1~нритерш> Стьюдзнта. Для оценки разлвчй кинетических кривых индексов репарации сублетальных радиадаоннш повреадзний использовали непарамэтрический метод - критврй Колмогорова-Смирнова (х2).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

СТВОЛОВЫЕ КРОВЕТВОРНЫЕ КЛЕТКИ (КОЕс) У ТИМУСДЕФИЦИТИК ЫЫШЕИ

1. Содердьаие оубклассов КОЕс в костном мозге тимэктомированных, мышей, Фактор оседания КОЕс.

Среди костномозговых КОЕс, определяемых классическим методом Till и Mcculloch (1961), выделяют более зрелые предшественники, образующие колонии в селезенке облученных реципиентов на 7-9 сутки (унипотентныэ предшественники), и мультшвшейный субклеоо КОЕс, образующий колонйи на 11-14 сутки fliagll с соавт., 1932). Эти два субкласоа КОЕс обличаются рядом особенностей: способностью к самоподдержвнию, ответом на циклоспецифичэские агенты (Hellman с соавт., 1979; Hodgson.с соавт., 1982, 1984) и составом гистологически типов колоний (Magli с соавт., 1982). В иерархии стволовых клеток KOEc-li-14 сут занимают более высокое положение, чем КОЕс-7-9 сут.

Свойства КОЕс из костного, мозга ТЭ мышей изучали в разные послеоперационные сроки ~ от 4 недель до 25 мес. после тямэктомйи. Контролем служили интактше мыши того же возраста, что й оперированные. Это позволило сравнить показатели костного мозга у мышей с естественной инволюцией тимуса и, в экспериментальной группе животных.

Do мере старения швотннх в' костном мозге увеличивается содержание ' миелокариоцитов, Примерно т текуи so величину увеличивается клеточвость костного мозга у З-х-двтних ТЭ мышей (табл.2), В каадрй возрастной группе we аду костным мозгом ИНГ и ТЭ животных не отиечено достовэршх различай. Приемной возрастных изменений клеточности костного мозга на является инволюция тиыуса$ изменения клеточное?» в постната"Ыюч онтогенезе связанг по-видимому, с. наличием в сыворотке старых животных фактора, способствующего увеличению размер^ кроветворного микрокрукения, регулирующего пролиферации СКК (Гуревич О.А., Чертков И.Л., 1982),

Теблица 2

Бозраст1шо изменения клеточгости костного мозге у тимэктомиров.

ных мышей

Возраст мышей, Клеточность костного мозГа, (хШ6)

мес. ИНГ ТЭ

1-6 15,1 ± 0,8 16,6 ± 1,2

7-12 15,9 i 0,2 16,9 ± 0,8

31 - 25 22,5 t 2,3* 24,0 ± 0,7**

Примечание. * и ** - достоверное увеличение относительно соотв ствувдих показателей в группах 1-6 мес.

Содержание двух субклассов КОЕс определяли на 105 введен костномозговых клеток, и учитывая клеточность костного моз: вычисляли их содержание в бедре. Тимэктомия не влияла относительное содержание в костном мозге как ранних (КОЕс сут.), так и поздних (КОЕс-8 сут.) крэветаорных клеток-предшес венников. Однако, в связи с тем, что с возрастом живот увеличивается клеточность костного мозга, примерно в 1,5 р; увеличивается и содержание двух субклассов КОЕс на Се, (табл.3).

Таблиц:

Содержание двух субклассов КОЕс в костном мозге интактных и

тимэктомированных мышей

Источник Субкласс ___ Возраст животных, мес.__________

костного КОЕс

мозга 1-6 7- 12 21 - г

5585 ± 1 5319 ±

6804 ± 1 6134 ±

ИНТ

.ТЭ

КОЕс-8 КОЕс-11

КОКс-8 К'.)Е"с-И

3377 ± 396 3551 ± 392

4504 ± 401 39S6 ± 737

5545 ± 520 4749 ± 301

5412

4336

318 576

Отсутствие различий можно считать справедливым только в том учае, если- фактор оседания КОЕс из костного мозга интактных и | мышей в селезенке облученных реципиентов примерно одинаков.

Фактор оседания КОЕс (Г2час) из костного мозга интэктних щей в среднем равен 9.5Ж, а из костного мозга ТЭ мышей - 9,8%.

Показано, что различная обработка костного мозга, например, [тостатиками (Vaseort с соавт., 1971), облучением (Croisât с »авт., 1970) или антигенами (Lepault с соавт., 1980) снижает тчение f-фактора. Попытка соотнести зтот показатель с шетическим статусом КОЕс из нормального костного мозга или от фослых ТЭ мышей, у которых КОЕс находятся вне пролиферативного /ла (I'rlnrlel с соавт., 1973, 1976; Lepault с соавт., 1980), не эивела к однозначным результатам. После обработки костного мозга ззличными дозами цитозин-арабинозида, когда больше 50% КОЕс зходится в S-фазе клеточного цикла, не выявлено различий по зктору оседания между циклирующими и покоящимися КОЕс (Dumenll соавт., 1984). По всей вероятности, эти два параметра (Г-фактор кинетический статус КОЕс) не взаимосвязаны. Кроме того, оказано, что при внутривенном введении кроветворных клеток етально облученным реципиентам, не происходит избирательной играции КОЕс из костного мозга или селезенки в кроветворный рган (микроокрукеше), соответствующий источнику КОЕс (Lord с оавт., 1989). Таким образом, идентичность фактора оседания КОЕс з костного мозга интактных и ТЭ мышей подтверждает вывод о имус-независимой регуляции числа костномозговых КОЕс.

2 • 0й9®Ф§Езтивный_потенциал_К0Ес..

Основная проблема в понимании функционирования стволовых гроветворшх клеток сводится к следующему: способны ли СКК к >е оконечной пролиферации (Otiertkoy, 1986; Mlcklem с соавт., 1983) [ли она ограничена конечным числом делений (Нозз с соавт., 1982). йзависимо от точки зрения на продифератиышй потенциял ясно, что ЖК имеют достгггочный резерв для продукции адекватного числа "емопоэтических клеток в течение всей жи: ш швотного.

О целью исследования зависимости пролиферативного потенциала iOEc от возраста животного, а также возможного участия тимуса в регуляций этого свойства, пролиферагивный потенциал КОЕс изучали i интактных и ТЭ мышей разного возраста. Пролифератившй

потенциал определяли по способности клеток . из 11-суточны селезеночных колоний продуцировать дочерние НОЕс (табл.4).

Таблица 4

Пролифератизный потенциал КОЕс (число дочерних КОЕс в 11-су

селезеночных колониях) из костного мозга интактных :

тимэктомироваяных мышей

Возраст доноров Число дочерних КОЕс на одну колонию

костного мозга, мес. ИНТ ТЭ

1,5 69 ад

3 96 т

6,5 60 70

8,5 67 89

10,5 НК 51

20 92 135

•24 120 96

25 83 78

Примечание. ВД - нет данных

В среднем по результатам 7 опытов пролиферативный потенцш КОЕс из костного мозга интактных мышей равен 84 ± Э, а из костнс мозга ТЭ мышей - 87 ± 12 (6 опытов). Различия статистически i .достоверны. ' ,

Полученные результаты подтвервдают точку' зрения возраст-независимой регуляции свойств СКК. Наиболее убедительнь данные, опровергающие точку зрения о снижении пролиферативног потенциала КОЕс в процессе старения животного были получены Harrison (1983). Методом конкурентной репопуляции, т.е. введением смеси костного мозга от молодых, взрослых и стара мышей, была установлена идентичность пролиферативного потанциа/ КОЕс для всех трех возрастных групп.

Удаление тимуса в период его максимальной активности тоже н влияет на такое важное' свойство ФСК, как пролиферативнн потенциал.

.В целом полученные результаты Согласуются с ичтенсивп разрабатываемой в последние года теорией клональной сукцесси

£ау, 1965; СЬегШУ и соавт., 1985, 1986), согласно которой СКК 5ладают высоким, но ограниченным пролифвративным потенциалом и акционируют, образуя сменяющие друг друга клоны иМеренцированных клеток.

3. колоний^

Одно из различий двух субклассов КОЕс связано с характером эзвития морфологических типов, колоний. Так, унипотентные редшественники (КОЕс 7-9 сут.) дифференцируются преимущественно эритроидном направлении (МавИ и соавт., 1982), а ультилинейннв (КОЕс 11-14 сут.) образуют эритроидные и смешанные элонии примерно в' равном соотношении (йМЬазаМ о соавт., 1906; г1ез1еу, »011, 1985).

Распределение гистологических типов колоний, образованных 8-11-сут. КОЕс из нормального костного мозга, согласуется с итературными данными (табл.5). Кроветворные клетки-предшествен-

Таблица 5

патологические типы селезеночных колоний, образованных роветворными клетками —предшественниками из костного мозга нтактных и тимэктомированных ш"ей (в % от суммы колоний)

ипн колоний ___________Костщ[В_мозг_щшей1_____________

интактных___________' тамэктомированных

8-сут, 11-сут. 8-сут. И-сут.

(460)* (410) (490) (62°)

рихроидные 59±2 33±2** 59±5 41±4**

ранулоцитарше 18±2 16'-2 12±2 15±2

егакариоцитарныв 10±2 7±2 1513 20±2

вешанные 4±1 3914® 813 2314®

[еднфференцированнне 8±2 5±2 5±2

[римечаше. * - в скобках - число проанализированных колоний;

** - снижение числа эритроидных колоний с 8 по 11 . сутки достоверно (Р<0,001);

а - увеличение числа смешанных колоний с 8 по 11 сутки достоверно (Р<0,05).

шпсн из костного мозга ТЭ мышей образуют все известные тиг колоний, однако процентное соотношение колоний разных росткс кроветворения отличается ст такового из костного•мозга интактнь мышей. Последнее справедливо для 11-, но не для 8-сут. колоний.

' Для костного мозга ТЭ мышей тоже характерна тенденция уменьшению числа эритроидных и увеличению числа смешанных колою о 8 по 11 сутки (различия достоверны), однако эти изменения I столь выражены. Кром° того, среди 11-суг. колоний замет! увеличена доля мегакариоцитарных колоний (примерно в 3 раза).

Мегакариоцитарные колонии - это единственный тип селезеночных колоний, по которым на гистологическом уровне можно изучав особенности развития клеток в индивидуальных колониях и популяад в цулом. Мегакариоциты - довольно крупные клетки; в них лел идентифицируются фигуры митоза, подсчет которых позволяет оценив их гролифвративнув активность. Основные характеристики мегакари*

• цитарных колоний представлены в табл.6. Независимо от источнш костного мозга характер развития 8-сут. колоний праз гичео одинаков.

Средний размер 11-сут. колоний, образованных костным мозга интактных мышей, увеличен за счет высокой пролифератив» активности клеток, входящих в состав колоний. Основную грута (70%) составляют колонии, содержащие 4-20 мегакариоцитов, и 23% 21-40 клеток. Минорная популяция, содержащая около I мегакариоцитов, составляет 1% (рис. 1). Чаким образом, средн размер колоний, представленных' в таблице ' 6, отражает разы доминирующего класса колоний и близок к модальному значению.

По сравнению с костным . мозгом интактных мша клетки-предшественники из костного мозга ТЭ мышей образуют втр больше мегакариоцитарных колоний. В них заметно преобладает до гигантских колоний, содержащих свыше 50 мегакариоцитов (23®). К правило, эти колонии гетерогешш по размеру и степени зрелое мегакариоцитов. Сдвиг гистограммы вправо (рис. 2) вызв уменьшением на 20% группы колоний, содержащих от 4 до 20 клеток Есть все основания полагать, что мегакариоцитарные колонии костного мозга ТЭ мышей образуются двумя категория предшественников. Первая - формирует в среднем 30-клеточн

• колонии, клетки которых характеризуются высоким митотическ индексом, а вторая категория образует большие колонии, в средн

Таблица 6

Особейиосж... ¿-с. ¿вития селезеночных мегакариоцитарных колоний из костного мозга интактннх и тимэктомирсванных мышей

Исследованные Колонии, образованные клетками-предшественниками параметри иа костного мозга мшдей:_________________________

ИНТАКТННХ _ТИМЭКТОМИРОВА®«.

8 СУТ. 11 суг. 8 СУТ. 11 сут.

1. ЧИСЛО оо селезенок 39 39 46

2. Сума колоний 46 32 65 115

3. Колоний/ селезенку 0,8 1.7 2,5

4. Сумма клеток на группу 63? 650 970 3472

5. Суша митозов 12 28 24 2Е6

6. Средний размер . КОЛОНИ?! 13,9±1,6

2С,3±3,1 14,9±1,4 30,2±2,8

7. Число митозов * ' на срез колонии 0,3±0,< 1,140,3 0,3±0,1 2,4±0,2

8. Число митозов на 1000 клеток 20±Э 52411 29±7 81±8

9. гомогенные колонии 76 58 71 17

Ю.Гетероген- ные колонии 24 42 29 83

Примечание. * -** -

число клеток на срез одной колонии, в процентах от общего чясла колоний

Рис. 1. Гистограмма распределения Л1-сут. мегакариоцитарных

колоний (1) и митозов в них (2), в орогчггах от общего числа (костный мозг интактных мышей). По оси абсцисс - число клеток в колонии.

Рис. 2. Гистограмма распределения 11-сут. мегакариоцитарных

колоний (1) и митозов в них (2), в процентах от ч.Лщего числа (костный мозг тимэктомироваыных мышей). По ос1, абсцисс - число клеток в колонии.

co держащие около 90 мегакариоци'^в, митотическал активность которых вдвое ниже.

Мегакариоциты, вхолщие ■ в состав ll-сут. колоний, пролиферируют гораздо интенсивнее, чем в 8-сут. Пик активности преобладает в колониях, содержащих 20-40 кле~ок.

По cf тзу клеток все мзгакпшоцитарные колонии подразделяются на гомогенные и гетерогешшь. Под гс.огеннши подразумевают . :олонии, содержащие клетки примерно одшт-того диаметра (минимальный диаметр около 10 мкм, а максимальный ~ окоио 60 мкм). Основная часть 8-сут. колоний, независимо от источника костного -озга представлена гомогенными колониями. Примерно в равном соотношении образуются гомо- и гетерогенные колоти из костного мозга интактшк мышей в поздние сроки развития ; в 5 раз болыне гетерогенных колоний по сравнению с гомогенными - среди ll-сут. мегакариоцитарныт колоний, образованных костным мозгом ТЭ мышей (табл. 6).

Езли митотический индекс отражает пролиф'чативную активность клеточной популяции, то по размеру клеток можно судить о степени их зрелости. Для мегакариоцитjB характерно гетерогенное содержание ЯНК, плоидность которой в норме увеличивается в процессе зндомитотического созревания клеток. Растгределение мегакариоцитов но статиям созревания имеет диагностическое значение. В представленной работе степень созревания мегакариоцитов >. ¿ла определена косвенно по диаметру клеток. В '.олониях (11-cy'i.), образованных костным мс.лчзм ТЭ шшей, в G раз низке, чем в контроле число мегакари' цитов со средним диаметром 15 мкм (примерно II стадия созревания), и в 1,5 раза выше число клеток со средним диаметром 30 мкм, чт. соответствует III стадии созревания мегакариоцитов.

Таким образом, впервые на модели селеэрчочных колонП показано, чт-- дай^решыр^вка кроветворных клеток-предшественни-кив в мегякариоцитапном i управлении peri мруется факторами тимической природа. У тк»!Эктомированных, но не у старых животных, дифференцировка ранш'- предвествьнниксв (КОЕс И. сут.) сопровождаемой интенсивным тх>стлм мегакариоцитарных колоний, шсокол митотической активностью и скорост-ю созревания мегаке-ц.цитов. Поскольк., количественная регуляция крог-творних ■те" к стволовой типа происхожу на jровне фактор-чуг"твите.гши

кдеток, то получинлые результаты доказывают исключительна значение ростоьых факторов Т-клеточной природа в рол! модификаторов линейно-специфических активностей.■

Вместе с тем неясно, действительно ли запрос-независима; категория кроветворных предшественников не чувствительна ; факторам химической природы, или это связано с пролиферативны статусом КОЕс при стабильном гемопоэзе. Изучение этого вопрос было продолжено на модели радиационных хтвр, т.е. в условия запросного кроветворения.

4. Стволовые кроветворные__клетки (КОВо) у_радиационных

химер, восстановленных костным мозгом тимэктомированных мшей.

У облученных мышей восстановление кроветворения происходи за счет интенсивной пролиферации и ди®Е»ренцировки СКК.

Клеточность костного мозга у радиационных химер во вс исследованные сроки (длительность химеризма от 1 до 7,5 мае.) : среднем одинакова и на зависит от источника кроветворных клеток которыми восстанавливали облученных мышей (табл. 7).

Таблица 7

Клеточность костного мозга у радиационных'химер, восстановлении костным мозгом интактных и тимэктомированных мышей.

_____Клеточность костного мозга. ( х 10 млн.)___

Восстановленных костным Восстановленных костш мозгом мозгом

интактных мышей тимэктомированных

1 , 11,8 ± 2,8 8,8 ± 1,1

3,5 13,1 ± 0,9 14,1 t 1,4

5 11,7 1,3 16,6 ± 1,2

7,5 15,7 ± 0,7 15,4 ± 0,2

Длительность

химеризма,

мес.

Резкое снижение (более чем в 4 раза) КОЕс-8 сут. и К0Ес-11 сут. у радиационных химер, восстановленных костным мозгом ГЭ мышей, регистрируется только через 7,5 мес. после облучения и восстановления кроветворения (рис. 3) за счет снижения' относительного содержания КОЕс.

х ю

»а

х Г»

\

аа в т.8

Рис. 3. Содержание 8- И-сут. НОЬ'с в костном мозге.радиационных химер.

1 - химеры, восстановленные костным мозгом ИНТ мышей;

2 - химеры, восстановленные костным мозгом ТЭ мышей. По оси абсцисс - длительность химеризма, мес.;

По оси ординат - число КОЕс на бедро. .

Пролиферагавныя потенциал КОЕс оказался скаженным в 4- раза узе у 4-х над. .химер, восстановленных костным мозгом тэшзктомированннх мышей (20 ± 3). В среднем пролиферативный потенциал КОЕс из костного мозга химер, восстановленных кроветворными клетками интактных мышей равен - 79±3, и значимо не олпается от значений пролифератявного потенциала КОЕс из мозга интактннх (84±8) и тимэктомированных мышей (37±12) при стабильном гемогоэзе.

Получоннке результаты позволяют заключить, что тимзктомия вызывает снижение пролифзративного потенциала СКК, которое выявляется лишь в системе с дополнительным пассажем. В условиях загтаосного кроветворения, т.е. в процессе регенерации кроветворения у облучонних реципиентов, СКК тимэктошрованннх мышей не спосоонй адекватно пополнять пул КОЕс, подвергающийся быстрой пролиферации и дифференцировке. Снижение пролиферативного потенциала СКК р 4 разя, что соответствует 2 митозам, регистрируемое через 4 недели после получения опытных химер, предшествует резкому сникению содержания 8- и Н-сут. КОЕс у 7,5 мес. химер. Уменьшение содержания КОЕс, однак , не отражается на общей клеточностн костного мозга, высокий уровень которой обеспечивается диф$еренцировкой более зрелых предшественников.

Получен важный вывод об активности Т-лимфоцитов или Т-клеточных ростовых факторов в поддержании гомеостаза в кроветворной,системе чьрез регуляцию пролиферативного потенциала СКК. В системе нн виво, на модели радиационных химер установлена "•эрреляция защитного потенциала гчк от его пролиферативного потенциала. Вглсте с тем не ясно, прямое ли это следствие тимэктомии на СКК или оно опосредовано через костномозговую строму.

КРОВЕТВОРНОЕ МИКРООКРУЖЕНИЕ У ТИМУСДЕФВДШХ МЫШЕЙ

Изучение возрастных изменений функционир вания кроветворного миг"оокру«зния носит не только частный характер, а связано с б" лее общей проблемой - лошткой приблизиться к пониманию пт>ичин и механизмов старения клеточных систем, и как следствие, возникновению злокаче гвеьлых забгиеваний у стагах животных.

КроветБо.^яое мккроокружение у тимусдефицитшх мышей изучали в двул. сериях экспериментов. В первой серии исследовал] влияние тимо-га-и и возраста доноров костного г-.згв ни формирование крове1 .¡орного мгчроокружеиия,, а во второй - влияние тимэктомии рептиентов на. сьособяост' СКК . из перифо! лческой крови репепу.щрозать новообра&^ванную строму.

ü. Отромальные

M23ra_THM3KTomigoBamjux_äQiiopoBi

Очаг эктопического кроветворения получали путем трансплантант костного мозга тимоктомированшх мышей под .сапоулу лочки ^ ттактных реципиентов (.ТЭ •* ИНТ >. В этих условиях сформированная ¡трома донорского типа заселяется в основном кроветворными :летт"ми, циркулирующей в пеpufft; гческой -.рови реципиента Удалов ГА. с coai '.,1977; Amsell, Dell, 1971). Вг -панты «плантации костного мозга, озволяющие, кроме'того, исследовать лияние возраста донора и реципиента "'а е копомерность ормирования эктопических r-тагов, представлены в табл. в.

Число стромальннх клеток-предшественников которое оценивали OCE8HHO по величине образованных очагов эктопического кроветво-ения, не менялось в течение лет жизни как интакть^х, так и доноров (табл.8). ß то же время рост гетеротопчого очаг.г роветворения у старых реципиентов ..оказался усиленным. Первые остоверн-е различия отмечаются у годовалых реципиентов, у ¿-х зтних реципиентов размер эктопического оЧс.'а кроветворения на громе от интактных мышей примерно в 3 раза Еыше, чем в соотве. -гвующей стандартной группе, а на строке от ТЭ мышей - "римерно в раза. Под стандартной группой понимается вариант имплантации зстного мозга от 2-х мес. донороь к-2-х мес. реципиентам.

Полученные результаты оказались вполне .однозначными: держание в костном мозге ТЭ доноров клеток, способных к строению кроветворного микроокружения с возрастом не снижается. )змер эктопического очага кроветворения зависит от возраста pj-шиента, а не донора костног мозга.- Полученные результаты сог-юуются в выводами Гуревич O.A., Черткова И.Л. (1982); Suiofleld ■ соавт. (1986), но противоречат данным Hotta с соавт. (1980).

Тимэктомия доноров костного моы'а, однако, оопрововдается ижением размеров формируемых очагов в 'плодах реципиентах (не виса!дем от возраста донора), и увеличением их по сравнению с нтролем в старых реципиентах. Результаты позволяв едположить, что солее зрелые с .громадные предшественники из стного мозга ТЭ доноров лучше отвечают на стимулирующий фактор, -збатываемый старыми реципиентами. Имплантация тимуса едотвращает последствия тимэктошы. Все это доказывает, что у арых мышей процессы инволюции тимуса и стимуляции •роста топического очага кроветворения протекают независимо.

Таблица 8

Влияние возраста шшей и тимэктомии доноров костного мозга ш размер гетеротопного очага кроветворения.

.Возраст' мышей к началу Клеточность очага, образованного

• • опытах_мес.__ _______имплантацией костного мозга ИНТ

___________и ТЭ доноров, хЮ млн.__________

ИНТ., тз ИНТ. ИНТ. ТЗ

• 2 2 11,8 ± 1,5 8,7 ± 0,4

12 2 9,0 t 0,2 6,9 4 0,5

24 2 9,4 ± 1.5 _ ILA. ± 1.6

2 12 19,2 ± 1,9* ± 2,4**

12 12 20,1 ± 0.2 25,8

2 ■ 24 24,8 ± 1,4* 27,3 ± 0,6**

24 _ 24 32,8 4 1,9 38,4 ± 2,9**

Примечание. * - достоверное увеличение относительно стандартной .группы в контроле (донор костного мозга - ИНГ.)

к* - достоверное увеличение относительно стандартной группы в опыта (донор костного мозга - ТЭ)

Качество стромальных клеток оценивали по наличию эктопических очагах кроветворения КОЕс и по их пролифератианоь потенциалу. Число КОЕс в очагах эктопического кроветвореш соответствует кпеточности очагов - в старых реципиент* количество" КОЕс на очаг выше, ' чем в молодых (рис. 4 Относительное содержание КОЕс в очагах не меняется. По вс< вероятнс ти, увеличение размеров эктопических очаг< кроветворения у старых рецшиетов обусловлено двумя причинам увеличением стромальных территорий, заселяемых циркулирующими (Я и событиями, происходящими ча уровне более зрели фактор-зависимых кроветворных клеток-предшестЕенников.

Пролифератившй потенциал КОЕс из эктопических очахо сформированных на строме от интактных мышей, колеблется довольно широких пределах - от 21 до 108, и от 34 до 108 -стреме от ТЭ шшей. Такие значительные колебания величин пролиферативного потенциала, известные и по литературе (Черта ИЛ., Гуреьич O.A., 1984), не связаны о возрастом донора

реципиента. Принимая во внимание одинаковую амплитуду колебаний изучаемого параметра КОЕс, можно утверждать, что стромальные клетки-предшественники из костного мозга ТЭ доноров строят кроветворное микроокружение, способное обеспечивать нормальную пролиферацию КОЕс.

Процесс построения кроветворного микроокружения обеспечивается благодаря функционированию клоногенных стромальных клеток, принадлежность которых к категории стволовых клеток кроветворной стромы была доказана методам серийных ретрайсшюнтаций очагов эктопического кроветворения (Гуревцч O.A., Чертков И.Л., 1980).

х 10

Рис. 4. Содержание И-сут. КОЕс в очагах эктопического крове- -творения, образованных костным мозгом интактных (1) и тишктомированяых мышей (2). По оси абсцисс - возраст мышей, мес.; По оси ординат - число КОЕс в очаге.

Для изучения способности стромальных прэдгиесивенников из костного мозга ТЭ доноров к многократному построение кроветворного микроокружения, имплантировали- фрагмент костной мозга ТЭ .доноров ложно-оперированным и ТЭ. реципиентам ( последующей ретрансплантацией очагов ТЭ реципиентам. Клетю стромы • от ТЭ доноров обладают высокой способностью I .самоподдержанию, т.е. к повторному переносу кроветворной мироокружения (вывод сделан на основании четырех пассажей).

Следующая категория стромальных клеток - чувствительная I дистантным регуляторным факторам, была определена в облученныз реципиентах. Костный мозг от тимэктомированных и с имплантированным тимусом реципиентов ("ТЭ+тимус") переносили по; капсулу почки необлученндх и облученных в дозе 8.Гр реципиентов. Наличие индуцибельных предшественников стромы определяли пс индексу, стимуляции. В среднем индекс стимуляции для отромалыш клеток из костного мозга ТЭ мышей равен 3,3 и сходен с таковыь для интактных шшей - а,4. Фактор, способствующий стимуляции эктопического очага у химер, - нетимической природа, т.к. индекс стимуляции в группе "ТЭ+тимус" доноров ,соответствует значениям, полученным для интактннх и ТЭ доноров.

Таким образом, кроветворное шкроокружение, формируемое костным мозгом тимэктомированных мышей, представлено нормально функционирующими трансдашнтабельныиш стволовыми клетками кроветворной стромы. и индуцибельными стромальными предшьствениикаш, отвечающими на дистантную регуляцию.

Анализируя причину усиленного роста эктопической .стромы у старых животных, естественно было искать связь этого феномена о инволюцией тимуса, причины которой до сих пор не ясны. В литературе накапливаются экспериментальные доказательства того, что причина возрастной инволюции тимуса лежит не в нем самом, а имеет системный характер., При старении шявл^рся фактор, который вызывает инеолюции собст. шлго тимуса и . препятствует росту тимуса, имплантированного от молодых животных к старым (Шгокаиа с соавг., 1989); не эф&октшша даже имплантация нескольких тимусов. Следовательно, получены доказательства существования двух типов дистантных факторов, влияющих на размер микроокружения, в первом случае - кроветворного, стимулирующего рост костномозговой стромы, и во -втором - тимического,

-231 '

тормозящего рост микроокруже пня тимуса. Возможно между ними и нет грямой связи, но само по свое наличие второго такого системного фактора, равно как и существование дальнодействуюцей регуляции тссы селерешж, дает основание полагать, что наличие гуморальных зегуляторов является фундаментальным принципом регуляции размера фоветворного микроокружения и лимфоидшх органов.

6. Характеристика эктопических очагов кроветворения, образованных в тимэктомированных реципиентах.

Во второй серии экспериментов костный мозг от интактшх 1оноров имплантировали под капсулу почки тимэктомированных мышей (ИНТ. •» ТЭ). Цель проведения этих опытов была связана с вменением возможностей кроветворных клеток из -периферической срови ТЭ мышей регопулировать эктопическую строму. В юриферическую кровь выходят СКК, преимущественно с низким 1ролиферативным потенциалом (Гуревич С.А.и соавт., 1983).

Клеточность очага гетеротопного кроветворения увеличивается з возрастом реципиентов, причем процесс "этот тимус-независим (рис. 5 А). Доказательством этому служат и размеры эктопических иегов, образованных в группах ИНТ. и ТЭ реципиентов, которым ' тредварительно был имплантирован тимус ежгеншх новорожденных иышей.

Регуляция пролиферации СКК в эктопических очагах зависит от физиологического состояния тимуса. В норке в процессе построения эктопического очага кроветворения происходит интенсивная пролиферация И диффорэнцировка СКК,' и когда размер очага достигает некоторой критической величины, происходит снижение относительного чиола КСЕс, что вызывает и уменьшение абсолютного содержания КОЕс в очагах (рис. 5 Б).

После тимэкгомии эта регуляция нарушена и росту эктопического эчага сопутствует постоянное возрастание как относительного, так и абсолютного числа КОЕс (рис. 5 Б). Трансплантация ткчуса к ТЭ реципиентам частично восстанавляваэт эту регуляцию. Полное восстановление ритма пролиферации КОЕс не происходит, по-видимому, вследствие того, что у , старых мышей трансплантат тимуса растет хуже, чем в молодом реципиенте. У иитактик мшея дополнительный тимус нарушает регуляцию числа КОЫо, что вновь свидетельствует о регуляторной роли тимуса ь поддержании пула СКК. ,

х 10 е

30-

26 20. )б 10 6 0

□ /

4

Г

а, а

■ _I_1_I_I_и.

6 7.6 14 1в.6 22 24.6

б 7.6 14 13.6 2Р 24.6

-1-1-1-1-1-1-1_I_I_и._I__1_I .....I . 1

6-7 14-10.5 22-24.6 ' Б-Г 14-16.6 22-24.6

Рис. 5. Клеточность (А) и содержание 11-сут. КОЕс (Б) ь очага: образованных у тншктомировашшх реципиентов разного возраста.

Доноры костного мозга: 1 - ИНТ; 2 - ИНТ+тимус;

• 3 - ТЭ; 4 - ТЭ + тимус. По оси абсцисс - возраст мышей, мес.;. По оси ординат - клеточность очага (А); число КОЕс (Б

Чувствительности к фактору (факторам) тимуса у КОЕс, однако, ае связана с нарушением пролиферативного потенциала КОЕс и не зависит возраста реципиентов. Число дочерних КОЕс, образующихся из 11-сут. первичных селезеночных колоний, в 4-х группах л реципиентов разного возраста в среднем одинаково. В ИНТ реципиентах пролиферативный потенциал КОЕс составляет 86+12, в "ИНТ+ТИмус" реципиентах - 7048, ТЭ - 85±13 и "ТЭ+тимус" -76412. Различия недостоверны. Получено еще одно доказательство того, что о возрастом пролиферативный потенциал КОЕс не изменяется. Результаты хорошо соответствуют модели клокальной сукцессии крбветвор ния, согласно которой генерационный во.зраст всей иерархии СКК всегда один и тот же.

В целом, анализ данных позволяет заключить, что в условиях стабильного гемопоэза регуляция отромальных клеток-предшественников не зависит от тимуса (тимэктомия доноров костного мозга), тогда как пролиферация циркулирующих. СКК регулируется факторами Т-клеточной природы (тимзктомия реципиентов). Прежнее утверждение относительно тимус-независимой регуляции СКК в условиях стабильного гемопоэза, оказалось частично опровергнутым благодаря методу гетвротопной трансплантаций костного мозга. Однако следует еще раз отметить, что выполненные серии экспериментов позволили охарактеризовать свойства СКК из периферической к,.эви, т.е.кроветворных клеток преимущественно с низким пролнфдратйвнш потенциалом. В связи с этим следующий фрагмент работы был посвящен особенностям заселения эктопических очагов кроветворения костномозговыми гекопоэтнческшя илеткаш-предшествениками.

7. С^ромашшэ клатки-предшестБвютки у радиационных, химер,, восстановленных костным мозгом тимзктомированных _мышэй.

, Схема получения гетеротопдах очагов, рэпопулировашшх донорскшиЕ костшшзговшй СКК, представлена в табл.1. Такая постановка опыта преследовала слэдукше цели:

1. Выяснить, - обладают ля стрсшльше предшественники из костного ыэзгз 13 шдая способностью формировать полноценное кроветворяшв »¿йкреюкружение Пъола летальных доз облучения. В варю клетки стрсш шсока радиорезистентны.

2. Установить, зависят ли интенсивность кроветворения в

эктогшческих очагах у радиационных химер, восстановленных костищ мозгом ТЭ мышей, от качества СКК. Как было показано (раздел 4) защитная способность костного к;озга ТЭ мыше! резко снижена.

3. Срзвнить свойства диркулируадих и -оседлых, г.а костномозговых КОЕс, в процессе построения эктопического, очаг. . , кроветворения. • ~

Свойства КОЕс из сформированных очагов эктопическое кроветворения определяли через 1,5-3,5 ыес. после получена химер. В пределах исследованных сроков клеточность очаго гетеротопного кроветворения и содержание в них КОЕс в средне одинаковы для всех 4-х вариантов их состава. Временна ограниченность проведения этого опыта не позволила точне * определить, как регулируется число КОЕо в эктопических очагах химер. Однако по снижению пролиферативного потенциала КОЕс у 1, мае. химер (табл.9), можно ожидать уменьшение числа КОЕс в очага в более поэдаше сроки» т.е. пооле истощения буферного (зрелого) отдела СКК.

- Таблица 9

ПролйферативиЗй потенциал КОЕс из очагов-гетеротопного кроветворения, образованных у 1,5 мер. радиационных химер. ,

Состав эктопического очага У хшер: Число дочерних КОЕс в Ц-{ строма +. костный мозг . селезеночных колониях

ИНГ + Ш£Г •.'■' 75

ИКС + ТЭ. 39

ТЭ + ИНТ . ' 74 ' ■

ТЭ + ТЭ ББ

Полученные результаты позволяют оаключить, что стромальга клетки-предаественацки иа костного ьозга ТЭ доноров стро, полноценное микроокружениэ,' ' обеспечивающее поддержан; нормального, гемопоээа. Вместе о тем, СКК от. тимэктомированн; мышой несут скрытый дефект в пролиферативном потенциале, котор не зыяЕляется в условиях стабильного гомопоэза, во имеет заштн

ооледствия в условиях запросного кроветворения. У "костномозго-нх" радиационннх химер пролиферативный потенциал КоЕс снижен в 4 аза по сравнению с нормой, а в процессе построения эктопического чага - в 1,5-2 раза (рис. 6). Такое различие связано с тем, что \ ля полного восстановления кроветворения у всей облученной мыши, огда потребность в зрелых клетках различных рядов Мферэнцировки высока, КОЕс пролиферируют гораздо интенсивнее, ем при создании локального кроветворного очага.

?яс, 6. Пролиферативный потенциал КОЕс из костного мозгз очагов гетеротошого кроветворения. Костный мозг: 1 - ИНГ, 2 - ТЭ; Химеры: 3 - восстановленные костным мозгоЦТЛ мышей, 4 - восстановленные костным мозгом Ш. мышей. Эктопические очаги в необлучешщ реципиентах: . 1* - ИНГ доноры костного мозга, 2* - ТЭ доноры костного мозга. Эктопические очаги э, радяАЩодаздх.химэрах.

3* - ТЭ шшвй, 4* - ИНТ мышей.

дпя функционирования кроветворного микроокружения важное значение тлеет характер кроветворения на нем (Adamaon, Fialkow, 197В; Гуревич и соавт., 1962). Подучено еще одно доказательство кооперативных взаимодействий кроветворных и стромальных клеток, направленных от СКК к стромо. Стволовые кроветворные клетки со сниженным пролиферативным потенциалом (СКК из периферической крови ТЭ мышей/ СКК из костного мозга ТЭ мышей, которыми восстанавливали радиационных химер) изменяют свойства £ регуляторную функцию стромальных предшественников, ,

Почему же при равновесном кроветворении у тимэктомировашш мышей не удается обнаружить заметных изменений в свойствах Ш (кроме стимуляции мегакариопитопоэза)? Не выявлено i возраст-зависчмой регуляции СКК у старых шшей (кроме, увеличени; числа миелокариоцитов). Для организма инволюция тимуса, вызванна; старением животного, или сопутствующая старению, - естественны! процесс. Инволюция тимуса никогда не бывает полной* т.к. стром! тимуса пусть и в минимальной степени функционирует и в старости. Свидетельством этому служит содержание альфа-1 тимозина i сыворотке старых особей, концентрация которого составляет 60$ О' нормального к годовалому возрасту мышей, и постепенно, но hi полностью, . исчезает к 2-м и более годам жизни кивотног (Welndrach с соавт., 1988) . Источником фактора, частичга компенсирующим, снижение гормонов тимуса, являются . клетк Лангечганса кожи, которые, во-первых, секретируют "впидермальны тимоцит-актавирующчй фактор", ИЛ-1-подобную активность,' и в вторых, вместе с Т-клетками образуют так. называему "ассоциированную о ножей лимфондную ткань" (Бацйег, 1983, 1984; Sauder с соавт,, 1982; Streileln, 1978). Все эти наблюдени вместе со структурным и антигенным сходством между кожей тимусом, позволяют предположить, что кока может функционироват как некоторый аналог тимуса (Sander, 1983; Haynes, 1984).

Вместе с тем, стимуляция мегакариоцитопоэза тимэктомированных мышэй и увеличение числа миелокариоцитов костном мозге у стара позволяет прийти к неожиданно!, заключению, что у молодых особей тимус (Т-лимфоциты или фактор Т-клеточной природы) иягнбирует гемопоэз на . ypoBi фактор-чувствительных кроветворных клеток.

ПОСТРЛДИАШОННОЕ ВОССТАНОВЛЕНИЕ СУЛЕ'ТАЛЬШХ РАДИАЦИОННЫХ ПОБРЕМЕНШ КРОВЕТВОРНЫМИ И СТРОМАЛЫШИ МЕТКМИ-ПРЕШСТВЕИЮКШ

Одной из центральных проблем радиобиологии млекопитающих яется проблема восстановления многоклеточного организма от действий ионизирующих излучений. Понимание механизмов становления от радиационных повреждений в кроветвоной системе ет не только теоретическую ценность, но и огромную значимость клинических целей, связанную с трансплантацией костного га. Ранее зыло показано, что КОЕс-3 су т. обладают высокой собностью к репарации сублетальных радиационных поврездений, орая нарушена у старых (.Chen, 1974) и тимэктомированных во ослом состоянии мышей (Тодрия Т.В., 1978). Вместе с тем эта популяция КОЕс не обладает радиопротектившми свойствами, итной способностью обладают пре-КОЕс и часть фракции КОЕс-11. sser с соавт.,1988,1990; Ploemacher с соавт., 1988). В связи 5тим была исследована способность к вутриклеточной репарации летальных радиационных повреждений в двух субпопуляциях. КОЕс эмбриональной печени и костного мозга взрослых мышей и в тках-предшествешшхах с громы кроветворных органов. В системе виво ■ внутриклеточную репарацию сублетальных радиационных реадений изучают на модели Элюшовского восстановления kind, Sutton, 1959), т.е. методом фракционного облучения.

В результате проведенных исследований показано, что ависимо от источника КОЕс (эмбриональная печень мышей 14-18 . развития, костный мозг), ренине -кроветворные предшественники ec-li сут.) репарируют сублетальные радиационие поц^ждения ;ествэнко хуже, чем более зрелые - КОЕс-8 сут. (рис. 7). .симальный индекс репарации для КОЕс-8 сут. из костного мозга ен 2,8±0,4 при 5 час интервале между фракциями облучения, а : КОЕс-11 сут. - 1,5i0,2 при трех-часовом интервале. Для более лых предшественников (КОЕс-8 сут.) из эмбриональной печени >актерна быстрая фаза репарации сублеталей - в интервале от 2 до час между «рракциями облучения индексы репарации примерно наковы (около г). Максимум репарации сублетальных радиационных реждений в кое-И сут.из эмбриональной печени равен i,5t0,2 : 3-4 час интервале между фракциями облучения.

ФО/НФ а.а'

в.а

i.o

КОЕс-В

КОЕс-11

«,вэ.н.

К.м.

1 В S <3 В В 1 Е 3 4 Б а

'Инге рвал т-жду <|i|>¡ik к ним и оГиучеиня, час

Й1С. 7. Изменение индусов репарации в зависимости от временно: интервала между фракциями облучения. Условные обозначения: К.м. - костный мозг; Э.П. - эмбриональная печень. По оси ординат - индексы репарации.

В -связи з низкими значениями индексов репарации, получаем! яри исследования раннего пострадиационного восст^ювлен суб: >та. ьных повреждений в il-сут. КОЕс из костного мозга эмбриональной печени, изучение роли. тимуса в этом проца оказалось невозможна.

В отличие от СКК,- стромальные клетки-предв'р-ственники, горне принадлежат к медленно обновляющейся популяции обладают уличительно высокой способностью к внутриклеточной репарации шационных повреждений фис. 8). Индекс репарацгч при 6-" час • тервале меаду фракциями облучения достаточно высок - около -11, что почти втрое превышает эти же значения (максима..ьнне) я С'Д.

01-.-1->-1-—1->-

0 12 3 4 6 6 7

ис. 8. Динамика изменения индексов рпарацы сублетальных радиационных повреждений в стромэльных клетках-предиественниках в зависимости от временного интервала между фракциями облучения. По оси абсцисс - интервал левду фракциями облучения

(чао); , .

По оси ординат - индексы репарации.

г

Клетки стромы, являющиеся радиорезистентной популящ сохраняют способность к репарации сублеталей и тимэктомированных мышей.

В результате проведенного исследования в системе ин 1 получен важный вывод о способности • стромальных предавственш .репарировать сублетальные радиационные повреждения. На мо,1 Элкиндовского восстановления получено еще одно подтверждение отсутствия влияния тимуса на функционирование клеток стр< Действие тимуса на способность к внутриклеточному восстанови сублетальных радиационных повреждений не универсально и л продемонстрировано только для более зрелых кроветво] предшественников.

•выводы

1. При равновесном кроватворении функционирование воловых кроветворных клеток не зависит от физиологический тивности тимуса; содержание в костном мозге с лезепчннх лониеобразующих единиц (КОЕс), их пролиферативный потенциал и фференцировочнне свойства возраст- и тимус-независимы.

2. При стабильном гемопоэзе тимус ингибирует гакариоцитопоэз. Удаление тимуса стимулирует дифферентровку юветворных предшественников в мегакариоцитарном направлении, чги провождается: а) увеличением продукции колоний чтого ростка оветворения, б) повышением пролиферативной активности и в) :оростью постэндомитотического созревания мегакариоцитов в 'лезеночных колониях. '

3. В условиях запросного роветворения (рэдиациошге химеры) галиферативгИ потенциал КОЕс снижен, что. является причиной 1абой защитной спсобности костного мозга тимус-дефицитных гвотних.

4. стромальные клетки-предшественнгоси, способные к переносу юветворного микроокрукения, и фактор-чувствительные кле-ки юветворной стромы не регулируются факторами тимичёского юисхождения.

б. Характер фуннционнрованп кроветворного микроокружения юисит от качества стволовых кроветворных . клеток: а) [тэнсивность кроветворения в эктопическом очаге определяется иженным пролиферативнш потенциалом костномозговых кроветворных га ток, вызванным тимэктомией; б) относительное со^ржаниэ КО"о в ¡топических очагах "роветворения, репопулированных фкулирующими в периферической крови клетками, регу лируется ■ «торами тимической природа.

6. Стволовые кроветворные клетгет из эм-риональной печени и ютного мозга взрослых мышей репарируют сублет; льные |диационные повреждения. Степень репарации сублетальных ииационных повреждений различна для клеток-предаественнико1-, ¡холящихся на разных уровнях в ие;архии стволовых клеток.

7. стромальные клетки-предшественти<и способны репарировать "5 лета льные радиационные повреждения. Репарация су&яеталь' та даревдений в стромальных клетках-п^дшествеылках тимус- газави-ма. ■

СПИСОК опубликованных работ по теме диссертации

1. Ган о.И., Дризе Н.И., Тодрия Т.В., Чертков И Предшественники транзиторных селезеночных колоний в эмбрионалы печени.// Бюлл.экспер.биол.мед. - 1984. - N 6. - С.727-729.

2. Ган 0.1/1., Тодрия Т.В. Клеточная репарация сублеталь; радиационных повреждений двух субпопуляций КОВс из эмбриональ: п чени и костного мозга взрослых мышей,//Бюлл.акспер.биол.мед 1989.- N 1.- С.89-91.

3. Ган О.И., Тодрия Т.В. Репарация радиационных повревдешй стволовых кроветворных клетках из эмбриональной печени мы кинетические аспекты.//Радиобиология. - 1991. - N 2. - С.222-2

4. Тодрия Т.В. Раннее пострадиационное восстановле клеток-предае ственшков кроветворной стромы. //Бюлл.экспер.био мед. -1984. - N 11. - 0.610-611.

5. Тодрия Т.В. Влияние гуморального и клеточного факторов тим на восстановление стволовых кроветворных клеток от сублеталь радиационных повреждений. - //В сб. "Трансплантация костн мозга в клинике и эксперименте", Москва. - 1984. - С.25-26. •

6. Тодрия Т.В. Влияние тимэктомии на дифференцировку субклас селезеночных колониеобразущих единиц, //В сб. "Кроветвор клерки-предшественники в механизмах повреадений и кошенсе системы крови при действии на организм экстремальных факторе Челябинск. - 1986. - С. 25. ' ...

7. Тодрия Т.В. Сравнение способности ранних и поздних КОВ внутриклеточной репарации сублетальных радиационных поврезде* У/Труда II республиканской конференции "Проблемы екологичес биофизики", Тбилиси. - 1986. - С, 87-89. '

8. Тодрия Т.В. Сравнение способности ранних и поздних КОЕ восстановлению от сублетальных радиационных повреждений.//Б1 экспер.биол.мед. - 1988. - N 5. - С.597-599.

9. Тодрия Т.Е., Габаившш Ы.Т. Дифференцировочные поте! стволовых кроветворных клеток у тимэктомироврчных мышей.//В "Конференция молода ученых института экспериментам морфологии", Тбилиси. 1982. - С.16-19.

.□. Тодрия Т.В., Ган О.И. Изучение способности уюток-предшествеников строки кроветворных органов к репарации ¡ублеталышх радиационных повреждений на модели гетеротопной -рансплантеции 'костного мозга. //В сб. "Трансплантация костного • юзга в клинике и эксперименте", Москва. - 1984. - С.Иб-118.

1. Тодрия Т.В., .Ган О.И. Влияние тимуса на способность ¡тромальных клеток-предшественников к внутриклеточной репарации ядиационных повреждений. //Радиобиология. - 1985. - Т.25, irn.l. - С.83-83.

2. Todrla T.V., Gan O.I. Intracellular repair oi radiation Induced damages by hemopoietic and stromal cell precursors. //In: 'Moleculer factors oi nematopolesls and stem celle", Moscow. -.990.- P. 141. ' .

.3. Тодрия T.B., Ган О.И. Кинетика репарации сублетальных >адиационшх повреждений в ранних . гемопоэтических гредиественииках (ll-суточннх КОЕс)//Билл.экспер.биол.мед. •• 1991. - N 1. - С. 74-76.