Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Исследования по стандартизации и созданию лекарственных средств на основе плодов расторопши пятнистой [Silybum marianum (L.) Gaertn.].

На правах рукописи

РЫЖОВ ВИТАЛИЙ МИХАЙЛОВИЧ

ИССЛЕДОВАНИЯ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ И СОЗДАНИЮ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ НА ОСНОВЕ ПЛОДОВ РАСТОРОПШИ ПЯТНИСТОЙ \SlLYIiUM МАШАЫиМ (Ь.) САЕЯт]

15.00.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Курск-2009

003474845

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель: доктор фармацевтических наук, профессор

Куркин Владимир Александрович

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор

Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Башкирский государпственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

заседании диссертационного совета Д 208.039.03 При ГОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО КГМУ Росздрава

Бубенчикова Валентина Николаевна

доктор фармацевтических наук, профессор Киселёва Татьяна Леонидовна

Защита состоится «.

2009 г. в /.С :рг>

часов на

Автореферат разослан « 1/0 » _ Ы/Ю^уХ- 2009 г.

»

Ученый секретарь Диссертационного совета

Е.Н. Пашин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Поиск лекарственных средств, обладающих гепато-протекторной активностью, для современной медицины и фармации по-прежнему не теряет своей актуальности. Экологически неблагоприятная обстановка, окислительный стресс - это причины, которые объясняют повышенный интерес к лекарственным препаратам, защищающим организм человека от влияния различных неблагоприятных факторов внешней среды и препятствующим развитию патологических процессов на фоне снижения эндогенной антиоксидантной защиты.

Известно, что расторопша пятнистая занимает лидирующее положение среди растений, обладающих антиоксидантной и гепатопротекторной активностью, благодаря уникальным биологически активным соединениям фенольной природы - флаволигнанам (В.А.Быков, С.В.Луценко, Н.Б. Фельдман, 2006.; А.И. Багинская, 1995.; В.А. Куркин, A.A. Лебедев, Г. Г. Запесочная, 2003.).

При этом ситуация на фармацевтическом рынке характеризуется явной недостаточностью отечественных лекарственных средств из плодов расторопши, представленных лишь Силимаром при доминировании зарубежных аналогов (Карсил, Силибор, Легалон, Силибинин и др.).

Нуждаются также в дальнейшем совершенствовании подходы к стандартизации сырья и флаволигнановых препаратов расторопши пятнистой особенно в плане гармонизации методик качественного и количественного анализа. В частности, качество сырья расторопши пятнистой регламентируется нормативным документом ТУ-64-4-30-81, в методиках качественного и количественного анализа которого не предусмотрено использование ГСО силибина. Актуальным также является обоснование возможности использования метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) для целей стандартизации сырья и препаратов расторопши с целью унификации методов анализа. Кроме того, имеющиеся на сегодняшний день методики микроскопического анализа сырья не отвечают современным требованиям к оценке качества. В них не отражен анализ измельченного сырья расторопши плодов, а также имеются неко-

торые неточности в обозначениях и отсутствуют цветные микрофотографии анализируемого лекарственного растительного сырья (ЛРС).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является исследование по совершенствованию методов стандартизации и разработке лекарственных препаратов на основе плодов расторопши пятнистой.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Проведение анатомо-морфологического анализа цельных и измельченных плодов расторопши пятнистой для уточнения диагностических признаков данного ЛРС.

2. Разработка методик качественного и количественного анализа новых лекарственных средств «Расторопши экстракт сухой» и «Ливирит»-таблетки пролонгированного действия, покрытые оболочкой.

3. Анализ возможности применения ВЭЖХ-анализа в стандартизации плодов расторопши и лекарственных препаратов на основе флаволигнанов.

4. Оценка проницаемости флаволигнанов плодов расторопши методом равновесного диализа из лабораторного образца - экстракта плодов расторопши и представленных на фармацевтическом рынке РФ субстанций (Силимар, Карсил) на основе сырья данного растения.

5. Исследование взаимодействия флавоноидов и флаволигнанов расторопши пятнистой с ленгмюровскими слоями и монослоями липосом.

6. Изучение возможности пролонгации действия флаволигнанов.

7. Оптимизация состава и технологии получения новых лекарственных препаратов на основе плодов расторопши «Расторопши экстракт сухой» и «Ливирит»-таблетки пролонгированного действия, покрытые оболочкой.

8. Разработка и оформление проектов нормативной документации на новые лекарственные средства «Расторопши экстракт сухой», «Ливирит» таблетки покрытые оболочкой (0,1 г).

Научная новизна. Проведен морфолого-анатомический анализ цельных и измельченных плодов расторопши, выявлены особенности строения и диагностические признаки данного ЛРС, заключающиеся в особенностях строения эк-

зокарпия, в частности, наличия палисадоподобно утолщенного эпидермиса, наличие мощного слоя склереид с характерными особенностями строения на поперечном срезе. Изучены возможности микроскопического метода анализа в целях выявления возможной фальсификации цельного и измельченного сырья расторопши пятнистой.

Показана перспективность и преимущества применения метода ВЭЖХ для стандартизации плодов и препаратов расторопши пятнистой, а также для оценки эффективности технологии получения новых гепатопротекторных препаратов из плодов расторопши пятнистой.

Выявлена обратно-пропорциональная зависимость проницаемости флаво-лигнанов субстанций на основе плодов расторопши от степени их очистки. В частности, наименьшей проницаемостью обладает индивидуальное вещество -силибин, напротив, неочищенный нативный экстракт плодов расторопши показал наибольшую проницаемость.

Впервые изучено взаимодействие флаволигнанов и флавоноидов расторопши пятнистой с ленгмюровскими слоями и монослоями липосом. Выявлена стабилизирующая способность флаволигнанов расторопши, в частности, сили-бина, на биомембраны, повышающаяся при комбинации его с флавоноидами (дигидрокверцетин).

Сведения, полученные в результате биофармацевтических исследований, послужили основой разработки технологии нового высокоэффективного гела-топротекторного препарата на основе фенольного комплекса из плодов расторопши пятнистой «Расторопши экстракт сухой». Установленный высокий показатель проницаемости флаволигнанов для данного экстракта позволил рекомендовать его в качестве лекарственной субстанции для создания нового состава и технологии таблеток-ретард пролонгированного действия «Ливирит».

Практическая значимость. Разработаны методики качественного и количественного анализа новых лекарственных средств «Расторопши экстракт сухой» и «Ливирит».

б

Разработана методика качественного и количественного анализа лекарственной субстанции «Силимар» с использованием метода ВЭЖХ-анализа.

Усовершенствована методика микроскопического анализа плодов и жома плодов расторопши пятнистой. Получены фотографии микропрепаратов, включенные в проект ФСП на сырьё «Расторопши пятнистой плоды», «Расторопши пятнистой плодов жом».

Определены числовые показатели новых лекарственных средств «Расторопши экстракт сухой» и «Ливирит».

Разработаны проекты ФСП на сырьё «Расторопши пятнистой плоды», «Расторопши пятнистой плодов жом», на новые лекарственные средства «Расторопши экстракт сухой» и «Ливирит».

Обоснована целесообразность применения разработанных препаратов «Расторопши экстракт сухой» и «Ливирит» в качестве гепатопротекторных средств.

Результаты исследований используются в научных изысканиях и в учебном процессе на кафедре фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии Самарского государственного медицинского университета (акты внедрения № 1 и № 2 от 4.09.2008 г.).

Разработанные способы получения и методики анализа лекарственных препаратов «Расторопши экстракт сухой», «Ливирит» апробированы в производственном процессе ООО «ОЗОН» (г. Жигулёвск). Получена экспериментальная партия лекарственного препарата «Ливирит таблетки пролонгированного действия, покрытые оболочкой 100 мг». В настоящее время осуществляется государственная регистрация данного лекарственного средства (акт внедрения № 3 от 4.09.2008 г.).

Разработанные методики анализа сырья «Расторопши пятнистой плоды», «Расторопши пятнистой плодов жом» и препарата «Расторопши экстракт сухой» апробированы на ЗАО «Самаралектравы» (п. Антоновка Самарской обл.). Получена экспериментальная партия лекарственного препарата «Расторопши экстракт сухой» (акт внедрения № 4 от 4.09.2008 г.).

Положения, выдвигаемые на защиту:

1. Результаты анатомо-морфологических исследований плодов расторопши пятнистой.

2. Методики качественного и количественного анализа разработанных лекарственных препаратов: «Расторопши экстракт сухой», «Ливирнт» таблетки пролонгированного действия, покрытые оболочкой, 100 мг.

3. Результаты исследований возможности применения ВЭЖХ для целей стандартизации сырья и препаратов расторопши пятнистой. Методика количественного определения суммы флаволигнанов в лекарственном средстве «Силимар».

4. Результаты биофармацевтических исследований лекарственных субстанций из плодов расторопши пятнистой (Силимар, Карсил, Экстракт расторопши сухой).

5. Результаты исследования по разработке состава, технологии получения и показателей качества новых лекарственных средств «Расторопши экстракт сухой» и таблеток пролонгированного действия на его основе (Ливирнт). Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим

планом научно-исследовательских работ Самарского государственного медицинского университета (№ Государственной регистрации 01200105332) и Республиканских программ:

1. «Совершенствование лекарственного обеспечения населения и лечебно-профилактических учреждений в рыночных условиях» по теме: «Создание лекарственных средств природного происхождения антимикробного, адаптоген-ного и гепатопротекторного действия» (№ Государственной регистрации 01990005277).

2. «Разработка методик качественного и количественного анализа сырья н препаратов лекарственных растений, содержащих фенилпропанонды и флаво-ноиды» (№ Государственной регистрации 01990007536).

Апробация работы и публикации. Материалы работы доложены и обсуждены на XI Всероссийском конгрессе «Экология и здоровье человека» (Сама-

ра, 2006), на конференции молодых ученых «Аспирантские чтения» (Самара, 2006, 2007, 2008), на III Всероссийской конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2007), на Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2007), на XIV, XV, XVI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2007,2008, 2009).

Основное содержание диссертации опубликовано в 13 научных работах, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 153 страницах машинописного текста, содержит 25 таблиц, 51 рисунок. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов и методов исследования (глава 2), 5-ти глав, отражающих результаты собственных экспериментальных исследований и их обсуждение, общих выводов, приложения и списка литературы, включающего 134 источника, из которых 12 на иностранных языках.

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, отмечена новизна и практическая значимость полученных результатов, а также изложены положения, выносимые на защиту.

Глава 1 содержит аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы по современному состоянию исследований плодов расторопши пятнистой, в котором обобщены и систематизированы сведения по изучению химического состава растения, фармакологической активности, применению в медицинской практике.

В главе 2 представлены характеристика объектов и методов исследования. Приведены методики химического, физического и физико-химического изучения лекарственного сырья, индивидуальных веществ и лекарственных препаратов, а также методы контроля качества лекарственных форм на основе плодов расторопши пятнистой.

В главах 3-7 экспериментальной части приводятся результаты собственных исследований по изучению биофармацевтических параметров извлечений из

плодов расторопши пятнистой, совершенствованию методов стандартизации данного сырья и препаратов на его основе, оптимизации состава и технологии получения, оценке качества и обоснованию целесообразности внедрения в медицинскую практику новых препаратов на основе изучаемого ЛРС в качестве гепатопротекторного лекарственных средств.

В приложение вынесены материалы по разработке нормативной документации и акты внедрения результатов исследований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Морфолого-анатомический анализ плодов расторопши пятнистой

Микроскопическое исследование цельных и измельченных плодов расторопши пятнистой, проводили при помощи световых микроскопов следующих марок:

• Цифровой микроскоп Мойс ВМ111 (с увеличением х40; хЮО; х400; хЮОО).

• Цифровой стереоскопический микроскоп Моис 1)М-39С-К9СЮ-А (с увеличением х40; х20).

Рисунок 1 - Микропрепарат поперечного среза семянки расторопши (х 20)

А- продольный срез; Б - кожура семянки (х 100), В - поперечный срез;

1 - кутикула;

2 - палисадоподобно вытянутые клетки эпидермиса;

3 - пигментный слой;

4 - волокнистые клетки;

5 - склереиды;

6 - спавшиеся клетки паренхимы плода;

7 - спавшиеся клетки паренхимы семенной кожуры;

8 - остаток эндосперма.

Рисунок 2 - Микропрепарат жома Рисунок 3 - Микропрепарат жома плодов расторопши: фрагмент се- плодов расторопши: фрагмент эпи-мядоли (х 400) дермиса (х 100)

Микроскопический анализ плодов расторопши позволил выявить, диагностические признаки сырья, заключающиеся в особенностях строения экзокар-пия, в частности, наличия палисадоподобно утолщенного эпидермиса, наличие мощного слоя склереид с характерными особенностями строения на поперечном срезе (рис. 1). Результаты проведенного исследования подтверждаются соответствующими микрофотографиями (рис. 1-4).

Рисунок 4 - Микропрепарат жома плодов расторопши (х 40)

1 - фрагмент эпидермиса плода с клетками пигментного слоя, 2 - склереи-ды плода, 3 - фрагмент паренхимы семядолей.

2. Исследование возможности использования метода ВЭЖХ для стандартизации сырья и гепатопротекторных препаратов расторопши пятнистой

В целях совершенствования методов стандартизации ЛРС и препаратов расторопши пятнистой проведены исследования по изучению возможности использования ВЭЖХ в методиках анализа. Для определения действующих веществ изучаемого сырья в методиках использовался ГСО Силибин (доминирующий флаволигнан плодов расторопши пятнистой).

Рисунок 5 - Силибин (С^НцОю)

Силибин получен в лабораторных условия на базе кафедры фармакогнозии СамГМУ методом хроматографического разделения суммы флаволигнанов расторопши (колоночная хроматография). Очистку силибина осуществляли методом перекристаллизации. Подтверждение структуры выделенного вещества проводили методом 'Н-ЯМР-спектроскопии (рис. 6).

г а» !_'г_¡ ¡ ! ; '• ; м

Рисунок 6 - ЯМР-спектр силибина в ЭМСО.

Анализ извлечений субстанций и водно-спиртовых извлечений из плодов расторопши проводили методом обращенно-фазовой ВЭЖХ на хроматографе

"Милихром-5" в изократическом режиме. Использовали колонку со стационарной фазой - "Separon Cig". Подвижной фазой являлась смесь ацетонитрила и воды в различных соотношениях, с добавлением 1% ледяной уксусной кислоты. Скорость потока - ОД мл/мин, детекция флаволигнанов осуществлялась при аналитической длине волны X¡mlí 288 нм. Для выявления сопутствующих веществ пробы детектировали дополнительно при X 254; 366 нм.

ГСО силибин при скорости потока - 0,1 мл/мин и температуре окружающей среды 20° С, соотношении элюентов ацетонитрил-вода (4:6) с добавлением 1% ледяной уксусной кислоты, детектируется на 16-ой минуте (рис. 7).

Наличие силибина в плодах расторопши пятнистой подтверждается методом добавки в исследуемую пробу образца ГСО силибина.

О.19«Н

о-isa

О. IDO

0-050

О'ООО ; т

о.coa s.ооо lo.ooa LS.aaa ао.ооо аз.осп за.834

Рисунок 7 - Хроматограмма анализа пробы ГСО силибина

А

0.261 • N

0.230 •

0.200 •

О.ISO -

O.lOO •

О.ООО : Т

О.___________ ______ ______ ______ __________'3*

Рисунок 8 - Хроматограмма анализа пробы «Силимара». В анализе расторопши экстракта сухого, как и в анализе плодов, изучался подход к качественному анализу данной субстанции методом ВЭЖХ. Количе-

ственное содержание рассчитывалось по сумме трёх пиков соответствующих доминирующим флаволигнанам в пересчете на ГСО Силибин. Содержание флаволигнанов в экстракте варьирует в пределах от 50,0 до 65,0%, что позволяет в качестве нижнего предела рекомендовать содержание суммы флаволигнанов: не менее 50,0%.

В анализе лекарственного средства «Силимар» (субстанция) нами предложен способ оценки содержание суммы флаволигнанов в процентах (X) в пересчете на силибин по формуле:

,, Я х200х100х2хтега>

Х=-, где

Нгсохтх 100x2

Н - сумма значений высот пиков силибина и двух доминирующих флаволигнанов испытуемого раствора;

Нгсо- высота пика раствора ГСО силибина;

ш- масса силимара, г;

шГсо" масса ГСО силибина, г.

На хроматограмме испытуемого раствора «Силимара» (рис. 8) пик № 7 соответствует ГСО силибину (рис. 7), анализ которого проводился в тех же условиях. В экспериментально подобранных условиях хроматографического Разделения при температуре окружающей среды 20° С, пик, соответствующий ГСО силибину, выходит на 16-ой минуте. Пики веществ № 4 и № 8 соответствуют флаволигнанам силикристину и силидианину.

При расчете содержания суммы флаволигнанов учитывали значения высот пиков силибина (пик № 7), силикристина (пик № 4) и силидианина (пик № 8). Установлено, что содержание суммы флаволигнанов в исследуемом препарате варьирует в диапазоне от 68,50% до 74,50 % (в пересчете на силибин).

Для сравнения предложенного метода анализа лекарственной субстанции (ВЭЖХ) и использующегося в ВФС 42-3380-99 (прямая спектрофотометрия, аналитическая длина волны 289 нм, пересчет суммы флаволигнанов на ГСО силибин) приготовлены модельные смеси трех доминирующих флаволигнанов -силибин хилидианинхиликристин (1:1:2) и их суммарное содержание опреде-

лено обоими методами. Получены выборки результатов единичных определений при |Л.1=|Д2 и сравнены статистически (табл. 1). Результаты, полученные первым и вторым методами, являются сопоставимыми, не отягощены систематическими ошибками (I „ыч < I табл)-

Таблица 1 - Данные сравнительной метрологической характеристики двух методов анализа количественного содержания суммы флаволигнанов (Р=95, 1 табл =2,23, п=11)_________________

Метод X Дх е { выч Р табл р А выч

Спектрофотометр ия 0,32 0,33 0,00551 0,0235 ±0,016 ±4,79 1,27 4,85 20,65

ВЭЖХ-анализ 0,32 0,31 0,00027 0,0163 ±0,011 ±3,41 0,99

Для анализа «Силимара» более воспроизводимые результаты дает ВЭЖХ-анализ (РЕЬ|Ч > И табл)- В этой связи анализ содержания суммы флаволигнанов может проводиться одним из двух методов (в зависимости от оснащенности лаборатории), при этом преимущества имеет методика ВЭЖХ-анализа.

3. Разработка методов анализа нового лекарственного средства «Рас-

торопши экстракт сухой»

Сухой экстракт плодов расторопши получали из жидкого экстракта путём перегонки экстрагента под вакуумом на водяной бане и последующей сушки под вакуумом. В результате чего был получен сухой аморфный порошок тёмно-коричневого цвета с выходом 5% от массы жидкого экстракта. Для него характерен слабый специфичный запах, слабо-горький, вяжущий вкус. Влажность экстракта составила 3 ± 0,05%.

3.1. Подлинность

Нами был использован ТСХ-анализ как метод экспресс-оценки качества изучаемого объекта с использованием стандартного образца ГСО силибина. В анализе использовали хроматографические пластинки «Сорбфил ПТСХ-П-А-УФ». Хроматографирование вели восходящим способом в смеси растворителей хлороформ - ацетон - муравьиная кислота (9:2:1). На хроматограмме раствора субстанции (рис. 9) при детекции в УФ-свете при 254 нм на светлом флуорес-

цирующем фоне должно появиться не менее трех пятен фиолетового цвета: одно пятно на уровне пятна ГСО силибина (Я5 =1), другие пятна сЯ5< [ (основные флаволигнаны: силидианин, силикристин).

Рисунок 9 - ТСХ-анализ расто-ропши плодов экстракта сухого

1- ГСО силибин,

2- Спиртовый раствор растороп-ши экстракта сухого

вычисляли по формуле:

3.2. Раздел «Количественное определение»

Количественное определение флаво-лигнанов в сухом экстракте плодов расто-ропши пятнистой определяли методом прямой спектрометрии в пересчете на ГСО силибин. Оптическую плотность раствора измеряли на спектрофотометре «Specord 40» (Analytik Jena) при длине волны 289 нм в кювете с толщиной слоя 1 см. В качестве раствора сравнения использовали спирт этиловый 95 %. Содержание суммы флаво-лигнанов в пересчете на силибин и абсолютно сухую субстанцию в процентах (X)

„ £> * ш0 * 100 * 25 * 100 * 100

X =-5-, где

Ц, *ш*100 * 25*(100-И')

Б - оптическая плотность испытуемого раствора (раствор Б); Оо-оптическая плотность раствора ГСО силибина; т - масса субстанции, г; Шо- масса ГСО силибина, г;

- потеря в массе при высушивании субстанции, %. Содержание флаволигнанов в экстракте должно быть не менее 50,0 %. Метрологическая характеристика результатов определение содержания флаволигнанов в сухом экстракте расторопши плодов (таблица 2).

Таблица 2 - Результаты количественного определения флаволигианов в сухом экстракте плодов расторопши

Навеска, И Х,% Метрологические характеристики

0,0300 0,255527 60,0 ¥ = 59,07 5 =1,3841 X ДХ =0,4376 Е=±0,74096%

0,0290 0,230542 56,0

0,0310 0,255243 58,0

0,0330 0,285764 61,0

0,0300 0,251268 59,0

0,0280 0,238492 60,0

0,0320 0,268928 59,2

0,0290 0,240834 58,5

0,0300 0,255527 60,0

0,0278 0,232842 59,0

4. Обоснование целесообразности использования в медицинской практике нового лекарственного средства «Расторопши экстракт сухой»

4.1 Изучение проницаемости флаволигианов методом равновесного диализа

К настоящему времени для всех флаволигианов расторопши (описано более 20) установлена гепатопротекторная активность. Более того в ходе ранее проведённых в СамГМУ исследованиях по сравнительному изучению индивидуальных флаволигианов было обнаружено, что, в частности, 2,3-дегидросилибин по влиянию на уровень накопления маллонового диальдегида значительно превосходит силибин. Это обстоятельство в совокупности с известным фактом низкой биологической доступности высокоочищенных субстанциях (Карсил, Легалон, Силимар) делают очевидной необходимость дальнейших исследований в направлении создания гепатопротекторных препаратов на основе всего фенольного комплекса БАС.

В целях сравнения имеющихся препаратов на основе силимариновой смеси представленной тремя доминирующими флаволигианов силибином, силидиа-нином, силикристином (Карсил, Силимар), с новым лекарственным средством «Расторопши экстракт сухой», содержащим нативную сумму веществ, были проведены биофармацевтические исследования по изучению проницаемости флаволигианов через полупроницаемую мембрану методом равновесного диализа.

Полупроницаемой мембраной служил целлофан марки Б-80-79 сорт II пористость 6,13 г/мл. Весь процесс диализа проводили в термостате при постоянной температуре 36°С. В качестве диализной жидкости брали буферные растворы с различными значениями рН, биологические среды: рН < 7 раствор хлористоводородной кислоты 0,1 н (желудок), рН > 7 раствор аммиака (тонкий кишечник). Контрольной средой являлась вода очищенная (рН=7).

Проницаемость флаволигнанов (С%) вычисляли (в процентах) как отношение количества флаволигнанов, прошедших через мембрану (ш) к количеству введенного вещества в диализную трубку (шо).

_ /пх100%

'"о

Результаты определения проницаемости флаволигнанов исследуемых субстанций и данные статистической обработки для точки забора пробы 300 мин в среде со значением рН=7 представлены в таблице 3.

Субстанции п ~х Б ДХ Е, %

Карсил 6 18,50 0,26077 0,1065 0,60

Силимар 6 45,20 0,14 0,0572 0,13

Расторопши экстракт сухой 6 89,11 0,0993 0,0406 0,05

ГСО Силибин 6 2,80 0,1050 0,0427 1,53

Величина относительной ошибки определения показателя С% в пределах нормы при доверительном интервале 95% говорит о высокой достоверности полученной величины. Динамика изменения проницаемости флаволигнанов во времени с момента введения пробы (в минутах) для контрольной среды с рН=7 (вода дистиллированная) приведена на рис. 7. Результаты сравнительного изучения высвобождения флаволигнанов из образцов в других используемых средах отражены на гистограмме (рис. 8) На основании полученных данных была выявлена обратная зависимость высвобождения флаволигнанов от степени очи-щенности испытуемых образцов: наиболее очищенное извлечение из плодов расторопши (ГСО Силибин) показало наименьшую проницаемость относитель-

но других извлечений. Напротив, нативный экстракт расторопши плодов показал наибольшую проницаемость (табл. 3).

ВД.*

/ 89,24%

80,00 /

/ ^

- — 18,7%

--• ~ » - .....и—г—.....—•• •>78-

Всммя ибер* ши

—— Карсил — Сигмлар — Экстракт расторопих сухой ГСО Смлибин |

Рисунок 10 - Фармакокинетическая Рисунок 11 - Гистограмма сравнения кривая высвобождения флаволигна- высвобождения флаволигнанов из

нов при рН = 7

препаратов при различных значениях рН

Результаты биофармацевтических экспериментов позволяют прогнозировать некоторые фармацевтические параметры нового препарата при энтераль-ном приёме, а именно начало интенсивного высвобождения и всасывания флаволигнанов уже в кислой среде желудка.

4.2. Изучение взаимодействия флаволигнанов и флавоноидов с монослоями липосом

Нами было проведено изучение взаимодействия силибина и дигидрок-верцетина (таксифолина) с ленгмюровскими монослоями лецитина и бислоями липосом как простейшими моделями липидной части биомембран. Для изучения монослоев использовалась оригинальная автоматизированная установка, созданная на кафедре «ЯР и ЭУ» физико-технического факультета Нижегородского государственного технического университета. При сжатии монослоя измеряли площадь поверхности Б и поверхностное давление л = уо - у, где у и у0 поверхностное натяжение водного раствора с нанесенным монослоем и при его отсутствии.

На основании результатов проведённого исследования сделаны выводы о локализации флавоноидов и флаволигнанов в монослое липосом. Так, дигидро-кверцетин обнаруживается как в липофильном бислое мембран, так и в водной

фазе (содержимом) липосом. Силибин иммобилизуется внутри гидрофобной части фосфолипидного бислоя с образованием более гидрофильных мицелляр-ных структур.

5. Исследование нового лекарственного средства на основе плодов

расторопши пятнистой «Ливирит»

Высокая высвобождаемость флаволигнанов из новой лекарственной субстанции «Расторопши экстракт сухой» свидетельствует о перспективности разработки пролонгированной формы экстракта расторопши.

В целях пролонгации высвобождения действующих компонентов из ЛФ нами взят компонентот гидроксипропилметилцеллюлоза (ГПМЦ), широко применяемый в производстве ретардных таблеточных форм. Проведены исследования по подбору состава таблеток расторопши экстракта сухого пролонгированного действия (таблица 4).

Таблица 4 - Состав таблеток Ливирит с учетом пленочной оболочки

Ядро: . .. Мг на табл. . % Оболочка: Мг на табл. %

Расторопши экстракт сухой 100,0 50,00 Гипромеллоза 50,83 5,08

ГПМЦ К4М 50,0 25,00 Полисорбат 16,67 1,67

МКЦ-101 40,0 20,00 Кислотный красный 1,00 0,10

Повидон 25 8,0 4,00 Титана диоксид 25,00 2.50

Кальция стеарат 2,00 1,00 Магния гидросиликат 5,00 0,50

Сумма 200,00 100,00 Сумма 98,50 100,00

Оценка высвобождения флаволигнанов из ретардных таблеток проводилась методом вращающейся корзинки на базе Центра контроля качества лекарственных средств Самарской области. На производственной базе ООО «ОЗОН» (г. Жигулевск Самарской области) была получена экспериментальная партия таблеток «Ливирита» пролонгированного действия, покрытых оболочкой. Изучены подходы к стандартизации данного лекарственного средства.

6. Разработка методик качественного и количественного анализа гепа-топротекторного средства «Ливирит»

Особенностью качественного анализа таблеток является наличие красителя в составе оболочки, который может давать дополнительное пятно на хромато-грамме.

Количественное содержание флаволигнанов в таблетках «Ливирит» целесообразно оценивать методом прямой спектрофотометрии в пересчете на ГСО силибин. Наличие окрашенного компонента в составе оболочки - кислотного красного может вносить вклад в спектральные характеристики спиртового извлечения из анализируемой лекарственной формы (таблетки «Ливирит»).

этиловом 95% 1:1000

Экспериментальным путем нами была выявлена возможность отделения флаволигнанов в пробе для спектрофотометрического анализа от красителя путем очистки пробы с помощью сорбента полиамид. Проведены сравнительные исследования УФ-спектров извлечения из пробы таблеток «Ливирит» с аналогичным извлечением, очищенным на полиамиде. Сопоставимые результаты количественной оценки суммы флаволигнанов с пробоподготовкой (очистка полиамидом) и без неё свидетельствуют о несущественном вкладе в величину светопоглощения и возможности оценки количества флаволигнанов методом прямой спектрпофотометрии без пробоподготовки (рис. 12). По результатом исследований была составлена спецификация и разработан проект ФСП на но-

вый лекарственный препарат «Ливирит» таблетки пролонгированного действия, покрытые оболочкой 100 мг.

ВЫВОДЫ

1. Исследование анатомического строения цельных плодов расторопши пятни-

стой с использованием цифровой микроскопии позволило выявить диагностические признаки сырья, заключающиеся в особенностях строения экзо-карпия, в частности, наличия палисадоподобно утолщенного эпидермиса, мощного слоя склереид с характерными особенностями строения на поперечном срезе. Научно обоснована методика микроскопического анализа, измельченного сырья плодов расторопши пятнистой (порошок), учитывающая особенности анатомического строения цельных плодов.

2. Изучены возможности использования ВЭЖХ для целей стандартизации пло-

дов и препаратов расторопши пятнистой как универсального метода, позволяющего совместить в себе как качественный, так и количественный анализ. Разработана методика количественного определения суммы флаво-лигнанов в субстанции «Силимар» с использованием ВЭЖХ.

3. Показана целесообразность использования стандартного образца ГСО сили-

бина в методиках ВЭЖХ-анализа объектов, содержащих флаволигнаны плодов расторопши пятнистой (на примере анализа цельных плодов расторопши, расторопши плодов жома, расторопши экстракта сухого и отходов производства «Силимара»).

4. Изучены показатели качества нового лекарственного средства «Расторопши

экстракт сухой», которые нашли отражение в НД на данный препарат.

5. Изучена сравнительная проницаемость флаволигнанов лекарственных суб-

станций и препаратов на основе плодов расторопши пятнистой методом in vitro. Доказана обратная зависимость высвобождения флаволигнанов от степени очищенности испытуемых образцов.

6. Впервые изучено взаимодействие флаволигнанов и флавоноидов плодов

расторопши пятнистой с монослоями липосом. Выявлены особенности взаимодействия флаволигнанов с монослоями, отличающие их от флавоноидов, что свидетельствует о различии в механизмах их мембрано-стабилизирующего действия.

7. Исследована возможность пролонгации высвобождения флаволигнанов из

таблеторованной лекарственной формы. Разработан оптимальный состав нового лекарственного средства «Ливирит», представляющий собой дозированную лекарственную форму экстракта расторопши - таблетки проло-нированного действия.

8. Изучены подходы к стандартизации таблеток «Ливирит», заключающиеся в

использовании ГСО силибина в методах ТСХ и прямой спектрофотомет-рии без проведения пробоподготовки.

9. Разработаны проекты ФСП на сырьё «Расторопши пятнистой плоды» «Рас-

торопши плодов жом», на новые лекарственные средства «Расторопши экстракт сухой» и «Ливирит» таблетки пролонгированного действия, покрытые оболочкой 100 мг.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Куркин, В.А. Создание импортзамещающих гепатопротекторных и антиок-сидантных лекарственных средств на основе плодов расторопши пятнистой / В.А. Куркин, В. М. Рыжов // XI Всероссийский конгресс «Экология и здоровье человека»: матер, конгр. - Самара, 2006. - С. 157-158.

2. Рыжов, В.М. Изучение взаимодействия силибина и дигидрокверцетина с ленгмюровскими монослоями лецетина и бислоями липосом / В.М. Рыжов // Межвузовская конференция молодых ученых «Аспирантские чтения»: матер. конф. - Самара, 2006. - С. 268-272.

3. Куркин, В.А. Актульные аспекты стандартизации лекарственного растительного сырья, содержащего флавоноиды / В.А. Куркин, Е.В. Авдеева, В.Б. Браславский, O.E. Правдивцева, A.B. Куркина, М.В. Егоров, Е.С. Артамоно-

ва, Ламрини Мохамед// XIV Рос. нац. конгр. «Человек и лекарство»: тез. докл. - М., 2007. - С. 839.

4. Рыжов, В.М. Актуальные проблемы создания новых отечественных гепато-протекторных лекарственных средств на основе плодов расторопши пятнистой/ В.М. Рыжов // XII Всероссийская научно-практическая конференция «Молодые ученые в медицине»: тез. докл. - Казань, 2007.- С. 264-265.

5. Куркин, В.А. ВЭЖХ-анализ гепатопротекторного лекарственного средства «Силимар» / В.А. Куркин, В.А. Быков, В.М. Рыжов, Е.В. Авдеева, Н.Д. Лужнов // Известия Самарского научного центра Российской академии наук Спец. выпуск «XII Всероссийский конгресс «Экология и здоровье человека». - Самара, 2007. - Т. 2 - С. 195-197.

6. Рыжов, В.М. Некоторые аспекты создания гепатопротекторных лекарственных средств на основе флаволигнанов расторопши пятнистой./ В.М. Рыжов // Сборник тезисов III Всероссийской конференции. - Барнаул, 2007. - Книга 2. - С. 292-295.

7. Рыжов, В.М. Методика количественного определения суммы флаволигнанов в гепатопротекторном лекарственном средстве «Силимар» с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии / В.М. Рыжов // Межвузовская конференция молодых ученых «Аспирантские чтения».- Самара, 2007. -С. 247-251.

8. Куркин, В.А. Взаимодействие силибина и дигидрокверцетина с ленгмюров-скими монослоями лецетина и бислоями липосом / В.А. Куркин, В.М. Рыжов, О.В. Бирюкова, Н.Б. Мельникова, В.В.Селехов // Фармация. -2008. - Т. 56, №2. - С. 41-46.

9. Куркин, В.А. Антиоксидантная активность некоторых тонизирующих и гепатопротекторных фитопрепаратов, содержащих флаваноиды и фенилпро-паноиды /В.А. Куркин, О.Л. Кулагин, Н.С. Додонов, A.A. Царева, Е.В. Авдеева, C.B. Барабаш, М.В. Ляшенко, A.B. Куркина, Е.А. Дремова, Ф.Ш. Сат-дарова, В.М. Рыжов // Растительные ресурсы. - 2008. - Т. 44, вып. 1. - С. 122-129.

10. Kurkin, Vladimir A. The new methodological approaches to the standardization of the some medicinal plants containing the flavonoids and phenylpropanoids /Vladimir A. Kurkin, Elena V. Avdeeva, Vitaly M. Ryzhov, Valery B. Braslavsky, Olga E. Pravdivtseva, Anna V. Kurkina, Maxim V. Egorov, Olga V. Shariva, Elena S. Artamonova, Farida Sh. Satdarova, Anna V. Egorova, Mohammed Lamrini, Lyubov N. Zimina, Mariya M. Anisimova, Denis G. Bulankin, Andrey V. Smirnov // XXIV International Conference on Polyphenols "Polyphenols Communication 2008". - Salamanca, 2008. - C. 185-186.

П.Куркин, B.A. Подходы к стандартизации лекарственного растительного сырья, содержащего флавоноиды и фенилпропаноиды /В.А. Куркин, Е.В. Авдеева, В. Б.Браславский, О. Е.Правдивцева, А. В.Куркина, М. В Егоров., В. М. Рыжов, Ф. Ш. Сатдарова, Е. С. Артамонова, М. Анисимова, JI. Н. Зимина, А. В. Егорова, Д.Г. Буланкин // XV Рос. нац. конг. «Человек и лекарство» М., 2008. - С. 545-546

12.Куркин, В.А. Актуальные аспекты стандартизации лекарственного растительного сырья, содержащего фенольные соединения / Куркин В.А., Авдеева Е.В., Браславский В.Б., Правдивцева О.Е., Куркина А.В., Стеняева В.В., Рыжов В.М., Сатдарова Ф.Ш., Зимина Л.Н., Ламрини М.Х., Буланкин Д.Г., Анисимова М.М., Сулейманова Л.Р. // XVI Росс. нац. конг. «Человек и лекарство» М„ 2009. - С. 690.

13.Куркин, В.А. Взаимодействие флаванонолов плодов расторопши пятнистой с ленгмюровскими монослоями лецитина и бислоями липосом / В. А. Куркин, В.М. Рыжов, О.В. Бирюкова, Н.Б. Мельникова, В.В. Селехов // Химико-фармацевтический журнал 2009. - Т. 43, № 2 -С. 33-42.

Подписано в печать 13.07.2009. Формат 60x84/16. Печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Бумага офсетная. Печать оперативная. Заказ 378.

Отпечатано в типографии ООО «Офорт». 443070, Самара, ул. Революционная, д. 70, литера П. Тел. 372-06-56, 372-06-57.

Актуальность темы. Поиск лекарственных средств, обладающих гепа-топротекторной активностью, для современной медицины и фармации по-прежнему не теряет своей актуальности. Экологически неблагоприятная обстановка, окислительный стресс — это причины, которые объясняют повышенный интерес к лекарственным препаратам, защищающим организм человека от влияния различных неблагоприятных факторов внешней среды и препятствующим развитию патологических процессов на фоне снижения эндогенной антиоксидантной защиты.

Известно, что расторопша пятнистая занимает лидирующее положение среди растений, обладающих антиоксидантной и гепатопротекторной активностью, благодаря уникальным биологически активным соединениям фе-нольной природы - флаволигнанам (В.А.Быков, С.В.Луценко, Н.Б. Фельдман, 2006.; А.И. Багинская, 1995.; В.А. Куркин, А.А. Лебедев, Г. Г. Запесоч-ная, 2003.).

При этом ситуация на фармацевтическом рынке характеризуется явной недостаточностью отечественных лекарственных средств из плодов расто-ропши, представленных лишь Силимаром при доминировании зарубежных аналогов (Карсил, Силибор, Легалон, Силибинин и др.) [44, 105].

Нуждаются также в дальнейшем совершенствовании подходы к стандартизации сырья и флаволигнановых препаратов расторопши пятнистой особенно в плане гармонизации методик качественного и количественного анализа. В частности, качество сырья расторопши пятнистой регламентируется нормативным документом ТУ-64-4-30-81, в методиках качественного и количественного анализа которого не предусмотрено использование ГСО си-либина. Актуальным также является обоснование возможности использования метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) для целей стандартизации сырья и препаратов расторопши с целью унификации методов анализа. Кроме того, имеющиеся на сегодняшний день методики микроскопического анализа сырья не отвечают современным требованиям к оценке качества. В них не отражен анализ измельченного сырья расторопши плодов, а также имеются некоторые неточности в обозначениях и отсутствуют цветные микрофотографии анализируемого лекарственного растительного сырья (ЛРС).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является исследование по совершенствованию методов стандартизации и разработке лекарственных препаратов на основе плодов расторопши пятнистой.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Проведение анатомо-морфологического анализа цельных и измельченных плодов расторопши пятнистой для уточнения диагностических признаков данного JIPC.

2. Разработка методик качественного и количественного анализа новых лекарственных средств «Расторопши экстракт сухой» и «Ливирит»-таблетки пролонгированного действия, покрытые оболочкой.

3. Анализ возможности применения ВЭЖХ-анализа в стандартизации плодов расторопши и лекарственных препаратов на основе флаволиг-нанов.

4. Оценка проницаемости флаволигнанов плодов расторопши методом равновесного диализа из лабораторного образца - экстракта плодов расторопши и представленных на фармацевтическом рынке РФ субстанций (Силимар, Карсил) на основе сырья данного растения.

5. Исследование взаимодействия флавоноидов и флаволигнанов расторопши пятнистой с ленгмюровскими слоями и монослоями липосом.

6. Изучение возможности пролонгации действия флаволигнанов.

7. Оптимизация состава и технологии получения новых лекарственных препаратов на основе плодов расторопши «Расторопши экстракт сухой» и «Ливирит»-таблетки пролонгированного действия, покрытые оболочкой.

8. Разработка и оформление проектов нормативной документации на новые лекарственные средства «Расторопши экстракт сухой», «Ливирит» таблетки покрытые оболочкой (0,1 г). I

Научная новизна. Проведен морфолого-анатомический анализ цельных и измельченных плодов расторопши, выявлены особенности строения и диагностические признаки данного ЛРС, заключающиеся в, особенностях строения экзокарпия, в частности, наличия палисадоподобно утолщенного эпидермиса, наличие мощного слоя склереид с характерными особенностями строения на поперечном срезе. Изучены возможности микроскопического метода анализа в целях выявления возможной фальсификации цельного и измельченного сырья расторопши пятнистой.

Показана перспективность и преимущества применения метода ВЭЖХ для стандартизации плодов и препаратов расторопши пятнистой, а также для оценки эффективности технологии получения новых гепатопротекторных препаратов из плодов расторопши пятнистой.

Выявлена обратно-пропорциональная зависимость проницаемости флаволигнанов субстанций на основе плодов расторопши от степени их очистки. В частности, наименьшей проницаемостью обладает индивидуальное вещество - силибин, напротив, неочищенный нативный экстракт плодов расторопши показал наибольшую проницаемость.

Впервые изучено взаимодействие флаволигнанов и флавоноидов расторопши пятнистой с ленгмюровскими слоями и монослоями липосом. Выявлена стабилизирующая способность флаволигнанов расторопши, в частности, силибина, на биомембраны, повышающаяся при комбинации его с флавонои-дами (дигидрокверцетин).

Сведения, полученные в результате биофармацевтических исследований, послужили основой разработки технологии нового высокоэффективного гепатопротекторного препарата на основе фенольного комплекса из плодов расторопши пятнистой «Расторопши экстракт сухой». Установленный высокий показатель проницаемости флаволигнанов для данного экстракта позволил рекомендовать его в качестве лекарственной субстанции для создания нового состава и технологии таблеток-ретард пролонгированного действия «Ливирит».

Практическая значимость. Разработаны методики качественного и количественного анализа новых лекарственных средств «Расторопши экстракт сухой» и «Ливирит».

Разработана методика качественного и количественного анализа лекарственной субстанции «Силимар» с использованием метода ВЭЖХ-анализа.

Усовершенствована методика микроскопического анализа плодов и жома плодов расторопши пятнистой. Получены фотографии микропрепаратов, включенные в проект ФСП на сырьё «Расторопши пятнистой плоды», «Расторопши пятнистой плодов жом».

Определены числовые показатели новых лекарственных средств «Расторопши экстракт сухой» и «Ливирит».

Разработаны проекты ФСП на сырьё «Расторопши пятнистой плоды», «Расторопши пятнистой плодов жом», на новые лекарственные средства «Расторопши экстракт сухой» и «Ливирит».

Обоснована целесообразность применения разработанных препаратов «Расторопши экстракт сухой» и «Ливирит» в качестве гепатопротекторных средств.

Результаты исследований используются в научных изысканиях и в учебном процессе на кафедре фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии Самарского государственного медицинского университета (акты внедрения № 1 и № 2 от 4.09.2008 г.).

Разработанные способы получения и методики анализа лекарственных препаратов «Расторопши экстракт сухой», «Ливирит» апробированы в производственном процессе ООО «ОЗОН» (г. Жигулёвск). Получена экспериментальная партия лекарственного препарата «Ливирит таблетки пролонгированного действия, покрытые оболочкой 100 мг». В настоящее время осуществляется государственная регистрация данного лекарственного средства (акт внедрения № 3 от 4.09.2008 г.).

Разработанные методики анализа сырья «Расторопши пятнистой плоды», «Расторопши пятнистой плодов жом» и препарата «Расторопши экстракт сухой» апробированы на ЗАО «Самаралектравы» (п. Антоновка Самарской обл.). Получена экспериментальная партия лекарственного препарата «Расторопши экстракт сухой» (акт внедрения № 4 от 4.09.2008 г.). Положения, выдвигаемые на защиту:

1. Результаты анатомо-морфологических исследований плодов расторопши пятнистой.

2. Методики качественного и количественного анализа разработанных лекарственных препаратов: «Расторопши экстракт сухой», «Ливирит» таблетки пролонгированного действия, покрытые оболочкой, 100 мг.

3. Результаты исследований возможности применения ВЭЖХ для целей стандартизации сырья и препаратов расторопши пятнистой. Методика количественного определения суммы флаволигнанов в лекарственном средстве «Силимар».

4. Результаты биофармацевтических исследований лекарственных субстанций из плодов расторопши пятнистой (Силимар, Карсил, Экстракт расторопши сухой).

5. Результаты исследования по разработке состава, технологии получения и показателей качества новых лекарственных средств «Расторопши экстракт сухой» и таблеток пролонгированного действия на его основе (Ливирит).

Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ Самарского государственного медицинского университета (№ Государственной регистрации 01200105332) и Республиканских программ:

1. «Совершенствование лекарственного обеспечения населения и лечебно-профилактических учреждений в рыночных условиях» по теме: «Создание лекарственных средств природного происхождения антимикробного, адаптогенного и гепатопротекторного действия» (№ Государственной регистрации 01990005277).

2. «Разработка методик качественного и количественного анализа сырья и препаратов лекарственных растений, содержащих фенилпропаноиды и флавоноиды» (№ Государственной регистрации 01990007536).

Апробация работы и публикации. Материалы работы доложены и обсуждены на XI Всероссийском конгрессе «Экология и здоровье человека» (Самара, 2006), на конференции молодых ученых «Аспирантские чтения» (Самара, 2006, 2007, 2008), на III Всероссийской конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2007), на Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2007), на XIV, XV, XVI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва,"2007, 2008, 2009).

Основное содержание диссертации опубликовано в 13 научных работах, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 153 страницах машинописного текста, содержит 25 таблиц, 51 рисунок. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов и методов исследования (глава 2), 5-ти глав, отражающих результаты собственных экспериментальных исследований и их обсуждение, общих выводов, приложения и списка литературы, включающего 134 источника, из которых 12 на иностранных языках.

выводы

1. Исследование анатомического строения цельных плодов расторопши пятнистой с использованием цифровой микроскопии позволило выявить диагностические признаки сырья, заключающиеся в особенностях строения экзокарпия, в частности, наличия палисадоподобно утолщенного эпидермиса, мощного слоя склереид с характерными особенностями строения на поперечном срезе. Научно обоснована методика микроскопического анализа, измельченного сырья плодов расторопши пятнистой (порошок), учитывающая особенности анатомического строения цельных плодов.

2. Изучены возможности использования ВЭЖХ для целей стандартизации плодов и препаратов расторопши пятнистой как универсального метода, позволяющего совместить в себе как качественный, так и количественный анализ. Разработана методика количественного определения суммы флаволигнанов в субстанции «Силимар» с использованием ВЭЖХ.

3. Показана целесообразность использования стандартного образца ГСО силибина в методиках ВЭЖХ-анализа объектов, содержащих флаволигнаны плодов расторопши пятнистой (на примере анализа цельных плодов расторопши, расторопши плодов жома, расторопши экстракта сухого и отходов производства «Силимара»).

4. Изучены показатели качества нового лекарственного средства «Расторопши экстракт сухой», которые нашли отражение в НД на данный препарат.

5. Изучена сравнительная проницаемость флаволигнанов лекарственных субстанций и препаратов на основе плодов расторопши пятнистой методом in vitro. Доказана обратная зависимость высвобождения флаволигнанов от степени очищенности испытуемых образцов.

6. Впервые изучено взаимодействие флаволигнанов и флавоноидов плодов расторопши пятнистой с монослоями липосом. Выявлены особенности взаимодействия флаволигнанов с монослоями, отличающие их от флавоноидов, что свидетельствует о различии в механизмах их мембрано-стабилизирующего действия.

7. Исследована возможность пролонгации высвобождения флаволигнанов из таблеторованной лекарственной формы. Разработан оптимальный состав нового лекарственного средства «Ливирит», представляющий собой дозированную лекарственную форму экстракта расторопши - таблетки пролонированного действия.

8. Изучены подходы к стандартизации таблеток «Ливирит», заключающиеся в использовании ГСО силибина в методах ТСХ и прямой спектрофото-метрии без проведения пробоподготовки.

9. Разработаны проекты ФСП на сырьё «Расторопши пятнистой плоды»

Расторопши плодов жом», на новые лекарственные средства «Расторопши экстракт сухой» и «Ливирит» таблетки пролонгированного действия, покрытые оболочкой 100 мг.