Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Фитохимическое изучение жома плодов крыжовника

На правах рукописи

00461369а

Кафьян Артур Рафаэлович

ФИТОХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЖОМА ПЛОДОВ КРЫЖОВНИКА 14.04.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

2 о НОЯ 2010

Москва-2010

004613698

Диссертационная работа выполнена в ГОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова.

Научный руководитель:

Доктор фармацевтических наук, профессор

Официальные оппоненты:

Доктор фармацевтических наук, профессор

Доктор фармацевтических наук, профессор

Нестерова Ольга Владимировна

Берлянд Александр Семенович

Белобородое Владимир Леонидович

Ведущая организация: ГОУ ВПО Российский университет дружбы народов Рособразования.

Защита состоится <i>% л2010 г. в /'/ "часов на

заседании Диссертационного Совета

ДШ .040.09 при ГОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова по адресу: 119019, г. Москва, Никитский бульвар, 13.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова по адресу: 117998, г. Москва, Нахимовский проспект, 49.

Автореферат разослан «_/^>> /^/У/^с^-с^Хс/ 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета доктор фармацевтических наук, профессор Садчикова Наталья Петровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

В настоящее время значительный интерес вызывает изучение растительного сырья, применяемого в нетрадиционной медицине. Некоторые виды сырья являются пищевыми, а по содержанию ценных биологически активных веществ не уступают, а иногда и превосходят официальные виды. В ряду биологически активных соединений особое место занимают полиненасыщенные жирные кислоты ряда со-6 и со-3. К такому сырью относятся плоды и жом плодов крыжовника.

Крыжовник - одно из наиболее интересных и ценных ягодных растений, исконная культура русских садов. Известно, что крыжовник помимо широкого спектра биологически активных веществ (флавоноиды, каротиноиды, микроэлементы, витамины и др.) является источником редкой у-линоленовой кислоты (полиненасыщенной жирной кислоты ряда со-6) -естественного предшественника простогландинов, лейкотриенов, участвующих в биогенезе человека. Актуальность применения жома и плодов крыжовника в качестве нового растительного сырья обусловлено, во-первых, его богатым химическим составом; во-вторых, содержанием у-линоленовой кислоты; в-третьих, дешевизной сырьевой базы, используемой для выделения данных ценных биологически активных веществ, поскольку жом плодов крыжовника является продуктом отхода технологических процессов в пищевом производстве, а также многообразием сортов крыжовника.

На фармацевтическом рынке широко распространены монопрепараты у-линоленовой кислоты (масло примулы вечерней, масло ослинника) и ортомолекулярные комплексы (Артрианом, Био-Фикс и др.) В настоящее время в качестве источника у-линоленовой кислоты используют некоторые

3

виды бурачника, плоды чёрной смородины. Однако сырьевая база, используемая для выделения данного ценного продукта недостаточна.

Цель исследования.

Фитохимическое изучение жома плодов крыжовника, разработка методики выделения липидного комплекса из растительного сырья позволяющая повысить выход конечного продукта, определение физико-химических характеристик выделяемого липидного комплекса и его стандартизация.

Задачи исследования.

1.Фармакогностический анализ жома плодов крыжовника, как нового вида лекарственного растительного сырья представляющего собой альтернативный экономичный источник полиненасыщенных жирных кислот.

2. Разработать методику выделения липидного комплекса из жома плодов крыжовника.

3. Установить жирнокислотный и фосфолипидный состав липидного омплекса жома плодов и определить их количественное соотношение.

4. Исследовать и оценить физико-химические показатели качества липидного комплекса.

5. Разработать методику количественного определения жирнокислотного состава липидного комплекса жома.

Научная новизна результатов работы.

Впервые в качестве новой сырьевой базы для выделения липидного комплекса предложено новое растительное сырье - плоды и жом плодов крыжовника. Предложена методика выделения липидного комплекса из жома и плодов крыжовника, позволяющая повысить выход экстрагируемых веществ с использованием смеси экстрагентов, применяемых в фармацевтическом производстве.

Теоретически обоснованы перспективы использования препаратов содержащих масло плодов крыжовника, при лечении и профилактике заболеваний пародонта и слизистой ротовой полости.

Научная новизна проведенных исследований подтверждается заявкой на патент РФ № 2009147392/14 от 22.12.2009 «Способ получения жирного масла из жома и плодов крыжовника», и заявкой №2009133015/20 от 03.09.2009 «Средство для лечения и профилактики заболеваний пародонта и слизистой ротовой полости».

Практическая значимость результатов исследования.

В результате исследований был изучен химический состав предлагаемого растительного сырья и содержание липидного комплекса в нем, что дало основание предложить его как новый экономичный источник полиненасыщенных жирных кислот. Была осуществлена стандартизация жома плодов крыжовника в соответствии с общими статьями ГФ XI «Плоды» и «Семена», а также были учтены требования к исходному цельному сырью, а именно плодам крыжовника- РшсШб ШЬеэ (ГОСТ 3225-75) и липидного комплекса выделенного из жома плодов крыжовника в соответствии с общей статьей « Масла жирные» ГФ X.

Была предложена методика по получению масла из плодов и жома плодов крыжовника с использованием смеси экстрагентов, применяемых в фармацевтической промышленности.

Результаты диссертационной работы «Фитохимическое изучение жома плодов крыжовника» использованы в проекте методического руководства по контролю качества экстрактов получаемых из лекарственного растительного сырья, используемых в качестве лекарственных средств и для создания препаратов на их основе (в Ташкентском фармацевтическом институте). Разработан проект фармакопейной статьи на жом плодов крыжовника.

Приоритет проведенных исследований подчеркивается предложенным составом, содержащим масло жома плодов крыжовника предназначенный для лечения и профилактики заболеваний пародонта и слизистой ротовой полости.

Положения, выносимые на защиту.

1.Результаты фармакогнозтического изучения жома плодов крыжовника, предлагаемого в виде нового альтернативного, экономического источника полиненасыщенных жирных кислот.

2. Разработки методик по выделению липидного комплекса из жома плодов крыжовника, направленных на повышение выхода конечного продукта.

3.Результаты качественного и количественного изучения липидного комплекса.

4.Данные стандартизации липидного комплекса выделенного из жома плодов крыжовника.

Апробация работы.

Апробация работы проведена на совместном заседании кафедры общей химии и ботаники ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова 6 мая 2010 года.

Основные положения и результаты исследования были представлены для обсуждения на IV Российской научно-практической конференции "Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов" (Москва, 2007 ), X Международный конгресс "Инновационные технологии в биологии и медицине" (Москва, 2009).

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова по теме: "Новые знания и подходы в оценке качества и сертификации биологически активных соединений синтетического и природного происхождения, лекарственных препаратов, изделий медицинской техники (технологические и экологические аспекты)", номер государственной регистрации 01.200.118796.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано пять печатных работ, две из которых в рецензируемых журналах, а также получено положительное решение по двум заявкам на выдачу патентов РФ.

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы и пяти глав экспериментальных исследований, выводов, списка литературы. Материал диссертации изложен на 115 страницах текста, в списке цитируемой литературы 192 наименования, из которых 62 зарубежные. Работа иллюстрирована 24 таблицами, 9 рисунками и 3 схемами.

Результаты экспериментов обработаны статистически, обобщены в таблицах, проиллюстрированы рисунками.

Содержание работы

Обзор литературы.

Изучение литературных данных показало, что крыжовник является весьма ценной ягодной культурой, характеризующейся высоким содержанием биологически активных веществ. Плоды крыжовника являются источником Сахаров, органических кислот, витаминов, каротиноидов, токоферолов, флавоноидов и что самое главное, крыжовник характеризуется высоким

содержанием полиненасыщенных жирных кислот. Плоды и жом плодов крыжовника являются источником редкой 7-линоленовой кислоты, являющейся предшественником высокоактивных биологически активных веществ: простагландинов, тромбоксанов, лейкотриенов и других эйкозаноидов, что делает их еще более ценной сырьевой базой. Учитывая тот факт, что жом плодов крыжовника является отходом пищевой промышленности, остающейся после многотонажного производственного процесса, его использование в качестве нового растительного источника полиненасыщенных жирных кислот делает его не только перспективным, но и экономичным.

Объекты и методы исследования.

Объектом исследования служил жом плодов наиболее широко культивируемых и распространенных на территории РФ сортов крыжовника: Салют, Русский желтый, Черномор, Колобок, Слабошип, Балтийский, Русский (типовые характеристики которых представлены в таблице 1), предварительно прошедший технологическую обработку, включающую механическое отжатие сока крыжовника и последующую термическую сушку. Жом плодов крыжовника получали в ЗАО "Садко Ц" и Липецкого кондитерского комбината .Отбор проб и анализ жома и плодов крыжовника осуществляли в соответствии с требованиями общей статьи ГФ XI части 1 «Правила приемки лекарственного растительного сырья и методы отбора проб для анализа», «Листья», «Плоды».

Типовые характеристики сортов крыжовника

Сорт Урожайность Характеристики плода Дегустационная оценка

Салют до 7 кг с куста Ягоды крупные (3-бг), не опушенные с восковым налетом 4,8 балла

Русский желтый до 7 кг с куста Ягоды крупные (5-7г),без опушения с тонкой кожицей и восковым налетом 4 балла

Черномор до 8 кг с куста Ягоды крупные(4-7г), без опушения с тонкой кожицей и слабым восковым налетом 4,5 балла

Колобок до 8 кг с куста Ягоды крупные( 4-8г), с сильным восковым налетом и тонкой кожицей 4,3 балла

Слабошип до 8 кг с куста Ягоды крупные до (6-8г),кожица тонкая со слабым восковым налетом 4 балла

Балтийский до 10 кг с куста Ягоды крупные (до Юг), кожица тонкая со слабым восковым налетом 4.5 балла

Русский до 6 кг с куста Ягоды крупные (б-8г), кожица тонкая со слабым восковым налетом 4,4 балла

Процесс оптимизации технологии получения липидных комплексов из жома плодов крыжовника проводили методом циркулярного экстрагирования.

При стандартизации жома плодов крыжовника руководствовались общими статьями ГФ XI «Плоды» и « Семена», а также учитывали требования к исходному цельному сырью, а именно к плодам крыжовника иРпкЛм ШЬеэ" (ГОСТ 3225-75).

Определение подлинности, измельченности, содержание примесей проводили согласно указаниям соответствующей статьи ГФ XI. При микроскопическом исследовании и разработке диагностических признаков анализируемого объекта учитывали требования, предъявляемые к технике микроскопического исследования порошков, плодов и семян.

Определение влажности, золы общей и нерастворимой в 10%НС1 проводили в соответствии с методами, описанными в статьях «Определение

9

влажности лекарственного растительного сырья», «Определение золы» ГФ XI.

Количественный состав изомеров токоферолов липидного комплекса жома плодов крыжовника определяли методом ВЭЖХ.

Каротиноиды липидного комплекса жома плодов крыжовника идентифицировали методом ТСХ, используя в качестве сорбента пластинки "Merck". Суммарное содержание каротиноидов липидного комплекса определяли спектрофотометрическим методом.

Уровень микробной загрязненности лекарственного сырья устанавливали с помощью метода мембранной фильтрации, изложенного в статье ГФ XI издания, вып.2. и изменениями к ней от 28.12.1995.

Для разработки показателей качества жома плодов крыжовника по содержанию действующих веществ, была осуществлена экстракция липидного комплекса пищевым бензином марки «Нефракс» (ТУ-80912-79) из сырья в течении 5 часов в аппарате типа Сокслет при соотношении сырье -экстрагент 1:10, с последующим отгоном экстрагента при температуре 62°С и гравиметрическим определением содержания липидного комплекса в перерасчете на абсолютно сухое сырье. Полученный липидный комплекс жома плодов крыжовника использовался на последующих этапах исследования.

С целью выявления зависимости выхода липидного комплекса от природы растворителя помимо пищевого бензина марки «Нефракс», были использованы также ряд других эстрагентов: хлороформ-метанол (2:1), гексан, петролейный эфир.

Содержание у-линоленовой кислоты в масле жома плодов крыжовника определяли методом ГЖХ, используя абсолютную градуировку по стандартному раствору метилового эфира у-линоленовой кислоты.

Для выполнения исследования использовался газожидкостный

хроматограф марки JIXM-8M с пламенно-ионизационным детектором и

10

металлической колонкой размерами 2м/3м, заполненной СЬгошобогЬ у(1%Н3Р04,18%НДЭГС). Температура термостата колонки - 200°С. Температура испарителя - 250°С, детектора - 260°С. Скорость газа -носителя - 30 мл/мин, водорода - ЗОмл/мин, воздуха - ЗООмл/мин. Объем вводимой пробы 5 мкл.

Статистическую обработку результатов проводили по общепринятым методам вариационной статистики соответствующей статье ГФ XI.

Разработка показателей качества жома плодов крыжовника.

Изучение микроскопических признаков сырья.

Микроскопическое изучение сырья проводили согласно статье ГФ XI «Техника микроскопического анализа». В ходе микроскопического анализа были изучены морфологические особенности жома плодов крыжовника, как нового лекарственного сырья.

На микропрепаратах жома плодов крыжовника различимы некрупные клетки эпидермиса с четко определяемыми утолщенными стенками. Встречаются одноклеточные волосики варьирующих размеров. В обрывках мелкоклеточной паренхимы мезокарпа обнаруживаются друзы оксалата кальция. В обрывках эндокарпа просматриваются одревеснелые, толстостенные склеренхимные клетки разнообразной формы.

Таким образом, диагностические признаки характерные для цельного сырья плодов крыжовника полностью сохраняются в жоме, что позволяет использовать микроскопическое исследование для идентификации данного вида лекарственного растительного сырья.

С целью разработки показателей качества жома плодов крыжовника исследованию были подвергнуты образца различных серий исследуемого сырья. Определение числовых показателей проводилось согласно требованиям соответствующих методик ГФ XI. С этой целью были определены следующие показатели: влажность жома плодов крыжовника, зола общая, зола нерастворимая в 10% НС1, степень измельченное™, содержание других частей растения. Полученные результаты иллюстрированы в таблице №1,

С целью разработки показателей качества анализируемого сырья по влагосодержанию и золе общей, параллельно с методиками ГФ XI применялся метод дериватографического анализа, позволяющий более достоверно и объективно оценить содержание остаточной влаги и золы в сырье, а также установить термические характеристики объектов исследования. Результаты определения влагосодержания и золы общей в анализируемом сырье, а также его термические характеристики представлены в таблице 2.

Анализируя данные, приведенные в таблице 2, следует подчеркнуть, что результаты, полученные методом дериватографии отличаются от результатов, полученных по методикам ГФ XI. Данные различия обусловлены тем, что удаление связанной влаги из сырья осуществляется при более высоких температурах, чем рекомендованные официальной методикой ГФ XI. Для большинства исследованных образцов лекарственного растительного сырья отмечено различие в числовых значениях при определении золы общей методами изотермического прокаливания и дериватографии. Это явление легко объясняется более полным озолением растительного сырья в условиях проведения дериватографического анализа (динамическая атмосфера воздуха, более высокие температуры) и, как следствие этого, более стабильные результаты анализа.

Результаты исследования числовых показателей, исследуемых сортов жома плодов

крыжовника

Числовые пок./сорт Салют Русский желтый Черномор Колобок Слабошип Балтийский Русский

Содержание харотинодов мг% 0,30 0,28 0,28 0,32 0,26 0,31 0,27

Содержание токоферолов,м г% 0,25 0.28 0.26 0,23 0,23 0,26 0,28

Влажность % 5,6 4,1 5,5 4,1 3,3 5,7 4,5

Зола общая,% 3,78 3,14 3,50 3,72 3,37 3,53 3,49

Зола н/р в 10%НС1 0,81 0,78 0,69 0.72 0,70 0.66 0,70

Содержание других частей. 0.32 0.30 0.38 0,35 0,47 0,38 0,35

Термические характеристики и результаты определения елагосодержания и золы общей методами ГФ XI и дериватограффии в исследуемых сортах жома плодов крыжовника

Показатели Термические эффекты Салют Русский желтый Черномор Колобок Слабошип Балтийски й Русский

Влажность опред. метдериватогр % 40-70°С уд.вл. 125-160°С уд.вл. 200-300°Ст.р. 350-470°Ст.р. 600- 800°Собр.зол .ост. 7,3 7,05 6,73 6,85 7,13 7,15 6,7

Зола опред.мсгг.дерива то графическим Методом 2,98 2,97 3,01 2,96 2,93 3,03 3,05

Влажность опрсд. метод. ГФХ1 % 5,6 4,1 5,5 4,1 3,3 5,7 4,5

Зола опрсд. метод. ГФХ1 % 3,78 3,14 3,50 3,72 3,37 3,53 3,49

Таким образом, основываясь на данные, полученные в процессе исследований и иллюстрированных в вышеприведенных таблицах, предлагается регламентировать следующие числовые показатели и их нормы для жома плодов крыжовника.

Таблица 4

Числовые показатели жома плодов крыжовника

Показатель Предлагаемая норма

Влага, % Не более 6

Зола общая, % Не более 4

Зола нерастворимая в 10% HCl, % Не более 1

Других частей растений (кусочков Не более 0,5

Частиц, не проходящих сквозь сито Не более 5

Содержание липидного комплекса, Не менее 2,61%

Выделение липидного комплекса из жома плодов крыжовника.

15

Как показал анализ литературных данных и данные микроскопических исследований, жом плодов крыжовника содержит жирное масло (липидный комплекс). С целью выявления содержания липидного комплекса в жоме плодов крыжовника, было осуществлено изучение зависимости выхода липидного комплекса от степени измельченности сырья, времени экстракции и природы растворителя. Для выявления зависимости выхода липидного комплекса от времени экстракции жом плодов крыжовника измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 0,5 мм, 1мм, 2 мм, 3 мм, 5 мм, брали по 5 навесок каждого измельчения и подвергали исчерпывающей экстракции в аппарате "Сокслет" пищевым бензином марки «Нефракс» в течение 1, 2, 3, 5 часов, после чего вынимали по 5 патронов, высушивали их до постоянной массы и определяли выход липидного комплекса. Полученные данные представлены в таблице 5 и 6.

Таблица 5

Зависимость выхода липидного комплекса от степени измельчения растительного

сырья

Сорт/Время 0,5мм 1мм Змм 5мм

Салют 2,99 2,99 2,22 1.95

Русский желтый 2,95 2,92 2.35 1,86

Черномор 2,73 2,71 2.12 1.75

Колобок 2,83 2,82 1,89 1,67

Слабошип 2,83 2,81 1,79 1,53

Балтийский 2.68 2,67 1.85 1,42

Русский 2,69 2,68 1.74 1,34

Содержание липидного комплекса в %.

Таблица 6

Зависимость выхода липидного комплекса от времени экстракции

Сорт/Время кстракции 1ч 2ч Зч 5ч

Салют 1,65 2,12 2,82 2,99

Русский желтый 1,78 2,25 2,84 2,92

Черномор 1,35 1,98 2,65 2,71

Колобок 1,38 1,95 2.75 2,82

Слабошип 1,75 2,05 2,74 2,81

Балтийский 1,85 2,24 2,56 2,67

Русский 1,65 2,32 2,58 2,68

Содержание липидного комплекса в %.

Изучение полученных данных показало, что оптимальным можно считать время экстракции жома плодов крыжовника 5 часов. Дальнейшее увеличение времени экстракции не приводило к существенному увеличению выхода липидного комплекса и поэтому не является целесообразным.

Из таблицы 5 видно, что при снижении размера частиц с 5мм до 1 мм происходит значительное увеличение выхода липидного комплекса. Дальнейшее измельчение сырья до значения 0,5 мм нецелесообразно, поскольку в конечном продукте обнаруживается присутствие значительного количества мелкого порошка жома, который загрязняет поры фильтра, при этом выход липидного комплекса существенно не возрастает.

Оптимальным является измельчение жома плодов крыжовника до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 1мм.

Для выявления зависимости выхода липидного комплекса от природы растворителя была осуществлена экстракция жома плодов семи сортов крыжовника, характеризующиеся наиболее высокими агроботаническими характеристиками с использованием в качестве растворителей хлороформ-метанол(2:1),гексан, петролейный эфир, пищевой бензин «Нефракс».

Зависимость выхода липидного комплекса от природы экстрагента и сорта экстрагируемого

сырья

Экстрагент Название сорта Содержание ЛК% X вх Дх £ %

Хлороформ-метанол(2:1) Салют 2,90±0,06 2,90 0,005 0,06 0,33

Рус.желтый 2.63±0,05 2.63 0,0040 0,05 0,32

Черномор 2,96± 0,05 2,96 0,004 0,05 0,33

Колобок 2,82± 019 2,82 0,003 0,19 1,32

Слабошип 2,79±022 2,79 0,078 0,22 1,54

Балтийский 2,92± 006 2,92 0,006 0,06 0,24

Русский 3,55± 0,36 3,55 0,026 0,36 1,70

Гексан Салют 2,61±0,17 2,61 0,044 0,17 0,87

Рус.желтый 2,92 ±0,21 2,92 0,069 0,21 1,69

Черномор 3,03 ±0,06 3,03 0,005 0,06 0,46

Колобок 2,88± 0,45 2,88 0,332 0,45 3,87

Слабошип 2,54± 0,17 2,54 0,044 0,17 1,47

Балтийский 3,00± 0,06 3,00 0,063 0,06 0,55

Русский 2,79 ±0,06 2,79 0,005 0,06 0,51

Петролейный эфир Салют 3,09± 0,07 3,09 0,008 0,07 0,66

Рус.желтый 3,02± 0,08 3,02 0,010 0,08 0,74

Черномор 2,81± 0,06 2,81 0,005 0,06 0,53

Колобок 2,93±0,12 2,93 0,023 0,12 1,13

Слабошип 2,91 ±0,22 2,91 0,078 0,22 2,10

Балтийский 2,77±0,06 2,77 0,05 0,06 0,46

Русский 2,68± 0,22 2,68 0,078 0,22 1,88

Бензин «Нефракс» Салют 2,99± 0,18 2,99 0,053 0,18 1,57

Рус.желтый 2,92± 0,20 2,92 0,066 0,20 1,81

Черномор 2,71± 0,17 2,71 0,044 0,17 1,49

Колобок 2,82± 0,21 2,82 0,072 0,21 1,94

Слабошип 2,81 ±0,08 2,81 0,078 0,08 1,13

Балтийский 2,67±0,06 2,67 0,006 0,06 1,69

Изучение жирнокислотного состава липидного комплекса жома плодов

крыжовника

С целью изучения качественного и количественного содержания жирных кислот, в липидном комплексе жома плодов крыжовника был использован метод газожидкостной хроматографии. Качественную расшифровку хроматограмм проводили по относительному времени удерживания стандартных растворов метиловых эфиров жирных кислот: линоленовой (ТУ6-09-14-1904-76),стеариновой (ТУ6-09-12-159-75), олеиновой (ТУ 6-09-101681-74), линолевой (ТУ6-09-12-159-75), а также смесь МЕ-М1Х-22 фирмы «Оллтекс» (США), содержащей метиловые эфиры жирных кислот и стандартные образцы а- и у- кислот фирмы «Сигма» (США).

Расшифровку хроматограмм проводили по стандартному раствору метиловых эфиров жирных кислот и по относительному времени удерживания.

Было установлено, что жирнокислотный состав анализируемого липидного комплекса представлен 5 жирными кислотами: стеариновой, олеиновой, линолевой, а-и у- линоленовыми кислотами.

С целью количественного определения насыщенных и ненасыщенных

жирных кислот в жоме плодов крыжовника, был использован метод

газожидкостной хроматографии. Методика включает в себя предварительное

построение калибровочной кривой с использованием стандартных растворов

метилового эфира стеариновой, олеиновой, линолевой, а- и у-линоленовой

кислот. Для приготовления стандартных растворов метилового эфира

стеариновой, олеиновой, линолевой, а- и у-линоленовой кислот, 0,02г

химически чистых вышеуказанных кислот помещают по отдельности в

колбы вместимостью 10 мл и добавляют 0,5г хлороформа для растворения.

Затем приливают 5 мл метанола, добавляют 0,5г кристаллического натрия

гидроксида и выдерживают 24 часа при температуре 20°С. После суточного

19

инкубирования рН среды доводят до 4,5-5,5 используя 10% раствор серной кислоты и оставляют на 1 час при температуре 20°С. Образец помещают в выпаривательную чашку и ставят под тягу для удаления растворителей. После выпаривания в чашку приливают 0,5 мл хлороформа и содержимое переливают в колбу. Полученный раствор №1 используется для приготовления раствора №2 (к 0,1 мл раствора №1 приливают 0,1 мл хлороформа) и №3 (к 0,1 мл раствора №1 приливают 0,3 мл хлороформа). Используя стандартные растворы №1, №2 и №3, строят калибровочные кривые зависимости площади пика от содержания стеариновой, олеиновой, линолевой, а- и у-линоленовой кислот в испытуемом растворе. Образец исследуемой липофильной фракции жома плодов крыжовника готовится следующим образом:

Около 0,1 г (точная навеска) анализируемой липофильной фракции помещают в колбу вместимостью 10 мл и приливают 0,5 мл хлороформа для растворения жира, затем приливают 5 мл метанола, добавляют 0,5г кристаллического натрия гидроксида и выдерживают 24 часа при температуре 20°С. После суточного инкубирования рН среды доводят до 4,55,5, используя 10% раствор серной кислоты и оставляют на 1 час при температуре 20°С. Для удаления нерастворимых примесей проводят центрифугирование в течение 15 минут при 10000 об\мин. Супернатант помещают в выпаривательную чашку. К осадку вновь приливают 5 мл хлороформа для полного извлечения метилового эфира жирных кислот и смесь повторно центрифугируют. Супернатанты объединяют и оставляют под тягой для удаления растворителей, затем в чашку приливают 0,5 мл хлороформа, содержимое переливают в колбу и анализируют на газожидкостном хроматографе марки ЛХМ-8М с пламенно-ионизационным детектором и металлической колонкой размерами 2м/3м, заполненной СЬготоБогЬ у( 1 %Н3Р04,18%НДЭГС). Температура термостата колонки -200°С, температура испарителя - 250°С, детектора - 260 °С. Скорость газа-

носителя - 30 мл\мин, водорода - 30мл\мин, воздуха - 300мл\мин. Объем вводимой пробы 5 мкл.

Таблица 8

Зависимость количественного состава липидного комплекса от сорта

Сорт Крыжовника Содержание жирных кислот в липофильном комплексе,%

Стеариновая кислота Олеиновая кислота Линолевая кислота Y- линоленовая кислота а- линоленовая кислота

Русский 6,94± 0,02 29,17± 0,03 35,42± 0,02 7,64± 0,08 4,34± 0,05

Салют 23,0б± 0,05 21,45± 0,03 2S,9S± 0,05 0,8± 0,02 25,74± 0,07

Рус.желтый 14,04± 0,04 20,22± 0,07 33,71± 0,03 7,3± 0,02 24,72± 0,05

Черномор 12,98± 0,08 24,43 ±0,10 33,59± 0,06 9,1 б± 0,04 19,85±0,03

Колобок 14,3 8± 0,05 18,72± 0,04 31,54± 0,05 7,92± 0,05 27,3 8± 0,02

Учитывая имеющиеся рекомендации ВОЗ по полному сохранению в растительных маслах фосфолипидов, важнейшие биологические функции которых установлены в последние годы, мы сочли целесообразным провести качественный анализ и количественную оценку суммарного содержания фосфолипидов в анализируемом сырье.

Для количественного гравиметрического определения и последующего фракционного разделения фосфолипидного комплекса были получены 1% хлороформные растворы, хроматографирование которых производили методом ТСХ на пластинках «Мегск» в системе хлороформ-метанол-вода (65:25:4). Детектирование проводили парами йода. Вещества фосфолипидной природы приобретали желтую или коричневую окраску. Во всех образцах были обнаружены фосфатидилсерин, фосфатидилхолин и фосфатидная кислота (табл. 9).

Жирнокислотный состав фракции фосфолипидов определяли методом ГЖХ после предварительной пробоподготовки, включающей гидролиз фосфолипидов с последующим метилированием полученных жирных кислот. Следует отметить, что жирнокислотный состав фосфолипидной фракции характеризуется высоким содержанием ненасыщенных жирных кислот, хотя качественный состав жирных кислот внутри видов не меняется.

Таблица 9

Фракционный состав фосфолипидов липидного комплекса жома

Сорт Содерж. Фракционный состав фосфолипидов

фосфоли Фосфатид Фосфатид Фосфатид Фосфатид Фосфатид Лиэофосф Фосфатид

п.,г ил ил ил ил ил атидная ная

инозитол холии глицерин этанолам серии кислота кислота

ИНШ ЯгОЛЗ 1<г*0,48 ИИ 1*1=0.62 1*1=0,70 Нг=0,74

Салют 0,4±0.02 + + - + + + +

Рус.желт ый 0,6±0,08 + + - + + - +

Черномор 0,55±0,0 6 + + - + + + +

Колобок 0,7±0,05 + + + + + + +

Слабоши п 0,4±0,03 + + - + + - +

Балтийск ий 0,6±0,05 + + + + + + +

Русский 0,7±0,03 + + + + + + +

Определение физико-химических показателей липидного комплекса

Липидный комплекс жома плодов крыжовника обыкновенного представляет собой густую массу зеленоватого цвета со специфическим запахом и приятным вкусом, часто затвердевающую при комнатной температуре.

Растворимость масла жома плодов крыжовника определяли в соответствии с требованиями общей статьи ГФ XI том I стр. 175-176. Масло

крыжовника практически не растворимо в воде, растворимо в спирте, легко растворимо в эфире, хлороформе, петролейном эфире.

Испытание на присутствие парафина, воска, смоляных масел, перекисей, альдегидов и мыла осуществлялось в соответствии с требованиями методик ГФ XI, выпуск 1,стр. 174-176. В результате испытания липидного комплекса на наличие парафина, воска, смоляных масел, перекисей, альдегидов и мыла были получены отрицательные результаты.

Показатель плотности липидного комплекса установлен в соответствии с требованиями статьи «Определение плотности» ГФ XI, выпуск1, стр 36-40.

Определение показателя преломления проведено в соответствии с требованиями статьи «Определение показателя преломления» ГФ XI, выпуск 1, стр 47-49.

Определение кислотного числа и числа омыления осуществлено в соответствии с методикой ГФ XI, выпуск 1, стр 438-441.

Таблица 10

Значения числовых показателей липидного комплекса

Сорт/Показа тель Салют Русский желтый Черномор Колобок Слабошип Балтийск ий Русский

Показатель 0,9251 0,9252 0,9254 0,9257 0,9253 0,9250 0,9253

плотности г/см3

Показатель 1,4678 1,4665 1,4681 1,4672 1,4679 1,4663 1,4675

преломления

Кислотное 4,615 4,621 4,611 4,617 4,613 4,614 4,618

число

Число 196,21 195,81 196,53 195,93 196,23 196,13 196,74

омыления

Йодное 129,58 129,34 129,20 130,10 129,38 130,10 129,50

число

Перикисное число 0,351 0,362 0,351 0,341 0,354 0,348 0,355

Значение йодного числа установлено в соответствии со статьей « Йодное число» ГФ XI, выпуск 1, стр 442-445.

Опираясь на результаты исследования, нами были предложены нормы показателей качества липидного комплекса жома плодов (табл. 11).

Таблица 11

Нормы показателей качества липидного комплекса жома плодов крыжовника

Числовые показатели Методика определения Предлагаемая норма

Плотность.г/см' ГФХЫстр. 36-40 0,925

Показатель преломления ГФХ!т.1стр. 47-49 1,4679

Йодное чило,г12/100г ГФХШстр. 442-445 129

Кмслотное число,мг КОН/1 г ГФХЫстр. 438-439 4,61

Число омыления,мг КОН/1г ГФХЫстр. 439-441 196,74

Перекисное число, ммоль/л ГОСТ26593-85 0,36

Таким образом, в результате проведенных исследований, установлено, что жом плодов крыжовника, содержащий ценные биологически активные вещества гидрофобной природы может быть использован в качестве перспективного источника ненасыщенных жирных кислот, в том числе у-линоленовой кислоты, в составе биологически активных добавок и лекарственных средств.

Выводы

1.Осуществлен фармакогностический анализ жома плодов крыжовника, в результате которого установлены микродиагностические характеристики для всех сортовых форм анализируемого сырья, определены числовые показатели, причем показатели золы и влажности определяли в соответствии с методикой ГФ XI и дериватограффии.

2. Предложена методика выделения липидного комплекса из жома плодов крыжовника с использованием таких органических растворителей как хлороформ-метанол (2:1), гексан, петролейный эфир, пищевой бензин марки «Нефракс», а также смеси эстрагентов, применяемых в фармацевтическом производстве, позволившая существенно увеличить выход и улучшить физико-химические характеристики получаемого липидного комплекса, что было положено в основу заявки на патент РФ №2009147392/14 от 22.12.2009 «Способ получения жирного масла из жома плодов крыжовника».

3. С целью изучения качественного и количественного содержания жирных кислот в липидном комплексе жома плодов крыжовника был предложен метод газожидкостной хроматографии. По результатам проведенных исследований было установлено, что жирнокислотный состав анализируемого липидного комплекса представлен пятью жирными кислотами: стеариновой, олеиновой, линолевой, а- и у- линоленовыми кислотами, соотношения которых незначительно варьируют в зависимости от сорта анализируемого сырья.

4.В результате исследований были определены физико-химические показатели липидного комплекса жома плодов крыжовника, осуществлено его испытание на присутствие парафина, воска, смоляных масел, перекисей, альдегидов и мыла. На основании полученных результатов были предложены показатели для стандартизации липидного комплекса.

5.Предложена методика количественного определения насыщенных и ненасыщенных жирных кислот в жоме плодов крыжовника с использованием метода газожидкостной хроматографии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1, Маркарян A.A., Нестерова О.В., Кафьян А.Р., Рогозина О.И., Кондрашев C.B. Изучение липидного комплекса жома плодов крыжовника, полученного из различных сортов растительного сырья.// Материалы IV Российской научно-практической конференции "Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов".-М.,2007.-С.114.

2. Кафьян А.Р., Нестерова О.В. Изучение липидного комплекса жома плодов крыжовника обыкновенного.// Естественные и технические науки. -М.,2009. - С.161-164.

3. Кафьян А.Р., Нестерова О.В. Определение жирнокислотного состава липидного комплекса жома плодов крыжовника.// Естественные и технические науки. -М.,2009. С165-166.

4. Кафьян А.Р. Качественное определение фосфолипидов в масле жома плодов крыжовника.// Медицинские науки. -М.,2009. - С. 43-44.

5. Кафьян А.Р. Изучение фосфолипидов масла жома плодов крыжовника.// Научные труды X международного конгресса "Здоровье и образование в XXI веке", "Инновационные технологии в биологии и медицине". -М.,2009. -С.147-148.

6. Кафьян А.Р., Нестерова О.В. Заявка на патент РФ № 2009147392/14 от 22.12.2009 «Способ получения жирного масла из жома и плодов крыжовника».

7. Кафьян А.Р., Нестерова О.В. заявка на патент РФ №2009133015/20 от 03.09.2009 «Средство для лечения и профилактики заболеваний пародонта и слизистой ротовой полости».

Отпечатано в ООО «Компания Спутник+» ПД № 1-00007 от 25.09.2000 г. Подписано в печать 11.10.2010 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1.5 Печать авторефератов (495)730-47-74, 778-45-60

В настоящее время значительный интерес вызывает изучение растительного сырья применяемого в традиционной медицине. Некоторые виды сырья к тому же являются пищевыми, а по содержанию ценных биологически активных веществ не уступают, а иногда и превосходят официальные виды. К такому сырью, относятся листья и плоды крыжовника [62].

Крыжовник - одно из наиболее интересных и ценных ягодных растений, исконная культура русских садов. В России его стали разводить в XI веке — почти на 5 столетий раньше, чем в Европе и тем более в Америке [105]. К достоинствам крыжовника можно отнести его скороплодность. Среди ягодных растений крыжовник отличается самой высокой транспортабельностью ягод. Ягоды созревают одновременно, что позволяет убирать урожай в один приём. Наиболее продуктивным периодом считается возраст 10-12 лет, но кусты крыжовника потенциально очень долговечны: в зависимости от происхождения, условий выращивания, ухода, своевременной обрезки они могут плодоносить до 40 и более лет [2, 19, 64, 74, 81]. Ягоды крыжовника очень разнообразны по размеру, форме и окраске. Крыжовник называют «северным виноградом», и по своим вкусовым качествам он действительно не уступают винограду. В отличие от других ягодных культур плоды крыжовника пригодны для использования в различной степени зрелости.

Крыжовник широко применяется в народной медицине. Органические кислоты, сахара (в основном в виде глюкозы и фруктозы), витамины, минеральные вещества и жиры в сочетании с другими биологически активными веществами, содержащимися в нем, обуславливают ценность данной ягодной культуры.

Жирные масла растений представляют собой наряду с углеводами энергетический и строительный резерв. До 90% видов растений содержат запасные жиры в семенах, но они могут накапливаться и в других частях растений. Главный источник образования компонентов жиров — гексозы, в первую очередь, глюкоза и фруктоза. В растениях синтезируются большинство известных жирных кислот. Процесс образования и накопления жиров в растениях протекает в тесной связи с их жизнедеятельностью в целом. Количество жира и его химический состав, свойственный данному виду (форме, сорту), не является постоянным в течение созревания семян или плодов. В незрелых семенах преобладают свободные жирные кислоты, вследствие чего масло из такого сырья имеет повышенное кислотное число. Количество жира последовательно увеличивается от начала формирования семени или плода до конца их созревания. При этом качественный набор жирных кислот (насыщенных и ненасыщенных) остаётся относительно постоянным [27,75].

Известно, что крыжовник является источником редкой у-линоленовой кислоты (полиненасыщенной жирной кислоты ряда со-6) — естественного предшественника простогландинов, лейкотриенов участвующих в биогенезе человека [27, 75].

На фармацевтическом рынке широко распространены следующие монопрепараты у-линоленовой кислоты (Лецитин, масло примулы вечерней, масло ослинника) и ортомолекулярные комплексы (Артрианом, Био-Фикс, и др.) В настоящее время в качестве источника у-линоленовой кислоты используют некоторые виды бурачника, плоды чёрной смородины. Однако сырьевая база, используемая для выделения данного ценного продукта недостаточна [62].

В последние годы наблюдается тенденция расширения сырьевой базы, используемой для получения биологически активных веществ, за счет 5 внедрения новых нетрадиционных растений и отходов пищевой промышленности. Нередко нетрадиционное растительное сырье не только не уступает традиционному по содержанию биологически активных веществ, но и превосходит его.

Актуальность применения плодов, а также жома плодов крыжовника остающегося после проведения соответствующих технологических операций в пищевом производстве, обусловлено большим многообразием сортов крыжовника, большинство из которых характеризуются высоким содержанием у-линоленовой кислоты и дешевизной вышеуказанного сырья, так как жом плодов крыжовника является отходом пищевой промышленности [2, 62].

Исходя из этого, целью настоящей работы является, изучение липидного комплекса жома плодов крыжовника, путем разработки методов выделения и стандартизации полученного липидного комплекса и определения его физико-химических характеристик. Для этого необходимо решить следующие задачи: провести фармакогностический анализ жома плодов крыжовника, как нового вида, лекарственного растительного сырья, представляющего собой альтернативный экономичный, источник полиненасыщенных жирных кислот. разработать методику выделения липидного комплекса из жома плодов крыжовника. установить жирнокислотный состав липидного комплекса жома плодов крыжовника и определить их количественное соотношение. исследовать и оценить физико-химические показатели качества липидного комплекса. установить фосфолипидный состав липидного комплекса жома плодов крыжовника.

Выводы.

1. Осуществлен фармакогностический анализ жома плодов крыжовника с точки зрения нового альтернативного, экономического источника полиненасыщенных жирных кислот. Разработка показателей качества для жома плодов крыжовника и его стандартизация была осуществлена на основе статей ГФ XI «Плоды» и «Семена», а также с учетом требований к исходному цельному сырью, а именно к плодам крыжовника " РгисШэ ШЬеэ " (ГОСТ 3225-75). В процессе изучения были определены такие показатели, как влага, зола нерастворимая в 10% НС1, содержание других частей растения (кусочков литьев,стеблей), частиц не проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 5мм, содержание липидного комплекса. На основе полученных результатов были предложены показатели стандартизации жома плодов крыжовника.

2. Предложена методика выделения липидного комплекса из жома плодов крыжовника с использованием таких органических растворителей как хлороформ-метанол (2:1), гексан, петролейный эфир, пищевой бензин марки «Нефракс», а также смеси эстрагентов, применяемых в фармацевтическом производстве, позволившая существенно увеличить выход и улучшить физико-химические характеристики получаемого липидного комплекса, что было положено в основу заявки на патент РФ №2009133015/20 от 03.09.2009 «Способ получения жирного масла из жома плодов крыжовника».

3. С целью изучения качественного и количественного содержания жирных кислот в лип ид ном комплексе жома плодов крыжовника был предложен метод газожидкостной хроматографии. По результатам проведенных исследований было установлено, что жирнокислотный состав анализируемого липидного комплекса представлен пятью жирными кислотами: стеариновой, олеиновой, линолевой, а- и у- линоленовыми кислотами, соотношения которых незначительно варьируют в зависимости от сорта анализируемого сырья.

4. В процессе исследования были определены физико-химических показатели липидного комплекса жома плодов крыжовника в соответствие с требованиями ГФ, и на основе полученных данных были предложены показатели для его стандартизации. Осуществлено его испытание на присутствие парафина, воска, смоляных масел, перекисей, альдегидов и мыла. На основе масла жома плодов крыжовника предложен состав, предназначенный для лечения и профилактики заболеваний пародонта и слизистой ротовой полости (Положительное решение о выдаче патента РФ № 2009147392/15 от 22.12.2009 «Средство для лечения и профилактики заболеваний пародонта и слизистой ротовой полости»).

5.Было установлено суммарное содержание фосфолшщцов в липидном комплексе жома плодов крыжовника. Качественный состав фосфолипидной фракции был установлен методом ТСХ. Во всех образцах были обнаружены фосфатидилсерин, фосфатидилхолин и фосфатидная кислота.