Фармакогностическое изучение травы Leonurus japonicus Houtt

Нго, Тхи Тхань Зиэп

Диссертации по фармакологии → Фармацевтическая химия и фармакогнозия

Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Фармакогностическое изучение травы Leonurus japonicus Houtt

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Нго, Тхи Тхань Зиэп Санкт-Петербург 2008 г.

Ученая степень: кандидата фармацевтических наук

ВАК РФ: 15.00.02

Автореферат диссертации по фармакологии на тему Фармакогностическое изучение травы Leonurus japonicus Houtt

На правах рукописи

Нго Тхи Тхань Зиэп

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ТРАВЫ ¡.ЕОЫияиБ ЗАРОМСиБ Нои«.

15.00.02. - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

о 6 но:--

Санкт-Петербург 2008

003451919

Диссертационная работа выполнена в ГОУ ВПО Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации

Научный руководитель:

кандидат фармацевтических наук, доцент Жохова Елена Владимировна Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, профессор Гравель Ирина Валерьевна кандидат фармацевтических наук, доцент Половинко Андрей Евгеньевич

Ведущая организация:

Ботанический институт имени В. Л. Комарова Российской Академии Наук

Защита диссертации состоится 25 ноября 2008 г. в 1500 на заседании

Диссертационного Совета Д 208.088.01 при Санкт-Петербургской

государственной химико-фармацевтической академии по адресу: 197376, г. Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, д. 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургской

государственной химико-фармацевтической академии по адресу: 197341, г. Санкт-Петербург, пр. Испытателей, д. 14.

Автореферат разослан 24 октября 2008 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета,

кандидат фармацевтических наук

Марченко Н. В.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Лекарственные растения занимают важное место в фармацевтической практике. В общей номенклатуре лекарственных средств приблизительно 40% составляют препараты растительного происхождения. По сравнению с синтетическими, растительные препараты, наряду с мягким многосторонним действием характеризуются, как правило, почти полным отсутствием нежелательных побочных эффектов. Изучение и внедрение в научную медицину новых растительных объектов стали одними из самых актуальных задач современной фармакогнозии.

Многие растения семейства губоцветные - Lamiaceae {Labiatae) обладают широким спектром биологической активности и используются как в научной, так и в народной медицине. К числу таких представителей принадлежат виды рода пустырник - Leonurus L.. Во многих видах этого рода были обнаружены различные группы биологически активных веществ: флавоноиды (рутин, генкванин, кверцетин), дубильные вещества, сапонины, азотсодержащие соединения (леонурин, стахидрин) [Дикорастущие полезные растения России, 2001; Растительные ресурсы, 1991]. Разные виды рода пустырник являются официнальными и включены в Национальные Фармакопеи многих стран мира. В Российскую Фармакопею XI издания включены пустырник сердечный (Leonurus cardiaca L.) и пустырник пятилопастный {Leonurus quinquelobatus Gilib.). Во Вьетнамскую и Китайскую Фармакопеи включен другой вид - пустырник японский (Leonurus japonicus Houtt.) [Китайская Фармакопея, 2000; Вьетнамская Фармакопея, 2002]. Причем официнальные на территории России виды пустырника известны своим выраженным седативным действием (в 2-3 раза сильнее, чем у настойки валерианы), a L. japonicus применяется в китайской и вьетнамской медицине как средство, нормализующее регулы, родовспомогательное, укрепляющее миометрий после родов. Фармакологическими исследованиями за рубежом выявлены также гормоноподобное, противоопухолевое, антимикробное, противовоспалительное и антиоксидантное действия L. japonicus (Chinwala, 2003; De Souza et al., 2004; Do, 2004; Sun, et al., 2005; Yang, 2002).

В России L. japonicus произрастает на территории Хабаровского и Приморского края, где является преобладающим среди других видов рода Leonurus L. (Крестовская Т. В., 1987, 1989; Пробатова Н. С., 1995; Куприянова

Л. А., 1954; Черепанов С. К., 1995). По данным зарубежных исследователей Ь ]аротсш имеет очень богатый набор биологически активных соединений, исследуемых в настоящее время в Японии, Китае и Вьетнаме. Но до сих пор стандартизация сырья Ь. )аротст во Вьетнаме проводится лишь по содержанию экстрактивных веществ, что мало отражает качество сырья в общем. Поэтому актуальными являются разработка нового современного метода стандартизации сырья, а также изучение данного вида с целью введения его в научную медицину России. Для этого следовало решить целый ряд задач, чему посвящена настоящая диссертационная работа.

Работа выполнена на кафедре фармакогнозии Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии в соответствии с научным направлением «Изыскание и изучение биологически активных веществ синтетического, микробного и растительного происхождения для создания на Их основе импортозамещающих оригинальных отечественных лекарственных субстанций» и тематическим планом научно-исследовательских работ СПХФА по теме «Мониторинг перспективных лекарственных растений флоры России». Исследования с использованием приборных хроматографических и спектроскопических методов выполнены в лаборатории аналитических методов НИУ академии и лаборатории экологии растительных сообществ Ботанического института им. В. Л. Комарова РАН.

Цели и задачи исследования. Целью данного исследования является проведение фармакогностического изучения и стандартизация травы Ь. аротсш.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• Провести фотохимический анализ надземной части Ь. ]аротсш и сравнительное изучение надземной части X. ¿аротсиз и Ь. quinquelobatus.

• Установить основные группы биологически активных веществ, разработать методики их количественного определения, провести исследование динамики накопления действующих веществ в надземной части Ь. ]аротсш.

• Выделить и установить структуру основных биологически активных веществ.

• Установить макро- и микроскопические признаки сырья Ь. ]аротсш.

• Провести товароведческий анализ для установления норм качества лекарственного растительного сырья.

• Обобщить полученные данные и на их основе разработать проект нормативного документа на траву Ь. ¡аротсш.

• Изучить возможность интродукции Ь. ¡аротсш в Ленинградской области.

Научная новизна. Впервые было проведено сравнительное фитохимическое изучение Ь. ¡аротсш и Ь. дшпдиеЬЬшт, а также сырья X. ¡аротсш, заготовленного в разных географических зонах. Проведено сравнительное изучение надземной части Ь. уаротсш и Ь. дшпдиеЬЬаШ, в результате которого было показано их различия по качественному, а также количественному содержанию таких биологически активных веществ как фенольныс кислоты, флавоноиды и терпеноиды. Изучен компонентный и мономерный состав, динамика накопления биологически активных веществ (БАВ) в разные фазы вегетации растения. Выделен и изучен комплекс флавоноидов, содержащийся в траве Ь. ]аротсш, впервые выделен и идентифицирован флавоноид генкванин 4'-глюкозид. Впервые изучен состав стероидных соединений надземной части Ь. ¡аротсш. Выделены и идентифицированы 5 стероидных соединений: [З-ситостерол, стигмастерол, 22,23- дигидроспинастерон, стигмаст-4-ен-З-он и кампестерол, причем три последних соединения выделены и идентифицированы впервые. Впервые выделены и идентифицированы 5 тритсрпеновых соединений из надземной части Ь. ¡аротсш (луп-20(29)-ен-3-он; олеан-12-ен-З-ой; урсан-12-ен-З-он; урсан-9(11),12-диен-3-он; а-амирин). Определен состав фенольных кислот, липидов, мономерный и компонентный состав полисахаридов. Определен набор макро- и микроэлементов Ь. }аротси$. Изучена возможность выращивания Ь. ¡аротсш в Ленинградской области.

Практическая значимость. Предложены методики количественного определения суммы флавоноидов в траве Ь. ¡аротсш и Ь. дшщиеЪЪагш. Модифицированная методика количественного определения суммы флавоноидов в траве Ь. дищиеЬЬаШя введена в практику научных исследований растительных объектов и учебного процесса на кафедре фармакогнозии СПХФА. Разработанная методика количественного определения суммы терпеноидов в надземной части Ь. ¡аротсш и Ь. дшщие1оЪа1ш может быть использована при анализе других видов растительного сырья. Данные о

фотохимическом составе, полученные в результате проведенных исследований, могут быть использованы при целенаправленном создании новых фитопрепаратов из травы Ь. аротсш, а также для введения растения в научную медицину России. Определены сроки и оптимальная фаза вегетации для заготовки сырья, а также предельный размер сырьевой части, подлежащей заготовке. Разработаны критерии, позволяющие установить подлинность сырья - травы Ь. ]аротсш, определены показатели его доброкачественности. Результаты работы использованы при разработке проекта ФСП на предлагаемый новый вид лекарственного сырья «Пустырника японского трава».

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на: конференции, посвященной 40-летию основания фармацевтического факультета Рязанского государственного университета имени академика И. П. Павлова «Актуальные проблемы фармации» (Рязань, 2006 г.); 62-й региональной конференции по фармации и фармакологии (Пятигорск, 2007 г.); региональной научной конференции студентов и аспирантов «Молодые ученые - практическому здравоохранению» (Санкт-Петербург, 2007 г.); 63-й региональной конференции по фармации и фармакологии (Пятигорск, 2008 г.); Щ международном форуме « Интегративная медицина» (Москва, 2008 г.); XII съезде русского ботанического общества «Фундаментальные и прикладные проблемы ботаники в начале XXI века» (Петрозаводск, 2008 г.).

Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 9 научных работах, в том числе 3 статьи опубликованы в журналах, входящих в «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов, рекомендованных ВАКом».

Основные положения, выносимые на защиту.

• Результаты общего фотохимического изучения надземной части Ь. _/аротсш.

• Результаты изучения состава липидов надземной части Ь ]аротсш.

• Результаты сравнительного изучения полифенольного комплекса из надземной части Ь. ]аротсш и Ь. дищиеЬЬаШя: анализ фенольных кислот и флавоноидов; выделение, установление структуры и изучение динамики накопления.

• Результаты изучения полисахаридов из надземной части L. japonicus и L. quinquelobatus: выделение, качественный и количественный анализ водорастворимых полисахаридов; выделение и изучение состава пектиновых веществ и гемицеллюлоз.

• Содержание Р-ситостерола в траве L. japonicus и L. quinquelobatus. Определение общего содержания терпсноидов в сырье.

• Выделение и установление структуры некоторых стероидных и тритерпеновых соединений из надземной части L. japonicus.

• Содержание макро- и микроэлементов в траве и в отдельных частях (листья, стебля, плоды) L japonicus.

• Результаты товароведческого анализа сырья «Пустырника японского трава» и его стандартизация.

• Результаты изучения возможности интродукции L. japonicus в Ленинградской области.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 173 страницах машинописного текста, иллюстрирована 57 рисунками и 38 таблицами. Диссертация состоит из введения, 5 глав (обзор литературы, материалы и методы, и 3 главы, содержащие результаты экспериментальных исследований), обсуждения результатов, выводов, списка литературы, включающего 150 источников, из них 68 на иностранных языках и 2 приложений.

Во введении сформулированы актуальность темы, цель и задачи исследования, научная новизна, практическая значимость работы. В первой главе представлен обзор литературы, в котором рассмотрены ботанико-географическая характеристика, химический состав и биологическая активность всех видов рода Leonurus. Во второй главе приведены основные использованные материалы и методы исследований. В третьей главе приведены результаты фотохимического, элементного анализа надземной части L. japonicus и L. quinquelobatus. В четвертой главе отражены результаты разработки показателей подлинности и качества травы пустырника японского. В пятой главе приведены результаты изучения возможности интродукции L. japonicus в Ленинградской области. В разделе «Обсуждение результатов» обобщены полученные теоретические и экспериментальные данные, обосновывающие необходимость и объективность проведенных исследований. В разделе «Основные результаты и выводы» приведены заключительные выводы

по проделанной работе. Приложение 1 - Проект ФСП на сырье «Пустырника японского трава». Приложение 2 - Акт внедрения методики количественного определения суммы флавоноидов в траве пустырника пятилопастного.

2. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты исследований

Основными объектами исследований являются образцы надземной части L. japónicas, заготовленные в 2005, 2006, 2007 годах в разные фазы вегетации в Северном и Южном Вьетнаме, в Ленинградской области, а также в Южном Китае (только фаза бутонизация). Образцы надземной части L. quinquelobatus (используемые в качестве объекта для сравнения) заготовлены в разные фенофазы в 2006 году на питомнике лекарственных растений СПХФА (Ленинградская область), а также в фазы бутонизации и начала плодоношения в 2007 году в Новгородской и Свердловской областях.

Фитохимическое изучение пустырника японского

Качественные фитохимические исследования установили, что основными группами биологически активных веществ пустырника японского являются флавоноиды, фенольные кислоты, стероидные и тритерпеновые соединения, азотсодержащие соединения, дубильные вещества, липиды, полисахариды, сапонины. Кроме того, присутствуют незначительные количества эфирного масла и иридоидов. Не обнаружены кумарины, кардиотонические гликозиды и антраценпроизводные.

Из надземной части L. japonicus и L. quinquelobatus был выделен комплекс азотсодержащих соединений. Разделение этого комплекса осуществлено с помощью хроматографии в тонком слое сорбента (ТСХ). Установлено, что состав азотсодержащих соединений образцов L. japonicus и L. quinquelobatus сходный. Далее был проведен газовый хромато-масс-спектрометрический (ГХ/МС) анализ на системе «Agilent 6890 N 5975 С», состоящей из газового хроматографа 6890N и масс-селективного детектора 5975С. Условия хроматографического разделения следующие: капиллярная колонка DB-5MS (5% дифенил и 95% диметилполисилоксан, толщина фазы 0,25 мкм) размером 30 м - 0,25 мм. Газ-носитель - гелий (1 мл/мин -постоянный расход). Деление потока 1:10. Начальная температура термостата

колонки - 40°С; программирование температуры - от 40 до 280°С со скоростью 6°С/мин. Выдержка при конечной температуре - 50 мин. Температура источника ионов - 230°С, интерфейса - 280°С. Идентификация соединений осуществлялась путём сравнения их масс-спектров с данными библиотек спектров. Результаты анализа подтвердили, что основным компонентом суммы азотсодержащих соединений в исследуемых образцах Ь. ]аротст и Ь. дищие1оЬаШ является стахидрин.

При изучении качественного состава дубильных веществ Ь. ]аротст установили, что преобладают конденсированные дубильные вещества. При определении количественного содержания данной группы веществ в образцах надземной части Ь. ]аротст и Ь. quinquelobaíus методом перманганатометрии обнаружили, что содержание дубильных веществ немного возрастает в зависимости от фенофазы растения, достигая максимального количества в фазе плодоношения, и почти не зависит от географического местонахождения. Содержание дубильных веществ составляет в среднем около 3-6% (табл. 1).

Таблица 1 - Содержание дубильных веществ в пересчете на танин в надземных частях Ьеопигт]аротст и Ьеопигт quinquelobatus

Вид Место сбора Фаза вегетации Содержание дубильных веществ, %

Ь.]аротсш Северный Вьетнам Бутонизация 2,84

Южный Вьетнам Цветение 3,81

Южный Китай Бутонизация 3,01

Лен. область Цветение 4,39

Лен. область Плодоношение 4,77

Ь. quinquelobatus Лен. область Цветение 4,84

Лен. область Начало плодоношения 5,56

Изучение состава липидов в образцах надземной части Ь. ¡аротст методом ГХ/МС показало, что он представлен сложными эфирами различных ненасыщенных (линолевая, а-линоленовая) и насыщенных (адипиновая, пальмитиновая, лауриновая, арахиновая, стеариновая, миристиновая, лигноцериновая, пентадекановая, себациновая, нонадекановая) жирных кислот, в основном с метиловым и этиловым спиртами. Выделенные эфиры жирных

кислот, их время удерживания и степени достоверности идентификации представлены в таблице 2.

Таблица 2 — Идентифицированные жирные кислоты из надземной части Ьеопигш¡аротст и их характеристики

№ п/п Жирная кислота Эфир Время удерживания, мин Степень достоверности (%)

1 линолевая метиловый 34,61 99

этиловый 35,87 99

2 а-линоленовая метиловый 34,74 99

этиловый 36,02 99

3 адипиновая бис-2- этилгексиловый 39,83 91

4 арахиновая метиловый 38,65 95

этиловый 39,75 94

5 лауриновая ундециловый 40,91 86

6 лигноцериновая метиловый 44,79 93

7 миристиновая - 32,44 94

8 нонадекановая этиловый 38,11 93

9 пальмитиновая метиловый 31,43 98

этиловый 32,82 98

10 пентадекановая этиловый 30,80 91

11 себациновая диэтиловый 18,68 91

12 стеариновая метиловый 35,19_____ 96

этиловый 36,45 99

Испытание на наличие сапонинов осуществлено с помощью реакции ценообразования в кислой и щелочной среде. ТСХ-анализ в системе растворителей хлороформ - метанол - вода (65:35:10) позволил установить, что надземные части Ь. ¡аротст и Ь. дищие1оЬаШ5 имеют довольно сходный состав сапонинов, который включает не менее 3 соединений (табл.3).

Таблица 3 — Результаты тонкослойио-хроматографического анализа сапонинов надземных частей Ьеопигш]аротсш и Ьеопигш дшпдие1оЬа1ш (визуальная оценка)

Объект Место сбора Значение ЯГ

0,92 0,83 0,71 0,53

Ь. ]аротсш Южный Вьетнам + + + -

Южный Китай + + + -

Ленинградская область + + + +

Ь. цшщие\оЪаЫ$ Ленинградская область + + + +

Примечание + - окраска пятна после проявления хроматограммы четко выражена, + - окраска пятна плохо выражена; прочерк означает, что соединение не обнаружено (пятно отсутствует на хроматограмме)

Исследование фенольного комплекса Ь. }аротсих и Ь. цшщиеЬЬаШ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) показало, что в образцах надземной части Ь. }аротсш, собранных в Южном Вьетнаме, содержится около 19 фенолышх кислот, из которых 5 было идентифицировано в следовых количествах: хлорогенновая, ванилиновая, и-оксикоричная, кофейная и феруловая. В образцах из Южного Китая содержится около 23 фенольных кислот, из которых 5 было идентифицировано в следовых количествах: хлорогеновая, ванилиновая, п-оксикоричная, и-оксибензойная и феруловая, не обнаружено наличие кислоты кофейной (рис. 1 и табл. 4).

Рис. 1 - Хроматограмма, полученная при ВЭЖХ-исследовании спиртового извлечения из надземной част и I. }аротси$ (Южный Китай)

Примечание Цифрами обозначены пики, соответствующие неидентифицированным соединениям

Таблица 4 - Компонентный состав фенольных кислот (в %, в пересчете на абсолютно-сухое сырье) Ьеопигш]аротсш и Ьеопигш цшщие1оЬа1ж

Фенольная кислота Вид пустырника, место сбора и фенофаза

Ь. ¡аротсиъ Ь дищие1оЬа[ш

Южный Вьетнам Южный Китай Лен. область Лен. область

цветение бутонизация бутонизация цветение

хлорогеновая 0,04 0,01 0,10 -

кофейная 0,03 - 0,02 0,16

ванилиновая 0,03 0,01 0,02 0,02

сиреневая - - 0,07 -

п-оксикоричная 0,08 0,09 0,42 0,77

феруловая 0,08 0,05 0,14 0,16

вератровая - - 0,01 -

п-оксибензойная - 0,05 - -

В надземной части Ь. ]аротст, выращенного в Ленинградской области, отмечается четкое повышение содержания фенольных кислот, обнаружено около 25 фенольных кислот, из которых 7 идентифицированы (кофейная, ванилиновая, сиреневая, и-оксикоричная, феруловая, вератровая и хлорогеновая), в том числе содержание кислоты и-оксикоричной достигает более 0,4% (см. табл. 4). 4

Определение количественного содержания фенольных кислот в надземной части образца Ь. }аротсш из Южного Вьетнама показало, что фенольные кислоты присутствуют в незначительном количестве во всех органах Ь. уаротсш, особенно в стеблях.

Иная картина в качественном и количественном содержании фенольных кислот наблюдалась у Ь. дшщиеЬЬМш. Обнаружено около 21 фенольной кислоты, из них 4 идентифицировано в достаточно высоких количествах (кофейная, ванилиновая, и-оксикоричная, феруловая). Доминирует кислота и-оксикоричная и её содержание доходит до 0,8 % (рис. 2 и табл. 4).

извлечения из надземной части L. quinquelobatus.

Примечание. Цифрами обозначены пики, соответствующие неидентифицировашшм соединениям.

Для образцов L. japónicas проводили изучение элементного состава. Установлено, что содержание токсичных элементов во всех образцах сырья не превышает предельные допустимые концентрации (ПДК), принятые для чая. Содержание марганца, цинка и меди достаточно высокое, что подтверждает результаты, полученные китайскими исследователями, и также сопоставимо с данными литературы по составу микроэлементов для другого вида рода - L. cardiaca L..

При определении динамики накопления БАВ установлено, что максимальное содержание экстрактивных веществ наблюдается в фазе бутонизации (для сырья, собранного в Ленинградской области - 34,93±1,01%) с использованием в качестве экстрагента 70%-ного спирта этилового. Содержание экстрактивных веществ в листьях - 36,44+1,51%, в стеблях -10,46±0,94%. По полученным результатам было предложено рекомендуемое значение сырьевой части с длиной стеблей 20 см.

Методом бумажной хроматографии (БХ) устанавлено наличие в надземной части L. japonicus около 13 флавоноидов. С использованием методов хроматографии (тонкослойной, колоночной, препаративной) и УФ-спектрофотометрии из полифенольного комплекса, выделенного из надземной части L. japonicus, были изолированы и идентифицированы 5 флавоноидов:

кемпферол, генкванин 4'-глюкозид, кверцитрин, гиперозид и рутин, причем генкванин 4'-глюкозид выделен и идентифицирован впервые.

Для оценки количественного содержания флавоноидов в сырье были разработаны дифференциальные спектрофотометрические методики. Установлены следующие параметры: стандартный образец - рутин (для Ь. ¡аротсш) и цинарозид (для Ь циищпе1оЪаЫ$)\ аналитическая длина волны -410 нм (для Ь. ¡аротсш) и 400 нм (для Ь. цитцие1оЬаЫ5)\ комплексообразователь - 1% раствор алюминия хлорида; измельченность сырья - 1 мм; экстрагент - 70%-ый спирт этиловый; соотношение сырья: экстрагента - 1:100; время экстракции - 120 мин.

С использованием разработанных методик были определены суммы флавоноидов в надземной части Ь. ]аротсш и Ь. дищиеЬЬа¡ш. Результаты показали, что содержание флавоноидов в надземной части Ь. /аротсш зависит от географического места произрастания, а также от фазы вегетации, и колеблется от 0,8% (фаза плодоношения - сырье из Южного Вьетнама) до 4,6% (фаза бутонизации - сырье из Ленинградской области) (табл. 5).

Таблица 5 - Результаты количественного определения суммарного содержания флавоноидов в надземной части Ьеопигш jаротсш

№ Место сбора Дата сбора Фаза вегетации Содержание флавоноидов, %

1 Лен. область 09.2006 Активный рост 2,76 ±0,04

2 Южный Китай 06.2006 Бутонизация 1,63 ±0,03

3 Сев. Вьетнам 06.2006 Бутонизация 1,73 ±0,03

4 Лен. область 08. 2007 Бутонизация 4,56 ±0,06

5 Лен.область 09.2007 Цветение 3,86 ±0,06

6 Южный Вьетнам 07.2006 Плодоношение 0,81 ± 0,01

7 Лен. область 10.2007 Плодоношение 1,38 ±0,02

Содержание флавоноидов в надземной части Ь. дшщиеЬЬаШ ниже и незначительно изменяется в зависимости от места сбора и фазы вегетации, составляя 0,8 - 1,4% (табл. 6).

Таблица 6 - Результаты количественного определения суммарного содержания флавоноидов в надземной части Ьеопигш дитдиеЬЬМш

№ Место сбора Дата сбора Фаза вегетации Содержание флавоноидов, %

1 Лен. область 06. 2006 Цветение 1,01± 0,02

2 Лен. область 08. 2006 Плодоношение 1,37 ±0,02

3 Нов. область 08. 2007 Бутонизация 0,94 ± 0,02

4 Нов. область 08.2007 Плодоношение 0,76 ±0,01

5 Сверд. область 08. 2007 Цветение 1,03 ±0,02

Из воздушно-сухого сырья были выделены свободные сахара и полисахаридные комплексы по схеме, представленной на рис. 3,

Рис. 3 - Схема получения полисахаридов 15

Полисахаридные комплексы представлены водорастворимыми полисахаридами (ВРПС), пектиновыми веществами (ПВ) и гемицеллюлозами (ГМЦ-А и ГМЦ-Б). Мономерный состав выделенных фракций моносахаридного комплекса определяли с помощью бумажной и газожидкостной хроматографии. В гидролизатах ВРПС образцов Ь. ¡аротст были идентифицированы: глюкоза, галактоза, манноза, рамноза, арабиноза, фукоза и галактуроновая кислота, причем глюкоза является доминирующим компонентом. ВРПС из Ь. цшщие\оЪаШ$ имеет главный компонент моносахар - арабинозу, кроме того, в составе гидролизата присутствует ещё ксилоза и незначительное количество ггаокуроновой кислоты (табл. 7).

Таблица 7-Мономерный состав водорастворимых полисахаридов, выделенных из сырья Leonurus japonicus и Leonurus quinquelobatus

Образцы Мономерный состав, %

Ara Rha Gal Glc Man Fue Xyl GalA GlcA

1 10,0 5,06 0,15 36,9 6,30 0,81 - 15,2 -

2 7,64 7,51 2,11 21,2 11,5 7,58 - 18,5 -

3 24,6 6,92 5,26 10,2 12,5 5,81 3,49 12,2 2,27

Примечание- 1 - L japonicus из Южного Китая; 2 - L. japonicus из Южного Вьетнама; 3-1 quinquelobatus из Ленинградской области; Glc - глюкоза, Ara - арабиноза, Gal - галактоза, Rha - рамноза, Man - манноза, Fue -фукоза, Ху1 - ксилоза, GlcA - глюкуроновая кислота, GalA - галактуроновая кислота; прочерк означает отсутствие компонента.

Содержание суммы водорастворимых полисахаридов в сырье определяли фенолсерным методом. Результаты показали, что это значение у Lü japonicus и L. quinquelobatus почти сходное. Независимо от места произрастания, содержание водорастворимых полисахаридов находится в пределах 1,6 - 3,6%.

Образцы L. japonicus и L. quinquelobatus имеют разное по значению количественное содержание мономерных единиц пектиновых веществ. Основными нейтральными остатками моносахаров в образцах L. japonicus являются рамноза и арабиноза. Помимо этих моносахаров присутствуют галактоза, глюкоза, фукоза и ксилоза, но в меньших количествах. В составе пектиновых веществ L. quinquelobatus присутствуют в большом количестве арабиноза, глюкоза, рамноза, галактоза и манноза, а фукоза и ксилоза обнаружены в незначительных количествах. Содержание уроновых кислот в

образцах Ь. }аротсш составляло около 85%, что значительно больше, чем у Ь. цшщие1оЪа1ж (67%).

Все образцы геммицеллюлозы содержат очень малое количество уроновых кислот. Образцы гсмицеллюлоз, выделенные из Ь. цшщие1оЪа1ж, содержат большие количества ксилозы (ксиланы). ГМЦ-В, выделенная из Ь. ]аротси$, имеет в составе фукозу в преобладающем количестве.

Для установления присутствия Р-ситостерола в надземной части Ь. ]аротсш и Ь. дшщиеЬЬаШя проводили ТСХ-анализ хлороформного извлечения из сырья. В качестве свидетеля использовали раствор стандартного образца Р-ситостерола. Для определения количественного содержания (3-ситостерола в сырье использовали метод депситометрии. Полученные результаты свидетельствовали о высоком содержании Р-ситостерола в надземной части Ь. ]аротсш (табл. 8).

Таблица 8 - Содержание р-ситостерола в надземной части Ьеопигив ]аротсш и

Ьеопигия дшпдие1оЬаШя

№ Место сбора Фаза вегетации Содержание Р-ситостерола (%)

1 Ленинградская область Активный рост 0,32 ± 0,04

2 Ленинградская область Бутонизации 0,26 + 0,03

3 Южный Китай Бутонизации 0,21 + 0,03

4 Северный Вьетнам Бутонизации - 0,20 + 0,02

5 Южный Вьетнам Цветение 0,15 + 0,01

6 Ленинградская область Цветение 0,10 ±0,01

Примечание: Образцы 1, 2, 3, 4, 5 - Ь /аротсиз, образец б -1. цщгщиеЬЬаЬа, расчеты проводили в пересчете на абсолютное сухое сырье.

Для разработки методики количественного определения суммы терпеноидов использовали аналитическую длину волны 535 нм, так как при данной длине волны максимумы поглощения хлороформного извлечения из сырья и хлороформного раствора Р-ситостерола после реакции с 1% раствором ванилина в кислоте уксусной ледяной и кислотой серной концентрированной совпадают (рис.4).

0,0 Н-1 ■ I-1-1-—

450 500 550 600 650 700 Длина волны, нм

Рис. 4 - Спектры окрашенных растворов после реакции с 1% раствором ванилина и кислотой серной концентрированной

Примечание' 1- раствор стандартного ß-ситостерола; 2 - хлороформное извлечение из L japonicus.

Суммарное содержание терпеноидов в сухом сырье вычисляли по калибровочному графику, построенному по ß-ситостеролу. Относительная ошибка методики составляла 4,7%. Результаты количественного определения суммы терпеноидов представлены в табл. 9.

Таблица 9 - Результаты определения содержания суммы терпеноидов в надземной части Ьеопигш ]'аротсш и Ьеопигиз дищиеЬЬШш

№ Место сбора Дата сбора Фаза вегетации Содержание терпеноидов(%)

1 Лен. область 09.2006 Активный рост 5,39 ±0,15

2 Лен. область 09.2006 Начало бутонизации 4,98 ±0,15

3 Южн. Китай 06.2006 Начало бутонизации 3,73 ± 0,12

4 Сев. Вьетнам 06.2006 Начало бутонизации 3,96 ±0,14

5 Лен. область 09.2007 Бутонизация 5,46 ±0,16

6 Лен. область 09.2007 Начало цветения 6,39 ±0,18

7 Южн. Вьетнам 07.2006 Массовое цветение 3,28 ±0,12

8 Лен. область 10.2007 Плодоношение 4,73 ±0,15

9 Лен. область 08.2006 Массовое цветение 2,78 ±0,11

Примечание: 1 -8 - образцы Ь ¡аротсиз, 9 - образец I. ^шгауие/обали; расчеты проводили в пересчете на абсолютное сухое сырье.

Из воздушно-сухого сырья после экстракции хлороформом и гексаном был выделен липофильный комплекс, содержащий сумму терпеновых соединений. Методом колоночной хроматографии проводили разделение суммы терпеновых соединений на фракции по схеме, представленной на рисунке 5.

Рис. 5. - Схема выделения и разделения терпеноидов

Примечание- Г - гексан; ГЭ - смесь гексана и этилацетата; ФР - фракции.

В результате анализа фракций методом ТСХ и ГХ/МС впервые установили присутствие в надземной части Ь. ]аротсив 5 тритерпеновых соединений (луп-20(29)-ен-3-он; олеан-12-ен; урсан-12-ен; урсан-9(11), 12 диен-3-он; а-амирин), а также 3 из 5 стероидных соединений (22,23-дигидроспинастерон; стигмаст-4-ен-З-он; кампестерол). Основной компонент фракции 13 - р-ситостерол определен методом ТСХ с использованием свидетеля - ГСО |3-ситостерола и подтвержден ГХ/МС анализом.

Степень достоверности идентификации соединений методом ГХ/МС представлена в таблице 10.

Таблица 10 - Степень достоверности масс-спектров (МС, %) идентифицируемых

терпеновых соединений

№ п/п Название соединений № фракции Время удерживания, мин МС, %

1 луп-20(29)-ен-3-он 7 54,23 93

2 олеан-12-ен-З-он 7 54,61 86

3 урсан-12-ен-З-он 7 55,91 97

4 22,23-дигидроспинастерон 7 56,59 93

5 стишаст-4-ен-З -он 8 57,74 95

6 урсан - 9(11), 12 диен - 3-он 8 52,48 93

7 Р-систостерол 13 54,41 87

8 кампестсрол 13 52,28 99

9 стигмастерол 13 52,98 99

10 а-амирин 14 56,17 99

Кроме этих веществ, ГХ/МС-анализом фракций 1, 2, 6 установили, что в них присутствует богатый комплекс терпеноидов, в состав которого входят: мопотерпены (апиол, а также борнеол, камфора, камфен, анетол, тимол, эвгенол -в следовых количествах); сесквитерпены (азулен, кариофиллен и их производные, лонгифолен).

Установление показателей подлинности и качества травы пустырника японского

При изучении микроскопических признаков различных частей сырья пустырника японского было выявлено, что препараты с поверхности листьев, чашелистиков чашечки и стебля имеют сходное строение по типу устьиц (аномоцитный) и наличию эфирномасличных железок, причем верхняя сторона листовой пластинки отличается от нижней отсутствием устьиц и эфирномасличных железок. На поверхности листа, стебля и чашечки встречаются волоски двух типов: кроющие - простые одно-, многоклеточные волоски и железистые - головчатые волоски с одно- (реже двух-) клеточной ножкой и одно-, двухклеточной головкой. Трехклеточные волоски обнаружены

только на поверхности стебля, в основном в области ребер, а на поверхности чашечки и листьев обнаружены только одно- и двухклеточные волоски (на нижней поверхности листа по жилкам изредка можно встретить трехклеточные коленчато-согнутые с бородавчатой кутикулой). Для стебля характерно переходное строение, пучки открытые коллатеральные. Четыре крупных пучка располагаются в ребрах, четыре меньших между ребрами.

Для определения подлинности травы пустырника японского также предложены качественные реакции на флавоноиды, стероидные и тритерпеновые, а также на азотсодержащие соединения. Для оценки количественного содержания основной группы биологически активных веществ в сырье - флавоноидов использовали метод дифференциальной спектрофотометрии (методика разработана в разделе фотохимического изучения). Содержание суммы флавоноидов определяли в пересчете на рутин. Для полученной методики установлены метрологические характеристики. Результаты представлены в таблице I

Таблица 'Л- Метрологические характеристики методики количественного определения суммы флавоноидов в надземной части пустырника японского

/ X Б Р,% г(Р,/) Дх

10 1,63 0,013 95 2,23 0,03 ±1,80

В результате товароведческого анализа десяти образцов сырья Ь. )аротст установлены следующие числовые показатели, которые были включены в проект ФСП:

Для цельного сырья: содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин не менее 1,5%; потеря в массе при высушивании не более 12%; золы общей не более 13%; золы, нерастворимой в 10% растворе кислоты хлористоводородной, не более 2%; стеблей, в том числе отделенных при анализе, не более 30%; частей травы, потемневших, пожелтевших и поврежденных вредителями, не более 5%; органической примеси не более 1%; минеральной примеси не более 1%.

Для измельченного сырья: содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин не менее 1,5%; потеря в массе при высушивании не более 12%; золы общей не более 13%; золы, нерастворимой в 10% растворе кислоты

хлористоводородной, не более 2%; частиц, непроходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 7 мм, не более 5%; частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 0,5 мм, не более 5%; частей травы, потемневших, пожелтевших и поврежденных вредителями, не более 5%; органической примеси не более 1%; минеральной примеси не более 1%.

Результаты анализа содержания основных групп биологически активных соединений (флавоноиды и терпеноиды) и других числовых показателей в образцах сырья, собранных в 2005-2007 годы показали, что срок хранения травы пустырника японского составляет 2,5 года.

Изучение возможности интродукции пустырника японского в Ленинградской области

При изучении возможности интродукции данного вида в Ленинградской области установлено, что общая продолжительность онтогенеза пустырника японского, выращенного в условиях закрытого грунта, составляет около 190210 дней, причем, генеративный период наступает спустя 110-120 дней после высадки семян, а сенильный период начинается после 180-190 дней. Наблюдается увеличение продолжительности имматурного и виргинильного периодов у растений, выращенных в условиях открытого грунта. Средняя высота растений составляла лишь 10-20 см, что намного ниже высоты, достигаемой в этом возрасте растениями, выращиваемыми в условиях закрытого грунта. Генеративный период не наблюдался. Ни одна особь не успела дать плоды. Также отмечено, что для Ь, ¡аротсич форма верхних стеблевых листьев не является выдержанным признаком, по которому этот вид можно отличать от других видов рода.

Отрицательный результат интродукции Ь. ¡аротсив в Ленинградской области, несмотря на хороший результат выращивания в условиях закрытого грунта объясняется тем, что естественными местами произрастания Ь. ]аропкт в России являются исключительно только те юго-восточные области, которые характеризуются продолжительным вегетационным периодом.

Основные результаты и выводы

1. В результате фотохимического исследования образцов Ь. }аротст, заготовленных в разных географических зонах установлено наличие флавоноидов, фенольных кислот, стероидных и тритерпеновых соединений, сапонинов, азотсодержащих соединений, полисахаридов, дубильных веществ, липидов, органических кислот, а также следов эфирного масла и иридоидов. Результаты сравнительного изучения показали, что Ь. ¡'аротсш и Ь цшщие\оЪа1№ имеют существенные различия по качественному, а также количественному содержанию таких биологически активных веществ как фенольные кислоты, флавоноиды и терпеноиды.

2. Установлен состав липидов, полисахаридов, фенольных кислот, флавоноидов, тритерпеновых и стероидных соединений в надземной части, а также установлен набор макро- и микроэлементов в различных органах Ь. ¡'аротсш, Изучена динамика накопления действующих веществ в надземной части Ь. _/аротсш. Было обнаружено, что в образцах надземной части, заготовленных в Ленинградской области, наблюдается повышение общего содержания фенольных кислот и флавоноидов. Разработаны методики количественного определения суммы флавоноидов и общего содержания терпеноидов в надземной части Ь ]аротсш. Данные критерии выбраны в качестве основного объективного показателя для стандартизации травы Ь. ¡аротсш по содержанию действующих веществ.

3. Впервые в надземной части Ь. ¡аротсш идентифицированы хлорогенновая, кофейная, п-оксибензойная, ванилиновая, п-оксикоричная, феруловая кислоты. Из надземной части Ь. ¡аротсш выделены 5 флавоноидов: рутин, гиперозид, кверцитрин, кемпферол и впервые выделен и идентифицирован генкванин 4'-глюкозид. Идентифицированы и выделены 12 жирных кислот, 5 стероидных соединений: р-ситостерол, стигмастерол, 22,23- дигидроспинастерон, стигмаст-4-ен-З-он и кампестерол. Впервые выделены и идентифицированы 5 тритерпеновых соединений из надземной части Ь. ¡'аротсш: луп-20(29)-ен-3-он; олеан-12-ен-З-он; урсан-12-ен-З-он; урсан-9( 11), 12-диен-З -он; а-амирин.

4. Установлены макро- и микроскопические признаки сырья X. ]аротсиз.

5. Определены оптимальные сроки заготовки, и размер сырьевой части, подлежащей заготовке. Установлены показатели подлинности и качества сырья.

6. Разработан проект фармакопейной статьи предприятия «Пустырника японского трава».

7. Изучена возможность интродукции Ь. ]аротс№ в Ленинградской области и установлено что, несмотря на хороший результат выращивания в условиях закрытого грунта, интродукция данного растения в Ленинградской области нецелесообразна.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1. Нго, Т. Т. Зиэп. Перспективный вид пустырника - Leonurus japonicus Houtt. / Зиэп Т. Т. Нго, Е. В. Жохова II Сб. науч. трудов «Актуальные вопросы фармации». - Рязань: РязГМУ, 2006. - С. 170-171.

2. Нго, Т. Т. Зиэп. Количественное определение суммы флавоноидов в пустырника японского траве / Зиэп Т. Т. Нго, Е. В. Жохова // Сб. науч. трудов «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции».

- Пятигорск, 2007. - Вып. 62. - С. 59-61.

3. Нго, Т. Т. Зиэп. К вопросу стандартизации сырья пустырника японского / Зиэп Т. Т. Нго // Тезисы докладов per. науч. конф. студентов и аспирантов «Молодые ученые - практическому здравоохранению». - СПб.: СПХФА, 2007.-С. 31-32.

4. Нго, Т. Т. Зиэп. Продукты вторичного метаболизма видов рода Leonurus (Lamiaceae) / Зиэп Т. Т. Нго, Е. В. Жохова // Растительные ресурсы. - 2007. -Т. 43, вып. 4.-С. 125-141.

5. Нго, Т. Т. Зиэп. Разработка методики количественного определения суммарного содержания флавоноидов в траве пустырника спектрофотометрическим методом / Зиэп Т. Т. Нго, Е. В. Жохова // Химия растительного сырья. - 2007. - № 4. - С. 73-77.

6. Нго, Т. Т. Зиэп. Изучение углеводного состава надземной части пустырника японского / Зиэп Т. Т. Нго, Е. В. Жохова // Сб. науч. трудов «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции».

- Пятигорск, 2008. - Вып. 63. - С. 33-34.

7. Нго, Т. Т. Зиэп. Сравнительное фитохимическое изучение надземных частей пустырника японского и пустырника пятилопастного / Зиэп Т. Т. Нго, Е. В. Жохова // Сб. науч. трудов международного форума «Интегративная медицина 2008». - М., 2008. - С. 128-131.

8. Нго, Т. Т. Зиэп. Содержание и состав фенольньк кислот надземной части Leonurus japonicus и L. quinquelobatus (Lamiaceae) / Зиэп Т. Т. Нго, А. И. Тулайкин, Е. В. Жохова // Растительные ресурсы. - 2008. - Т. 44, вып. 3. - С. 92-96.

9. Нго, Т. Т. Зиэп. Изучение терпеноидных соединений надземной части пустырника японского / Зиэп Т. Т. Нго, Е. В. Жохова, A. JI. Буданцев /У Матер. XII съезда русского ботанического общества «Фундаментальные и прикладные проблемы ботаники в начале XXI века». - Петрозаводск, 2008. -Т.З.-С. 280-282.

Юля Sam¡

iтокJê-f

На правах рукописи

Нго Тхи Тхань Зиэп

Фармакогностическое изучение травы ¿Ботям ыротсиз Нои«.

Специальность 15.00.02 —фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Печать НВ Андриановой

Подписано к печати 22.10.2008. Формат 60 х 90/16 Бумага тип. Печать ризограф _Гарнитура «Тайме». Печ. л.3,0. Тираж 100 экз. Заказ 752_

Санкт-Петербург 2008

Оглавление диссертации Нго, Тхи Тхань Зиэп :: 2008 :: Санкт-Петербург

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Ботанико-географическая характеристика рода Leonurus L.

1.2. Продукты вторичного метаболизма видов рода Leonurus L.

1.2.1. Фенольные соединения

1.2.2. Терпеноиды

1.2.3. Алкалоиды

1.3. Биологическая активность видов рода пустырник и их 33 применение в медицине

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Материалы исследований

2.2. Методы исследований

Глава 3. ФИТОХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ПУСТЫРНИКА 44 ЯПОНСКОГО

3.1. Общий фитохимический анализ на основные группы 44 биологически активных веществ

3.1.1. Исследование на присутствие азотсодержащих 44 соединений

3.1.2. Исследование на присутствие дубильных веществ

3.1.3. Исследование на присутствие липидов

3.1.4. Исследование на присутствие органических кислот

3.1.5. Исследование на присутствие полисахаридов

3.1.6. Исследование па присутствие стероидных соединений и тритерпеноидов

3.1.7. Исследование на присутствие сапонинов

3.1.8. Исследование на присутствие флавоноидов

3.1.9. Исследование на присутствие фенольных кислот

3.1.10. Исследование на присутствие иридоидов

3.1.11. Исследование на присутствие эфирного масла

3.1.12. Исследование на присутствие антраценпроизводных

3.1.13.Исследование на присутствие кардиотонических 61 гликозидов

3.1.14. Исследование на>присутствие кумаринов

3.2. Изучение макро- и микроэлементов

3.3. Определение содержания экстрактивных веществ и 68 динамика их накопления

3.3.1. Определение содержания экстрактивных веществ в 69 зависимости от фенофазы и места произрастания

3.3.2. Определение содержания экстрактивных веществ в 71 зависимости от размера сырьевой части растения

3.4. Изучение состава флавоноидов

3.4.11 Качественный состав

3.4.2. Выделение и установление компонентного состава 75 флавоноидов из пустырника японского

3.4.2.1. Выделение и очистка суммарного полифенолъного комплекса

3.4.2.2. Разделение суммарного полифенолъного комплекса

3.4.2.3. Установление структуры выделенных флавоноидов

3.4.3. Разработка методики количественного определения 83 суммы флавоноидов в траве пустырника японского

3.4.3.1. Выбор индивидуального флавоноида и аналитической длины 84 волны

3.4.3.2. Выбор условий экстракции

3.4.3.3. Количественное содержание флавоноидов в надземной 91 части пустырника японского и пустырника пятилопастного

3.5. Изучение углеводного состава надземной части пустырника

3.5.1. Изучение состава свободных моносахаров

3.5.1.1. Изучение качественного состава свободных моносахаров

3.5.1.2. Изучение количественного содержания свободных 98 моносахаров

3.5.2. Изучение динамики накопления и состава 100 водорастворимых полисахаридов

3.5.2.1. Выделение и очистка водорастворимых полисахаридов 100!

3.5.2.2. Изучение мономерного состава водорастворимых 101 полисахаридов

3.5.2.3. Изучение количественного содержания водорастворимых 104 полисахаридов

3.5.3. Выделение и анализ пектиновых веществ

3.5.4. Выделение и изучение мономерного состава гемицеллюлоз

3.6. Изучение состава стероидов и терпеноидов надземной 108 части пустырника японского

3.6.1. Определение fl-ситостерола и изучение динамики его 108 накопления

3.6.2. Количественное определение суммы терпеноидов в 111 надземной части пустырника японского и пустырника пятилопастного

3.6.3. Выделение и установление структуры некоторых 115 терпеноидных соединений

3.6.3.1. Выделение суммы терпеноидных соединений

3.6.3.2. Установление структуры терпеновых соединений

Глава 4. УСТАНОВЛЕНИЕ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ПОДЛИННОСТИ 125 И КАЧЕСТВА ТРАВЫ ПУСТЫРНИКА ЯПОНСКОГО

4.1. Установление показателей подлинности

4.1.1. Морфологические диагностические признаки сырья

4.1.2. Микроскопическое исследование травы пустырника 126 японского

4.1.2.1. Анатомическое строение листьев (препарат с 126 поверхности)

4.1.2.2. Анатомическое строение стебля (препарат с 131 поверхности, поперечный срез)

4.1.2.3. Анатомическое строение чашелистиков чашечки 133 (препарат с поверхности)

4.1.3. Качественные фитохимические реакции на группы 136 основных биологически активных веществ

4.1.3.1. ТСХ-анализ на рутин в составе суммы флавоноидов

4.1.3.2. ТСХ-анализ на азотсодержащие соединения

4.1.3.3. Качественная реакция на стероидные и тритерпеновые 138 соединения

4.2. Установление показателей качества

4.2.1. Количественное определение суммы флавоноидов в траве пустырника японского

4.2.1.1. Методика количественного определения суммы 138 флавоноидов

4.2.1.2. Определение метрологических характеристик методики

4.2.1.3. Определение предельного значения содержания суммы 141 флавоноидов в пересчете на рутин в сырье

4.2.2. Определение товароведческих показателей

4.3. Установление срока хранения сырья

Глава 5. ИНТРОДУКЦИЯ ПУСТЫРНИКА ЯПОНСКОГО В 148 ЛЕНИНГРАДСКОЙ ОБЛАСТИ

5.1. Определение лабораторной всхожести

5.2. Интродукция пустырника японского в условиях закрытого 150 грунта

5.3. Интродукция в Ленинградской области (открытый грунт)

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Введение диссертации по теме "Фармацевтическая химия и фармакогнозия", Нго, Тхи Тхань Зиэп, автореферат

Многие растения семейства губоцветные - Lamiaceae (Labiatae) обладают широким спектром биологической активности и используются как в научной, так и в народной медицине. К числу таких представителей принадлежат виды рода пустырник - Leonurns L. Во многих видах этого рода были обнаружены различные группы биологически активных веществ: флавоноиды (рутин, генкванин, кверцетин), дубильные вещества, сапонины, азотсодержащие соединения! (леонурин, стахидрин) [19, 66]. Разные виды рода пустырник являются официнальными и включены в Национальные Фармакопеи многих стран мира. В Российскую Фармакопею XI издания включены пустырник сердечный и пустырник пятилопастный. Во Вьетнамскую и Китайскую Фармакопеи включен другой вид - пустырник японский (Leonurus japonicus Houtt.) [93, 104]. Причем официнальные на территории России виды пустырника известны своим выраженным седа-тивным действием (в 2-3 раза сильнее, чем у настойки валерианы), а пустырник японский применяется в китайской и вьетнамской медицине как средство, нормализующее регулы, родовспомогательное, укрепляющее миометрий после родов. [66, 67, 102, 148]. Фармакологическими исследованиями за рубежом выявлены также гормоноподобное, противоопухолевое, антимикробное, противовоспалительное и антиоксидантное действия пустырника японского [95, 98, 102,108, 132, 145, 146, 147].

В российской литературе имеется очень мало информации о биологически активных веществах пустырника японского, хотя данный вид произрастает на территории Хабаровского и Приморского края, где является преобладающим среди других видов рода [32, 33, 38, 77]. По данным зарубежных исследователей пустырник японский имеет очень богатый набор биологически активных соединений, исследуемых в настоящее время в Японии, Китае и Вьетнаме. Но до сих пор стандартизация сырья пустырника японского во Вьетнаме проводится лишь по содержанию экстрактивных веществ, что мало отражает качество сырья в общем. Поэтому актуальными являются разработка нового современного метода стандартизации сырья, а также изучение данного вида с целью введения его в.научную медицину России. Для этого следовало решить целый ряд задач, чему посвящена настоящая диссертационная работа.

Работа выполнена на кафедре фармакогнозии, Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии в соответствии с научным направлением «Изыскание и изучение биологически активных веществ синтетического, микробного и растительного происхождения для создания на их основе импортозамещающих оригинальных отечественных лекарственных субстанций» и тематическим планом научно-исследовательских работ СПХФА по теме «Мониторинг перспективных лекарственных растений флоры России». Исследования с использованием приборных хроматографических и спектроскопических методов выполнены в лаборатории аналитических методов НИУ академии и лаборатории экологии растительных сообществ Ботанического института им. В. JL Комарова Российской Академии Наук.

Цели и задачи исследования. Целью данного исследования является проведение фармакогностического изучения и стандартизация травы пустырника японского.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести фитохимический анализ надземной части L. japonicus и сравнительное изучение надземной части L. japonicus и. L. quinquelobatus.

2. Установить основные группы биологически активных веществ, разработать методики их количественного определения, провести исследование динамики накопления действующих веществ в надземной части L. japonicus.

3. Выделить и установить структуру основных биологически активных веществ.

4. Установить макро- и микроскопические признаки сырья L. japonicus.

5. Провести товароведческий анализ для' установления норм качества лекарственного растительного сырья.

6. Обобщить полученные данные и на их основе разработать проект нормативного документа на траву L. japonicus.

7. Изучить возможность интродукции- L. japonicus в Ленинградской области.

Научная новизна. Впервые было проведено сравнительное фотохимическое изучение L. japonicus и L. quinquelobatus, а также сырья L. japonicus, заготовленного в разных географических зонах. Проведено сравнительное изучение надземной части L. japonicus и L. quinquelobatus, в результате которого было показано их различия по качественному, а также количественному содержанию таких биологически активных веществ как фенольные кислоты, флавоноиды и терпеноиды. Изучен компонентный и мономерный состав, динамика накопления биологически активных веществ (БАВ) в разные фазы вегетации растения. Выделен и изучен комплекс флавоноидов, содержащийся в траве L. japonicus, впервые выделен и идентифицирован флавоноид генкванин 4'-глюкозид. Впервые изучен состав стероидных соединений надземной части L. japonicus. Выделены, и идентифицированы 5 стероидных соединений: p-ситостерол, стигмастерол, 22,23- дигидроспинастерон, стигмаст-4-ен-З-он и кампестерол, причем три последних соединения выделены и идентифицированы впервые. Впервые выделены и идентифицированы 5 тритерпеновых соединений из надземной части L. japonicus (луп-20(29)-ен-3-он; олеан-12-ен-З-он; урсан-12-ен-3-он; урсан-9(11),12-диен-3-он; а-амирин). Определен состав фенольных кислот, липидов, мономерный и компонентный состав полисахаридов. Определен набор макро- и микроэлементов L. japonicus. Изучена возможность выращивания L. japonicus в Ленинградской области.

Практическая значимость. Предложены методики количественного определения суммы флавоноидов в траве L. japonicus и L. quinquelobatus. Модифицированная- методика количественного определения- суммы, флавоноидов- в траве L. quinquelobatus введена в практику научных исследований растительных объектов и учебного процесса- на кафедре фармакогнозии СПХФА. Разработанная методика количественного определения^ суммы терпеноидов в надземной части L. japonicus и L. quinquelobatus может быть использована при анализе других видов.растительного сырья. Данные о фитохимическом составе, полученные в результате проведенных исследований, могут быть использованы при целенаправленном создании новых фитопрепаратов из травы L. japonicus, а также для введения растения» в научную медицину России. Определены сроки и оптимальная фаза вегетации для заготовки сырья, а также предельный размер сырьевой части, подлежащей заготовке. Разработаны критерии, позволяющие установить подлинность сырья - травы L. japonicus, определен показатели его доброкачественности. Результаты работы использованы при разработке проекта ФСП на предлагаемый новый вид лекарственного сырья «Пустырника японского трава».

Апробация работы.

Основные положения диссертации доложены на:

• Конференции, посвященной 40-летию основания фармацевтического факультета Рязанского государственного университета имени академика И. П. Павлова «Актуальные проблемы фармации» (Рязань, 2006 г.)

• 62-й региональной конференции по фармации- и фармакологии (Пятигорск, 2007 г.)

• Региональной научной конференции студентов и аспирантов «Молодые ученые - практическому здравоохранению» (Санкт-Петербург, 2007 г.)

• 63-й региональной конференции по фармации и фармакологии (Пятигорск, 2008 г.)

• III международном форуме « Интегративная медицина» (Москва, 2008 г.)

• XII съезде русского ботанического общества «Фундаментальные и прикладные проблемы ботаники в начале XXI века» (Петрозаводск, 2008 г.).

Заключение диссертационного исследования на тему "Фармакогностическое изучение травы Leonurus japonicus Houtt"

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. В результате фитохимического исследования образцов L. japonicus, заготовленных в разных географических зонах установлено наличие флавоноидов, фенольных кислот, стероидных и тритерпеновых соединений, сапонинов, азотсодержащих соединений, полисахаридов, дубильных веществ, липидов, органических кислот, а также следов эфирного масла и иридоидов. Результаты сравнительного изучения показали, что L. japonicus и L. quinquelobatus имеют существенные различия по качественному, а также количественному содержанию таких биологически активных веществ как фенольные кислоты, флавоноиды и терпеноиды.

2. Установлен состав липидов, полисахаридов, фенольных кислот, флавоноидов, тритерпеновых и стероидных соединений в надземной части, а также установлен набор макро- и микроэлементов в различных органах L. japonicus. Изучена динамика накопления действующих веществ в надземной части L. japonicus. Было обнаружено, что в образцах надземной части, заготовленных в Ленинградской области; наблюдается повышение общего содержания фенольных кислот и флавоноидов. Разработаны методики количественного определения суммы флавоноидов и общего содержания терпеноидов в надземной части L. japonicus. Данные критерии выбраны в качестве основного объективного показателя для стандартизации травы L. japonicus по содержанию действующих веществ.

3. Впервые в надземной части L. japonicus идентифицированы хлоро-генновая, кофейная, п-оксибензойная, ванилиновая, п-оксикоричная, феруловая кислоты. Из надземной части L. japonicus выделены 5 флавоноидов: рутин, гиперозид, кверцитрин, кемпферол и впервые выделен и идентифицирован генкванин 4'-глюкозид. Идентифицированы и выделены 12 жирных кислот, 5 стероидных соединений: (3158 ситостерол, стигмастерол, 22,23- дигидроспинастерон, стигмаст-4-ен-3-он и кампестерол. Впервые выделены и идентифицированы 5 тритерпеновых соединений из надземной части L. japonicus: луп-20(29)-ен-3-он; олеан-12-ен-З-он; урсан-12-ен-З-он; урсан-9(11),12-диен-3-он; а-амирин.

4. Установлены макро- и микроскопические признаки сырья L. japonicus.

6. Разработан проект фармакопейной статьи предприятия «Пустырника японского трава».

7. Изучена возможность интродукции L. japonicus в Ленинградской области и установлено что, несмотря на хороший результат выращивания в условиях закрытого грунта, интродукция данного растения в Ленинградской области нецелесообразна.

Список использованной литературы по фармакологии, диссертация 2008 года, Нго, Тхи Тхань Зиэп

1. Арустамова, Ф. А. Изучение химического " состава пустырника обыкновенного, произрастающего в Азербайджане / Ф. А. Арустамова // Изв. АН. АрмССР. Биол. науки. 1962. - Т. 15. - № 5. - С. 77-82.

2. Атлас ареалов и ресурсов лекарственных растений СССР / под. ред. П. С. Чикова. М.: ГУГК, 1980. - 340 с.

3. Бандюкова, В. А. Применение цветных реакций для обнаружения флавоноидов путем хроматографии на бумаге / В. А. Бандюкова // Раст. ресурсы. 1965. - Т. 1, вып. 1. - С. 591-596.

4. Барабой, В. А. Растительные фенолы и здоровье человека / В. А. Барабой. -М.: Наука, 1984.- 160 с.

5. Барыкина, Р. П. Справочник по ботанической микротехнике. Основы и методы / Р. П. Барыкина и др.. М.: Изд-во МГУ, 2004. - 312 с.

6. Беликов, В. Г. Фармацевтическая химия: учебник для вузов / В. Г. Беликов. 3-е изд., доп. и пер. Пятигорск: Изд-во ПГФА, 2003. - 720 с.

7. Березина, В. С. Фармакогностическое изучение видов рода Lamium L. s. L.: автореф. дис. канд. фарм. наук: 15.00.02 / В. С. Березина; СПХФА. -СПб., 2003.-23 с.

8. Березина, В. С. Содержание и состав суммарных водорастворимых полисахаридных комплексов в надземной части Lamium album L. и Galeobdolon luteum Huds. / В. С. Березина и др. // Раст. ресурсы. 2003. -Т. 39, вып. 1.-С. 69-76.

9. Битюцкий, Н. П. Необходимые микроэлементы растений : учебник / Н. П. Битюцкий. СПб.: ДЕАН, 2005. - 256 с.

10. Выделение и анализ природных биологически активных веществ / под. ред. Е. Е. Сироткиной. Томск: ИТУ, 1987. - 185 с.

11. Георгиевский, В. П. Биологически активные вещества лекарственных растений / В. П. Георгиевский, Н. Ф. Комисаренко, С. Е Дмитрук. -Новосибирск: Наука, 1990. — 333 с.

12. Гёрёг, Ш. Количественный анализ стероидов: пер. с англ. / под. ред. И. В. Торгова, В. Г. Березкина. М.: Мир, 1985; - 504 с.

13. Гигиенические требования к безопасности и пищевой; ценности пищевых продуктов. Продовольственное сырье и пищевые продукты. Сан ПиН 2.3.2. 1078-01. -М., 1997.-46 с.

14. Глушенко, Н: Н. Современные аспекты стандартизации и контроля качества лекарственных средств / Н. Н. Глушенко, Т. В. Плетнева, В; А; Попков. М:: РУДН; 2002. - 84 с.

15. Головкин, Б. Н. Биологически активные- вещества растительного происхождения: в 2-х т. / Б. Н. Головкин и др.. М:: Наука, 2001. — 2 т.

16. Гончарова; Т. А. Энциклопедия лекарственных растений: Лечение травами. ,- М^: Издательский дом МСП; 2001. 560 с.

17. Государственная? Фармакопея СССР: Вып. 1. Общие методы анализа. / МЗзСеСРШ-e изд., дош -М;, 1987.- 334 с.

18. Государственная Фармакопея СССР: Вып. X Общие методы анализа: Лекарственное растительное сырье / МЗ СССР. 11-е изд., доп. М., 1989.-400 с.

19. Дикорастущие полезные растения России / под. ред. А. Л. Буданцева, Е. Е. Лесиовской. СПб.: Изд-во СПХФА, 2001. - 663 с.

20. Дудкищ. М: С. Углеводьь Symphytum: asperum / М. С. Дудкин, Н. А. Денисюк // Химия природных соединений. 1984. - № 1. - С. 15-20.

21. Евгеньева, И. И. Планарная хроматография и анализ органических веществ / И. И. Евгеньева // Соросовский образовательный журн. 1999. -№41.-С. 50-55:

22. Захарова, И: Я: Методы изучения микробных полисахаридов / И. Я. Захарова, Л. В. Косенко. Киев: Наукова думка, 1982. - 189 с.

23. Зинченко, Т. В. Флавонощи представник1в в родини губоцв1них / Т. В. Зинченко, В. А. Бандюкова // Фарм. журн. 1969. - № 1. - С. 49.

24. Интродукционное изучение цветочных растений:: сборник науч. трудов / под. ред. Л. Е. Соболевой. -Ялта, 1985. Т. 97. - 131 с.

25. Интродукция новых видов растений на Севере: труды Коми филиала АН СССР / отв. ред. И. В. Забоева и др.. Сыктывкар, 1984. - № 68. - 144 с.

26. Кабата-Пендиас, А. Микроэлементы в растениях и почвах, пер. с англ. /

27. A. Кабата-Пендиас, X. Пендиас. М.: Мир, 1989. - 439 с.

28. Казаринова, Н. В. Лекарственные растения Сибири для лечения сердечно-сосудистых заболеваний / Н. В. Казаринова и др.. -Новосибирск: Наука, 1991. 340 с.

29. Клышев, Л. К. Флавоноиды растений (распространение, физико-химические свойства, методы исследования) / Л. К. Клышев, В. А. Бандюкова, Л. С. Алюкина. Алма-Ата: Наука, 1978. - 220 с.

30. Козлова, Л. М. К фитохимии пустырника пятилопастного / Л. М. Козлова // Фармация. 1967. - Т. 16. - № 6. - С. 23-26.

31. Крестовская, Т. В. Что такое L. heterophyllus Sweet. / Т. В. Крестовская // Новости сист. высш. раст. 1988. - Т. 24. - С. 156-159.

32. Крестовская, Т. В. Обзор видов секции Leonurus рода Leonurus (Lamiaceae) / Т. В. Крестовская // Бот. журн. 1988. - Т.73. - № 12. - С. 1744-1755.

33. Крестовская, Т. В. Система и конспект рода Leonurus L. (Lamiaceae) / Т. В. Крестовская // Новости сист. высш. раст. — 1989. — Т. 26. С. 142— 149;- Т. 27.-С. 139-144.

34. Крестовская, Т. В. Leonurus L. Пустырник // Флора Сибири: Pyrolaceae- Lamiaceae. Новосибирск: Наука, 1997.-Т. 11.-С. 192-195.

35. Крупина, М. А. Фармакогностическое изучение пустырника татарского Leonurus tataricus L.: автореф. дис. канд. фарм. наук : 15.00.02. /М. А. Крупина. СПб., 1994. - 18 с.

36. Крылова, Н. И. Закономерности в соотношении азотсодержащих компонентов в биомассе дрожжей / Н. И. Крылова, Э. Г. Дедюхина,

37. B. К. Ерошин // Прикладная биохимия и микробиология. 1983. - Т. 19,- вып. 4. С. 486-489.

38. Кузнецова, М. А. Лекарственное растительное сырье и препараты / М. А. Кузнецова. М.: Высшая школа, 1987. - 190 с.

39. Кукенов, М. К. Исследование флавоноидов в некоторых видах флоры Казахстана / М. К. Кукенов // Дикорастущие технические и лекарственные растения Казахстана. Алма-Ата, 1975. - С. 80-89.

40. Куприянова, Л. А. Род Leonurus L / Л. А. Куприянова.// Флора СССР. -М.; Л.: Изд-во АН СССР, 1954.-Т. 21. - С. 145-157.

41. Лекарственное растительное сырье. Фармакогнозия: учеб. пособие / под. ред. Г. П. Яколева. СПб.: СпецЛит, 2006. - 845 с.

42. Литвиненко, В. И. Спектральное исследование флавоноидов. Обнаружение свободных фенольных оксигрупп в различных положениях / В. И. Литвиненко, Н. П. Максютина // Химия природн. соедин. 1965. - № 6. - С. 420-424.

43. Ловкова, М. Я. Почему растения лечат / М. Я. Ловкова и др.. М.: Наука, 1989.-256 с.

44. Муравьева, Д. А. Фармакогнозия: учебник / Д. А. Муравьева, И. А. Самылина, Г. П. Яковлев. 4-е изд., пер. и дон. - М.: Медицина, 2002. -656 с.

45. Нго, Т. Т. Зиэп. Перспективный вид пустырника Leonurus japonicus Houtt. / Зиэп Т. Т. Нго, Е. В. Жохова // Сб. науч. трудов «Актуальные вопросы фармации». - Рязань: РязГМУ, 2006. - С. 170-171.

46. Нго, Т. Т. Зиэп. К вопросу стандартизации сырья пустырника японского / Зиэп Т. Т. Нго // Тезисы докладов per. науч. конф. студентов и аспирантов «Молодые ученые практическому здравоохранению». -Спб.: СПХФА, 2007. - С. 31-32.

47. Нго, Т. Т. Зиэп. Разработка методики количественного определения суммарного содержания флавоноидов в траве пустырника спектрофотометрическим методом / Зиэп Т. Т. Нго, Е. В. Жохова // Химия растительного сырья. 2007. - № 4. - С. 73-77.

48. Нго, Т. Т. Зиэп. Продукты вторичного метаболизма видов рода Leonurus (Lamiaceae) / Зиэп Т. Т. Нго, Е. В. Жохова // Раст. ресурсы. 2007. - Т. 43, вып. 4.-С. 125-141.

49. Нго, Т. Т. Зиэп. Изучение углеводного состава надземной части пустырника японского / Зиэп Т. Т. Нго, Е. В. Жохова // Сб. науч. трудов «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции». Пятигорск, 2008. - Вып. 63. - С. 33.

50. Никитюк, В. Г. Фитостеролы как биологически активные вещества природных комплексов. Исследования стероидного комплекса препарата «Липохромин» / В. Г. Никитюк, Э. Г. Привалова // Провизор. 1999. -№8.-С. 35-36.

51. Ноздрюхина, Л. Р. Нарушения микроэлементного обмена и пути его коррекции / Л. Р. Ноздрюхина, Н. И. Гринкевич. М.: Наука, 1980. - 280 с.

52. Олейников, Д. Н. Методика количественного определения группового состава углеводного комплекса растительных объектов / Д. Н. Олейников, Л. М. Танхаева // Химия растительного сырья. 2006. - № 4. - С. 29-33.

53. ОСТ 91.500.05.001-00. Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения. М., 2000. - 65 с.

54. ОФС 42-0013-03. Правила приемки лекарственного растительного сырья и методы отбора проб. М., 2003. - 18 с.

55. Петренко, В. В. Изучение алкалоидного состава травы пустырника пятилопастного / В. В. Петренко, Н. В. Куринная // Фарм. журн. 1966. -Т. 21.-№6.-С. 36-39.

56. Петренко, В. В. Химическое изучение флавоноидов пустырника пятилопастного / В. В. Петренко, Н. В. Куринная // Фарм. журн. 1966. -Т. 20.-№5.-С. 51-56.

57. Племенков, В. В. Химия изопреноидов: учебное пособие / В. В. Племенков. Барнаул: Изд-во Алт. ун-та, 2007. - 322 с.

58. Повыдыш М. Н. Фармакогностическое изучение зеленчука желтого -Galeobdolon luteum Huds.: дис. канд. фарм. наук: 15.00.02 / М. Н. Повыдыш; СПХФА. СПб., 2006. - 158 с.

59. Полле, А. Я. Выделение и общая характеристика полисахаридов из пижмы обыкновенной, мать-и-мачехи и лопуха войлочного / А. Я. Полле, Р. Г. Оводова, С. В. Попов // Химия растительного сырья. 1999. - № 1. -С. 33-38.

60. Потиевский, Э. Г. Медицинские аспекты применения пектина / Э: Г. Потиевский, А. И. Новиков, М.: Медицинская книга, 2002. - 96 с.

61. Практикум по фармакогнозии: Учебное пособие для студ. вузов / под. ред. В. Н. Ковалева. Харьков: Изд-во НФаУ, 2004. - 510 с.

62. Пробатова, Н. С. Сем. Яснотковые, или Губоцветные Lamiaceae Lindl. (Labiatae Juss.) / H. С. Пробатова, Т. В. Крестовская // Сосудистые растения советского Дальнего Востока. - СПб.: Наука, 1995. - Т. 7. - С. 294-379.

63. Пулатова, Т. П. Изучение терпеновых соединений некоторых растений семейства губоцветных, произрастающих в Узбекистане / Т. П. Пулатова // Материалы юбилейной респ. науч. конф. фармацевтов, посвящ. 50-летию образования СССР. Ташкент, 1972. - С. 34-37.

64. Растительные ресурсы России и сопредельных государств: Часть II, доп. к 1-7-му томам. / отв. ред. A. JL Буданцев. СПб.: Мир и семья-95, 1996. -571 с.

65. Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический состав, использование. Семейства Hippuridaceae-Lobeliaceae. СПб., 1991.-198 с.

66. Рахметова, А. А. Дослщжения флавонощ1в собачо1 кропиви туркестанско1 / А. А. Рахметова // Фарм. журн. 1986. - № 2. - С. 78.

67. Саар, В. Г. Определение моносахаридов в физиологических жидкостях /

68. B. Г. Саар; С. В. Кузнецова, Е. М. Королева // Тез. докл. Всерос. конф. «Химический анализ веществ и материалов». М., 2000. - С. 102.

69. Тулайкин, А. И. Углеводы из надземной части: выделение и анализ / А. И. Тулайкин, В. С. Березина, М. Ю. Гончаров // Раст. ресурсы. 2004. -Т. 40, вып. 4.-С. 73-79.

70. Федосеева, JL В. Количественное определение иридоидов в сырье пустырника / JI. В. Федосева, Д. М. Попов // Фармация. 1997. - № 4.1. C. 18-20.

71. Фитохимический и товароведческий анализ лекарственного растительного сырья. Методические указания к лабораторным занятиямпо фармакогнозии / под. ред. Л. С. Теслова. СПб.: Изд-во СПХФА, 2005.-152 с.

72. Фитохимический анализ лекарственного растительного сырья: Методические указания к лабораторным занятиям. / под. ред. К. Ф. Блиновой. СПб.: Изд-во СПХФА, 1993. - 60 с.

73. Хасанов, В: В. Состав жирных кислот и стероидов растительных масел / В: В. Хасанов и др. // Химия растительного сырья. 2006. - № 3. - С. 27-31.

74. Химический анализ лекарственных растений. Учебное пособие для фарм. вузов / Ладыгина Е. Я и др. ; под. ред. Н. И. Гринкевича, Л. Н. Сафронича. -М.: Высшая школа, 1983. 176 с.

75. Черепанов, С. К. Сосудистые растения России и сопредельных государств (в пределах бывшего СССР) / С. К. Черепанов. СПб.: Мир и семья-95, 1995.-992 с.

76. Чултемсурен, М. Количественное содержание некоторых действующих веществ в пустырниках, произрастающих в Монголии / М. Чултемсурен, В. В. Петренко // Фарм. журн. 1971. - Т. 26. - № 3. - С. 60- 64.

77. Шаламова, Г. Г. Минеральный и белковый состав полисахаридного комплекса из соцветий Tanacetum vulgare / Г. Г. Шаламова' К. Н. Сысоева // Химия природных соединений. — 1985. № 2. - С. 267-268.

78. Шретер, А. И. Лекарственная флора Советского Дальнего Востока / А. И. Шретер. М.: Медицина, 1975. - 328 с.

79. Шретер, А. И. Природное сырье китайской медицины / А. И. Шретер, Б. Г. Валентинов, Э. М. Наумова. -М.: Теревинф, 2003. Т. 1. - 571 с.

80. Энциклопедический словарь лекарственных растений и продуктов животного происхождения: учебное пособие / под. ред. Г. П. Яколева, К. Ф. Блиновой. СПб: СпецЛит, 1999. - 407 с.

81. Ahmed, А. Н. Complete Н and С NMR assignments of three labdane diterpenoids isolated from Leonotis ocymifolia and six other related compounds / A. H. Ahmed, J. J. M. Marion, R. Benjamin // Magn. Res. in Chem. 2003. - Vol. 41. - N. 2. - P. 147-151.

82. Ahmed, F. Antibacterial activity of Leonurus sibiricus aerial parts / F. Ahmed, M. A. Islam, M. M. Rahman // Fitoterapia. 2006. - Vol. 77. - N. 4. - P. 316-317.

83. AH, M. S. Ursolic acid: a potent inhibitor of superoxides produced in the cellular system / M. S. AH et al. // Phytotherapy Research. 2007. - Vol. 21.-N. 6.-P. 558-561.

84. Al-Musayeib, N. M. Labdane diterpenes from Otostegia fruticosa / N. M. Al-Musayeib et al. // Phytochemistry. 2000. - Vol. 54. - N. 8. - P. 771-775.

85. Boalino, D. M. Labdane diterpenes of Leonurus sibiricus / D. M. Boalino et al. //Nat. Prod. -2004. Vol. 67. -N. 4. - P. 714-717.

86. Bol'shakova, I. V. Antioxidant properties of a series of extracts from medicinal plants / I. V. Bol'shakova, E. L. Lozovskaia, I. I. Sapezhinskii // Biofizika. 1997. - Vol. 42. -N. 2. - P. 480-483.

87. Buzogany, K. Comparative study between the spices Leonurus cardiaca L. and Leonurus quinquelobatus Gilib. / K. Buzogany, V. Cucu // Clujul med. 1983. - Vol. 56. - N. 4. - P. 385 - 388; Chem. Abstrs. - 1984. - Vol. 100. - N. 65051.

88. Cai, X.H. A new labdane diterpene from Leonurus heterophyllus / X.H. Cai et al. // J. Asian Nat. Prod. Res. 2006. - Vol. 8. - N. 7. - P. 599-603.

89. Calabuig, M. T. Labdane diterpenes from Cistus symphytifolius / M. T. Calabuig et al. // Phytochemistry. 1981. - Vol. 20. - N. 9. - P. 22552258.

90. Cantino, P. D. Genera of Labiatae: status and classification / R. M. Harley, T. Reynolds (ed.). Advances in Labiatae science. Kew, 1991. - P. 175178.

91. Chao, Z. Determination of stachydrine and leonurine in Herba Leonuri by ion-pair reversed-phase high-performance liquid chromatography / Z. Chao, L. L. Ma, X. J. Zhou // Di Yi Jun Yi Da Xue Xue Bao. 2004. - Vol. 24. - N. 11.-P. 1223-1226.

92. Chines Pharmacopeia, 2000.

93. Chinou, I. Cytotoxic and antibacterial labdane type diterpenes from the aerial parts of Cistus creticus /1. Chinou et al. // Planta Med. 1994. - Vol. 60. - N 1. - P. 34—36.

94. Chinwala, M. G. In vitro anticancer activities of Leonurus heterophyllus Sweet (Chinese motherwort herb) / M. G. Chinwala et al. // Altern. Complement Med. 2003. - Vol. 9. - N. 4. - P. 511-518.

95. Cong, Y. A new flavonoside from Leonurus heterophyllus / Y. Cong, J. H. Wang, X. Li // Asian Nat. Prod. Res. 2005. - Vol. 7. - N. 3. - P. 273- 277.

96. Connolly, J. D. Dictionary of Terpenoids / J. D. Connolly, R. A. Hill. -1 st ed. -London: Chapman & Hall, 1991.-3 Vols.

97. De Souza, G. C. Ethnopharmacological studies of antimicrobial remedies in the south of Brazil / G. C. De Souza et al. // Ethnopharmacol. 2004. - Vol. 90.-N. l.-P. 135-143.

98. Demetzos, C. A new labdane-type diterpene and other compounds from the leaves of Cistus incanus ssp. creticus / C. Demetzos et al. // Natur. Prod. -1990. Vol. 53. - N. 5. - P. 1365-1368.

99. Dimas, K. Cytotoxic activity of labdane type diterpenes against human leukemic cell lines in vitro / K. Dimas et al. // Planta Med. 1998. - Vol. 64.-N3.-P. 208-211.

100. Do, H. B. 1000 cay thu6c va dong vat lam thu6c a Viet Nam / H. B. Do et al. Ha noi, Nha xuat ban khoa hoc va ky thuat, 2006. - Vol. 1. - 1140 p.1. Г Г

101. Do, T. L. Nhirng cay thuoc va vi thuoc Viet nam / T. L. Do. 14 th ed. - Ha noi: Nha xuit ban Y hoc, 2006. - 1275 p.

102. Duke, J. A. CRC Handbook of medicinal spices / J. A. Duke et al.. 2 nd ed. - Boca Raton, FL.: CRC Press, 2002. - 348 p.

103. Dirge dien Viet nam III. Ha noi: Nha xuat ban у hoc, 2002. - 535 p.

104. El-Domiaty, M. M. The first report on the occurrence of furofuranoid lignan glucosides in Acanthaceae / M. M. El-Domiaty et al. // Pharm. Biology. -2002. Vol. 40. - N. 2. - P. 96-102.

105. Harborn, J.B. The flavonoids: advances in research / J. B. Harborn, T.J. Mabry. London; New York, 1982. - 744 p.

106. Harley, R. M. Lamiaceae И The Families and Genera of Vascular Plants / K. Kubitzki (ed.). Berlin, 2004. - Vol. VII. Lamiales (except Acanthaceae including Avicenniaceae). - P. 182-190.

107. Hayashi, Y. Studies on the ingredients of Leonurus sibiricus L. / Y. Yayashi // Yakugaku zasshi. 1962. - Vol. 82. - N. 7. - P. 1020-1023.

108. Herbal Pharmacology in the People's Respublic of China / Washington D. C., 1975.- 102 p.

109. Hon, P. M. Prehispanolone, a labdane diterpene from Leonurus heterophyllus / P. M. Hon et al. // Phytochemistry. 1991. - Vol. 30. - N. 1. - P. 254256.

110. Hon, P. M. Preleoheterin and leoheterin, two labdane diterpenes from Leonurus heterophyllus / P. M. Hon et al. // Phytochemistry. 1993. - Vol. 33.-N.3.-P. 639-641.

111. Institute for Systematic Botany: Atlas of Florida vascular plants электронный ресурс. USA., 2008. - Режим доступа: http://www. plantatlas.usf.edu / maps.asp?Plant ID=1399. - Загл. с экрана.

112. Institute of Pacific Islands Forestry: Pacific Island Ecosystems at Risk электронный ресурс. USA., 2008. - Режим доступа: http://www.hear.org/pier/spices/Leonurusjaponicus.html. - Загл. с экрана.

113. Islam, М. A. Analgesic and anti-inflammatory activity of Leonurus sibiricus / M. A. Islam et al. // Fitoterapia. 2005. - Vol. 76. - N. 3-4. - P. 359-362.

114. Iwatsuki, K. Flora of Japan / K. Iwatsuki et al.. Tokyo, 1993. - 496 p.

115. Kalpoutzakis, E. New semisynthetic antimicrobial labdane-type diterpenoids derived from the resin "ladano" of Cistus creticus / E. Kalpoutzakis et al. I I Naturforsch. 2001. - Vol. 56. - N. 1-2. - P. 49-52.

116. Knoss, W. Accumulation of furanic labdane diterpenes in Marubium vulgare and Leonurus cardiaca / W. Knoss, J. Zapp // Planta Med. 1998. - Vol. 64. -N. 4.-P. 357-361.

117. Li, X. Lamiaceae / X. Li, I. Hedge // Flora of China. 1994. - Vol. 17. - P. 162-164.

118. Mabry, T. J. A precedure for the ultra-violet spectral detection of orthohydroxyl groups in flavonoids / T. J. Mabry, K. R. Markham // Phytochemistry. 1968. -Vol. 7.-N. 7.-P. 1197-1200.

119. Mabry, T. J. The systematic identification of flavonoids / T. J. Mabry, K. R. Markham, M. B. Thomas. New York, 1970. - P. 41-353.

120. Matkowski, A. Antioxidant and free radical scavenging activities of some medicinal plants from the Lamiaceae / A. Matkowski, M. Piotrowska // Fitoterapia. 2006. - Vol. 77.-N. 5.-P. 346-353.

121. Mondello, L. Silver-ion reversed-phase comprehensive two-dimensional liquid chromatography combined with mass spectrometric detection in lipidic food analysis / L. Mondello et al. // J. Chromatogr. A. 2005. - N 9. - P. 91-98.

122. Morita, H. Cycloleonuripeptides E and F, cyclic nonapeptides from Leonurus heterophyllus / H. Morita et al. // J. Nat. Prod. 2006. - Vol. 69. - N. 5. - P. 839-841.

123. Ono, M. Ten new labdane-type diterpenes from the fruits of Vitex rotundifolia / M. Ono et al. // Chem. Pharm. Bull. 2001. - Vol. 49. - N. 1. - P. 82-86.

124. Papanov, G. Y. 19-hydroxygaleopsin, a labdane diterpenoid from Leonurus cardiaca / G. Y. Papanov et al. // Phytochemistry. 1998. - Vol. 47 . - N. l.-P. 139-141.

125. Phan, M. G. New labdane-type diterpenoids from Leonurus heterophyllus Sw. / M. G. Phan et al. // Chem. Pharm. Bull. 2005. - Vol. 53. - N. 8. - P. 938-941.

126. Phan, M. G. New bis-spirolabdane-type diterpenoids from Leonurus heterophyllus Sw. / M. G. Phan et al. // Chem. Pharm. Bull. 2005. - Vol. 53.-N. 11.-P. 1475-1479.

127. Rojatkar, S. R. A diterpene from Cipadessa fruticosa and Grangea maderaspatana / S. R. Rojatkar, Y. G. Chiplunkar, B. A. Nagasampagi // Phytochemistry.- 1994. -N37.-P. 1213.

128. Roman, R. R. A. Labdane diterpenes from Leonurus japonicus leaves / R. R. Roman et al. // Phytochemistry. 2006. - Vol. 67. - N. 10. - P. 965-970.

129. Romeo-Gonzalez, R. R. Labdane diterpenes from Leonurus japonicus leaves / R. R. Romeo-Gonzalez et al. 11 Phytochemistry. 2006. - Vol. 67. - N. 10. -P. 965-970.

130. Satoh, M. Studies on the constituents of Leonurus sibiricus L. / M. Satoh et al. // Chem. Pharm. Bull. -2003. Vol. 51. -N. 3. -P. 341-342.

131. Schulz, О. E. Components of Leonurus cardiaca / О. E. Schulz, M. Alhyane // Sci. Pharm. 1973. - Vol. 41. -N. 2. - P. 149-155 ; Chem. Abstr. - 1973. -Vol.49.-N. 75882.

132. Sun, J. Anti-oxidative stress effects of Herba Leonuri on ischemic rat hearts / J. Sun et al. // Life Sci. 2005. - Vol. 76. - N. 26. - P. 3043-3056.

133. Tasdemir, D. New furanoid and? seco-labdanoid diterpenes from Leonurus persicus / D. Tasdemir, A. D. Wright, O. Sticher // Nat. Prod. 1996. - Vol. 59.-N. 2. -P. 131-134.

134. Tasdemir, D. Further labdane diterpenoids isolated from Leonurus persicus / D. Tasdemir, O. Sticher // Nat. Prod. 1997. - Vol. 60. - N. 9. - P. 874-879.

135. Tasdemir, D. Labdane diterpenes from Leonurus persicus / D. Tasdemir, I. Calis, O. Sticher//Phytochemistry.-1998.-Vol. 49, Nl.-P. 137- 143.

136. Tasdemir, D. Iridoid glycosides of Leonurus persicus / D. Tasdemir et al. 11 Nat. Prod. 1999. - Vol. 62. - N. 6. - P. 811-816.

137. Tschesche, R. Caffeic acid 4-rutinoside from Leonurus cardiaca / R. Tschesche, A. Diederich,H.C. Jha// Phytochemistry.-1980.-Vol. 19.-N, 12.-P.2783.

138. United, States Department of Agriculture:Natural Resources conservation Service электронный ресурс. USA., 2008. - Режим доступа:ihttp://plants.usda.gov/java/nameSearch?keywordquery=Leonurus+sibiricus& mode=sciname. Загл. с экрана.

139. Usov, A. I. Polysaccharides of algae. Polysaccharide composition of several calcareous red algae: isolation of alginate from Corallina pilulitara / A. I. Usov, M. I. Bilan, N. G. Klochkova // Bot. Marina. 1995. - Vol. 38. - N. 3. - P. 43-51.

140. Wiersema, J. H. World Economic Plants: A standard reference / J. H. Wiersema, L. Blanca. CRC press. 1999. - 792 p.

141. Xiao-Han, C. Studies on chemical constituents of Leonurus japonicus / C. Xiao-Han et al. // Journal of Shenyang Pharmaceutical University. 2006. -Vol. 23.-N. l.-P. 13-14.

142. Xu, J. Z. Regulation on growth and accumulation of total alkaloid in Leonurus artemisia (Lour.) S. Y. Hu by various microfertilizers / J. Z. Xu et al. // Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2000. - Vol 25. - N. 1. - P. 20-23.

143. Xueqin, X An improved method for the quantitation of flavonoids in Herba Leonuri by capillary electrophoresis / X. Xueqin et al. // Agric. Food Chem. 2005. - Vol. 53. - N. 15. - P. 5853-5857.

144. Yang, M. Study on the biological assay of Herba Leonuri-analysis the dosage response curve of Herba Leonuri and oxytocin and establishment of adequate potency pattern / M. Yang et al. // Zhong Yao Cai. 2002. - Vol. 25. -N. 6. -P. 409-411.

145. Yang, X. Characteriration and expression of an nsLTPs-like antimicrobial protein gene from motherwort {Leonurus japonicus) / X. Yang et al. // Plant Cell Reports. 2008. - Vol. 27. - N. 4. - P. 759-766.

146. Zheng, L. Effect of Leonurus heterophyllus Sweet on tissue factor transcription and expression in human umbilical vein endothelial cells in vitro / L. Zheng, С. H. Fang // Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 2007. - Vol. 27.-N. 6.-P. 805-808.

147. Zheng, X. K. Experimentalstudy of estrogenic activities of five kinds of Chinese herbal medicines / X. K. Zheng et al. // Zhongguo Zhong Yao Za Zhi.-2006.-Vol. 31.-N. 15.-P. 1254-1257.