Автореферат и диссертация по медицине (14.01.01) на тему:Фотосенсибилизированная фотомодификация крови в лечении хронической герпес-вирусной инфекции у пациенток с привычным невынашиванием беременности в анамнезе

На правах рукописи

МАРКОВА ЭЛЕОНОРА АЛЕКСАНДРОВНА

ФОТОСЕНСИБИЛИЗИРОВАННАЯ ФОТОМОДИФИКАЦИЯ КРОВИ В ЛЕЧЕНИИ ХРОНИЧЕСКОЙ ГЕРПЕС-ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ У ПАЦИЕНТОК С ПРИВЫЧНЫМ НЕВЫНАШИВАНИЕМ БЕРЕМЕННОСТИ В АНАМНЕЗЕ

14.01.01 — Акушерство и гинекология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 7 ИЮЛ 2014

Москва - 2014

005550710

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук

Хашукоева Асият Зульчифовна Свитич Оксана Анатольевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Тетруашвили Нана Картлосовна

ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, руководитель второго акушерского отделения патологии беременности

доктор медицинских наук, профессор Ляшко Елена Сергеевна

ГБОУ ВПО МГМСУ имени А.И. Евдокимова Министерства здравоохранения Российской Федерации, профессор кафедры репродуктивной медицины и хирургии ФПДО

Ведущая организация:

Государственное бюджетное учреждение здравоохранения «Московский областной научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии» Министерства здравоохранения Московской области

Защита диссертации состоится «_»_2014 года в_часов

на заседании Диссертационного Совета Д.208.072.12 на базе ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России по адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д.1. и на сайте www.rsmu.ru

Автореферат разослан «_»_2014 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Хашукоева Асият Зульчифовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Несмотря на большой прогресс современной медицины, проблема привычного невынашивания беременности (ПНБ) продолжает оставаться актуальной (Макаров О.В. и соавт., 2007; Сидельникова В.М., 2010; Nigro G., 2011; Christiansen О.В., 2014).

В последние годы одно из ведущих мест в генезе преждевременного прерывания беременности занимают вирусные инфекции, среди которых доминируют герпетические инфекции. Доказана этиологическая роль герпесвирусной инфекции, обусловленной вирусом простого герпеса (ВПГ-2) и цитомегаловирусом (ЦМВ) в привычном невынашивании беременности. По мнению ряда авторов, основным патогенетическим звеном самопроизвольных выкидышей является дисбаланс в иммунной системе и, как следствие, активизация репликационной активности ВПГ и генерализация инфекции с поражением плаценты и плода (Попова А.Ф., 2010; Ball Е., 2007; Pamele А. Carpentier, 2011).

Герпесвирусная инфекция (ГВИ) у пациенток с ПНБ часто протекает в субклинической форме, не имеет характерных клинических проявлений, что затрудняет ее диагностику, а проведение противовирусного лечения необходимо. Существующий ряд химиотерапевтических препаратов с противогерпетической активностью быстро и эффективно купируют острые проявления простого герпеса, не предотвращая рецидивы хронической герпесвирусной инфекции, что обуславливает необходимость поиска новых эффективных методов лечения.

В настоящее время внимание специалистов привлекают новые подходы в терапии хронической рецидивирующей герпесвирусной инфекции, одним из которых является фотодинамическая терапия (ФДТ), которая нашла широкое применение в разных областях медицины. Фотосенсибилизированное лазерное облучение крови (фотомодификация крови) — частный случай ФДТ. Метод предусматривает фотомодификацию крови (ФМК) за счет взаимодействия оптического излучения и препарата фотосенсибилизатора (ФС).

Показано, что ФДТ воздействует на вирусные частицы вируса папилломы человека, инактивирует вирус иммунодефицита человека (Kvacheva Z.B., 2005; Choi М.С., 2013), что указывает о потенциальном использовании ФДТ в терапии герпесвирусной инфекции в качестве предгравидарной подготовки к беременности у пациенток с ПНБ вирусного генеза.

Принимая во внимание факт существующего дисбаланса в иммунной системе у пациенток с ПНБ на фоне герпесвирусной инфекции, в последние годы существует повышенный интерес к изучению цитокинов при осложненной беременности. Цитокиновый профиль при ПНБ, ассоциированной с герпесвирусной инфекцией, и лечении фотосенсинсибилизиованной ФМК до настоящего времени не изучен, также отсутствуют работы, посвященные влиянию ФДТ на иммунную систему.

В связи с этим представляет научный и практический интерес изучение механизмов фотодинамического воздействия на герпесвирусную инфекцию, а также исследование влияния метода ФМК на цитокиновый профиль у женщин с привычными потерями беременности на фоне ГВИ и стойкой неэффективностью ранее проводимых лечебных мероприятий.

Цель исследования Изучение противовирусного и иммуномодулирующего эффекта фотосенсибилизированной фотомодификации крови у пациенток с привычным невынашиванием беременности вирусного генеза.

Задачи исследования

1. Проанализировать частоту выявления и особенности течения герпесвирусной инфекции у женщин с привычным невынашиванием беременности.

2. На экспериментальном этапе изучить механизм противовирусного фотодинамического действия in vitro для обоснования применения фотосенсибилизированной фотомодификации крови при ГВИ у пациенток с ПНБ в анамнезе.

3. Определить особенности состояния основных показателей периферической крови, гемостаза, динамику титра антител у пациенток с хронической

рецидивирующей герпетической инфекцией и привычном невынашивании беременности при фотосенсибилизированной ФМК.

4. Оценить клиническую эффективность фотосенсибилизированной фотомодификации крови путем изучения экспрессии гена ФНО-а и цитокинового профиля (ФНО-а, ИФН-а, ТФР-pl) для предгравидарной подготовки пациенток с привычным невынашиванием беременности вирусного генеза.

Научная новизна

Впервые научно обоснован и подтвержден на экспериментальных моделях in vitro метод фотосенсибилизированной ФМК у пациенток с вирусным генезом привычного невынашивания беременности.

На основании полученных результатов получена приоритетная справка на изобретение: «Способ оценки эффективности противогерпетического действия фотодинамического воздействия на вирус простого герпеса in vitro» № 2013112489 от 20.03.2013г.

Впервые показана значимость оценки в динамике уровней экспрессии гена ФНО-а с продукцией сывороточного провоспалительного цитокина ФНО-а и про- (ФНО-а, ИФН-а) и противовоспалительными цитокинами (ТФР-pi) в сыворотке крови при фотосенсибилизированной фотомодификации крови у пациенток с ПНБ на фоне рецидивирующей герпесвирусной инфекции.

Практическая значимость работы

Разработана схема эксперимента для изучения механизмов противовирусного действия ФДТ in vitro. Создана модель in vitro, позволяющая изучать механизмы противовирусного действия ФДТ на различные типы вирусов, а также механизмы действия других ФС при использовании различных источников лазерного облучения для обоснования применения метода фотосенсибилизированной фотомодификации крови.

Проведена оценка клинической эффективности метода фотосенсибилизированной ФМК у пациенток с привычным невынашиванием беременности вирусного генеза. Полученные данные об изменении цитокинового профиля у пациенток с рецидивирующей ГВИ расширяют

представление о патогенезе ПНБ вирусного генеза и показывают необходимость изучения нового метода терапии фотосенсибилизированной ФМК при данной патологии.

На основании полученных результатов в клиническую практику внедрен метод фотосенсибилизированной ФМК для лечения пациенток с привычным невынашиванием беременности и рецидивирующей ГВИ в анамнезе. Отмечено нормализующее влияние фотосенсибилизированной ФМК на показатели цитокинового профиля у пациенток с герпесвирусной инфекцией и привычным невынашиванием беременности в анамнезе.

Положения, выносимые на защиту

1. Пациентки с ПНБ и герпесвирусной инфекцией имеют более высокую частоту прерывания беременности, рецидивирующий характер генитального герпеса в отсутствии эффективности проводимой противовирусной терапии, что обуславливает необходимость поиска новых методов лечения с целью предгравидарной подготовки к беременности.

2. На экспериментальной модели in vitro показать эффективность противовирусного действия фотодинамической терапии.

3. У пациенток с ПНБ на фоне рецидивирующей герпесвирусной инфекцией установлено повышение уровня экспрессии гена ФНО-а в мононуклеарных клетках крови, повышение продукции провоспапительного цитокина ФНО-а, снижение противовоспалительного цитокина ТФР-pi и уровня ИФН-а в сыворотке крови, что является прогностически неблагоприятным для планирования беременности у пациенток с данной патологией.

4. Включение в комплексную терапию рецидивирующей герпесвирусной инфекции фотосенсибилизированной фотомодификации крови нормализует экспрессию гена ФНО-а, баланс и уровни про- (ФНО-а) и противовоспалительных (ТФР-pi) цитокинов у пациенток с ПНБ, что является обоснованным и позволяет повысить процент благоприятного исхода беременности.

Внедрение результатов исследования

Результаты исследования внедрены в практику работы гинекологических отделений ГБУЗ «Городская клиническая больница №55 Департамента здравоохранения города Москвы» и ГБУЗ «Медико-санитарная часть №33 Департамента здравоохранения города Москвы». Результаты исследования используются для обучения студентов, врачей-интернов, ординаторов, аспирантов на кафедре акушерства и гинекологии №1 лечебного факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России.

Апробация диссертации

Основные положения работы представлены на Международном конгрессе «Лазер Хельсинки 2012» (Laser Helsinki International Congress, Хельсинки, Финляндия, 2012); XIII и XIV Всероссийском научном форуме «Мать и дитя» (Москва, 2012, 2013); VII и VIII Международном конгрессе по репродуктивной медицине (Москва, 2013, 2014); VI Международной конференции молодых ученых «Современные вопросы акушерства и гинекологии» (Москва, 2013); XXVI Международном конгрессе с курсом эндоскопии «Новые технологии в диагностике и лечении гинекологических заболеваний» (Москва, 2013); Объединенном иммунологическом форуме (Нижний Новгород, 2013); Российской (итоговой) научно-практической конкурс-конференции студентов и молодых ученых «Авиценна-2014» (Новосибирск, 2014).

Апробация диссертации состоялась на совместной научно-практической конференции коллектива сотрудников кафедры акушерства и гинекологии №1 лечебного факультета ГБОУ ВПО РНИМУ имени Н.И. Пирогова и врачей гинекологических отделений ГБУЗ «Городская клиническая больница №55 Департамента здравоохранения города Москвы» 28 мая 2013 г., протокол № 9.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 18 печатных работ, из них 6 - в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

Личное участие автора

Автором лично проведена работа по клинико-инструментальному обследованию пациенток, анализу клинико-лабораторных данных, а также статистическая обработка полученных данных и анализ результатов исследования. Автором проведена экспериментальная работа in vitro по ФДТ герпесвирусной инфекции на культурах клеток линии Vero вирусологическими и культуральными методами: выделение культур клеток, пассирование вируса, определение титра вируса по способу Рида и Менча, постановка ИФА и ПЦР-РВ изучаемых показателей, подготовка публикаций, оформление диссертации и автореферата.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ

Диссертация изложена на 134 страницах печатного текста, состоит из введения, обзора литературы, общей характеристики материалов и методов исследования, клинической характеристики обследованных пациенток, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, включающего 180 источников, из них 101 — отечественных, и 79 — зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 14 таблицами, 21 графиками и рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клиническая часть работы выполнена на кафедре акушерства и гинекологии №1 ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова (заведующий кафедрой — д.м.н., профессор, заслуженный врач РФ О.В. Макаров) на базе ГБУЗ «Городская клиническая больница №55 Департамента здравоохранения города Москвы» (главный врач - к.м.н. O.E. Куликова). Весь объем экспериментальной работы был выполнен в ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН в лаборатории молекулярной иммунологии (заведующая лабораторией - д.м.н. O.A. Свитич) и в ЦНИЛ ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова на кафедре иммунологии медико-биологического факультета (заведующая кафедрой - д.м.н., профессор Л.В. Ганковская).

Нами было проведено комплексное клинико-лабораторное обследование 134 небеременных женщин, из них: 74 пациентки (основная группа) с рецидивирующей герпесвирусной инфекцией (ВПГ-2, ЦМВ), из них — 36 пациенток без невынашивания беременности в анамнезе (1 подгруппа) и 38 пациенток с ПНБ вирусной этиологии (2 подгруппа). Пациенткам основной группы (22 женщины) проводилась фотосенсибилизированная ФМК. Группу сравнения составили 30 пациенток с ПНБ в анамнезе и рецидивирующей ГВИ, получавших внутривенно препараты иммуноглобулинов (2 группа) и 30 условно здоровых женщин без клинических проявлений инфекций, вызванных ВПГ-2 и ЦМВ (контрольная группа).

Методы клинического обследования включали сбор анамнестических данных, общий осмотр, специальное гинекологическое исследование. Всем пациенткам проводилось исследование клинических и биохимических показателей крови, коагулограмма, анализ мочи, определение группы крови, резус-принадлежности, определение антител к Treponema pallidum, ВИЧ, HBsAg, HCV; ПЦР-диагностика инфекций, передающихся половым путем, определение в крови антител к ВПГ и ЦМВ (IgG и IgM); ультразвуковое исследование внутренних половых органов.

После выполнения по стандартам необходимых диагностических мероприятий пациенткам проводилась фотосенсибилизированная фотомодификация крови.

Методика проведения фотосенсибилизированной ФМК с препаратом «Фотодитазин»: внутривенное струйное введение 1 мл (концентрация 0,5 мг/мл) «Фотодитазин» («Вета-Гранд», РФ) в разведении на 10 мл физиологического раствора (ОАО «Биохимик», РФ) в затемненном помещении. Через 5-10 минут после инъекции проводили транскутанное 8-минутное лазерное облучение крови, которое осуществляли с помощью диодного лазерного аппарата «Аткус-2» («Полупроводниковые приборы», РФ). Доза лазерного облучения при проведении фотосенсибилизированной ФМК составляла 200-350 Дж/см2 (длина волны 662 нм, плотность мощности на выходе 1,85-2 Вт). На фоне проводимой терапии осуществлялся клинико-

лабораторный мониторинг всех пациенток в динамике для оценки влияния данного метода лечения на состояние организма. Курс проведения фотосенсибилизированной фотомодификации крови составил 8 процедур. Процедура проводилась согласно графику 1 раз в 3 дня.

У всех пациенток проводили забор периферической крови (до процедуры; через 1 час после процедуры, через 1 сутки после процедуры, после 3-й процедуры (9-10 сутки) и после завершения курса лечения (18-20 сутки)) для исследования иммунологических показателей.

Всем пациенткам до начала исследования была предоставлена письменная информация о препарате, разъяснена суть исследования, его цель и связанный с участием в исследовании риск для здоровья. Перед началом исследования пациентка подписывала форму информированного согласия, подтверждающую ее добровольное участие.

Молекулярно-генетические и иммунологические методы исследования

включали изучение уровня экспрессии гена ФНО-а и определение цитокинового профиля (ФНО-а, ИФН-а, ТФР-Р1) в сыворотке крови у обследованных пациенток, которым проводилась фотосенсибилизированная ФМК.

Для изучения экспрессии гена ФНО-а были использованы следующие методы: выделение РНК из мононуклеарных клеток периферической крови, реакция обратной транскрипции и полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Клинические образцы (мононуклеарные клетки) подвергали лизису и из лизата выделяли РНК. Для обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в качестве праймеров были использованы олигонукпеотиды «Синтол» (РФ).

Определение цитокинового профиля (ФНО-а, ИФН-а, ТФР-Р1) в сыворотке крови проводили методом иммуноферментного анализа согласно рекомендуемым методикам с помощью коммерческих иммуноферментных тест-систем, выпускаемых «еВюваепсе» (США) и в соответствии с протоколами для постановки иммуноферментного анализа от фирмы-производителя. Регистрацию результатов иммуноферментного анализа

10

проводили на аппарате ридер «Reader ELx800» (Universal Microplate Reader, ЗАО ФинБио, Санкт-Петербург).

Материалы исследования обработаны при помощи компьютерных программ Excel и STATISTICA 7.0. Для проверки статистических гипотез использовались: t-критерий Стьюдента, непараметрический критерий Вилкоксона-Манна-Уитни. Для всех тестов и критериев величин критического уровня значимости принималась равной 0,05, т.е. различия признавались статистически значимыми при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На первом экспериментальном этапе исследования проводилась оценка противовирусного эффекта ФДТ in vitro непосредственно на вирус простого герпеса и на вирус-инфицированньте клетки, а также отработка оптимальных условий для реализации фотодинамического эффекта с использованием ФС «Фотодитазин», и изучение противовирусных механизмов ФДТ на примере герпетической инфекции.

В результате экспериментов были определены оптимальные дозы лазерного облучения и препарата ФС, при которых значительных изменений в культуре клеток не наблюдалось (концентрация ФС — 10-50 мкг/мл, доза лазерного облучения - 1,8 Дж/см2). Для оценки эффективности фотодинамических воздействий на ВПГ была разработана схема эксперимента для определения прямого и опосредованного действия ФДТ на вирус, на инфицированную ВПГ-1 и ВПГ-2 культуру клеток Vero, на потомство вновь продуцируемого вируса in vitro. Был реализован противогерпетический эффект фотодинамического воздействия в культуре клеток с использованием ФС «Фотодитазин». Под действием лазерного облучения в сенсибилизированных образцах с оптимальной концентрацией ФС 10 мкг/мл и наименьшей концентрацией вновь продуцируемого вируса 4,0 ТЦД5о/0,1мл наблюдалось 25% ЦПД с применением инкубации до и после облучения, т.е. титр вновь продуцируемого вируса снижался на 2 ТЦД50/0,1 (рис. 1).

5 3,5

концентрация вируса

■ исход.

□ 0,1 исход

□ 0,01 исход

контроль ВПГ-1 ВПГ-1+Л.О. ВПГ-1+ФС \ ВПГ-1+ФС+Л.О/ ВПГ-1+ФС

(ЗОмин) +Л.О.

Примечание:

По оси ординат-титр вновь продуцируемого вируса (ТЦД50/0,1мл), по оси абсцисс - модификации

экспериментов

Значения столбцов:

1. контроль ВПГ-1

2. культура клеток, инфицированная ВПГ-1 при воздействии лазерного облучения

3. культура клеток, инфицированная ВПГ-1 после введения фотосенсибилизатора

4. культура клеток, инфицированная ВПГ-1 при фотодинамическом воздействии и соблюдении инкубации в течение 30 мин до и после облучения

5. культура клеток, инфицированная ВПГ-1 при фотодинамическом воздействии и соблюдении только первичной инкубации до облучения

* - р<0,05 уровень значимости различий по критерию Стьюдента по сравнению с контрольной группой с исходной концентрацией ВПГ-1

** - р<0,05 уровень значимости различий по критерию Стьюдента по сравнению с контрольной группой с концентрацией ВПГ-1 0,01

Рис. 1. Оценка пролиферации и гибели клеток при исследовании цитотоксического действия ФДТ с ФС «Фотодитазин» in vitro на модели герпес-вирусной инфекции ВПГ- 1.

Результаты, полученные в данной схеме эксперимента при соблюдении таких же условий, по ВПГ-2 показали достоверное снижение титра вируса на полтора порядка (в 10 и более раз) [рис. 2], что указывает на противовирусный эффект фотодинамического воздействия.

ВПГ-1 + ФДТ ВПГ-2 + ФДТ

Рис. 2. Цитопатическое действие ВПГ после ФДТ в культуре клеток.

При клиническом анализе было выявлено, что возраст пациенток в исследуемых группах достоверно не отличался, колебался от 18 до 35 лет и в среднем составил 25,8±4,0 лет, что соответствовало наиболее активному периоду репродуктивной функции женщин.

Пациентки основной группы отличались от контрольной повышенным уровнем соматической патологии и отягощенным инфекционным анамнезом с превалированием заболеваний желудочно-кишечного тракта (70,2%) и мочевыделительной системы (31,2%), а также высокой частотой ранее перенесенных вирусных инфекций (97.3%).

При статистической обработке данных выявлены различия в частоте рецидивов и длительности обострений герпесвирусной инфекции у пациенток основной группы. У женщин с привычным невынашиванием беременности частота рецидивов в год была статистически достоверно выше, чем у пациенток без невынашивания беременности (5,4±1,2 и 2,9±1,1 соответственно).

Оценка акушерского анамнеза выявила, что в контрольной группе количество самопроизвольных выкидышей было достоверно меньшим, чем у женщин с ПНБ на фоне герпесвирусной инфекции (основная группа и группа сравнения), что способствует инфицированию генитального тракта.

Почти все обследованные пациентки страдали гинекологическими заболеваниями. В основной группе у пациенток с привычным невынашиванием беременности чаще, чем в контрольной, встречались различные нарушения менструального цикла (25,6%), рецидивирующий кольпит (51,3%), эктопия шейки матки (32,4%), хронические воспалительные процессы придатков матки (28,4%).

В структуре урогенитальной инфекции у пациенток основной группы преобладали Gardnerella vaginalis (63,2%), Clamydia trachomatis (23,7%), Ureaplasma urealyticum (26,3%). Длительной персистенции вирусной инфекции, способствуют изменения состава вагинального микроценоза, результатом которого являются изменения иммунитета на локальном уровне.

В патогенезе невынашивания беременности важная роль принадлежит иммунным механизмам. На фоне вирусной инфекции при невынашивании беременности активация системы естественного иммунитета недостаточна для элиминации вирусных антигенов. При этом стимуляция естественного иммунитета (выработка цитокинов) способствует репродуктивным потерям вследствие смещения иммунного равновесия (Макаров О.В., 2007; Хашукоева А.З., 2009).

В связи со значимостью иммунных механизмов при ПНБ проведено исследование продукции цитокинов (ФНО-а, ИФН-а, ТФР-ßl) в сыворотке крови и уровней экспрессии гена ФНО-а мононуклеарными клетками крови при фотосенсибилизированной ФМК у пациенток основной группы с хронической герпесвирусной инфекцией.

Изучаемые показатели определяли в динамике до терапии и на фоне проводимого лечения. Нами выявлен достоверно повышенный в 50 раз фоновый уровень экспрессии гена ФНО-а в МНК клетках периферической крови по сравнению со здоровыми донорами (8,23±2,65х103 копий гена). Экспрессия гена ФНО-а у пациенток 1 подгруппы на фоне лечения через 10 суток после начала терапии достоверно снижалась у 60,0% пациенток (р<0,05) [рис. За]. Во 2 подгруппе пациенток с ПНБ в анамнезе выявлено, что уровень экспрессии ФНО-а до начала лечения был сопоставим со средними значениями

14

данного показателя у пациенток в 1 группе (40,18±10,0 и 36,18±9,81 х 103 копий гена соответственно). На фоне терапии в данной группе женщин экспрессия гена ФНО-а уже через 1 час после первой процедуры снизилась у 75,0% пациенток. После проведения курса фотосенсибилизированной ФМК достоверная динамика снижения экспрессии гена ФНО-а была выявлена у 62,5% пациенток во 2 подгруппе с ПНБ (р<0,05) [рис. 36].

а

временные точки забора крови

Рис. За. Экспрессия гена ФНО-а в мононуклеарных клетках у пациенток 1 подгруппы на фоне проведения фотосенсибилизированной ФМК.

—й—12 '

дотерапии через 1 час через 1 сутки черезЮдней после терапи..

временные точки забора крови

Примечание: * - Уровень значимости по критерию Манна-Уитни р<0,05 по сравнению с фоновым уровнем экспрессии гена ФНО-а.

- диапазон показателя в группе здоровых

Рис. 36. Экспрессия гена ФНО-а в мононуклеарных клетках у пациенток 2 подгруппы на фоне проведения фотосенсибилизированной ФМК.

Таким образом, на основании полученных данных мы можем сделать вывод, что проведение фотосенсибилизированной ФМК способствовало снижению экспрессии гена ФНО-а в мононуклеарных клетках у пациенток основной группы, что является благоприятным для предстоящей имплантации.

15

Для достоверной оценки эффективности терапии в динамике было проведено исследование про- и противовоспалительных цитокинов (табл. 1).

Таблица 1.

Динамика показателей продукции цитокинов в сыворотке крови у пациенток на фоне проведения фотосенсибилизированной ФМК

Время забора крови Основная группа (п = 22)

1 подгруппа без ПНБ 2 подгруппа с ПНБ

ФНО-а пк/мл

до начала терапии 6,1б±4,Г 7,35±3,95"

через 1 сутки 5,68±3,2" 7,02±4,2*

через 10 суток 4,675±2,8 5,2±1,8

через 1 час после завершения терапии 3,9±1,6 3,45±2,2

ТФР-Р1 пк/мл

до начала терапии 140,94±39,9" 391,86±48,1"

через 1 сутки 168,2±54,77" 323,7±122,2"

через 10 суток 302,1 ±158* 287,8±165

через 1 час после завершения терапии 534,4±197,5'" 342,13± 129,9"

ИНФ-а пк/мл

до начала терапии 11,06±3,54 12,85±1,96

через 1 сутки 14,1 ±2,57 13,3±2,65

через 10 суток 14.3±2,58 12,63±1,89

через 1 час после завершения терапии 13,7±1,3 12,97±1,7

Пргшечание: * - достоверность различий р<0,05 при сравнении между показателями в подгруппах с фоновым уровнем.

# - достоверность различий р<0,05 при сравнении показателей между собой в подгруппах.

Экспрессию гена ФНО-а сопоставляли с уровнем продукции провоспалительного ФНО-а. На фоне лечения у пациенток 1 подгруппы без ПНБ в анамнезе отмечался рост продукции ФНО-а на фоне терапии у 40% пациенток, что обусловлено участием ФНО-а в механизме защиты организма от ВПГ. У остальных 60,0% пациенток наблюдалось снижение продукции ФНО-а на фоне терапии, что составило 3,9±1,6 пк/мл после проведения курса процедур (рис. 4а).

16 14 12 ¡10 | 8 те 6

о

—^-

-*

1 т -Лт — -—^ - _ *

через 1 час через 1 сутки через 10 дней

временные точки забора крови

60% 40%

после терапии

Рис. 4а. Динамика продукции ФНО-а в сыворотке крови у пациенток 1 подгруппы на фоне проведения фотосенсибилизированной ФМК.

временные точки забора крови

Примечание: * Уровень значимости по критерию Манна-Уитни р<0,05 по сравнению с фоновым уровнем ФНО-а.

- диапазон показателя в группе здоровых Рис. 46. Динамика продукции ФНО-а в сыворотке крови у пациенток 2 подгруппы на фоне проведения фотосенсибилизированной ФМК.

У большинства пациенток с ГВИ и без ПНБ в анамнезе (1 подгруппа) на фоне проводимой терапии динамика продукции ФНО-а повторяла динамику экспрессии гена ФНО-а. Таким образом, нами установлено, что фотосенсибилизированная ФМК приводила к нормализации данного показателя, участвующего в реализации врожденного иммунного ответа против ВПГ.

Полученные результаты продукции ФНО-а были сопоставлены с данными ретроспективного анализа в контрольной группе, где фоновый уровень ФНО—а в среднем составлял 2,4±0,8 пк/мл (Гаджиева Ф.Г., 2010), 3,3±0,25 пк/мл (Гайдарова Н.Ф., 2013) и был достоверно ниже в 2 раза фонового уровня продукции ФНО-а у пациенток 1 подгруппы.

Во 2 подгруппе пациенток с ПНБ получено, что концентрация сывороточного ФНО-а до начала терапии составляла 7,35±3,95 пк/мл (р<0,05), что было достоверно выше нормальных показателей в контрольной группе, но сопоставимо со средними значениями у пациенток в 1 подгруппе. Снижение продукции ФНО-а на фоне терапии наблюдалось у 62,5% пациенток, данный показатель не менялся достоверно (рис. 46), при этом у 80,0% из этих женщин наблюдалось повышение продукции ФНО-а в начале и середине курса ФМК. Показатель сывороточного ФНО-а после завершения курса лечения у пациенток 2 подгруппы составлял 3,45±2,2 пк/мл (р<0,05) и достоверно отличался от значений, полученных до начала лечения и недостоверно — от нормальных показателей в контрольной группе.

При изучении содержания ИФН-а в динамике было установлено, что на фоне проведения фотосенсибилизированной ФМК уровень ИФН-а у пациенток основной группы достоверно не отличался от исходных значений. При сопоставлении с нормальными популяционными показателями - 20-120 пг/мл в контрольной группе (Ершов Ф.И., 2006), нами выявлен достоверно сниженный фоновый уровень ИФН-а (в 1,6 раз) у всех пациенток с ГВИ. У женщин основной группы уровни сывороточного ИФН-а, несмотря на проведение фотосенсибилизированной ФМК, оставались в пределах фоновых значений, что характеризует глубокое подавление интерферонгенеза -интерферондефицитное состояние.

Таким образом, результаты нашего исследования показали, что фотосенсибилизированная ФМК у пациенток с ПНБ на фоне рецидивирующей ГВИ не влияет на систему интерферонов, поэтому, мы считаем, что в комплексную терапию герпесвирусной инфекции для предгравидарной подготовки целесообразно добавить препараты рекомбинантного интерферона в сочетании с иммуномодулирующей терапией.

Среди других цитокинов, влияющих на функционирование трофобласта, выделяют трансформирующий фактор роста Р1 (ТФР-р1), регулирующий дифференцировку и функциональную активность клеток трофобласта и участвующий в подготовке эндометрия к имплантации плодного яйца, что

18

способствует адгезии клеток трофобласта (Сухих Г.Т. и соавт., 2010; Jana Skrzypczak и соавт., 2007).

Нами проведена оценка уровней противовоспалительного цитокина ТФР-ßl в сыворотке крови в динамике на фоне фотосенсибилизированной ФМК. Было получено, что до проведения терапии у пациенток 1 подгруппы без ПНБ в анамнезе уровень исходного ТФР-ßl составлял 140,94±39,9 пк/мл (р<0,05) и был достоверно ниже в сравнении с ретроспективно полученным значением концентрации ТФР-ßl в сыворотке крови здоровых доноров 243,0±6,5 пк/мл (Кубанова A.A. и соавт., 2006), что связано с гиперактивацией системы естественного иммунитета у женщин с рецидивирующей ГВИ.

В динамике на фоне терапии у пациенток 1 группы отмечался достоверный рост уровня ТФР-ßl и в конце курса лечения составлял 534,4±197,5 пк/мл (р<0,05) [рис. 5а].

600 -500 -

-1 подгруппа -значение нормы ТФР-М

*

S. о

через 1 час

через 1 сутки

через 10 дней

после терапии

временные точки забора крови

Рис. 5а. Динамика продукции ТФР-Р1 в сыворотке крови у пациенток 1 подгруппы на фоне проведения фотосенсибилизированной ФМК.

600 -

х 500 -

§ 400 •

,- Í 300 •

« к

; 5 200 ■

§S 100-

ää о-

до терапии

-62,50% -37,50%

- значение нормы ТФР-Ы

через 1 час через 1 сутки через 10 дней

временные точки забора крови

после терапии

Прш/ечание: * - Уровень значимости по критерию Манна-Уитни р<0,05 по сравнению с фоновым уровнем ФНО-а.

Рис. 56. Динамика продукции ТФР-Р1 в сыворотке крови у пациенток 2 подгруппы на фоне проведения фотосенсибилизированной ФМК.

19

Во 2 подгруппе пациенток с ПНБ в анамнезе исходный уровень ТФР-Р1 составил 391,86±48,1 пк/мл и был в 1,6 раз выше, чем в контрольной группе. На фоне фотосенсибилизированной ФМК отмечались две тенденции по динамике продукции ТФР-Р1. У 62,5% пациенток этой группы в начале курса процедур наблюдалось недостоверное снижение продукции ТФР-Р1, но к середине (10-е сутки) и к завершению курса процедур (18-20-е сутки) продукция ТФР-р1 имела тенденцию к нарастанию (рис. 56). У остальных 37,5% пациенток данной группы в динамике отмечался достоверный рост ТФР-Р1 в сравнении с аналогичными показателями в 1 подгруппе, что, как мы считаем, будет способствовать подготовке эндометрия к имплантации плодного яйца, адгезии клеток трофобласта и торможению репликации ВПГ и вынашиванию беременности.

Таким образом, фотосенсибилизированная ФМК у пациенток с ПНБ на фоне рецидивирующей ГВИ приводит к индукции секреции противовоспалительного цитокина ТФР-Р1 до 342,13±129,9 пк/мл в сыворотке крови, что можно считать эффектом терапии с целью предгравидарной подготовки у данной категории женщин.

Таким образом, ПНБ на фоне рецидивирующей герпесвирусной инфекции у пациенток обусловлено не наличием персистирующей инфекции, а нарушенными механизмами иммунной защиты от герпесвирусов.

Проведенные исследования по оценке цитокинового профиля (ФНО-а, ИФН-а, ТФР-Р1) и экспрессии гена ФНО-а на фоне фотосенсибилизированной ФМК показали, что наиболее достоверными маркерами эффективности проводимой терапии было снижение экспрессии гена ФНО-а в 2,2 раза, снижение уровня ФНО-а в 2 раза и увеличение ТФР-Р1 в 3,8 раз по сравнению с фоновыми значениями.

Эффективность проведенного лечения оценивали клинически по данным наступления и течения беременности, а также количеству рецидивов герпесвирусной инфекции. При динамическом наблюдении в течение 1 года за пролеченными пациентками эпизодов рецидива ГВИ на фоне беременности не было зарегистрировано ни у одной пациентки. Беременность наступила у 15

20

заинтересованных пациенток (41,7%) 1 подгруппы и у 24 (63,1%) - 2 подгруппы (рис. 6).

По оси ординат — процент наступивших беременностей, доношенных до срока гестации 20 недель и более * - Уровень значимости по критерию Манна-Уитни р<0,05 по сравнению с группой сравнения.

Рис. 6. Сравнительная частота наступления беременности у пациенток основной группы после фотосенсибилизированной ФМК через 10 месяцев.

Полученные клинические данные мы сопоставили с группой сравнения и выявили, что процент наступления и вынашивания беременности был достоверно выше в основной группе пациенток по сравнению со 2 группой женщин, получавших препараты иммуноглобулинов, и составил 63,1% против 53,3% (р<0,05). Рецидивов ГВИ во время беременности также не было зарегистрировано у пациенток основной группы.

Таким образом, результаты проведенных исследований позволяют сделать вывод, что фотосенсибилизированная ФМК может стать эффективным методом предгравидарной подготовки, как самостоятельный метод или в составе комплексной противовирусной терапии у пациенток с герпесвирусной инфекцией и ПНБ в анамнезе. Определение экспрессии гена ФНО-а и цитокинового профиля (ФНО-а, ТФР-р1) позволяет отслеживать эффективность проведения фотосенсибилизированной ФМК и доказывает целесообразность ее применения.

1 группа 2 группа 3 группа

выводы

1. Пациентки с ПНБ имеют высокую частоту предрасполагающих факторов риска репродуктивных потерь в сравнении с группой условно здоровых женщин: наличие рецидивирующей герпесвирусной инфекции в сочетании с высокой частотой хронических инфекционных заболеваний, экстрагенитапьных очагов инфекции, хронических воспалительных заболеваний генитального тракта и отягощенного репродуктивного анамнеза.

2. На экспериментальном этапе исследования создана модель герпесвирусной инфекции in vitro для изучения механизмов противовирусного действия ФДТ, позволяющая изучать прямое и опосредованное действие ФДТ, оптимизировать дозу препарата фотосенсибилизатора и дозу лазерного излучения для получения противогерпетического эффекта ФДТ, который был реализован in vitro при концентрации ФС «Фотодитазин» 10-50 мкг/мл и воздействии лазерного облучения в дозе 1,8 Дж/см2 (время облучения 30 сек), при соблюдении инкубации до и после облучения не менее 30 мин. При данных условиях эксперимента титр вируса достоверно снижался на 1,5-2 порядка.

3. У пациенток с ПНБ до начала терапии фотосенсибилизированной ФМК выявлены достоверные изменения иммунологических показателей:

- повышенный фоновый уровень экспрессии гена ФНО-а в МНК клетках периферической крови в 50 раз по сравнению со здоровыми донорами;

- повышение концентрации провоспалительного цитокина ФНО-а в 3 раза по сравнению со здоровыми донорами;

- снижение фонового уровня ИФН-а в сыворотке крови в 1,6 раз по сравнению с группой здоровых женщин;

4. Комплексный анализ экспрессии гена ФНО-а и цитокинового профиля (ФНО-а, ИФН-а, ТФР-pi) у пациенток с ПНБ и рецидивирующей формой герпесвирусной инфекции (2 подгруппа) показал, что фотосенсибилизированная ФМК приводит к изменениям иммунологических показателей: отсроченному (до 10 суток) достоверному снижению уровня экспрессии гена ФНО-а до 17,93±10,5 пк/мл; снижению уровня провоспалительного цитокина ФНО-а до 3,45±2,2 пк/мл и индукции секреции

22

противовоспалительного цитокина ТФР-Р1 до 342,13± 129,9 пк/мл в сыворотке крови, что можно считать положительной динамикой данной терапии с целью предгравидарной подготовки у данной категории женщин. 5. Фотосенсибилизированная фотомодификация крови у пациенток с ПНБ на фоне рецидивирующей ГВИ не влияет на систему интерферонов и уровни титров специфических иммуноглобулинов класса в против ВПГ-2 и ЦМВ, поэтому в комплексную терапию герпесвирусной инфекции для предгравидарной подготовки целесообразно добавить препараты рекомбинантного интерферона в сочетании с иммунотерапией.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Повышение концентрации провоспалительного ФНО-а и экспрессии гена ФНО-а в МНК клетках периферической крови, снижение фонового уровня ИФН-а могут быть использованы для прогнозирования невынашивания беременности, ассоциированного с ГВИ и определения показаний к проведению фотосенсибилизированной ФМК.

2. Для оценки эффективности фотосенсибилизированной ФМК у пациенток с ПНБ и рецидивирующей герпесвирусной инфекцией целесообразно определять экспрессию гена ФНО-а в мононуклеарных клетках и цитокиновый профиль (ФНО-а, ТФР-Р1) в сыворотке крови на протяжении всего курса лечения, а также после окончания терапии до момента наступления беременности.

3. Использование ФС «Фотодитазин» при транскутанной фотосенсибилизированной ФМК является оптимальным и безопасным для получения благоприятного эффекта и достижения оптимального иммунологического баланса для наступления беременности у пациенток с герпесвирусной инфекцией и ПНБ в анамнезе.

4. Учитывая отсутствие необходимости в проведении обезболивающей терапии, почасового мониторинга за состоянием пациентки после процедуры, низкого риска развития побочных эффектов и осложнений терапии, фотосенсибилизированная ФМК может быть применена в амбулаторных условиях, либо в стационаре одного дня.

23

Список опубликованных работ по теме диссертации:

1. Маркова, Э.А. Фотодинамическая терапия — противовирусная терапия? История вопроса. Перспективы применения / А.З. Хашукоева, O.A. Свитич, Э.А. Маркова и др. // Лазерная медицина. - 2012. - №16(2). - С. 63-67.

2. Маркова, Э.А. Эффект фотодинамического воздействия на герпесвирусную инфекцию в эксперименте in vitro / А.З. Хашукоева, O.A. Свитич, Э.А. Маркова // Материалы I Всероссийской научной конференции молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине XXI века». — М., 2012. - С. 199.

3. Markova, Е.А. Antiviral effect of photodynamic therapy in experiment in vitro. / O.V. Makarov, A.Z. Khashukoeva, O.A. Svitich et. al. // Photodiagnosis and photodynamic therapy. Supplement. Abstracts of Laser Helsinki International Congress, Helsinki, Finland. - 2012. - P. S28.

4. Маркова, Э.А. Противовирусный эффект фотодинамической терапии в эксперименте in vitro / А.З. Хашукоева, O.A. Свитич, Э.А. Маркова и др. // Материалы XIII Всероссийского научного форума «Мать и дитя». - М., 2012. -С. 300.

5. Маркова, Э.А. Экспериментальное обоснование метода фотосенсибилизированной фотомодификации крови в лечении пациенток с привычным невынашиванием беременности / О.В. Макаров, А.З. Хашукоева, O.A. Свитич и др. // Материалы VII Международного конгресса по репродуктивной медицине. -М., 2013. - С. 228.

6. Маркова, Э.А. Оценка цитокинового профиля при фотосенсибилизированной фотомодификации крови у пациенток с привычным невынашиванием беременности в анамнезе / А.З. Хашукоева, O.A. Свитич, Э.А. Маркова и др. // Материалы II Всероссийского междисциплинарного образовательного конгресса «Осложненная беременность и преждевременные роды: от науки к практике». - М., 2013.-С. 119-120.

7. Маркова, Э.А. Новые возможности фотодинамической терапии в лечении привычного невынашивания беременности, ассоциированного с хронической герпесвирусной инфекцией / Э.А. Маркова, O.A. Свитич, С.А. Хлынова и др. // Вестник РГМУ, специальный выпуск, 2013. - №2. - С. 100-104.

8. Маркова, Э.А. Применение фотосенсибилизированной фотомодификации крови для лечения пациенток с рецидивирующей герпесвирусной инфекцией и привычным невынашиванием беременности / А.З. Хашукоева, O.A. Свитич, Э.А. Маркова и др. // Материалы XXVI Международного конгресса с курсом эндоскопии «Новые технологии в диагностике и лечении гинекологических заболеваний».-М„ 2013.-С. 155.

9. Маркова, Э.А. Оценка цитокинового профиля при фотомодификации крови у пациенток с привычным невынашиванием беременности / А.З. Хашукоева, O.A. Свитич, Э.А. Маркова и др. // Материалы объединенного иммунологического форума. - Нижний Новгород, 2013. - С. 285-286.

10. Маркова, Э.А. Фотосенсибилизированная фотомодификация крови в лечении хронической герпес-вирусной инфекции у пациенток с привычным невынашиванием беременности в эксперименте in vitro / А.З. Хашукоева, O.A. Свитич, Э.А. Маркова и др. // Материалы XIV Всероссийского научного форума «Мать и дитя». - М., 2013. - С. 216.

11. Маркова, Э.А. Противовирусный эффект фотодинамической терапии в эксперименте in vitro / А.З. Хашукоева, O.A. Свитич, Э.А. Маркова и др. // Материалы II Всероссийской конференции с международным участием «Актуальные вопросы ФДТ и Фотодиагностики». - М., 2013. — С. 31.

12. Маркова, Э.А. Противовирусная фотодинамическая терапия: новый взгляд на терапию привычного невынашивания беременности, ассоциированного с хронической смешанно-вирусной инфекцией (обзор литературы) / А.З. Хашукоева, O.A. Свитич, Э.А. Маркова и др. // Акушерство и гинекология. — 2013.-№6.-С. 11-16.

13. Маркова, Э.А. Фотосенсибилизированная фотомодификация крови - новый метод предгравидарной подготовки при привычном невынашивании беременности, ассоциированном с герпесвирусной инфекцией / Хашукоева А.З., Свитич O.A., Маркова Э.А. и др. // Лечащий врач-2013.- №11.- С.20-24.

14. Маркова, Э.А. Возможности фотосенсибилизированной фотомодификации крови в терапии рецидивирующей герпес-вирусной инфекции у пациенток с репродуктивными потерями в анамнезе / Хашукоева А.З., Свитич O.A.,

25

Маркова Э.А. и др. // Материалы VIII Международного конгресса по репродуктивной медицине. — М., 2014. - С. 86-87.

15. Маркова, Э.А. Эффект фотодинамического ингибирования герпесвирусной инфекции с использованием фотосенсибилизатора на основе хлорина Е6 в эксперименте in vitro. Противогерпетический эффект фотодинамического действия в эксперименте in vitro / O.B. Макаров, А.З. Хашукоева, O.A. Свитич и др. // Журнал экспериментальной микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. — 2014. — №1. — С. 48-55.

16. Маркова, Э.А. Оценка цитокинового профиля (ФНО-а, ИНФ-а, ТФР-ßl) при фотосенсибилизированной фотомодификации крови у пациенток с привычным невынашиванием беременности вирусного генеза в анамнезе / А.З. Хашукоева, O.A. Свитич, Э.А. Маркова и др. // Российский Иммунологический Журнал. - 2014. - том 8(17), №2. - С. 164-169.

17. Маркова, Э.А. Экспериментальное обоснование противовирусной фотодинамической терапии у пациенток с привычным невынашиванием беременности инфекционного генеза / А.З. Хашукоева, O.A. Свитич, Э.А. Маркова и др. // Материалы Российской (итоговой) научно-практической конкурс-конференции студентов и молодых ученых «Авиценна-2014», посвященной 135-летию со дня рождения Н.И. Горизонтова. - Новосиб., 2014. — С. 69.

18. Маркова, Э.А. Цитокиновый профиль при химиосенсибилизированной фотомодификации крови у пациенток с привычным невынашиванием беременности вирусного генеза / А.З. Хашукоева, O.A. Свитич, Э.А. Маркова и др. // Материалы XXVII Международного конгресса с курсом эндоскопии «Новые технологии в диагностике и лечении гинекологических заболеваний». -М„ 2014.-С. 98.

Подписано в печать 23.06.2014 г. Формат А5 Бумага офсетная. Печать цифровая. Тираж 100 экз. Заказ № 18985 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-т, д.28 Тел. 8(495)782-88-39