Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Фармакогностическое изучение соссюреи горькой как источника биологически активных веществ

На правах рукописи

ПОГОДИН ИЛЬЯ СЕРГЕЕВИЧ

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ СОССЮРЕИ ГОРЬКОЙ КАК ИСТОЧНИКА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ

ВЕЩЕСТВ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

3 2014

Пермь-2014

005545105

005545105

Диссертационная работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Омская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится «25» февраля 2014 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 208.068.01 при ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 614990, г. Пермь, ул. Полевая, 2, тел./факс (342) 233-55-01.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 614070, г. Пермь, ул. Крупской, 46.

Дата размещения объявления о защите диссертации на сайте Министерства образования и науки Российской Федерации ЬЦр//\улу\у.тоаеоу.ги «Л» декабря 2013 г. Диссертация, автореферат и объявление о защите диссертации размещены на сайте ГБОУ ВПО ПГФА Ь«р/Аууууу.оГа.ш декабря 2013 г.

Лукша Елена Александровна

кандидат фармацевтических наук, доцент кафедры фармацевтической, аналитической и токсикологической химии ГБОУ ВПО «Омская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Официальные оппоненты: Федосеева Людмила Михайловна

доктор фармацевтических наук, профессор кафедры фармацевтической химии с курсом органической и токсикологической химии ГБОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Турышев Алексей Юрьевич

кандидат фармацевтических наук, доцент кафедры фармакогнозии с курсом ботаники ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 208.068.01

Н.В. Слепова

Список сокращений:

ССЦ- тетрахлорметан;

БАВ - биологически активные вещества;

БЗ — биологический запас;

БСФ - бромсульфалеин;

БХ - хроматография на бумаге;

ВЕОЗ — возможный ежегодный объем заготовки;

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография;

ГОСТ — государственный отраслевой стандарт;

ГСО - Государственный стандартный образец;

ГФ - Государственная фармакопея;

ИК - инфракрасная спектроскопия;

ИЭ - интенс-эффекгивности;

КХ - колоночная хроматография;

ЛПВП - липопротеиды высокой плотности;

JIC - лекарственное средство;

ОБ - общий белок;

ОСТ — отраслевой стандарт;

ОХ - общий холестерин;

PCO — рабочий стандартный образец;

СФ — спектрофотометр™, спектрофотометр;

ТСХ - хроматография в тонком слое сорбента;

УФ - ультрафиолетовый;

ФГ - фибриноген;

ФС - фармакопейная статья;

ЭЗС - эксплуатационный запас сырья.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. Одной из актуальных задач фармации в современном мире является поиск перспективных источников лекарственных средств растительного происхождения. По данным Всемирной организации здравоохранения, лекарственные средства растительного происхождения для лечения и профилактики различных заболеваний используют около 80 % населения (ВОЗ, 2002).

Соссюрея горькая (Saussurea amara (L.) DC.) - многолетнее травянистое растение, произрастающее на территории Сибири (Флора Сибири, 1997). В народной и традиционной медицине надземную часть соссюреи горькой используют при инфекционных заболеваниях, злокачественных новообразованиях, диарее, лихорадке, эпилепсии, ревматизме, расстройстве желудка и кровоизлияниях (Раст. ресурсы СССР, 1993). В эксперименте обнаружена туберкулоцидная, антипротозойная, противоопухолевая, антибактериальная (Макаренко, 1974; Моденова, 1983), желчегонная (Tsendayush D.et al., 2006; Glasl S., 2007) активность извлечений соссюреи горькой. Таким образом, соссюрея горькая представляет практический интерес для внедрения в медицинскую практику как источника биологически активных веществ.

Детальный обзор литературных сведений показывает, что химический состав соссюреи горькой изучен недостаточно, что затрудняет разработку методов стандартизации лекарственного сырья и препаратов и ограничивает применение данного растения в официнальной медицине.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью настоящего исследования явилось фитохимическое, морфолого-анатомическое и фармакологическое изучение соссюреи горькой для обоснования возможности внедрения в медицинскую практику в качестве источника биологически активных веществ.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. На основании изучения данных научной литературы о видах растений рода Saussurea DC., произрастающих на территории Сибири, обосновать перспективность фармакогностического изучения соссюреи горькой.

2. Провести фитохимический анализ и определить компонентный состав доминирующих групп биологически активных соединений надземной части соссюреи горькой.

3. Провести фармакологическое исследование извлечений, полученных из надземной части соссюреи горькой.

4. Провести оценку запасов сырья соссюреи горькой на территории Омской области и изучить морфолого-анатомическое строение надземной части соссюреи горькой.

5. Разработать нормативную документацию, регламентирующую качество лекарственного растительного сырья: проект фармакопейной статьи «Соссюреи горькой трава» и Инструкцию по заготовке, сушке и хранению травы соссюреи горькой.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. В результате фотохимического исследования установлен компонентный состав основных групп биологически активных веществ (БАВ) соссюреи горькой. Определено количественное содержание в растении полисахаридов, аминокислот, аскорбиновой кислоты, растительных пигментов (каротиноиды и хлорофиллы), сесквитерпеновых лактонов, флавоноидов, фенолокислот, кумаринов, дубильных веществ.

Впервые в извлечениях из надземной части соссюреи горькой, собранной на территории Сибири, методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)

идентифицировано 10 соединений фенолыюй природы: кумарины (умбеллиферон), флавоноиды (лютеолин, лютеолин-7-гликозид, апигенин, космосиин), фенолокислоты (кофейная, хлорогеновая, галловая, сиреневая, феруловая); 3 соединения терпеноидной структуры: сесквитерпеновые лактоны (гроссгемин, репин и цинаропикрин).

При проведении фармакологических испытаний извлечений из травы соссюреи горькой установлено наличие противоописторхозной и гепатопротекторной активности. В эксперименте на животных установлено, что водно-спиртовые извлечения из травы соссюреи горькой относятся к 4 классу токсичности (1ЛЭ50 > 5,0 г/кг) по степени воздействия на организм.

Для определения возможности использования соссюреи горькой в медицине впервые проведена оценка запасов сырья соссюреи горькой на территории административных районов Омской области, принадлежащих к лесостепной и степной зоне. В результате установлено, что ежегодный объем заготовки составляет не менее 40 тон травы соссюреи горькой.

На основании морфолого-анатомического исследования надземной части соссюреи горькой определены макро- и микропризнаки сырья, которые целесообразно использовать для оценки подлинности травы соссюреи горькой.

Разработаны методики качественного обнаружения и количественного определения сесквитерпеновых лактоиов в пересчете на цинаропикрин (методом ВЭЖХ); методики качественного обнаружения (методом хроматографии в тонком слое сорбента) и количественного определения флавоноидов в пересчете на лютеолин (методом дифференциальной спектрофотометрии) в траве соссюреи горькой. Определены числовые показатели, регламентирующие качество сырья. Впервые проведено изучение накопления флавоноидов и сесквитерпеновых лактонов в траве соссюреи горькой по фазам вегетации и определены оптимальные сроки заготовки сырья. Установлен срок хранения для травы соссюреи горькой.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. На основании данных фитохимического, фармакологического и товароведческого анализа разработаны:

- проект ФС «Соссюреи горькой трава»;

- «Инструкция по заготовке и сушке травы соссюреи горькой»;

- Методические рекомендации «Количественное определение флавоноидов в траве соссюреи горькой»;

- Методические рекомендации «Количественное определение сесквитерпеновых лактонов методом ВЭЖХ в траве соссюреи горькой».

СТЕПЕНЬ ВНЕДРЕНИЯ. Разработанные методические рекомендации внедрены в рабочий процесс Территориального центра по сертификации и контролю качества лекарственных средств Омской области, г. Омск, а также в учебный процесс кафедры биологической химии с курсом медицинской, фармацевтической и токсикологической химии ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В. Ф. Войно-Ясенецкого», кафедры фармакогнозии с курсами ботаники и экологии ГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет», кафедры фармации ГБОУ ВПО «Омская государственная медицинская академия». ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

- результаты фитохимического исследования надземной части соссюреи горькой;

- результаты изучения компонентного состава фенольных соединений и сесквитерпеновых лактонов надземной части соссюреи горькой;

- результаты фармакологических исследований надземной части соссюреи горькой;

- результаты морфолого-анатомических исследований с установлением диагностических признаков травы соссюреи горькой;

- методики количественного определения флавоноидов и сесквитерпеновых лактонов травы соссюреи горькой.

АПРОБАЦИЯ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ. Основные положения работы доложены и обобщены на научно-практических конференциях: Всероссийской научной конференции «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2011, 2013); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 45-летию фармацевтического факультета КГМУ (Курск, 2011); III Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы фармацевтической науки и практики» (Владикавказ, 2012); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 10-летию фармацевтического факультета ОмГМА (Омск, 2013); 1st International Scientific Conference «Science progress in European countries:new concepts and modern solutions» (Германия, Штутгарт, 2013).

СВЯЗЬ ЗАДАЧ ИССЛЕДОВАНИЯ С ПРОБЛЕМНЫМ ПЛАНОМ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ НАУК. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научных исследований ГБОУ ВПО «Омская государственная медицинская академия» Минздрав России, тематикой проблемной комиссии «Актуальные проблемы лекарствоведения в Сибирском регионе».

ЛИЧНЫЙ ВКЛАД АВТОРА. Автор принимал участие в определении цели исследования и путей ее реализации, планировании и выполнении экспериментов. Автором проводились фитохимические, морфолого-анатомические и ресурсоведческие виды исследования, анализ, статистическая обработка, научное обоснование и обобщение полученных результатов. При изучении фармакологических свойств, выполненных в соавторстве, использованы результаты исследования с долей личного участия автора 80%.

СООТВЕТСТВИЕ ДИССЕРТАЦИИ ПАСПОРТУ НАУЧНОЙ СПЕЦИАЛЬНОСТИ. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 — фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 2, 3 и 6 паспорта фармацевтическая химия, фармакогнозия.

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 9 работ, в том числе 4 статьи в изданиях Перечня ВАК.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ Материалы исследования изложены на 150 страницах машинописного текста, содержит 31 таблицу и 20 рисунков. Список литературы включает 173 источника, из них 51 на иностранных языках.

Диссертационная работа состоит из введения, шести глав, выводов, списка использованной литературы и приложений.

ОСНОВНОЕ С О ДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Характеристика объектов и методов исследования

Объектом исследования служила надземная часть растения семейства сложноцветных соссюрея горькая (Saussurea amara (L.)DC.), собранная в период с 2004 по 2012 гг. в фазу цветения на территории Новосибирской, Тюменской, Курганской и Омской областей в пределах естественного ареала. Сушку сырья производили воздушно-теневым способом.

Фотохимический состав биологически активных веществ надземной части соссюреи горькой изучали с помощью общепринятых химических (качественные реакции), физико-химических (УФ и ИК-спектроскопия), хроматографических методов (КХ, ТСХ, БХ, ВЭЖХ).

Обнаружение БАВ в надземной части соссюреи горькой методом ВЭЖХ проводили на жидкостных хроматографах Shimadzu LC-20 Prominence и HEWLETT PACKARD Agilent 1100 Series с диодно-матричным детектором и последующей компьютерной обработкой результатов анализа в программах LC Solutions и ChemStation соответственно. Хроматографическая идентификация обнаруженных БАВ проводилась в сравнении со стандартными веществами.

Спекгрофотометрические исследования проводились на приборе СФ-2000 (ОКБ «Спектр», Россия) и UNICO 2802S (UNICO, США).

Экспериментальные исследования и все манипуляции с лабораторными животными выполняли в соответствии с практическими рекомендациями «Этическая экспертиза биомедицинских исследований» (Белоусов Ю.Б., 2005), с соблюдением правил гуманного обращения с животными (Report of the AVMA Panel on Euthanasia, 2001) и «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных».

Эксперименты по изучению острой токсичности извлечений при внутрижелудочном введении выполняли на базе Института фармакологии ТНЦ СО РАМН в соответствии с Методическими указаниями по изучению общетоксического действия фармакологических веществ (Хабриев Р.У., 2005).

Противоописторхозную активность водно-спиртовых извлечений соссюреи горькой выполняли на базе Института фармакологии ТНЦ СО РАМН и кафедры фармацевтической химии Сибирского государственного медицинского университета (г. Томск) в соответствии с Методическими указаниями по изучению антигельминтной активности фармакологических веществ (Хабриев Р.У., 2005).

Исследование гепатопротекторной активности водно-спиртовых извлечений соссюреи горькой проводили на 36 крысах-самцах линии Wistar массой 180—200 г. на модели токсического гепатита (Хабриев Р.У., 2005).

Оценку сырьевой базы травы соссюреи горькой проводили общепринятыми методами. (Пименова М. Е., 2003; Белоногова В. Д. 2008).

Морфолого-анатомические исследования проводили по общепринятым методикам с помощью стереоскопического микроскопа МБС-10 и микроскопа МИКМЕД-1. Объекты фиксировали цифровым фотоаппаратом «Samsung L210» и цифровой камерой для микроскопа Levenhuk С310. Снимки обрабатывали на компьютере в программе «GIMP 2.8.».

Стандартизацию цельного и измельченного сырья проводили согласно методикам ГФ XI и ГФ XII. При разработке проекта ФС на сырье руководствовались ОСТ 91500.05.001-00 «Стандарты качества JIC. Основные положения» и Руководством по стандартизации лекарственных средств (Хабриев Р.У., 2006).

Статистическую обработку полученных результатов проводили путем расчета средней (X) и средней квадратичной ошибки (ш). О достоверности различий судили, используя параметрический (t-критерий Стьюдента) и непараметрический (Т-критерий Манна-Уитни) методы (Вершинин В. И., 2005; Смагунова А. Н., 2012). Расчеты проводили с использованием программ STATISTICA 6.0 и SPSS 12.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучение качественного и количественного состава биологически активных веществ надземной части соссюреи горькой

Химическими и физико-химическими методами было проведено изучение БАВ надземной части соссюреи горькой. Установлено присутствие 13 групп БАВ, в том числе полисахаридов (13,34±0,15 %); аминокислот (0,48±0,01 %); аскорбиновой кислоты (0,12±0,01 %); сесквитерпеновых лактонов (0,61±0,02 %); каротиноидов (1,60±0,19 мг%); хлорофиллов А и В (15,80±0,70 и 29,30±0,60 мг%); фенольных соединений (8,56±0,12 %): из них кумаринов (0,59±0,02 %), флавоноидов (2,74±0,03 %), фенолкарбоновых кислот (4,45±0,16 %), дубильных веществ (0,50±0,04 %); следы эфирного масла и тритерпеновых сапонинов; не обнаружены алкалоиды, антрагликозйды и кардиотонические гликозиды.

Количественный анализ показал, что доминирующими группами БАВ вторичного метаболизма надземной части соссюреи горькой являются фенольные соединения и сесквитерпеновые лакгоны, которые играют важную роль в фармакологической активности ряда растительных средств.

Таким образом, детальное изучение фенольных соединений и сесквитерпеновых лактонов в надземной части соссюреи горькой представляет несомненный практический интерес.

Разделение сесквитерпеновых лактонов на фракции проводили методом колоночной хроматографии на силикагеле с последующим анализом полученных фракций методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Результаты исследования представлены в таблице 1.

Таблица 1

Результаты ВЭЖХ-анализа сесквитерпеновых лактонов в надземной части соссюреи горькой

Гроссгемин tR=5,59±0,05 (min) и Репин tR=9,28±0,02 (min) Цинаропикрин tR=l 1,48±0,07 (min)

о о но wtoA^OH о

Содержание во введённой пробе, %

2,93 1,0 4,35

В результате ВЭЖХ-анализа нами были идентифицированы следующие сесквитерпеновые лактоны, относящиеся к гваянолидам - гроссгемин, репин и

цинаропикрин, из которых доминирующим является цинаропикрин.

Для изучения компонентного состава и выявления доминирующих компонентов нами было проведено классическое разделение фенольных соединений на фракции, анализ полученных фракций проводили хроматографическими методами.

Результаты качественного анализа фенольных соединений методами бумажной хроматографии и хроматографии в тонком слое сорбента представлены в табл. 2.

Таблица 2

Результаты идентификации веществ фенолыгой природы в надземной части соссюреи горькой

Название вещества Окраска в УФ-свете: Величина IV*

до проявления после проявления*

Хлорогеновая кислота (5-0-кофеил-О-хинная кислота) голубая зеленая (пары аммиака) 0,621 0,68 П 0,45 V

Цинарин (1,4-дикофеилхинная кислота) голубая усиление окраски (пары аммиака) 0,65 V

Кофейная кислота (3,4-диоксикоричная кислота) голубая усиление окраски (пары аммиака) 0,821 0,48 II . 0,9 V

Феруловая кислота (4-окси-3-метоксикоричная кислота) фиолетово-голубая фиолетовая (пары аммиака) 0,841 0,38 II 0,18 IV

Умбеллиферон (7-гидроксикумарин) голубая усиление окраски (спиртовый раствор КОН) 0,321

Апигенин (5,7,4'-триоксифлавон) бурая зелено-желтая (спиртовый раствор А1С13) 0,921 0,1211 0,32 IV

Лютеолин (5,7,3',4'-тетрагидроксифлавон) темно-коричневая желто-зеленая (спиртовый раствор А1С13) 0,851 0,10 II

Цинарозид (7-0-р-В-глюкогшранозид лютеолина) темно-коричневая желто-коричневая (спиртовый раствор А1С13) 0,57 III 0,69 IV 0,6 V

* -в скобках указаны реактивы для проявления хроматограмм

**- цифрами обозначены системы растворителей для хроматографирования

I— бутанал-уксусная кислота - вода (4:1:2) - БХ

II—15 % раствор уксусной кислоты - БХ

III—этилацетат-уксусная кислота - вода (5:1:1) - ТСХ

IV— хлороформ -метанол (8:2) - ТСХ

V—этилауетат-муравьиная кислота-уксусная кислота-вода (100:11:11:26) - ТСХ Для выявления доминирующих компонентов нами был использован ВЭЖХ-

анализ полученных фракций фенольных соединений. Результаты представлены на рисунке 1 и в таблице 3.

№

Таблица 3

Результаты ВЭЖХ-анализа фракций фенольных соединений извлечения из надземной части соссюреи горькой

Содержание во введенной пробе, % 2

^птах) НМ

Идентифицировано

кумарины

10

И

12

13

1,93

10,21

6,15

2,85

10,91

16,32

9,22

15,91

1,73 7,43

5,61

10,59

6,37

325, 267

флавоноиды

умбеллиферон

336, 267

339,263

338, 267

338, 256

349,262,251

346,267,251

348, 267, 253

фенолокислоты

космосиин

гликозид алигенина

гликозид алигенина

лютеолвн

гликозид лютеолина

цинарозид

267, 219

264,218

324,233,217

326,241,217

320,232,216

сиреневая кислота

галловая кислота

кофейная кислота

хлорогеновая кислота

феруловая кислота

В результате установлено, что флавоноиды представлены флавонами, среди которых доминирующими являются лютеолин и его гликозид - цинарозид; среди фенолкарбоновых кислот преобладают оксикоричные кислоты и основным компонентом является хлорогеновая кислота, кумарины представлены умбеллифероном.

Изучение фармакологической активности извлечений из надземной части

соссюреи горькой

В результате исследований острой токсичности водно-спиртовых извлечений соссюреи горькой на 40 % и 70 % этаноле выявлено, что образцы водно-спиртовых извлечений в соответствии с ГОСТ 12.1007-76 «Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности» относятся к 4 классу опасности - «вещества малоопасные».

Результаты скринингового исследования противоописторхозной активности водно-спиртовых извлечений соссюреи горькой представлены на рис 2.

Экстрагент - 40 % этанол

Экстрагент -70% этанол

30,и

62£5

20 30 40 50

Показатель шггенс-эффекгавноста, %

Рис. 2 Результаты оценки противоописторхозной активности водно-спиртовых извлечений соссюреи горькой

Полученные данные достоверно указывают на количественное снижение марит описторхов, что является характеристикой изучаемого фармакологического действия.

В результате исследования противоописторхозной активности было установлено, что средняя приживаемость описторхов в печени подопытных животных составила 69 %. Введение водно-спиртовых извлечений соссюреи горькой на 70 и 40 %-м этаноле приводило к дегельминтизации золотистых хомячков в разной степени: коэффициент ИЭ в 1-й группе, где животные получали водно-спиртовое извлечение соссюреи на 70 %-м этаноле, составил 62,85±4,65 %, а во 2-й группе, где животные получали водно-спиртовое извлечение соссюреи на 40 %-м этаноле — 30,11±8,85 %.

Выявлено, что противоописторхозной активностью обладает 70 % водно-спиртовое извлечение соссюреи горькой (ИЭ составляет 63 %). При этом необходимо отметить что, противоописторхозная активность 40 % спиртового водно-спиртового извлечения, является слабоэффективной (ИЭ составляет 30 %).

Для оценки гепатопротекторной активности использовали водно-спиртовое извлечение соссюреи горькой на 70 % спирте этиловом.

Введение исследуемой группе животных с острым токсическим гепатитом водно-спиртового извлечения надземной части соссюреи горькой в течение 7 дней оказывало положительное влияние на функции печени.

О снижении воспалительных процессов в органе свидетельствует уменьшение массы печени по сравнению с контролем на 19 %. Под влиянием извлечения ретенции БСФ снизилась на 55 %, продолжительность гексобарибиталового сна уменьшилась на 37 % по сравнению с данным показателем контрольной группы животных, что свидетельствует о восстановлении экскреторной и антитоксической функции печени. Полученные результаты доказывают, что извлечение из надземной части соссюреи горькой влияет на синтетическую функцию печени животных с острым токсическим гепатитом: в сыворотке крови увеличилось содержание ЛПВП на 16 %, в плазме крови количество ОБ и ФГ возросло на 8 % на 19 % соответственно.

Таким образом, полученные данные достоверно свидетельствуют, что водно-спиртовое извлечение соссюреи горькой на 70 % спирте этиловом обладает выраженным гепатопротекторным эффектом, так как под его действием осуществляется восстановление экскреторной, антитоксической и синтетической функции печени животных с острым токсическим гепатитом.

Таким образом, химико-фармакологические исследования подтвердили перспективность внедрения соссюреи горькой в медицинскую практику.

Ресурсоведческие исследования травы соссюреи горькой в Омской области

Заготовка сырья проводилась в ходе ресурсоведческих экспедиционных исследований на территории Омского, Тюкалинского, Любинского, Крутинского, Называевского, Москаленского, Марьяновского, Калачинского, Оконешниковского, Черлакского, Нововаршавского, Таврического районов Омской области в 2010-2012 гг.

Всего исследована 221 заросль соссюреи горькой на территории Омской области. Оборот заготовки устанавливался экспериментально и равен 3.

Определение запасов растительного сырья проводили на конкретных зарослях методом модельных экземпляров, результаты проведенных ресурсоведческих исследований представлены в табл. 4.

Таблица 4

Сводная опись запасов соссюреи горькой на территории Омской области

№ п/ п Адм. район Кол-во исслед. зарослей Общая площадь зарослей, га БЗ, кг ЭЗС, кг ВЕОЗ, кг

1. Омский 13 4,97 10108,9±768,9 8571,3 2857,1

2. Калачинский 15 0,24 649,9±59,9 530,23 176,7

3. Оконешниковский 32 6,47 19831,2±916,2 17998,9 5999,6

4. Черлакский 25 0,42 1737,4±113,0 1642,5 547,5

5. Нововаршавский 16 0,99 2457,1±196,8 2063,5 687,8

6. Таврический 10 1,14 2966,4±174,8 2616,9 872,3

7. Крутинский 30 6,2 36367,8±5904,6 25558,7 4207,9

8 Называевский 29 18,56 65657,9±4760,6 56136,6 18712,2

9 Москаленский 13 1,71 5294,8±296,2 4702,5 1567,5

10 Марьяновский 11 0,96 3892,9±219,5 3454,1 1151,4

11 Тюкалинский 12 1,47 3247,1±362,4 2522,4 840,8

12 1 Любинский 15 1,13 5890,1±234,8 5420,5 1806,8

Всего 221 54,52 158101,7± 13772,7 131217,8 39427,6

-------""г**-"1"* "«пуил^ ^апиншп, и шчли зрения заготовки

запасов сырья соссюреи горькой, являются: Оконешниковский и Называевский районы Омской области. Всего на территории Омской области можно заготовить около 40 тонн сырья травы соссюреи горькой.

Исследование подлинности травы соссюреи горькой

В результате макроскопического исследования были выявлены морфологические признаки травы соссюреи горькой. Сырье представляет собой смесь цельных или частично измельченных олиственных побегов длиной до 30 см. Стебли округлые ребристые, шероховатые, голые. Листья короткочерешковые или сидячие, иногда немного низбегающие, цельнокрайние 2-10 см длины, 0,15-1,5см ширины. Корзинки колокольчатые 1,5-3,0 см шириной в виде щитковидного соцветия. Обертки черепитчатые, коротко-волосистые или слегка паутинистые. Наружные листочки их короткие, ланцетные, острые или на верхушке зубчатые, средние - на верхушке расширенные в округлые, пленчатые, по краям зазубренные, придатки розового цвета; самые внутренние листочки узкие, почти без придатков. Цветоложе густопленчатое; пленки линейно-шиловидные, блестящие, неравные, до 7 мм длиной. Цветы фиолетово-розовые, пыльники белые. Придатки пыльников коротко и слабо волосистые. Цвет стеблей и листьев серовато-зеленый, запах своеобразный ароматный, вкус водного извлечения горький.

Проведенные анатомические исследования позволили выявить основные микродиагностические признаки травы соссюреи горькой. При рассмотрении микропрепаратов с поверхности листа видны клетки эпидермиса, многоугольные прямостенные, некоторые со слабо волнистым контуром. Кутикула с ясно выраженной лучисто-морщинистой складчатостью хорошо выражена на верхней эпидерме. На нижней эпидерме кутикула гладкая.

Рис. 2. Соссюрея горькая. Верхний (1) и нижний (2) эпидермис. Лучисто-морщинистая складчатость кутиткулы (3). Нитевидные волоски (4) не - нитевидные волоски. Волоски, расширенные в месте прикрепления (5) в - волоски. Железистые «булавовоидные» волоски (6) же - железистые волоски. Куполообразные железки (7) ж - железки.

Рис. 3. Эпидермис обертки (1, 2), сосочковидные выросты и простые волоски ее

Рис . 4 Эпидермис трубчатого цветка (1), с железистыми волосками (2, 3), же -железистые волоски.

На нижней эпидерме кутикула гладкая. Устьица аномоцитного устьичного типа преобладают они на нижней стороне. Волоски простые и железистые 3-х типов: нитевидные, многоклеточно-прямые и изогнутые, тупо-верхушечные, состоящие из 2-6 клеток; многоклеточные, расширенные у места прикрепления и железистые «булавовидные» волоски, состоящие из одной-двух клеток в основании и многоклеточной овальной головки, заполненной желтовато-коричневым содержимым. Железки куполообразного строения, на месте прикрепления образуют розетку (рис. 2).

Эпидермис листочков обвертки состоит из веретенообразных клеток с ровными стенками. На эпидермисе, особенно у места прикрепления много сосочковидных островерхушечных выростов. Кроме того, по краям видны простые многоклеточные тонкостенные волоски (рис. 3).

При рассмотрении трубчатых цветков с поверхности видны клетки, стенки которых изменяются от ровных до сильноизвилистых.

На трубке венчика изредка встречаются два типа трихом: железистые «булавовидные» волоски и крупные волоски, состоящие из многоклеточной ножки и шаровидной головки (рис. 4).

Для определения подлинности наряду с разделами «Внешние признаки» и «Микроскопия» нормативная документация должна содержать описание методик качественного обнаружения действующих веществ. Для разработки методики оценки подлинности нами были использованы результаты химико-фармакологического

исследования травы соссюреи горькой, которое выявило ведущую роль в проявляемой фармакологической активности двух групп БАВ, флавоноидов и сесквитерпеновых лактонов, что позволяет обосновать выбор флавоноидов и сесквитерпеновых лактонов, как групп веществ, достоверно указывающих на подлинность травы соссюреи горькой.

Разработка методик качественного обнаружения и количественного определения сесквитерпеновых лактонов в траве соссюреи горькой

Для разработки методик качественного обнаружения и количественного определения сесквитерпеновых лактонов нами был предложен метод высокоэффективной жидкостной хроматографии, одним из важных преимуществ которого является одновременное качественное обнаружение и количественное определение доминирующего сесквитерпенового лактона - цинаропикрина.

ВЭЖХ-анализ исследуемых образцов проводили на приборе Shimadzu LC-20 Prominence в изократическом режиме. Количественное содержание цинаропикрина в исследуемых образцах в процентах определяли методом сравнения с рабочим стандартным образцом (РСО) цинаропикрина, полученного методом препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Валидационную оценку разработанной методики количественного определения сесквитерпеновых лактонов проводили по показателям: специфичность, линейность, прецизионность (воспроизводимость) и точность.

Специфичность разработанной методики подтверждалась совпадением времени удерживания анализируемого компонента и РСО цинаропикрина (рис. 5, 6). Пики сопутствующих и родственных соединений, входящих в состав извлечения соссюреи горькой, хорошо разделяются с пиком цинаропикрина, время удерживания которого 11,25 мин, и не влияют на аналитическое определение.

Рис. 5. Хроматограмма рабочего стандартного образца цинаропикрина.

0,44 0,46 0,43 0,S 0,52 0,54 0,56 0,58 0,6 0,62 0,64 0,66 0,68 0,7 0,72 0,74 0,76 0,78

мг/мл

Рис. 7. Градуировочный график зависимости площадей хроматографических пиков от содержания цинаропикрина в траве соссюреи горькой.

Установлено, что в заданной области концентраций сесквитерпеновых лактонов в траве соссюреи горькой график имеет линейный характер и описывается уравнением Y=1101,97X+1,57. Коэффициент корреляции (г) равен 0,999, что позволяет использовать данную методику для количественного определения сесквитерпеновых лактонов в данном диапазоне концентраций.

Рис. 6. Хроматограмма хлороформно-эганольного извлечения (4:1) соссюреи горькой.

(цинаропикрин tR=ll,25).

Линейность и аналитическая область методики была подтверждена анализом 7 проб разных концентраций в диапазоне от 70 до 130 % от концентрации принятой за 100 %. Сравнение зависимости между содержанием цинаропикрина (мг/мл) в испытуемых растворах и величинами площадей хроматографических пиков показало, что она имеет линейный характер. Графическая зависимость отражена на графике (рис. 7).

У = 1.5723 + 1101.967-х

мВ/с

В разработанной методике величина относительного стандартного отклонения прецизионности (RSD = 1.25 %) менее 5 %, что характеризует надежность анализа в выбранных условиях.

Результаты определения точности методики показали, что теоретические и экспериментальные значения количественного содержания сесквитерпеновых лактонов в траве соссюреи горькой практически полностью совпадают. Величина относительного стандартного отклонения (RSD = 0,440 %) не превышает 5 %, а открываемость R составляет 99,76 %, что характеризует точность методики как удовлетворительную.

Установлено, что предлагаемая методика количественного определения сесквитерпеновых лактонов методом ВЭЖХ в траве соссюреи горькой является специфичной, воспроизводимой и точной, что предполагает рекомендовать данную методику для контроля качества лекарственного растительного сырья «Соссюреи горькой трава».

В соответствии с проектом ФС «Соссюреи горькой трава», содержание сесквитерпеновых лактонов должно быть не менее 0,5 %.

Разработка методик качественного обнаружения и количественного определения флавоноидов в траве соссюреи горькой

Для обнаружения флавоноидов предложен метод ТСХ, при этом для увеличения достоверности результатов нами предложено проводить сравнение с государственным стандартным образцом лютеолин-7-глюкозида (Fluka CAS 49968).

Для разработки методики количественного определения флавоноидов использовали 10 образцов сырья травы соссюреи горькой, при этом исследовали влияние на выход флавоноидов степени измельчения сырья, условий экстракции и концентрации этанола. Установлено, что максимальное количество флавоноидов извлекается из сырья при измельчении до размера частиц 1 мм. Экстрагирование флавоноидов проводили 90 % этанолом при соотношении сырья и экстрагента 1:30. Для наиболее полного извлечения флавоноидов проводить трехкратную экстракцию из сырья по 30 минут.

Для количественного определения флавоноидов в траве соссюреи горькой нами разработана методика, основанная на их способности образовывать окрашенный комплекс со спиртовым раствором алюминия хлорида, который вызывает батохромный сдвиг длинноволновой полосы поглощения и при этом в УФ-спектре наблюдается максимум поглощения при длине волны 400±2 нм. Аналогичный максимум поглощения при длине волны 400±2 нм отмечен для комплекса ГСО лютеолина (Fluka CAS 62696), использованного нами в качестве стандартного образца.

Опираясь на данные фотохимического исследования, следует отметить целесообразность введения в методику количественного определения флавоноидов стадии кислотного гидролиза флавоновых гликозидов с целью концентрирования и выделения агликонов, в частности лютеолина. Результаты ВЭЖХ-анализа показывают, что подкисление извлечения приводит к значительному увеличению выхода флавоноидов (Рис. 8, 9).

Разработанная методика количественного определения флавоноидов в траве соссюреи горькой провалидирована по показателям: линейность (Y=30,807X - 0,385, г=0,993), прецизионность (RSD=0,480 %) и точность (RSD=0,97 %)

состав подвижной фазы: ацетонитрил - вода в соотношении 30:70; температура колонки комнатная;

скорость подвижной фазы 0,5 мл/мин;

Рис. 8. Хроматограмма извлечения соссюреи горькой до проведения гидролиза пик 4- лютеолин (содержание в пробе 24,13 %); пик 16- лютеолин- 7-глюкозид (содержание в пробе 36,22 %).

состав подвижной фазы: ацетонитрил -вода в соотношении 50:50;

температура колонки - комнатная; скорость подвижной фазы 0,5 мл/мин;

Рис. 9. Хроматограмма извлечения соссюреи горькой после проведения гидролиза пик 2- лютеолин (содержание в пробе 70,21 %).

дг

**

1

I I" 1« ] \

г..........V............

«

ад

о*

Рис. 10. Спектр (видимая область) гидролизата спиртового извлечения соссюреи горькой (1) и стандартного образца лютеолина (2) после проведения реакции комплексообразования с алюминия хлоридом.

Графически линейная зависимость «оптической плотности - содержание флавоноидов» отражена на графике (рис. 11).

D

0,9 0,85 0,8 0,75 0,7 0,65 0,6 0,55 0,5 0,45 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 .0,1 0,05

0,014 0,01e 0,018 0,02 0,022 0,024 0,028 0,028 О.ЬЗ 0,032 0,034 d,Ô36 0,038 0,04 Г

Рис. 11. Градуировочный график зависимости «оптическая плотность — содержание флавоноидов» в траве соссюреи горькой.

Установлено, что предложенная методика количественного определения суммы флавоноидов в траве соссюреи горькой является воспроизводимой и точной, что предполш-ает рекомендовать данную методику для контроля качества лекарственного растительного сырья «Соссюреи горькой трава».

В соответствии с проектом ФС «Соссюреи горькой трава», содержание флавоноидов должно быть не менее 2,0 %.

Показатели доброкачественности сырья

В соответствии с требованиями ОСТ 91500.05.001-00 к структуре и перечню разделов фармакопейной статьи на лекарственное растительное сырье, установлены числовые показатели для стандартизации сырья соссюреи горькой.

Определены товароведческие показатели сырья: содержание суммы сесквитерпеновых лактонов в пересчете на цинаропикрин не менее 0,5 %; содержание флавоноидов в пересчете на лютеолин не менее 2,0 %; экстрактивных веществ, извлекаемых 70%-м этанолом не менее 20,0 %; влажность не более 10,0 %; зола общая не более 10,0 %; зола, нерастворимая в 10 % растворе кислоты хлористоводородной не более 1,0 %; частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 2 мм не более 10,0 %; других частей растения не более 0,5 %; органической примеси не более 1,0 %; минеральной примеси не более 0,5 %.

Результаты проведенных исследований использованы при разработке проекта ФС «Соссюреи горькой трава».

Обоснование времени заготовки и сроков хранения сырья «Соссюреи горькой трава»

Для обоснования времени заготовки травы соссюреи горькой было проведено изучение динамики накопления флавоноидов и сесквитерпеновых лактонов в течение вегетационного периода. Результаты, представленные на рис. 12, указывают, что максимальное содержание флавоноидов наблюдается в период массового цветения

растения, при этом содержание сесквитерпеновых лактонов возрастает в фазу бутонизации, максимальное накопление приходится на фазу цветения и постепенно снижается в фазу плодоношения.

Полученные данные использованы при разработке нормативной документации на траву соссюреи горькой, а именно «Инструкция по заготовке и сушке травы соссюреи горькой».

%з 2.5 2 1,5 1 0,5

тфя;

МЁ ■1 .,:;■

вегетация

0420

Й.650

бутонизация

цветение

0,570

плодоношение

Рис, 12. Сезонная динамика содержания флавоноидов и сесквитерпеновых лактонов в надземной части соссюреи горькой в зависимости от фазы развития (И - флавоноиды; □ - сесквитерпеновые лактоны).

Полученные результаты (Рис. 13) позволяют установить срок годности 2 года для цельного и измельченного сырья «Соссюреи горькой трава» и использованы для

разработки проекта ФС.

7............-......................................................-....................... .......-........................................._......._

3 2,5

1 0.5

5

0,58

гЬ

: »*>

Ш

(„■46

18 месяцев 24 месяца

Рис. 13. Результаты изучения сроков годности травы соссюреи горькой, (в - флавоноиды; ЕЮ] - сесквитерпеновые лактоны).

выводы

1. На основании данных литературных источников по распространенности и химико-фармакологической изученности видов рода Saussurea DC., встречающейся на территории Сибири, установлено, что наиболее перспективным растением для внедрения в медицинскую практику является соссюрея горькая (Saussurea amara (L.)

DC.).

2. Установлено, что биологически активные соединения надземной части соссюреи горькой представлены: полисахаридами 13,34±0,15%; аминокислотами 0,48±0,01 % (лизин, гистидин, аргинин, треонин, валин, метиоюш, изолейцин); аскорбиновой кислотой 0,12±0,03 %; сесквитерпеновыми лактонами 0,61±0,02 % (цинаропикрин, гроссгемин, репин); каротиноидами 1,60±0,19 мг%; хлорофиплами (А 15,80±0,70 и В 29,3±0,60 мг%); фенольными соединениями 8,56±0,12 %, из них фенолкарбоновыми кислотами и их производными 4,45±0,16 % (хлорогеновая кислота, кофейная кислота, галловая кислота, феруловая кислота, цинарин, сиреневая кислота); флавоноидами 2,74±0,03 % (апигенин, космосиин, лютеолин, цинарозид); кумаринами 0,59±0,02 % (умбеллиферон); дубильными веществами 0,50±0,04 %; следы тритерпеновых сапонинов и эфирного масла.

3. В ходе оценки неспецифической токсичности установлено, что этанольные извлечения соссюреи горькой относятся к IV классу опасности (малоопасные вещества). Результаты скрининговых фармакологических исследований извлечений соссюреи горькой показали наличие гепатопротекторной и противоописторхозной активности.

4. Определен объём возможной ежегодной заготовки травы соссюреи горькой (до 40 тонн) на территории Омской области.

5. Определены морфологические и микроскопические диагностические признаки травы соссюреи горькой. Диагностическое значение имеет форма, окраска и строение листьев, стеблей, соцветий, а также особенности обертки корзинок. Микроскопические диагностические признаки заключаются в наличии на эпидермисе листа 3 типов волосков: нитевидных; многоклеточных, расширенныхх у места прикрепления и железистых «булавовидных» волосков; встречаются «куполообразные» железки. На эпидермисе трубчатых цветков встречаются два типа трихом: железистые «булавовидные» волоски и крупные волоски, состоящие из многоклеточной ножки и шаровидной головки.

6. Разработаны методики качественного обнаружения и количественного определения флавоноидов (с применением методов ТСХ и дифференциальной спектрофотометрии) и сесквитерпеновых лактонов (с применением метода ВЭЖХ) в траве соссюреи горькой, определены числовые показатели травы соссюреи горькой.

7. Разработан проект ФС «Соссюреи горькой трава», составлен проект Инструкции по сбору и сушке травы соссюреи горькой.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Погодин, И. С. Изучение полисахаридного комплекса соссюреи горькой (Saussurea amara DC.)/ И. С. Погодин, Е. А. Лукша, В. А. Колесова / Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции // Тез. докл. науч. конф. - Пятигорск, 2011.-С.164-165.

2. Погодин, И. С. Изучение аминокислотного состава соссюреи горькой (Saussurea amara DC.) / И. С. Погодин, Е. А. Лукша // Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 45-летию фармацевтического факультета КГМУ. - Курск, 2011. - С.335-337

3. Погодин, И. С. Разработка методики количественного определения флавоноидов в траве соссюреи горькой / И. С. Погодин, Е. А. Лукша // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы фармацевтической науки и практики». - Владикавказ, 2012. - С. 207-212

4. Погодин, U.C. Фармакологическое изучение соссюреи горькой / И. С. Погодин, Е. А. Лукша // Омский научный вестник. - 2012. — № 2(114). - С.49-52.

5. Погодин, И. С. Морфолого-анатомическое исследование травы соссюреи горькой СSaussurea amara (1L)DC.) / И. С. Погодин, Е. А. Гришина, Е. А. Лукша II Медицина и образование в Сибири. - 2012. - № 6. -http://Tyww.ngmu.ru/cozo/mos/article/text full.php?id=842

6. Погодин, И. С. Оценка сырьевых запасов соссюреи горькой (Saussurea amara (L.) DC.) на территории Омской области / И. С. Погодин, Е. А. Лукша // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции / Тез. докл.. науч. конф. - Пятигорск, 2013. -С.83-84.

7. Погодин, И. С. Разработка методики количественного определения сесквитерпеновых лактонов в траве соссюреи горькой / И. С. Погодин, Е. А. Лукша // Современные проблемы иаукп и образования. - 2013. — № 1 http://elibrarv.ru/item.asp?id=18829328

8. Pogodin, I. S. Seasonal dynamics of biologically active substances in the aerial parts of Saussurea amara (L) DC / I. S. Pogodin, E. A. Luksha // 1st International Scientific Conference «Science progress in European countries:new concepts and modern solutions» Stuttgart, Germany, 2013. - P. 11-12.

9. Погодин И. С. Фенолыгые соединения надземной части соссюреи горькой ОSaussurea amara (L.) DC.) / И. С. Погодин, Е. А. Лукша // Вестник НГУ. Серия: Биология, Клиническая медицина. - 2013. - № 1. - С. 105-110.

Автор выражает глубочайшую благодарность и признательность заместителю Министра здравоохранения Омской области, начальнику управления по фармацевтической деятельности и производству лекарств Людмиле Владимировне Шукиль; заведующему лабораторией фармакологии кровообращения НИИ фармакологии СО РАМН (Томск), профессору Марку Борисовичу Плотникову; профессору СибГМУ (Томск) Ефиму Авраамовичу Краснову; старшему лаборанту гербария ТГУ имени П.Н. Крылова (Томск) Наталье Виллибальдовне Курбатской; старшему научному сотруднику лаборатории химии терпеноидов АО «МНПХ «Фитохимия» (Караганда) Ивасенко Светлане Александровне.

Погодин Илья Сергеевич (Россия)

Фармакогностическое изучение соссюреи горькой как источника биологически активных веществ

С использованием современных физико-химических (УФ и ИК-спектроскопии, бумажной хроматографии, хроматографии в тонком слое сорбента, высокоэффективной жидкостной хроматографии) и других методов аналитической химии проведен анализ веществ первичного (полисахариды, аминокислоты, аскорбиновая кислота) и вторичного (сесквитерпеновые лакгоны, каротиноиды, хлорофиллы, фенолкарбоновые кислоты, кумарины, флавоноиды) обмена надземной части соссюреи горькой. Осуществлена оценка безопасности применения (острая токсичность) и изучена специфическая (противоописторхозная и гепатопротекторная) активность водно-спиртовых извлечений из надземной части соссюреи горькой. Проведена оценка запасов травы соссюреи горькой (на примере Омской области). По результатам проведенного фармакогностического анализа, разработан проект фармакопейной статьи «Соссюреи горькой трава».

Pogodin Ilya Sergeyevich (Russian Federation)

Pharmakognostic study of Saussure amarae as a source of biologically active substances

Using modem physic - chemical (UV and IR spectroscopy, paper chromatography, thin-layer chromatography sorbent, high performance liquid chromatography ) or other methods of analytical chemistry analyzes of the primary substances (polysaccharides, amino acids, ascorbic acid) and secondary (sesquiterpene lactones, carotenoids, chlorophylls, phenol carbonic acids, coumarins, flavonoids) exchange aboveground parts Saussure amarae. The estimation of the safety of use (acute toxicity) and studied specific (antiopisthorchosis and hepatoprotective) activity of hydro-alcoholic extracts of the aerial parts Saussure amarae. The estimation of reserves Saussure amarae herbs (for example, the Omsk region). As a result of pharmakognostic analysis, drafted pharmacopoeial monograph "Saussure amarae herb".

Подписано в печать 23.12.2013 Формат 60x84/16 Бумага офсетная П. л. - 1,0 Способ печати — оперативный Тираж 100

Издательско-полиграфический центр ОмГМА 644050, г. Омск, пр. Мира, 30, тел. 60-59-08