Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Фитохимическое изучение надземной части некоторых видов рода Stellaria

На правах рукописи

АНЧЕЕВА ЕЛЕНА ЮРЬЕВНА

ФИТОХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ НАДЗЕМНОЙ ЧАСТИ НЕКОТОРЫХ ВИДОВ РОДА БТЕЫАЫА

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

22АПР 2015

005567708

Санкт-Петербург - 2015

005567708

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель: Теслов Леонид Степанович

Официальные оппоненты: Сорокина Алла Анатольевна

Авдеева Елена Владимировна

кандидат доцент

фармацевтических наук,

Ведущая организация: Государственное бюджетное профессионального образования университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

доктор фармацевтических наук, профессор, ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный

медицинский университет им. И.М.Сеченова» Минздрава России, профессор кафедры фармакогнозии доктор фармацевтических наук, доцент, ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Минздрава России, профессор кафедры фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии.

образовательное учреждение высшего «Ярославский государственный медицинский

Защита состоится «09» июня 2015 года в 15.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.088.01, созданного на базе ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия» Минздрава России (197376, г. Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, д. 14, лит. А).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия» Минздрава России (197227, г. Санкт-Петербург, пр. Испытателей, д. 14) и на сайте организации (Ьйр8://8Нез.£00£1е.сот/а/рЬагттпо1есЬ.сош/с1}880Уе1).

Автореферат разослан « У » XX.2015 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 208.088.01, кандидат фармацевтических наук, доцент

Орлов А.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Расширение базы лекарственного растительного сырья и оценка возможности его применения в медицинской практике является важной фармакогностической задачей. Целенаправленное изучение растений, применяющихся в традиционной и народной медицине, представляет собой один из основных подходов в поиске перспективных видов растительного сырья. Объектами данного исследования были выбраны надземные части четырех представителей рода Stellaria L. - звездчатки средней Stellaria media (L.) Vill., звездчатки вильчатой Stellaria dichotoma L., звездчатки ланцетовидной Stellaria holostea L. и звездчатки дубравной Stellaria nemorum L., которые широко распространены на территории РФ. Из представителей данного рода трава звездчатки средней нашла широкое применение в народной и традиционной медицине. Ее используют в качестве противовоспалительного, противозудного, антиревматического и витаминного средства. Недавно установлено, что полисахаридная фракция, выделенная из травы звездчатки средней, проявляет гепатопротективный эффект (Горина Я.В., 2012). Трава звездчатки дубравной и звездчатки ланцетовидной применяется в народной медицине как противоопухолевое средство, а также местно - при грибковых заболеваниях кожи. Кроме того, настой травы звездчатки ланцетовидной применяют при сердечно-сосудистых заболеваниях в качестве гипотензивного средства. Данные о химическом составе надземной части звездчатки средней, звездчатки ланцетовидной и корней звездчатки вильчатой указывают на то, что одной из основных групп биологически активных соединений сырья этих видов являются С-гликозиды флавоноидов. Из литературных источников известно, что эти производные флавоноидов проявляют различную биологическую активность, например, противовоспалительную, противодиабетическую, гепатопротективную, а также обладают антиоксидантными свойствами, и поэтому поиск новых видов лекарственного сырья, в которых флавоноидные С-гликозиды присутствуют в качестве доминирующих компонентов, является актуальным направлением в плане создания новых эффективных фитопрепаратов на их основе (Shie J. et al., 2010, Pham A. et al., 2013, Wang Y. et al., 2014, Okuyama T. et al, 2014). Таким образом, широкое распространение выбранных для изучения видов звездчатки, данные об их применении в народной и традиционной медицине, фрагментарная изученность химического состава доказывают обоснованность выбора их в качестве объектов исследования, в связи с чем представляется актуальным углубленное изучение компонентного состава биологически активных веществ надземной части представителей рода Stellaria с целью отбора перспективных видов в качестве источников лекарственных средств.

Степень разработанности темы исследования. Фотохимическому составу и биологической активности надземной части звездчатки средней посвящены многочисленные труды отечественных и зарубежных ученых: Гориной Я.В., Кузнецова П.В., Сурковой О.В., Budzianowski J., Dong Q., Kitanov G.M. Установление структуры и фармакологической

активности биологически активных соединений корней звездчатки вильчатой рассмотрены в работах Morita Н., Morikawa Т., Гребневой Н.Ю., при этом химический состав надземной части данного растения остается неизученным. Данные о других объектах данного исследования - надземной части звездчатки дубравной и звездчатки ланцетовидной крайне ограничены. Изучению антиоксидантной активности флавоноидов in vitro методами уделяется внимание в работах зарубежных ученых Benaissa О., Majewska М., Pietta P.G.

Диссертационная работа была выполнена на кафедре фармакогнозии Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии (СПХФА). Исследования с использованием приборных хроматографических, спектроскопических, хемилюминисцентных методов выполнены на базе Института фармацевтической биологии и биотехнологии (г. Дюссельдорф, Германия), Института химической технологии (г. Прага, Чехия), лаборатории фармакологических исследований СПХФА и лаборатории «ООО Аналит Продаете» (г. Санкт-Петербург).

Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы является проведение комплексного фитохимического исследования надземной части вышеуказанных представителей рода Stellaria и оценка возможности использования их в качестве источников биологически активных веществ. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- провести общий фотохимический анализ надземных частей видов рода Stellaria для выявления основных групп биологически активных соединений в изучаемом сырье;

- изучить качественный и количественный состав компонентов фенольного комплекса;

- провести исследование качественного состава и содержания первичных метаболитов, а также элементного состава сырья;

- установить макро- и микроскопические признаки четырех видов рода Stellaria-,

- определить острую токсичность сухих экстрактов из надземной части видов рода Stellaria, ' провести их скрининг на наличие антибактериального эффекта и сравнительный анализ антиоксидантной активности, а также оценить антиоксидантные свойства выделенных из изучаемого сырья доминирующих флавоноидов;

- разработать методику количественного определения основной группы биологически активных веществ (флавоноидов) в изучаемом сырье, а также исследовать динамику их накопления в зависимости от фазы вегетации выбранного сырья и оценить вариабельность компонентного состава;

- на основании проведенных фотохимических исследований и биологических тестов изучаемых видов рода Stellaria выбрать наиболее перспективный вид сырья для введения в медицинскую практику.

Научная новизна исследования. В результате изучения химического состава сырья видов рода БгеИагга из надземной части 5. Ло/о^/еа и 5. петогит впервые выделены и идентифицированы с использованием современных физико-химических методов анализа 6 флавоноидов - производных апигенина и диосметина, в том числе новое природное соединение - 6-С-[(а-арабинопиранозил)-(1—>2)-0-/?-ксилопиранозил] апигенина, а также редкий флавоноид с необычным типом замещения в кольце В — 3,5,7-тригидрокси-3',5'-диметоксифлавон. Структура нового природного соединения подтверждена с помощью масс-спектрометрии, а также одномерной и двумерной спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР). В надземной части звездчатки вильчатой впервые идентифицированы в качестве основных флавоноидов - 6-С-[(а-арабинопиранозил)-(1—»2)-0-/?-ксилопиранозил] апигенина и б-С-/?-глкжопиранозид-8-С-а-арабинопиранозид апигенина, а в надземной части звездчатки средней - б-С-/^галактопиранозид-8-С-/?-глюкопиранозид апигенина и 6-С-/?-глюкопиранозид-8-С-/?-ксилопиранозид апигенина. Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемной масс-спекгрометрией (ВЭЖХ-МС/МС) в надземной части видов рода звездчатка впервые установлено присутствие и количественное содержание минорных соединений группы флавона, флаванона и изофлавона, а также кумарина скополетина.

Впервые изучен аминокислотный, углеводный и элементный состав 5. ко1о$1еа, 8. петогит и & сНсИо1ота. Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) установлен качественный и количественный состав свободных аминокислот надземной части изучаемых видов. Во всех анализируемых объектах найдены по 20 аминокислот, в том числе 10 незаменимых; для каждого образца определены преобладающие в составе сырья аминокислоты. На основании исследования углеводного состава установлено, что водорастворимые полисахариды надземной части видов Б1е11апа построены из остатков моносахаридов: маннозы, глюкозы, галактозы, рамнозы, арабинозы и кислоты галактуроновой. В составе пекгиноподобных веществ сырья 5. сИсИаота и 5. петогит преобладает кислота галактуроновая, а в сырье 5. Ао/о^Геа — кислота глюкуроновая. В свободном виде в сырье исследуемых видов преобладают нейтральные сахара (манноза, галактоза, глюкоза). С помощью атомно-эмиссионной спектроскопии в сырье исследуемых видов определено, что основными макроэлементами являются кальций, калий и магний, а также отмечено аккумулирование в значительном количестве таких микроэлементов, как железо и йод.

С помощью разработанной методики ВЭЖХ впервые проведен сравнительный анализ количественного содержания суммы флавоноидов в сырье четырех видов БХеИапа, а также установлена динамика накопления суммы флавоноидов в надземной части 51. коШгеа, произрастающей на территории Республики Адыгея, получены данные о компонентном составе образцов, собранных в разные годы.

Впервые были определены антиоксидантные свойства сухих экстрактов видов рода звездчатка и выделенных из них флавоноидов (6-С-[(а-арабинопиранозил)-(1—*2)-0-ß-ксилопиранозил] апигенина, 6-С-[(а-арабинопиранозил)-(1-+2)-0-/?-глюкопиранозил] апигенина, 6-С-/?-глюкопиранозида лютеолина, 3,5,7-тригидрокси-3',5'-диметоксифлавона) методом активированной хемилюминисценции. Показана связь структуры флавоноидов и степени выраженности антиоксидантных свойств.

Теоретическая и практическая значимость работы, внедрение результатов исследования. Разработана методика количественного определения суммы флавоноидов методом ВЭЖХ в надземной части видов рода Stellaria, которая может быть рекомендована для стандартизации травы звездчатки ланцетовидной, в сырье которой установлено наибольшее накопление флавоноидов. Разработаны методики выделения 9 флавоноидов из звездчатки ланцетовидной и звездчатки дубравной, которые могут использоваться для препаративного получения индивидуальных С-гликозидов флавоноидов - биологически активных веществ растительного происхождения. Результаты фотохимических исследований могут быть использованы при целенаправленном создании фотопрепаратов из надземной части звездчатки ланцетовидной, основываясь на биологических эффектах С-гликозидов в составе сырья. Материалы диссертационной работы внедрены в учебный процесс кафедры фармакогнозии ГБОУ ВПО СПХФА Минздрава России (акты о внедрении).

Методология и методы исследования. Исследование проводилось в период с 2011 по 2014 гг. Базовыми объектами являлись четыре вида растительного сырья — потенциальные источники биологически активной группы природных соединений (С-гликозидов флавоноидов). Теоретическую основу исследования составляли работы зарубежных и отечественных ученых в области фотохимических исследований. Методология исследования заключалась в осуществлении детального сравнительного фотохимического изучения выбранных объектов, при проведении которого был использован комплекс современных физико-химических методов анализа.

Степень достоверности и апробация полученных результатов. Основные материалы диссертации доложены на III Всероссийской научной конференции студентов и аспирантов «Молодая фармация - потенциал будущего» (25-26 апреля 2013г., ГБОУ ВПО СПХФА), I -ой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инновации в здоровье нации» (20 ноября 2013 г., ГБОУ ВПО СПХФА), 1-ой Всероссийской научно-практическая конференции «Беликовские чтения» (12-14 декабря 2013 г., филиал ГБОУ ВПО ВолгГМУ), П-ой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инновации в здоровье нации» (17 ноября 2014 г., ГБОУ ВПО СПХФА) и учебно-методическом совещании «Преподавание фармацевтических дисциплин» (21 ноября 2014 г., СПб) (доклад).

Основные положения, выносимые на защиту: - результаты общего фотохимического изучения надземной части видов рода Stellaria-,

- результаты исследования качественного и количественного состава компонентов фенольного комплекса надземной части видов рода 51е!1аг1а;

- результаты сравнительного исследования аминокислотного, углеводного, а также минерального состава надземной части видов рода 5/е//агш;

- результаты изучения антиоксидантного эффекта сухих экстрактов и некоторых выделенных флавоноидов из надземной части видов рода &е//ог/д, а также оценка острой токсичности и антибактериальной активности сухих экстрактов;

- исследования по разработке методики количественного определения суммы флавоноидов методом ВЭЖХ в изучаемом сырье.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с научным направлением «Изыскание и изучение биологически активных веществ синтетического, микробного и растительного происхождения для создания на их основе импортозамещающих оригинальных отечественных лекарственных субстанций» и тематическим планом научно-исследовательских работ СПХФА по теме «Мониторинг перспективных лекарственных растений флоры России» (номер Государственной регистрации 01200852355).

Личный вклад автора в проведение исследования и получение научных результатов. Диссертация представляет собой самостоятельный научный труд и включает исследования автора за период с 2011 по 2014 гг. Во всех работах, выполненных в соавторстве, вклад автора выражается личным участием в сборе, определении и паспортизации сырья, постановке и выполнении экспериментальных исследований по идентификации природных соединений, проведении товароведческих, фармакологических исследований и обобщении полученных результатов.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Диссертация соответствует паспорту специальности 14.04.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия, а именно: пункту 6 - изучение химического состава лекарственного растительного сырья, установление строения, идентификация природных соединений, разработка методов выделения, стандартизации и контроля качества лекарственного растительного сырья и лекарственных форм на его основе.

Публикации материалов исследования. Основное содержание диссертации опубликовано в 9 научных работах, в том числе 4 статьях в журналах, входящих в перечень рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертации, рекомендованных ВАК Минобрнауки России.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 175 страницах машинописного текста, иллюстрирована 46 рисунками и 26 таблицами. Диссертация состоит из введения, 7 глав (обзор литературы, объекты и методы исследования, и пяти глав, содержащих результаты экспериментальных исследований), основных результатов и выводов, списка

литературы, включающего 159 источников, из них 84 на иностранных языках и 2 приложений.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении приведена актуальность, цели и задачи исследования, его научная новизна и практическая значимость.

1. Обзор литературы

В первой главе рассмотрены систематическое положение, морфологические признаки, химический состав и биологическая активность видов рода Stellaria, а также биологические эффекты С-гликозидов флавоноидов, в том числе обнаруженных в некоторых представителях изучаемого рода.

2. Объекты и методы исследования

Исследования проводились на 8 образцах сырья 4 видов рода Stellaria - S. holostea (Республика Адыгея, Майкопский район), S. петогит (Ленинградская область, Выборгский район), S. media (Ленинградская область, Всеволожский район) и S. dichotoma (Республика Бурятия, Заиграевский район), которые заготавливались в период 2009-2013 гг. от дикорастущих растений.

Обнаружение основных групп биологически активных веществ в исследованных образцах и изучение компонентного состава флавоноидов, фенольных кислот, углеводов, аминокислот, элементов проводили с помощью общепринятых химических реакций, бумажной (БХ) и тонкослойной хроматографии. Анализ фенольного комплекса, первичных метаболитов и элементного состава проводили с помощью современных физико-химических методов: ВЭЖХ, высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-селективным детектором (ВЭЖХ-МС), ВЭЖХ-МС/МС, газо-жидкостной хроматографии (ГЖХ), ЯМР, атомно-эмисионной спектроскопии с индуктивно-связанной плазмой. Для определения острой токсичности и антимикробного действия использовали сухие экстракты, полученные из образцов сырья видов рода Stellaria. Исследования антиоксидантного эффекта сухих экстрактов и индивидуальных соединений проводили методом активированной хемилюминисценции.

3. Результаты исследования Сравнительное фотохимическое исследование видов рода Stellaria

С целью определения основных групп природных соединений был проведен общий фитохимический анализ надземной части S. holostea, S. петогит, S. media и S. dichotoma, в результате которого во всех четырех видах обнаружены флавоноиды, фенольные кислоты, кумарины, сапонины, полисахариды и аминокислоты. При этом дубильные вещества присутствуют в следовых количествах, а антраценпроизводные, иридоиды и карденолиды в сырье не найдены. Основными группами природных веществ надземной части изучаемых видов являются фенольные соединения (флавоноиды, фенольные кислоты), а также сапонины. Из первичных метаболитов отмечается относительно высокое содержание полисахаридов в траве звездчатки средней. Дальнейшие фотохимические исследования

надземной части представителей рода звездчатка были направлены на детальный анализ фенольных соединений и выделение индивидуальных флавоноидов, которые накапливаются в сырье в наибольшем количестве. Для качественной оценки этих компонентов извлечения, полученные при экстрагировании надземной части видов рода БгеИапа 90 % спиртом метиловым, подвергали исследованию методом ВЭЖХ на хроматографе Бюпех Р580 с фото диодным детектором (иУВ340в) (рисунок 1). Анализ УФ-спектров основных пиков, соответствующих на хроматограммах флавоноидам, и сравнение их с литературными данными показали, что основные соединения относятся к флавоновым производным, так как в их спектрах имеются характерные максимумы поглощения в области длин волн 265-275 нм и 330-350 нм.

Рисунок 1 - Полученные методом ВЭЖХ хроматограммы извлечений из S. nemorutn (a), S. holostea (б), S. dichotoma (в) и S. media (г): по оси абсцисс - время удерживания, по оси ординат - интенсивность поглощения при длине волны 235 нм

Кроме того, для первичного структурного анализа основных пиков также был проведен ВЭЖХ-МС анализ данных извлечений на хроматографе Agilent 1100 series, соединенного с масс-спектрометром Finnigan LCQ Deca (Thermo Finnigan); тип ионизации -электроспрей. Анализ типа фрагментации молекул указывал на то, что основные флавоноиды изучаемых видов представлены гликозидами, имеющими от одного до четырех Сахаров в молекуле. При этом углеводные остатки присоединяются к агликонам посредством С-гликозидной связи, так как в масс-спектре не фиксировался интенсивный пик протонированного агликона, характерный для О-гликозидов.

Для препаративного выделения доминирующих флавоноидов были выбраны надземные части S. петогит и S. holostea, так как данные виды являлись малоизученными и более разнообразными по набору компонентов. Для этого использовалась комбинация различных методов разделения: жидко-жидкостная экстракция, колоночная хроматография на нормально-фазовом и обращенно-фазовом силикагеле и сефадексе. Очистка индивидуальных соединений проводилась методом полупрепаративной ВЭЖХ на приборе «Lachrom-Merck Hitachi HPLC system» (насос L7100 с УФ детектором L7400). Таким образом, из надземной части звездчатки дубравной были выделены 5 доминирующих флавоноидов, соответствующие пикам № 1, 2, 3, 4, 5 (рисунок 1а) а из сырья звездчатки

ланцетовидной - 4 флавоноида, соответствующие пикам № б, 7, 8, 9 (рисунок 16), Структура выделенных флавоноидов 1-9 (рисунок 2) была установлена с помощью таких физико-химических методов анализа, как спектроскопия ЯМР (ЯМР-спектры записывались на спектрометре Bruker Avance III 600), ВЭЖХ-МС анализ и спектроскопия в УФ области спектра.

О) RI " R. » 0-Ху\ (вмиекик 3) (б) R, - /i-СЛи. R3 ■■ H. R, - ОН

(4) R| г- ß-Glu, R3 « ix-Ara (шафтозиs} (ÎJR|» H. R; = /Ï-Glu, R, « ОН (5>R| «■ fl-Cciï. - /1С,h, {NiR, - /i-ilh.. Fi, .. I L R, - OMc

Рисунок 2 - Структурные формулы выделенных флавоноидов из надземной части S. петогит

(1-5) и S. holostea (6-9) Следует отметить, что флавоноид (1) оказался новым природным соединением, ранее не описанным в литературе. Его структура была доказана с помощью одномерной и двумерной спектроскопии ЯМР и масс-спектрального анализа как 6-С-[(а-арабинопиранозил)-(1-»2)-0-/?-ксилопиранозил] апигенина. Для установления молекулярной массы использовали масс-спектрометр высокого разрешения «UHR-QTOF maXis 4G» (Bruker Daltonics, Bremen). Молекулярная формула С25Н26013 была определена на основе молекулярного ионного пика с отношением массы к заряду m/z 535,1446 [М+Н]+ в масс-спектре высокого разрешения. Данные *Н спектра ЯМР (таблица 1, рисунок За), снятого в МеОН-<4 указывали на присутствие ароматической системы типа АА'ВВ' для сигналов 8Н 7.85 (2Н, d, J=8.8 Hz, Н-2', Н-6') и 6Н 6.93 (2Н, d, 7=8.8 Hz, Н-3', Н-5'), соответствующие пара-замещенному кольцу В. Два других сигнала в ароматической области спектра при 8Н 6.61 (1Н, s) и 5Н 6.48 (1Н, s) были отнесены к протонам Н-3 и Н-8, основываясь на наблюдаемых дальних гетероядерных корреляциях между протоном Н-3 (8 6.61) и углеродными сигналами С-4 (6С 184.0), С-10 (Sc 105.2), С-2 (5С 166.1), и С-1' (8С 123.6), а также между протоном Н-8 и С-6 (8С 109.1), С-10 (8С 105.2), С-7 (8С 165.1) и С-9 (8С 159.1) (рисунок 36). /?-Аномерная конфигурация ксилозы и а-аномерная конфигурация арабинозы были определены по высокому значению константы спин-спинового взаимодействия между HI" и Н2" (Vr 2» = 9.2 Гц) в спектре, снятом в DMSO-a?fo и между Н-1'" и Н-2'" (3Jr>2- = 6.7 Гц) в спектре, снятом в МеОН-с4 соответственно (таблица 1). Кроме того, присутствие дальних гетероядерных корреляций между Н-1" и С-6 (8С 109.1), С-5 (8С 162.8) и С-7 (8С 165.1), подтвердили

присоединение /?-ксилопиранозы в положении С-6 апигенина посредством С-гликозидной связи. Положение связи между моносахаридами было установлено с помощью НМВС спектра, который показал корреляцию между Н-1"1 (5Н 4.35) и С-2" (5с 81.8), таким образом, подтверждая присоединение а-арабинопиранозы в положении С-2" /?-ксилопиранозы посредством (1—>2) гликозидной связи (рисунок Зв).

Таблица 1 - 'Н, 13С и НМВСЯМР данные флавоноида (1) (ПН: 600 MHz, 13С: 150 MHz)

Позиция 6ц* (mult.; J в Гц) Sh" (mult.; J в Гц) SrB HMBC"

2 166.1 (C)

3 6.68, s 6.61, s 103.9 (CH) C4, СЮ, C2, Cl'

4 184.0 (O

5 162.8 (C)

6 109.1 (C)

7 165.1 (C)

8 6.49, s 6.48, s 94.2 (CH) C6, C10, C7, C9, C4

9 159.1 (C)

10 105.2 (C)

1' 123.6 (C)

2' 7.88, d (8.8) 7.84, d (8.8) 129.4 (CH) C6', C4', C21

3' 6.94, d (8.8) 6.93, d (8.8) 117.0 (CH) C1,,C4,,C5'

4' 162.8 (C)

5' 6.94, d (8.8) 6,93, d (8.8) 117.0 (CH)

6' 7.88, d (8.8) 7.85, d (8.8) 129.4 (CH)

4'-ОН 10.49, s

5-ОН 13.53, br s

7-ОН 10.08, br s

1" 4.64, d (9.2) 4.85e 74.2 (CH) C6, C7, C5, C2", C5"

2" 4.37, t (9.2) 4.52, br s 81.8 (CH)

3" 3.40, dd (8.8, 9.2) 3.60, m 80.3 (CH) C2", C4"

4" 3.48, m 3.69, ddd (10.4,9.0, 71.3 (CH) C5", C2"

5,4)

5" 3.12,t(U.O) 3.29e 71.5 (CH2) C4", Cl", C3"

3.79, dd (11.0,5.4) 3.95, dd (11.1, 5.3) C4", Cl", C3"

1"' 4.28, d (6.0) 4.35, d (6.7) 106.8 (CH) C2"

2"' 3.36, dd (6.0, 7.8) 3.51, dd (6.7, 8.6) 73.2 (CH) Cl'", C3'"

3"' 3.29, dd (7.8, 3.5) 3.42, dd(8.6, 3.5) 74.2 (CH) C2'"

4,„ 3.46, m 3.60, m 69.2 (CH) C3'"

5'" 3.06, dd (12.1, 4.4) 3.29e 66.5 (CH2) Cl'", C3'", C4"'

2.88, dd (12.1, 2.5) 3.09, dd (12.7, 2.1) Cl'", C3'", C4"'

Примечание - 8Н - химический сдвиг *Н; 6С - химический сдвиг 13С; mult. - мультиплетность; НМВС -

дальняя гетероядерная корреляционная спектроскопия. - спектр снят в DMSO-ifo - спектр снят в MeOH-i^; s

- синглет; Ьг в - уширенный сннглет; (1 - дуплет; сМ - дуплет дуплетов; сШ - дуплет дуплета дуплетов; 1 -

триплет; m - мультиплет

НИИ s s 1 s s \ SIS isa S ssj î 2 1 й ^

1

1 1 f / / If j

...... r-, i j) ] J 1 J /1 lËid 1 1 »

1 1* »i ej 3.6 > |

rw ,6.93 ■HT 64 '1 1 t. 35 r w 3.95 ГС ¿m) | 60 1 еШ) З.оя

1 (>(dd 3.51; ■ ,ле*°7

1 >1 1

i J * к ULfc l

a * Si я 5 S Щ s; IS ¡3

о » • ;; s " »! ■* 5J 50 M ** 4< 4 2 4.0 3 " 1.1 JJ i.0

Н-З, . Н-8

'IT

i j i{6.4«,105.23} {6.48,10?. if]

' (l "j {6.61,113.64} ,

.........—......-.....-i-......4—1.....-t-

{6.48,159.06} * {6.61,1|6.13Ь p.4il65.07^

.98}

{6.61,184.00}^ ^{6.48,183.'

i ,Hl-*yt , Hl-Ara H3:X| , l|l

t^JmjL^

6.6 6.4 6.2 6» 5.S 5.5

j : 7f i.....................

t ' / • д C2-X»L ; 1 ___________ fi ■ "fV" таг S|1 ir , ........1 '" ;

I i : Ж ' j |<H9 %

, (6) (B)

Рисунок 3 - H спектр (а), ароматическая (б) и алифатическая (в) часть НМВС спектра ЯМР флавоноида (1) в МеОН-^

Для того, чтобы определить возможность присутствия выделенных флавоноидов в надземной части S. dichotoma и S. media, нами были проанализированы хроматограммы и масс-спектры метанольных извлечений при помощи метода ВЭЖХ-МС. Исследование основных пиков на хроматограммах и соответствующих масс-спектров показало, что некоторые из них имеют такое же время удерживания и масс-фрагментацию, как и выделенные ранее флавоноиды. Так в надземной части S. dichotoma был впервые обнаружен шафтозид (4) и 6-С-[(а-арабинопиранозил)-(1-»2)-0-/?-ксилопиранозил] апигенина (1), соответствующие пикам 3 и 5 (рисунок 1в), соответственно, а в надземной части 5. media был впервые идентифицирован 6-С-у5-галактопиранозид-8-С-/?-глюкопиранозид апигенина (5) и виценин 3 (3), соответствующие пикам 1 и 3 (рисунок 1г) Для подтверждения присутствия этих соединений был проведен анализ методом ВЭЖХ исследуемого извлечения из сырья и выделенных флавоноидов. При этом время удерживания и УФ-спектры пиков на хроматограммах извлечений и индивидуальных флавоноидов полностью совпадали.

Идентификацию и количественное определение минорных фенольных соединений (флавоноидов, изофлавоноидов и кумаринов) четырех видов рода Stellaria осуществляли методом ВЭЖХ-МС/МС при использовании хроматографа High Ultimate 3000 RS (Dionex, Sunnyvale, CA, USA), соединенного с масс спектрометром гибридной системы тройной квадруполь - линейная ионная ловушка с источником ионизации электроспрей (АВ Sciex, Foster City, CA, USA) путем сравнения времен удерживания и масс-спектров спиртовых извлечений из сырья данных видов звездчатки и стандартных образцов фенольных соединений (таблица 2 и 3).

Таблица 2 - Содержание минорных флавоноидов и кумаринов в надземной части видов рода 81е11аг1а (в мкг/г на воздушно-сухое сырье) ___

Соединение 5. сЧсИоЮта' 5. сНсИо^та2 Ьо\о$1са1 5. тесНа' 5. петогит1

Апигенин 12,54 ± 0,31 3,84 ± 0,10 0,08 ± 0,02 0,02 ± 0,01 1,42 ±0,37

Апигенин-7-глкжозид 2,09 + 0,11 1,41 ± 0,05 0,28 ± 0,02 0,18 + 0,02 1,80 + 0,12

Флавон 0,01 ± 0,01 0,01 ± 0,01 <0 <0 -

Кемпферол 0,90 + 0,01 0,76 + 0,01 0,06 + 0,01 0,04 ± 0,02 0,40 ± 0,04

Лютеолин 0,54 ± 0,03 0,29 ±0,01 1,05 ± 0,03 0,34 ± 0,03 0,18 + 0,05

Лютеолин-7-глюкозид 2,05 ± 0,39 2,72 ±0,65 10,85 ± 0,62 49,11 ± 0,75 1,11 + 0,34

Нарингенин 11,21 ±0,59 4,03 ± 0,37 0,72 ± 0,04 0,79 ± 0,03 0,80 + 0,17

Нарингенин-7-глкжозид 0,98 ±0,09 0,47 + 0,08 - - 0,21 ± 0,07

Кверцетин 0,40 ± 0,01 0,28 ± 0,01 <0 <0 0,15 ± 0.01

Рутин 1,88 ± 0,14 1,60 ± 0,15 11,68 ± 0,20 12,07 ± 0,21 0,28 ± 0,06

Скополетин <0 0,04 ±0,01 1,71 ± 0,14 0,21 ± 0,04 1,30 ± 0,35

Примечания 1 Образцы надземной части видов рода 5(е//ог/а, собранные в 2012 г., обозначены -1 2 Образец надземной части Яе11аг1а ЛсИоЮта, собранный в 2009 г., обозначен - 2 3 Обозначение <0 означает, что значения выше, чем предел обнаружения, но ниже чем предел количественного

определения 4 Содержание идентифицированных соединений представлено как среднее арифметическое 3 определений (п=3); ± абсолютное стандартное отклонение

Таблица 3 - Содержание изофлавоноидов в надземной части видов рода 51е11апа ( в нг/г на воздушно-сухое сырье)___

Соединение 5. (Ифо^та1 5. ¿ИсИоЮта1 & йо/аг/еа1 £ тесНа1 5. петогит1

Дайдзин - <0 13,14 ± 0,65 - <0

Формононентин <0 14,24 ± 1,21 - 11,19 ± 0,06 -

Генистеин 19,74 + 0,07 12,91 ± 0,16 15,30 ±0,09 51,80 + 0,29 83,89 ± 0,71

Генистин 17,20 ± 0,38 22,24 ± 0,89 143,84 ± 0,71 991,54 ± 1,04 1031,83 ± 1,09

Глицитеин 8,40 ± 0,22 - 4,60 ± 0,08 -

Изоформононетин <0 - - - -

Ононин <0 48,60 ± 0,18 <0 122,85 ± 0,36 <0

Сиссотрин - - - - - <0

Софорикозид <0 45,56 ± 0,86 266,36 ± 0,91 <0

Текторидин 17,12 ± 0,27 - - - -

Примечание - Обозначения см. таблица 2

Использование современных физико-химических методов анализа позволило детально изучить состав компонентов фенольного комплекса четырех видов рода &е//агга. Из надземной части & петогит выделены 5 флавоноидов, являющиеся производными агликона апигенина с 2 остатками моносахаридов в форме дигликозидов и биозидов (рисунок 2). Также в сырье данного вида обнаружен изовитексин (6-С-/?-глюкопиранозид апигенина), что

было подтверждено с стандартного образца.

помощью качественного анализа методом ВЭЖХ в присутствии Кроме того, методом ВЭЖХ-МС/МС в звездчатке дубравной идентифицированы и количественно определены 9 флавоноидов - производных флавона, флавонола и флаванона. Из надземной части 5. Ь.о1о$1еа выделены 3 флавоноида, являющиеся производными лютеолина и диосметина, а также редкий флавоноид - морелосин (9), представляющий собой агликон с необычным типом замещения в кольце В. Кроме того,

методом ВЭЖХ-МС/МС в составе данного сырья идентифицированы 9 флавоноидов (производные флавона, флавонола и флаванона), из них 7 определены количественно (таблица 2). В надземной части S. media с помощью методов ВЭЖХ, ВЭЖХ-МС, ВЭЖХ-МС/МС обнаружены 11 флавоноидов, из которых доминирующими в сырье являются 6,8-ди-С-гликозиды апигенина; в траве S. dichotoma с помощью тех же методов идентифицированы 13 флавоноидов, из которых доминирующими являются С-гликозиды апигенина. Наряду с флавоноидами методом ВЭЖХ-МС/МС в надземной части видов рода Stellaria установлено присутствие и количественное содержание кумарина скополетина. Качественный и количественный анализ состава изофлавоноидов методом ВЭЖХ-МС/МС изучаемых видов рода Stellaria показал, что в сырье содержатся от пяти до шести компонентов; из них общими и доминирующими соединениями являются генистин и генистеин (таблица 3).

Опубликованные данные по составу и биологической активности полисахаридов звездчатки средней (Горина Я. В., 2012) послужили предпосылкой для проведения сравнительного анализа-углеводного состава видов рода Stellaria. Для выделения отдельных групп углеводов из образцов надземной части четырех видов рода Stellaria использовали стандартную методику (Тулайкин А. И. и др., 2004). Полученные фракции углеводов подвергали очистке, кислотному гидролизу и исследованию их мономерного состава методами БХ, а также методом ГЖХ после получения триметилсилильных производных на хроматографе «Кристалл-2000М» (Россия) с пламенно-ионизационным детектором (таблица 4).

..Таблица 4 - Результаты анализа состава свободных моносахаридов (СМ), водорастворимых полисахаридов (ВРПС) и пекгиноподобных веществ (ПВ)

Объект изучения, надземная часть Исследуемая углеводная фракиия Идентифицированные свободные моносахариды (СМ) или мономерные звенья в составе ВРПС или ПВ)

S. media СМ Rha, GalA, Gal, GlcA, Ara

ВРПС Ara, Rha, Gal, Glu, GalA, Man

ПВ Ara, Rha, Man, GalA, Gal, Glu

S. dichotoma СМ Xyl, Gal

ВРПС Rha, Ara, Man, GalA, Glu

ПВ Rha, Man, Glc, Gal, GalA, Ara

S. holostea ГСМ Gal, Glc, GalA, Man, Rha

ВРПС Rha, Glc, Xyl, Ara, Man, Gal

ПВ Man, Rha, GlcA, GalA, Xyl, Gal, Glc

S. rtemorum СМ - Rha, GalA, Man, Glc, Gal A

ВРПС Gal, Glc, Man, GalA, GlcA

ПВ Rha, Man, GalA, GlcA, Ara, Gal

Примечания 1 Полужирным шрифтом выделены углеводы, которые определены как доминирующие в составе углеводных фракций, выделенных из сырья 2 Условные обозначения: Rha - рамноза, Glc - глюкоза, Gal - галактоза, Ara - арабиноза, Ху1 - ксилоза, Man -манноза, GalA - кислота галактуроновая, GlcA - кислота глюкуроновая

На основании полученных данных установлено, что водорастворимые полисахариды

(ВРПС) надземной части изучаемых видов Ле//аг/а построены из остатков моносахаридов: маннозы, глюкозы, галактозы, рамнозы, арабинозы и кислоты галактуроновой. В составе пекгиноподобных веществ (ПВ) звездчатки средней, вильчатой и дубравной преобладает кислота галактуроновая, а в сырье звездчатки ланцетовидной — кислота глюкуроновая. В

свободном виде в сырье исследуемых видов преобладают нейтральные сахара (манноза, галактоза, глюкоза), а в звездчатке средней - также и галакгуроновая кислота.

Изучение свободных аминокислот в сырье представляло интерес исходя из того, что литературные данные об их составе в представителях рода Ъ\.е11апа Ь. в доступной отечественной и зарубежной литературе отсутствовали. Исследование проводили методом обращенно-фазовой ВЭЖХ после дериватизации фенилизотиоцианатом. В результате анализа впервые был установлен качественный и количественный состав свободных аминокислот четырех представителей рода БгеИапа (таблица 5).

Таблица 5 - Аминокислотный состав надземной части видов рода &е//яп'а

Название аминокислоты Содержание аминокислоты в пересчете на абсолютно сухое сырье, иг/г*

S. media S. петогит S. holoslea S. dichotoma

кол-во %от суммы кол-во %от суммы кол-во %от суммы кол-во % от суммы

аспарагин 0,218 9,9 0,087 12,5 0,144 6,8 0,262 11,2

глутамин 0,384 17,5 0,067 9,6 0,305 14,4 0,149 6,4

гидроксипролин 0,003 0,1 0,006 0,9 0,002 ОД 0,002 ОД

серин 0,067 3,0 0,025 3,6 0,064 3,0 0,071 3,0

глицин 0,084 3,8 0,02 2,9 0,041 1,9 0,18 7,7

гистидин 0,003 0,1 0,008 1,2 0,014 0,7 0,048 2,1

аргинин 0,258 11,7 0,022 3,2 0,504 23,8 0,342 14,6

треонин 0,008 0,4 0,008 1,2 0,007 0,3 0,036 1,5

аланин 0,036 1,6 0,028 4,0 0,280 13,2 0,113 4,8

пролин 0,314 14,3 0,107 15,4 0,305 14,4 0,132 5,6

тирозин 0,05 2,3 0,087 12,5 0,062 2,9 0,036 1,5

валин 0,129 5,9 0,02 2,9 0,082 3,9 0,168 7,2

изолейцин 0,064 2,9 0,008 W 0,028 1,3 0,105 4,5

лейцин 0,028 1,3 0,008 1,2 0,023 1,1 0,082 3,5

фенилаланин 0,067 3,0 0,014 2,0 0,046 2,2 0,094 4,0

лизин 0,011 0,5 0,006 0,9 0,005 0,2 0,027 1,2

цистин+ цистеин 0,241 11,0 0,087 12,5 0,059 2,8 0,136 5,8

метионин 0,008 0,4 0,003 0,4 0,007 0,3 0,01 0,4

триптофан 0,224 10,2 0,084 12,1 0,142 6,7 0,344 14,7

Общее содержание 2,197 100 0,695 100 2,120 100 2,337 100

Примечание - Полученные данные являются средним арифметическим трех параллельных измерений. Полужирным шрифтом выделены доминирующие аминокислоты. Относительная погрешность определения находилась в пределах от 0,2 % до 1,4 %

В надземной части всех исследуемых видов обнаружены и количественно определены по 20 основных аминокислот; из них незаменимыми являются валин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, треонин, триптофан, фенилаланин, аргинин, гистидин. Наибольшее суммарное содержание, аминокислот в сырье среди объектов выявлено у звездчатки вильчатой. Согласно полученным данным, в надземной части S. media преобладают следующие свободные аминокислоты: аспарагин, глутамин, пролин, аргинин,

цистин+цистеин, триптофан (64,7 %У; в сНсИо1ота: аспарагин, аргинин, триптофан (40,6 %)'; в Ао/<м?еа: аргинин, пролин, глугамин, аланин (65,8

Изучение элементного состава растительных объектов является важным аспектом при установлении возможности их применения в • медицинской практике, т.к. накопление некоторых элементов в значимых количествах может служить обоснованием для использования исследуемого сырья при дефицитных состояниях в профилактических или лечебных целях, а также в комплексной терапии заболеваний. Определение элементного состава изучаемых объектов проводилось на спектрометре методом атомной эмиссионной спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой (прибор БЫтасЬи 1СРЕ-9000) (таблица 6).

Таблица 6 - Количественное содержание элементов в надземной части представителей рода Б1еИапа

Название элемента Соде ржание элементов в надземной части звездчатки, мкг/г

средней вильчатой . дубравной ланцетовидной

Са 3710,0±1,8 1053,1+1,3 1512,3+1,1 1280,3+0,9

К 1140,2±1,9 780,2±1,2 1350,4±1,0 1142,4±1,1

щ 714,5*1,6 610,6+1,1 850,6±0,5 207,5+1,0

Ре . 620,3+1,5 1635,4±0,9 250,7±0,9 470,7±0,8

Р 61,0+0,9 1900,2+0,9 570,2+0,6 364,2+1,1

Ыа 531,5+0,6 129,3±0,9 251,2±03 207,4±0,6

Б 480,1±0,3 414,2+0,6 350,9±0,2 292,3+04

I 90,1±0,4 60,2±0,7 93,1±0,8 52,1+0,4

51 50,2+0,4 60,9±0,8 8,6+0,9 15,5+0,9

А1 40,2+0,4 80,1±1,1 32,4±14 -

Мп 34,6+1,6 20,6+1,2 65,7+1,3 59,4+1,1

Ва 21,7+1,7 21,1±0,9 250,8+13 25,5 ±0,6

Бг 18,1±1,3 13,1+0,4 17,3+0,6 4,2+1,3

вп 15,2+1,1 14,4±0,6 18,2+03 14,1±0,6

Си 9,1±0,9 8,2+1,2 5,3+1,4 6,2+0,8

Т1 • 8,4+0,6 17,1+1,1 1,3+1,2 1,2+1,2

Ъ\ 4,0±0,8 4,1+1,6 5,1+1,1 24±1,0

а ■ 2,6±0,9 2,3+1,2 2,8±0,9 2,2+0,9

в 2,2±0,5 2,3+0,9 1,5±0,3 1,7+0,9

и 0,1±0,5 0,1+0,8 0,1+0,4 0,1±1,1

А-ч; РЬ; БЬ - - - -

Общее содержание 7544,1 68274 56384 41494

Примечание - .Полученные данные являются средним арифметическим трех параллельных измерений; ± относительная погрешность определения, в %

Сравнительный анализ состава макроэлементов показал относительно высокое

содержание кальция, калия и магния в изучаемых видах сырья. Наиболее высокое содержание кальция отмечается нами в надземной части звездчатки средней, что также сопоставимо с результатами, полученными ранее для образцов сырья, собранных на территориях Западной и Восточной Сибири и Казахстана (Бабешина Л. Г. и др., 2010). Для микроэлементного состава четырех видов звездчатки следует отметить значительное накопление железа и йода. В связи с тем, что исследуемые образцы собраны в разных районах страны, содержание данных элементов в довольно больших количествах, возможно, является общим признаком для данных представителей рода $1е11апа. Такой высокий показатель элементарного железа в надземной части звездчатки средней соотносится с ее применением в качестве народного

'в % по относительному содержанию данных соединений в общей сумме аминокислот

средства для лечения анемии и астенического синдрома, причиной которого также часто являются железодефицитные состояния. Помимо этого, в сырье присутствуют и другие элементы «кроветворного комплекса» — марганец и медь. Сравнительный анализ содержания микроэлементов показал, что наиболее высокое содержание железа отмечено в надземной части звездчатки вильчатой, йода - в надземной части звездчатки средней и звездчатки дубравной, а также марганца - в надземной части звездчатки дубравной и звездчатки средней. Не были обнаружены в образцах сырья всех исследуемых видов токсические элементы As, Pb и Sb. Сравнительный макро- и микроскопический анализ надземной части видов рода Stellaria

В результате проведенного макроскопического анализа надземных частей изучаемых растений были выявлены общие и отличительные морфологические признаки. К диагностическим признакам сырья видов Stellaria относится наличие или отсутствие, а также характер опушения надземных органов, размер и форма листьев, чашелистиков и лепестков. В результате проведенного микроскопического исследования также были выявлены общие и отличительные анатомические признаки сырья данных растений. При этом установлено, что для подтверждения подлинности исследуемых видов сырья определяющими могут служить тип и строение встречающихся на поверхности листьев и стеблей трихом, наличие кристаллических включений оксалата кальция в виде друз, а также некоторые особенности строения стебля: наличие слоя гиподермы на поперечном срезе у S. holostea и S. петогит, наличие склеренхимы перициклического происхождения у S. dichotoma и уголковой колленхимы у S. holostea, а также непучковое строение у S. media.

Исследование острой токсичности и изучение антиоксидантного эффекта сухих экстрактов и флавоноидов видов рода Stellaria Изучение острой токсичности проводили на 50 белых беспородных мышах-самцах по методу Миллера-Тейнтнера. Высушенные спиртовые извлечения из надземной части изучаемых видов (далее - сухие экстракты) вводили перорально, однократно, в виде водной суспензии в диапазоне доз от 1,0 г/кг до 10,0 г/кг массы тела животного. При введении сухих экстрактов в максимальной дозировке 10 г/кг, все животные (п=8), получившие сухой экстракт звездчатки вильчатой, звездчатки ланцетовидной и звездчатки дубравной выжили. При введении животным сухого экстракта звездчатки средней в дозировке Юг/кг 6 из 8 животных погибли. Дополнительные исследования токсичности позволили установить ЛД50 сухого экстракта данного вида, которая при однократном пероральном введении составила 9 г/кг массы мыши. Таким образом, изучаемый сухой экстракт надземной части звездчатки средней можно отнести также как и экстракты других изучаемых видов Stellaria к относительно безвредным препаратам в соответствии с классификацией Hodge - Sterner (Саноцкий И.В., 1970).

Измерения антиоксидантной активности сухих экстрактов, полученных из надземной части изучаемых видов рода Stellaria, а также для некоторых выделенных из надземной части звездчатки ланцетовидной и звездчатки дубравной флавоноидов в сравнении с активностью

стандартных образцов флавоноидов выполнялись на хемилюминометре «1днп-5773» («ДИСофт», Россия) с использованием программного продукта PowerGraph. Значение общей ангиоксидантной активности определяли в единицах действия (ЕД) кверцетина, так как согласно полученным кинетическим кривым зависимости интенсивности хемилюминесценции от времени проведения реакции, сухие экстракты, как и кверцетин, являются антиоксидантами средней силы. Пересчет общей антиоксидантной активности (ОАА) производили с помощью калибровочного графика зависимости латентного времени и концентрации стандартного образца кверцетина (таблица 7).

Таблица 7 - Общая антиоксидантная активность сухих экстрактов надземной части видов

рода Stellaria, полученных с использованием различных растворителей

Вид экстрагента для получения сухого экстракта ОАА сухого экстракта надземной части видов рода Stellaria (в ЕД кверцетина)1

S. holostea S. media S.nemorum 5. dichotoma

Вода очищенная 0,020+2.6 0,120+2.1 0,007+2.3 0,007+2.1

40% спирт этиловый 0,02212.4 0,052+0,9 0,014±2.9 0,005±1.1

70% спирт этиловый 0,230+1.6 0,049+1.6 0,018+1.4 0,012±1.2

96% спирт этиловый 0,045+2.3 0,005+1.9 0,020+2.6 0,013±2.4

Примечание - Указанные величины ЕД показывают количество кверцетина (в г) с такой же антиоксидантной активностью, что и 1 г изучаемого сухого экстракта; ± относительная погрешность измерений (п=3), в %

Анализ полученных данных позволяет сделать вывод, что антиоксидантная активность сухих экстрактов надземной части представителей рода Stellaria варьирует в пределах от 0,007 ЕД для водных сухих экстрактов звездчатки дубравной и звездчатки вильчатой до 0,230 ЕД для 70 % спиртового сухого экстракта звездчатки ланцетовидной. Высокая антиоксидантная активность экстракта звездчатки ланцетовидной соответствует данным количественного определения флавоноидов в исследуемом сырье, так как именно для надземной части этого вида наблюдается наиболее высокое их содержание (таблица 9). Высокий показатель антиоксидантного эффекта водного экстракта звездчатки средней, вероятно, связан с высоким содержанием полисахаридов в сырье, для которых также характерна выраженная антиоксидантная активность (Горина Я. В., 2012).

Для сравнительного анализа антиоксидантного эффекта некоторых флавоноидов, которые были обнаружены в сырье изучаемых видов, проведено определение ОАА 4 стандартных образцов - производных флавона (апигенина, лютеолина, изовигексина, витексина) и изофлавоноида генистеина, а также четырех индивидуальных соединений, выделенных из видов рода Stellaria (таблице 8). Результаты определения антиоксидантной активности методом активированной хемилюминесценции и наблюдаемая зависимость степени выраженности антиоксидантного эффекта от структуры флавоноидов согласуются с литературными данными, установленными другими авторами in vitro спектрофотометрическими методами (Majewska М. et al, 2011, Benaissa О. et al, 2013). Так, наиболее важным фактором для проявления выраженного антиоксидантного действия является наличие о-дигидроксигруппы в кольце В флавоноидов в положениях 3' и 4'. Отсутствие же такой группировки в кольце В уменьшает выраженность антиоксидантного эффекта, практически сводя его относительные значения к незначительным величинам (ОАА

лютеолина почти в 7 раз выше, чем ОАА апигенина). Присутствие гидроксигруппы в положении 3 кольца С также увеличивает антиоксидантную активность флавоноида (ОАА кверцетина почти в 1,5 раза выше, чем ОАА лютеолина).

Таблица 8 - Общая антиоксидантная активность изучаемых флавоноидов

Название флавоноида (тривиальное название) ОАА в массовых ЕД кверцетина1 ОАА в молярных ЕД кверцетина2

Агликоны:

Апигенин3 0,093+2,2 0,083±2,2

Лютеолин 0,670±1,7 0,634±1,7

3,5,7-тригидрокси-3',5'-диметоксифлавон (морелосин)5 0,1бб±3,6 0,181±3,6

Генистеин4 0,110±3,6 0,101+3,6

Монозиды:

6-С-/?-глкжопиранозид лютеолина (изоориентин)1 0,323±1,1 0,475+1,1

6-С-/?-глкжопиранозид апигенина (изовитексин)3 0,015±1,3 0,022+1,3

8-С-Д-глюкопиранозид апигенина (витексин)3 0,047±2,1 0,068±2,1

Биозиды:

6-С-((а-арабинопиранозил)-(1—>2)-0-^-ксилопнранозил] апигенина5 0,002±2,3 0,004±2,3

6-С-((а-арабинопиранозил)-(1—>2)-0-Д-глюкопиранозил] апигенина5 0,018±1,9 0,034±1,9

'Указанные величины ЕД показывают количество кверцетина (в г), проявляющего такую же антиоксидантную активность как и 1 г изучаемого соединения; ± относительная погрешность измерений (п=3), в % 2Указанные величины ЕД показывают количество кверцетина (в моль), проявляющего такую же антиоксидантную активность как и 1 моль изучаемого соединения; ± относительная погрешность измерений (п=3), в % 'Стандартные образцы флавоноидов, соответствующие установленным компонентам в сырье исследуемых видов 4Выделен из семян сои 'Выделены автором из 5, Ио1о$!еа и 5. петогит

Исследование антибактериального эффекта экстрактов видов рода БХеИаг'т

Литературные сведения о наличии антибактериального эффекта экстракта из семян звездчатки ланцетовидной послужили основанием для проведения скрининга на наличие антимикробного эффекта для экстрактов, полученных из надземной части исследуемых видов (КишагаБашу У. е/ а1, 2002). Исследование сухих экстрактов, полученных при экстрагировании спиртом метиловым надземной части видов рода БгеИапа, проводили методом дисков (таблица 8).

Таблица 8 - Результаты скрининга на наличие антибактериального эффекта сухих экстрактов видов рода $1е11апа

Объект изучения на наличие антибактериального эффекта Диаметр зоны отсутствия роста микроорганизма, мм

Staphylococcus aureus АТСС 29213 Escherichia coli АТСС 25922 Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853

Экстракт S.media (200 мкг/диск) 13 - -

Экстракт S.holostea (200 мкг /диск) 12 - -

Экстракт S.dichotoma (200 мкг /диск) 7 - -

Экстракт S.nemorum (200 мкг/диск) 10 - -

Рифампицин (10 мкг/диск) 35 19 11

Гентамицин (10 мкг/диск) 23 30 21

Таким образом, было показано, что все изучаемые экстракты проявляют умеренную антимикробную активность в отношении золотистого стафилококка Staphylococcus aureus, но

не обладают антибактериальными эффектом в отношении синегнойной палочки

Pseudomonas aeruginosa и кишечной палочки Escherichia coli в условиях данного эксперимента.

Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в надземной

части видов рода Stellaria

Исследования качественного состава флавоноидов, результаты определения антиоксидантной активности сухих экстрактов и некоторых выделенных флавоноидов показали взаимосвязь между их структурой и выраженностью данного эффекта. Поэтому представлялось обоснованным провести разработку количественного определения суммы флавоноидов и оценить их количественное содержание в сырье исследуемых видов. Для проведения данной работы был использован метод обращенно-фазовой ВЭЖХ. Хроматографическое разделение фенольных соединений проводилось на приборе Dionex Р580. Скорость потока элюента - 1 мл/мин, температура колонки - 40 °С.

Для проведения сравнительного анализа количественного содержания суммы флавоноидов, нами были подобраны оптимальные условия хроматографирования, подходящие для разделения флавоноидов всех четырех исследуемых видов, которые содержат соединения близкие по составу и полярности. В процессе подбора режима хроматографирования были опробированы методики с разным режимом элюирования и временем проведения анализа. В результате были установлены оптимальные параметры, при которых наблюдалось четкое разделение пиков на хроматограммах исследуемых объектов при минимальном времени проведения анализа. Ниже представлены параметры подвижной фазы при анализе методом ВЭЖХ.

Время, мин Концентрация спирта метилового в 0,1 % водном растворе кислоты трифторухсусной, %

0—5 0—20

5—25 20—70

25—27 70—100

Общее содержание флавоноидов надземной части изучаемых видов (таблица 9) определяли по сумме хроматографических пиков, имевших характерные для флавоноидов УФ-спектры, в пересчете на стандартный образец апигенина, так как основные флавоноиды надземной части исследуемых видов представлены производными данного агликона и имеют сходные с ним УФ-спектры. Для детекции флавоноидов надземной части исследуемых объектов и апигенина была выбрана аналитическая длина волны X = 340 нм, которая является специфичной и наиболее часто используемой при анализе флавоновых соединений.

Таблица 9 - Количественное определение флавоноидов методом ВЭЖХ в надземной

части видов рода Stellaria

Надземная часть Содержание флавоноидов в пересчете на абсолютно сухое сырье, %

S. holostea 2,12±0,025

S. dichotoma 0,90+0,012

S. пет о гит 0,84+0,007

S.media 0,52±0,006

Примечание - Полученные данные представляют собой среднее значение трех параллельных определений (п=3); ± абсолютная погрешность измерения

Полученные данные о содержании флавоноидов надземной части четырех видов рода Йе//ап'а коррелируют с результатами определения антиоксидантного эффекта сухих экстрактов из них. В результате проведенных исследований антиоксидантного эффекта и количественного определения флавоноидов изучаемого сырья установили, что наибольшим антиоксидантным действием и максимальным содержанием флавоноидов среди изучаемых видов является надземная часть звездчатки ланцетовидной.

Введение нового вида лекарственного растительного сырья в медицинскую практику предусматривает не только разработку методики определения действующих веществ для оценки его качества, но и ее валидацию. В связи с этим нами были проведены исследования разработанной методики на соответствие современным рекомендациям, предъявляемым к аналитическим методикам. Валидация проводилась по следующим параметрам: линейность, правильность, сходимость, промежуточная прецизионность и устойчивость.

Для доказательства линейности методики, нами был изучен график зависимости значений оптической плотности (аналитического сигнала) от концентрации стандартного образца. Для этого навеску апигенина растворяли в спирте метиловом и аликвоты стандартного раствора пропорционально разводили спиртом метиловым и в разных концентрациях подвергали хроматографическому анализу. Линейность данной методики характеризовалась наличием прямо пропорциональной зависимости аналитического сигнала от концентрации определяемого стандартного образца (коэффициент корреляции равен 0,9994, уравнение прямой у=1561,2х - 3486,7). Эксперименты с добавками стандартного образца апигенина к аликвоте показали отсутствие систематической ошибки и правильность разработанной методики. Сходимость (повторяемость) оценивали по независимым результатам, полученным в одинаковых условиях (один и тот же исполнитель, оборудование и реактивы) в пределах короткого промежутка времени (в течение одного дня), а внутрилабораторную (промежуточную) прецизионность оценивали в условиях одной и той же лаборатории в разные дни. Относительная погрешность (ё) параллельных определений для 6 измерений составила не более 2 %.

Среди изучаемых объектов надземная часть звездчатки ланцетовидной имеет наиболее разнообразный качественный состав флавоноидов, а также самый высокий показатель их количественного содержания. В связи с этим нами была изучена динамика накопления флавоноидов в данном сырье в зависимости от времени сбора сырья. Объектами исследования служили образцы надземной части звездчатки ланцетовидной, собранные в течение вегетационного периода на территории Республики Адыгея в апреле-июле 2013 г. В результате определения количественного содержания флавоноидов установлено, что максимальное их накопление в надземной части звездчатки ланцетовидной наблюдается в фазу массового цветения, которая является оптимальной для сбора данного вида сырья (2,12+0,025).

Анализ УФ спектров основных пиков на хроматограммах извлечений из образцов сырья звездчатки ланцетовидной, собранной в разные годы, а также масс-спекгральный анализ данных пиков показал присутствие одинаковых флавоноидов - производных апигенина и лютеолина, при этом варьирует количественное соотношение некоторых компонентов (рисунок 4), а содержание флавоноидов изменяется незначительно - 2,06±0,019 (для образца, собранного в мае 2012 года) и 2,12+0,025 (образца, собранного в мае 2013 года).

Рисунок 4 - Хроматограммы извлечений из надземной части звездчатки ланцетовидной, собранной в мае 2012 (а) и 2013 (б) годов

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основные итоги проведенного диссертационного исследования сводятся к следующим основным положениям:

1. В результате общего фитохимического анализа установлено, что основными группами биологически активных веществ четырех видов рода Stellaria являются фенольные соединения. Методом ВЭЖХ-МС установлено, что доминирующими соединениями фенольного комплекса изучаемых объектов являются С-гликозиды флавоноидов -производные апигенина и лютеолина.

2. Из надземной части S. петогит впервые выделены 5 флавоноидов, являющиеся производными агликона апигенина с 2 остатками моносахаридов в форме дигликозидов и биозидов, среди них новое природное соединение - 6-С-[(а-арабинопиранозил)-(1-»2)-0-/?-ксилопиранозил] апигенина. Также в сырье данного вида обнаружен изовитексин. Кроме того, методом ВЭЖХ-МС/МС в S. петогит впервые идентифицированы и количественно определены 9 флавоноидов - производных флавона и флаванона. Из надземной части S. holostea выделены 2 флавоноида, являющиеся производными лютеолина (ориентин, изоориентин), а также впервые - 6-С-/?-глюкопиранозид диосметина и редкий флавоноид 3,5,7-тригидрокси-З ',5 '-диметоксифлавон (морелосин). Кроме того, методом ВЭЖХ-МС/МС в составе данного сырья впервые идентифицированы 9 флавоноидов (флавоны, флаваноны), из них 7 количественно определены. В надземной части S. media с помощью методов ВЭЖХ, ВЭЖХ-МС, ВЭЖХ-МС/МС впервые идентифицированы 6 флавоноидов, а в надземной части S. dichotoma - 12 флавоноидов, из которых доминирующими в сырье обоих видов флавоноидами являются С-гликозиды апигенина.

3. Методом ВЭЖХ-МС/МС изучен качественный состав и определено количественное содержание 10 изофлавоноидов во всех четырех изучаемых объектах. В результате установлено, что доминирующими соединениями во всех видах являются генистин и

генистеин. Наряду с флавоноидами этим же методом в надземной части всех растений установлено присутствие и содержание кумарина скополетина.

4. Методом ГЖХ впервые установлен качественный состав свободных моносахаридов и связанных мономеров, входящих в структуру водорастворимых полисахаридов и пектиноподобных веществ надземной части S. holostea, S. петогит и S. dichotoma.

5. Впервые методом ВЭЖХ определен качественный состав свободных аминокислот и их содержание в надземной части четырех видов звездчатки. Во всех анализируемых объектах идентифицированы по 20 аминокислот, из которых 10 относятся к незаменимым; для каждого образца определены преобладающие в составе сырья аминокислоты.

6. Методом атомной эмиссионной спектрометрии впервые определено содержание основных 6 макро- и 12 микроэлементов в траве S. holostea, S. петогит и S. dichotoma. Преобладающими макроэлементами в исследуемом сырье являются кальций, калий и магний, а микроэлементами - железо и йод. Не выявлено присутствие токсических элементов.

7. При сравнительном морфолого-анатомическом исследовании надземной части четырех видов рода Stellaria и определены диагностические макроскопические и микроскопические признаки сырья.

8. В ходе исследования острой токсичности сухих экстрактов исследуемых видов было установлено, что все экстракты относятся к классу относительно безопасных препаратов. Впервые были определены антиоксидантные свойства суммарных экстрактов изучаемых видов методом активированной хемилюминисценции, при этом наиболее высокий антиоксидантный потенциал имеют сухой экстракт S. holostea (экстрагент - 70 % спирт этиловый), а также сухой экстракт S. media (экстрагент — вода очищенная). Сравнительный анализ некоторых флавоноидных агликонов и их гликозидов, обнаруженных в изучаемом сырье, показал, что наиболее выраженный антиоксидантный эффект проявляют производные лютеолина, а гликозилирование молекулы флавона уменьшает его потенциал. Кроме того, сухие экстракты надземной части всех изучаемых видов, полученных при экстрагировании спиртом метиловым, проявляют антибактериальный эффект в отношении Staphylococcus aureus.

9. Разработана ВЭЖХ методика количественного определения суммы флавоноидов надземной части S. holostea, которая может быть рекомендована для оценки качества нового вида сырья. Определена оптимальная фаза для сбора сырья и проведено сравнительное изучение качественного и количественного состава образцов, собранных в разные годы. Проведена валидация методики на соответствие критериям линейности, правильности, сходимости, прецизионности и устойчивости.

10. На основании результатов изучения качественного и количественного состава доминирующих компонентов четырех видов звездчатки и анализа литературных данных об их биологической активности можно сделать заключение о возможности создания

фитопрепаратов с противовоспалительной, гипотензивной, противодиабетической, гепатопротективной, антиоксидангной активностью. При этом наиболее перспективным видом для комплексного исследования с оценкой фармакологической активности является сырье звездчатки ланцетовидной.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ancheeva, Е. Flavonoids from Stellaria nemorum and Stellaria holosteaf E. Ancheeva, G. Daletos, R. Muharini, W. Lin, L. Teslov, P. Proksch // Natural Product Communications. - 2015. - Vol. 10, N 3. - P. 437-4402.

2. MikSâtkovâ, P. Détermination of Flavonoids in Stellaria by High-Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry / P. MikSâtkovâ, E. Ancheeva, K. Hejtmânkovâ, L. Teslov, O. Lapiik II Analytical Letters. Taylor & Francis. - 2014. -Vol. 47, N 14. - P. 2317-23312.

3. Анчеева, Е.Ю. Элементный состав надземной части четырех видов рода звездчатка / Е.Ю. Анчеева, Л.С. Теслов // Фармация. - 2014. -№2. - С. 22-242.

4. Анчеева, Е. Ю. Сравнительный анализ состава свободных аминокислот некоторых видов рода Stellaria L. [Электронный ресурс] / Е.Ю. Анчеева // Современные проблемы науки и образования. - 2013. - Вып. 2. - Режим доступа: http://www.science-education.ni/pdf/2013/2/400.pdf2.

5. Анчеева, Е.Ю. Разработка методики количественного определения флавоноидов надземной части звездчатки ланцетовидной / Е.Ю. Анчеева, Л.С. Теслов // Сборник материалов II Всероссийской научной конференции с международным участием «Инновации в здоровье нации». - Спб., ноябрь 2014. - С. 290-293.

6. Анчеева, Е.Ю. Анализ аминокислотного состава и исследование седативного эффекта надземной части звездчатки средней / Е.Ю. Анчеева, Ю.А. Егорова // Сборник статей III Всероссийской научной конференции студентов и аспирантов с международным участием «Молодая фармация - потенциал будущего». - Спб., апрель 2013. - С. 116118.

7. Анчеева, Е.Ю. Фотохимический анализ надземной части звездчатки средней и звездчатки вильчатой / Е. Ю. Анчеева, Л.С. Теслов // Тезисы II Всероссийской научной конференции студентов и аспирантов с международным участием «Молодая фармация - потенциал будущего». - Спб., апрель 2012. - С. 5-6.

8. Анчеева, Е.Ю. Определение антиоксидангной активности сухих экстрактов, полученных из надземной части звездчатки средней / Е.Ю. Анчеева, Л.С. Теслов // Сборник материалов I Всероссийской научной конференции с международным участием «Инновации в здоровье нации». - Спб., ноябрь 2013. - С. 90-92.

9. Анчеева, Е.Ю. Фармакогностическое изучение надземной части звездчатки средней / Е.Ю. Анчеева, Л.С. Теслов // Сборник материалов Всероссийской научно-практической конференции «Беликовские чтения». - Пятигорск, декабрь 2013. - С. 26-27.

3 Статьи, опубликованные в ведущих научных рецензируемых журналах перечня ВАК

Для заметок

На правах рукописи

Анчеева Елена Юрьевна

ФОТОХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ НАДЗЕМНОЙ ЧАСТИ НЕКОТОРЫХ ВИДОВ РОДА БТЕЬЬАЫА

14.04.02 — фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Печать А. В. Пономаревой

Подписано к печати 02.04.2015.

Формат 60 х 90/16. Бумага тип. Гарнитура «Тайме». Печать ризограф. Печ. л. 1,6. Тираж 120 экз. Заказ 1363

«Изд-во СПХФА». Санкт-Петербург, ул. Проф. Попова, 14