Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Фармакогностическое изучение некоторых видов рода Geranium L.

На правах рукопь си

РАЗАРЕНОВА КСЕНИЯ НИКОЛАЕВНА

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ НЕКОТОРЫХ ВИДОВ РОДА GERANIUM L.

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

4 АПР 2!113

Санкт-Петербург - 2013

005051347

Диссертационная работа выполнена в ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия» Минздрава России

Научный руководитель: Жохова Елена Владимировна

кандидат фармацевтических наук, доцент

Официальные оппоненты: Буданцев Андрей Львович

доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Ботанический институт им. В. Л. Комарова Российской академии наук, заведующий лабораторией растительных ресурсов;

Половинко Андрей Евгеньевич

кандидат фармацевтических наук, доцент кафедры управления и экономики фармации, фармацевтической технологии, фармацевтической химии и фармакогнозии ГБОУ ВПО «Северо-Западный государственный медицинский университет имени И. И. Мечникова» Минздрава России

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО «Ярославская государственная медицинская академия» Минздрава России

Защита состоится «23» апреля 2013 г. в 14.00 на заседании Диссертационного Совета Д 208.088.01 при ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия» Минздрава России (197376, г. Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, д. 14)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия» Минздрава России по адресу: 197227, г. Санкт-Петербург, пр. Испытателей, д. 14.

Автореферат разослан « 21 » марта 2013 г.

Учёный секретарь

Диссертационного совета Д 208.088.01, кандидат фармацевтических наук, доцент

Наталья Владимировна Марченко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одной из многочисленных задач современной фармацевтической науки является поиск растительных источников биологически активных веществ (БАВ) для создания на их основе препаратов различного фармакологического действия. Многолетний опыт исследования лекарственных растений свидетельствует об их многостороннем воздействии на организм человека и низкой токсичности по сравнению с синтетическими лекарственными средствами.

Перспективными источниками для создания фитопрепаратов являются представители рода герань - Geranium L. Герань пятнистая - G. maculatum L. (трава и корни) включена в Британскую травяную Фармакопею. Герань каролинская - G. carolinianum L. (трава) и герань Уилфорда - G. wilfordii Maxim, (трава) входят в Государственную Фармакопею Китайской Народной Республики, а герань Тунберга - G. thunbergii Siebold et Zucc. (трава) - в Японскую Фармакопею. Данные виды рекомендованы к использованию в качестве вяжущих, гемостатических, антимикробных и противовоспалительных средств. Однако, родина гераней пятнистой и каролинской - Северная Америка, в России они в диком виде не встречаются. Герани Тунберга и Уилфорда произрастают на Дальнем Востоке. Из видов, произрастающих на северо-западе Европейской России, лишь герань Роберта - G. robertianum L. (трава) включена во Французскую Фармакопею.

На северо-западе Европейской России произрастает 12 видов рода Geranium, среди которых некоторые находят применение в народной медицине при болезнях пищеварительной системы (диарея, гастриты, колиты, энтероколиты), при воспалительных заболеваниях ротовой полости, кровотечениях различного генеза, при подагре, ревматизме.

Для видов этого рода характерно наличие комплекса полифенольных соединений в надземных и подземных органах. Однако, для большинства представителей рода сведения, касающиеся состава фенольного комплекса и других групп БАВ, фрагментарны.

Вышеприведенные факты указывают на целесообразность подробного исследования компонентного состава биологически активных соединений и фармакологической активности представителей рода Geranium с целью введения их в научную медицину.

Диссертационная работа была выполнена на кафедре фармакогнозии Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии (СПХФА) в соответствии с планом научно-исследовательских работ СПХФА по теме «Мониторинг перспективных лекарственных растений флоры России» (номер Государственной регистрации 01200852355). Фармакологические и микробиологические исследования проводились на базе лаборатории фармакологических исследований СПХФА и на кафедре микробиологии СПХФА. Исследования с использованием приборных хроматографических и спектроскопических методов выполнены в лаборатории аналитических методов НИУ академии, лаборатории экологии растительных сообществ Ботанического института им. В. JI. Комарова Российской Академии Наук и лаборатории «ООО Аналит Продактс».

Цели и задачи исследования. Целью работы является оценка возможности использования в качестве источников биологически активных веществ видов рода Geranium, произрастающих на северо-западе Европейской России, а также комплексное фармакогностическое изучение наиболее перспективных представителей данного рода. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• Провести сравнительное изучение некоторых видов рода Geranium, произрастающих на северо-западе Европейской России, по содержанию дубильных веществ и антимикробной активности и выявить наиболее перспективные объекты для дальнейших исследований;

• Провести сравнительное фотохимическое исследование отобранных на первом этапе видов рода Geranium;

• Оценить острую токсичность водных извлечений из выявленных перспективных представителей рода; изучить их антимикробную активность;

• Определить урожайность сырьевой фитомассы перспективных видов рода герань на конкретных зарослях на территории Ленинградской области;

• Установить макро- и микроскопические признаки наиболее перспективного сырья; провести товароведческий анализ для установления норм качества лекарственного растительного сырья; разработать проект нормативного документа (проект фармакопейной статьи - ФС) на сырье.

Научная новизна. Впервые определены содержание дубильных веществ и антибактериальная активность 7 дикорастущих видов рода Geranium флоры северо-запада Европейской России (G. pratense L., G. sylvaticum L., G. palustre L., G. sanguineum L., G. sibiricum L., G. robertianum L., G. pusillum L.) и культивируемого вида G. lividwn L1 Her. С помощью современных физико-химических методов (ВЭЖХ, ГЖХ, спектрофотометрии) изучен химический состав основных групп БАВ (флавоноидов, фенольных кислот, углеводов, аминокислот) надземной и подземной части G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre. Изучен компонентный состав, динамика накопления БАВ в сырье указанных видов в разные фазы развития растений. Методом атомно-абсорбционной спектроскопии определен набор макро- и микроэлементов надземной и подземной частей G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre.

Экспериментально определен уровень острой токсичности водных извлечений из надземной и подземной частей G. pratense, G. sylvaticum, в. palustre.

Проведено определение урожайности G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre в естественных условиях произрастания в Ленинградской области.

Практическая значимость. Разработана методика количественного определения суммарного содержания флавоноидов в надземной части G. pratense. Определены сроки и оптимальная фаза вегетации растения для заготовки сырья, а также оптимальный размер сырьевой части, подлежащей заготовке. Установлены критерии, позволяющие оценить подлинность и доброкачественность сырья G. pratense. Результаты работы использованы при

разработке проектов нормативных документов - ФС - на предлагаемые новые виды лекарственного сырья «Герани луговой трава» и «Герани луговой корневища с корнями». Экспериментально установлено, что водные извлечения из надземной и подземной части G. pratense обладают низкой токсичностью; также показана антибактериальная активность сухих экстрактов растения. Результаты фотохимического и фармакологического исследований надземной и подземной частей G. pratense могут быть использованы для введения этих видов сырья в практику научной медицины, а также при целенаправленном создании новых фитопрепаратов. Методика качественного и количественного определения флавоноидов и фенольных кислот методом ВЭЖХ в надземной и подземной частях G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre введена в лекционный курс по дисциплине «Фармакогнозия» для студентов фармацевтического факультета.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на: Межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых «Фармация в XXI веке: эстафета поколений», посвященная 90-летию СПХФА (Санкт-Пегербург, СПХФА 2009); Научно-методической конференции «Гаммермановские чтения - 2011» (Санкт-Петербург, СПХФА, 2011); 66-й региональной конференции по фармации и фармакологии (Пятигорск, 2011 г.); 11-ой Всероссийской научной конференции студентов и аспирантов с международным участием «Молодая фармация - потенциал будущего» (Санкт-Петербург, СПХФА, 2012); II Международной научно-практической конференции «Современная медицина и фармацевтика: анализ и перспективы развития» (Москва, 2012); Международной научно-методической конференции «Сандеровские чтения» (Санкт-Петербург, СПХФА, 2012); XVI Международном съезде «Фитофарм» (Санкт-Петербург, 2012); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященная 30-летию фармацевтического факультета ЯГМА «Инновационные процессы в лекарствоведении» (Ярославль, 2012).

Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 12 работах, в том числе 4 статьи в рецензируемых научных изданиях.

Основные положения, выносимые на защиту.

• Результаты сравнительного изучения восьми видов рода Geranium по содержанию дубильных веществ и антимикробной активности;

• Исследование динамики накопления и компонентного состава основных групп БАВ (флавоноидов, фенольных кислот, дубильных веществ, углеводов, аминокислот), а также минерального состава надземной и подземной частей G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre-,

• Результаты изучения острой токсичности водных извлечений из надземной и подземной частей G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre-,

• Критерии оценки качества и подлинности видов сырья «Герани луговой трава» и «Герани луговой корневища с корнями» по результатам товароведческого анализа и их стандартизация.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 235 страницах машинописного текста, иллюстрирована 76 рисунками и 70 таблицами. Диссертация состоит из введения, б глав (обзор литературы, материалы и методы и четыре главы, содержащие результаты экспериментальных исследований), основных результатов и выводов, списка литературы, включающего 128 источников, из них 52 на иностранных языках и 5 приложений.

В первой главе рассмотрены систематическое положение, химический состав и биологическая активность некоторых видов рода Geranium. Во второй главе приведены основные материалы и методы исследований, использованные в экспериментальной работе. В третьей главе приведены результаты сравнительного изучения восьми видов рода Geranium по содержанию дубильных веществ и антимикробной активности. В четвертой главе приведены результаты сравнительного фотохимического и фармакологического анализа надземной и подземной частей G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre, а также результаты определения урожайности сырья G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre на конкретных зарослях на территории Ленинградской области. В пятой главе отражены результаты исследования антимикробной активности сухих экстрактов, полученных на основе надземной и подземной части G. pratense. Шестая глава посвящена вопросам стандартизации сырья «Герани луговой трава» и «Герани луговой корневища с корнями», проведению товароведческого анализа, разработке критериев подлинности, нормативов доброкачественности и определению сроков годности сырья. В разделе «Основные результаты и выводы» приведены заключительные результаты и выводы по проделанной работе. Приложение А включает список исследованных образцов видов рода Geranium-, Приложение Б - проект ФС на сырье «Герани луговой трава» и пояснительную записку к нему; Приложение В - проект ФС на сырье «Герани луговой корневища с корнями» и пояснительную записку к нему; Приложение Г - фотографии исследованных видов рода Geranium, сделанные автором во время экспедиций в июне-августе 2009 года; Приложение Д - Акт о внедрении результатов диссертационной работы.

Автор выражает признательность администрации СПХФА в лице ректора академии профессора И. А. Наркевича за предоставленную возможность для выполнения диссертационной работы. Автор выражает глубокую благодарность сотрудникам отдела гербария БИН РАН Конечной Г. Ю. и Ефимову П. Г. за помощь в заготовке образцов сырья видов рода Geranium, заведующей лаборатории фармакологических исследований Бурякиной А. В., доценту кафедры микробиологии Караваевой А. В. и сотруднику лаборатории аналитических методов Сипкиной Н. Ю. за помощь в проведении химических и биологических экспериментов.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Материалы и методы исследования Исследования проводились на 62 образцах сырья 8 видов рода Geranium (G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre, G. sanguineum, G. sibiricum, G. robertianum, G. pusillum, G. lividum), заготовленных в Ленинградской, Псковской и Новгородской областях в 2009-2012 годах.

Обнаружение основных групп БАВ в исследованных образцах и изучение компонентного состава флавоноидов, фенольных кислот, углеводов, аминокислот, макро- и микроэлементов проводили с помощью общепринятых химических реакций, хроматографии на бумаге (БХ) и современных физико-химических методов: УФ-спекгрофотометрии, атомно-абсорбционной спекгрофотометрии, ВЭЖХ, ГЖХ. Для определения антимикробного действия использовали водные и водно-спиртовые извлечения из образцов сырья видов рода Geranium. Исследования острой токсичности для водных извлечений из надземной и подземной части G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre проводили на белых нелинейных мышах самцах массой тела 18-23 г.

Определение урожайности сырья на основе надземной и подземной части G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre проводили в пределах конкретных зарослей, расположенных в Гатчинском и Всеволожском районах Ленинградской области.

Отбор проб и товароведческий анализ сырья проводили в соответствии с требованиями ОФС 42-0013-03 «Правила приемки лекарственного растительного сырья и методы отбора проб» (2003) и ГФ XI, вып. 1, 2. Составление проекта нормативной документации -фармакопейной статьи на сырье осуществляли в соответствии с ОСТ 91.500.05.001-00. «Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения» (2000).

2. Результаты исследования Сравнительное исследование некоторых видов рода Geranium по содержанию дубильных веществ и антимикробной активности

Объектами исследования служили образцы надземной части 8 видов рода Geranium (фаза цветения-начала плодоношения): G. pratense, G. palustre, G. sylvaticum, G. sanguineum, G. robertianum, G. sibiricum, G. pusillum и G. lividum. Для G. pratense, G. palustre и G. sylvaticum исследовали также подземную часть (фаза плодоношения).

Для сравнительной оценки содержания дубильных веществ в указанных видах гераней использовали перманганатометрический метод Левенталя (ГФ XI), перманганатометрический метод в сочетании с осаждением дубильных веществ желатином и спектрофотометрический метод. При количественном определении дубильных веществ спектрофотометрическим методом применяли аналитическую длину волны 274±2 нм, так как при данной длине волны максимумы поглощения водно-спиртового извлечения из надземных и подземных частей разных видов герани и препарата танина (ГФ X) совпадают.

Результаты количественного определения дубильных веществ тремя методами представлены в таблице 1.

Для G. sibiricum, G. robertianum, G. pusillum и G. lividum желатиновый метод оказался непригодным, т.к. при добавлении раствора желатина к водной вытяжке из надземной части указанных гераней выраженный осадок не образовывался. Спектрофотометрический метод неприемлем в отношении G. lividum, т.к. спеюр поглощения спирто-водного извлечения из данной герани не имеет выраженного максимума в диапазоне длин волн 200-500 нм.

Таким образом, согласно полученным данным среди анализируемых видов рода герань наибольшее содержание дубильных веществ отмечено для надземной и подземной частей G. sylvaticum, G. pratense, G. palustre, а также для надземной части G. sanguineum.

Таблица 1 - Результаты определения содержания дубильных веществ в исследуемых видах рода Geranium (в % в пересчете на танин в пересчете на воздушно-сухое сырье)

N п/п Вид и его анализируемая часть Методы количественного анализа дубильных веществ

Пермангана-тометрический Желатиновый метод Спекгрофото-метрический

1. G. pratense, надземная часть 15,04±0,48 3,604:0,18 9,70±0,48

G. pratense, подземная часть 23,40±0,28 14,32±0,43 13,92±0,36

2. G. palustre, надземная часть 13,93±0,33 5,62±0,28 7,29±0,33

G. palustre, подземная часть 21,09±0,76 15,51±0,47 4,74±0,15

3. G. sylvaticum, надземная часть 10,53±0,42 4,34±0,22 6,55±0,29

G. sylvaticum, подземная часть 23,55±0,31 14,96±0,21 8,41±0,43

4. G. sanguineum, надземная часть 13,71±0,35 8,08±0,42 7,57±0,28

5. G. sibiricum, надземная часть 6,97±0,09 - 4,48±0,22

6. G. robertianum, надземная часть 7,32±0,3б - 4,13±0,17

7. G. pusillum, надземная часть 7,64±0,38 - 4,22±0,18

8. G. lividum, надземная часть 4,5б±0,24 - -

Антимикробную активность водных и 70%-спиртовых извлечений из 8 видов герани определяли методом радиальной диффузии в агар согласно методике ГФ XII. Использовали следующие тест-микроорганизмы: Escherichia coli АТСС 25922, Pseudomonas aeruginosa АТСС 9027, Staphylococcus aureus АТСС 209-P, Bacillus cereus ATCC 10702. В качестве объекта сравнения использовали корневища лапчатки прямостоячей - Potentilla erecta L. Результаты исследования представлены в таблице 2.

В результате было установлено, что G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre проявили наиболее выраженную антибактериальную активность среди 8 видов (таблица 2), что коррелирует с содержанием дубильных веществ.

Таблица 2 - Антимикробная активность водных и водно-спиртовых вытяжек из надземной и подземной частей различных видов рода Geranium ___

Образец S. aureus \ Е. coli | В. cereus \ P. aeruginosa

диаметр задержки роста микроорганизмов в мм

В С В С В С В С

G. palustre надземная часть 10 14 14 9 13 9 13 14

подземная часть 11-12 13 9 0 8 13 0 14

G. sylvaticum надземная часть 9-10 0 0 0 14 0 9 15

подземная часть 9-10 14 14 0 10 12 14 15

G. pratense надземная часть 0 12 0 0 14 9 0 12

подземная часть 13-14 12 17 0 10 9 10 9

G. sanguineum надземная часть 0 15 0 0 0 0 0 0

G. robertianum надземная часть 0 8 0 0 0 0 0 12

G. sibiricum надземная часть 0 8 0 0 0 0 0 0

G. pusillum надземная часть 0 0 0 0 0 0 0 12

G. lividum надземная часть 0 0 0 0 0 9 0 0

Potentilla erecta корневища 12 13 0 0 0 9 12 13

Примечание. В - водное извлечение; С - спиртовое извлечение.

Для водных и 70%-спиртовых извлечений из надземных и подземных частей трех названных видов выявлена активность в отношении грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, в том числе спорообразующих.

С учетом полученных данных по количественному содержанию дубильных веществ и антимикробной активности для дальнейших исследований выбраны три многолетних корневищных вида - G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre, которые являются еще и наиболее часто встречаемыми на северо-западе Европейской России видами среди представителей рода герань.

Сравнительное фитохимическое исследование G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre

На основании проведенного общего фотохимического анализа установлено, что основными группами БАВ G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre являются полифенольные соединения, полисахариды, аминокислоты. В надземной и подземной частях исследуемых видов обнаружены гидролизуемые и конденсированные дубильные вещества и фенольные кислоты, в надземной части кроме того показано наличие флавоноидов. Три исследуемых вида содержат незначительные количества сапонинов и азотсодержащих соединений, не содержат кардиотонических гликозидов, антраценпроизводных, кумаринов и эфирного масла.

При исследовании динамики накопления экстрактивных веществ, извлекаемых спиртом этиловым 40%, установлено, что при увеличении длины побегов G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre содержание экстрактивных веществ уменьшается. В качестве оптимального размера сырьевой части нами рекомендовано заготавливать побеги длиной до 20-25 см. При сравнительном изучении содержания экстрактивных веществ, извлекаемых спиртом этиловым 40%, отдельно в корневищах и в корнях исследуемых видов получено, что в корнях их больше, чем в корневищах. Следовательно, в качестве сырья на основе подземных органов мы рекомендуем использовать корневища с корнями.

Изучение компонентного состава и содержания фенольных кислот и флавоноидов осуществляли методом ВЭЖХ. В надземной и подземной частях G. pratense и G. sylvaticum, а также в надземной части G. palustre обнаружены галловая и эллаговая кислоты. В надземной части G. pratense и G. palustre идентифицирована протокатеховая кислота. В надземной часта G. sylvaticum и G. palustre обнаружена хлорогеновая кислота. Гиперозид был идентифицирован в надземной части трех исследуемых видов. В надземной части G. pratense кроме того был обнаружен изокверцитрин. В G. sylvaticum и G. palustre все названные соединения были идентифицированы впервые. В G. pratense впервые обнаружена протокатеховая кислота. Примеры хроматограмм спиртовых извлечений из исследуемых видов приведены на рисунках 1-2. В подземной части G. palustre при проведении ВЭЖХ-исследования названные соединения не были обнаружены (таблица 3).

Установлено, что среди рассматриваемых объектов максимальное количество свободной галловой кислоты отмечено в надземной части G. pratense (таблица 3). Этот вид отличается от G. sylvaticum и G. palustre также максимальным содержанием свободной эллаговой кислоты в надземной и подземной частях. Однако, по содержанию флавоноидного гликозида гиперозида надземная часть G. pratense уступает надземной части G. sylvaticum и G. palustre.

Рисунок 1 - Хроматограммы (ВЭЖХ) спиртового извлечения травы G. pratense (I - длина волны 271 нм, III - длина волны 254 нм, IV - длина волны 354 нм) и травы G. palustre (II - длина волны 261 нм): 1 - галловая кислота, 2 - хлорогеновая кислота, 3 - эллаговая кислота, 4 - гиперозид, 5 -изокверцитрин. Условия хроматографирования: прибор - хроматограф фирмы «Shimadzu» (Япония), модель LC - 20АВ Prominence, колонка Zorbax Eclipse XDB С18, 250x4,6 мм, 5 мкм, детектор диодно-матричный SPD - М20А, элюент А - раствор кислоты трифторуксусной 0,03%, элюент В - ацетонитрил, режим градиентного элюирования.

« <5mlíi

40 «min

Рисунок 2 - Хроматограммы (ВЭЖХ) спиртового извлечения корневищ с корнями G. sylvaticum (I - длина волны 271 нм) и G. pratense (П - длина волны 254 нм): 1 - галловая кислота, 2 -эллаговая кислота

У

и

4

ІІь^^Ьд

vXÁ—А_Л_-

Рисунок 3 - Хроматограммы (ВЭЖХ) гидролизата травы G. pratense (I - длина волны 261 нм, II -длина волны 365 нм, III - длина волны 254 нм) и корневищ с корнями G. pratense (IV - длина волны 254 нм): 1 - протокатеховая кислота, 2 - кверцетин, 3 - кемпферол, 4 - эллаговая кислота

Таблица 3 - Содержание фенольних соединений в надземной и подземной частях G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre (сбор 2010 года, фаза конца цветения-начала плодоношения)

Название соединения Время удерживания, мин Содержание обнаруженных фенольных соединений, среднее значение определения в мг/г абсолютно-сухого сырья

G. pratense надземная часть G. sylvaticum надземная часть G, palustre надземная часть G. pratense подземная часть G. sylvaticum подземная часть G. palustre подземная часть

Галловая кислота 3,88 3,57 0,17 1,50 0,92 1,38 -

Эллаговая кислота 29,38 5,14 2,29 0,55 8,83 1,76 -

Протокатеховая кислота 6,95 0,23 - 0,38 - - -

Хлорогеновая кислота 12,55 - 1,85 2,98 - - -

Гиперозид 29,92 1,69 3,02 3,26 - - -

Изоквер-цитрин 30,39 0,24 - - - - -

Примечение. Прочерк означает отсутствие компонента на хроматограмме.

С целью установления, какие фенольные соединения трех исследуемых видов находятся в связанной форме, а какие в свободном состоянии, методом ВЭЖХ было проведено исследование гидролизатов их сырья. Гидролизаты были получены при кипячении сырья с кислотой хлористоводородной 2М с последующей обработкой экстракта этилацетатом. Этилацетатную фазу отделяли, этилацетат отгоняли, полученный сухой остаток растворяли в спирте и исследовали методом ВЭЖХ.

Хроматограммы гидролизатов G. pratense приведены на рисунке 3. В шдролизатах надземной и подземной частей G. pratense, G. sylvaticum, а также в гидролизате надземной части G. palustre были идентифицированы галловая кислота, эллаговая кислота и протокатеховая кислота. Рассчитанное количество указанных фенольных соединений в гидролизате превышало их содержание в суммарных извлечениях из сырья, что свидетельствует о присутствии в исходных образцах галлотаннинов, эллаготаннинов, производных протокатеховой кислоты. В шдролизатах надземной части G. palustre и G. sylvaticum идентифицирована кофейная кислота, являющаяся, вероятно, продуктом гидролиза хлорогеновой кислоты, обнаруженной в надземной части названных видов и не обнаруженной в их гидролизате. В гидролизате надземной части трех исследуемых видов идентифицированы флавоноловые агликоны кверцетин и кемпферол.

Для оценки количественного содержания флавоноидов в сырье исследуемых видов была разработана методика дифференциальной спектрофотометрии. Установлены следующие условия: стандартный образец - рутин; аналитическая длина волны 410 нм, комплексообразователь - алюминия хлорида спиртовый раствор 1%, экстрагент спирт этиловый 40%, режим экстракции - трехкратная мацерация на кипящей водяной бане по 30 минут на каждой ступени, соотношение сырья и экстрагента 1:30. Оптимальный размер частиц сырья - 2 мм. Время взаимодействия алюминия хлорида с флавоноидами - 30 минут.

Проведена валидационная оценка методики. Установлено, что предложенная методика отвечает современным требованиям: она специфична, носит линейный характер, позволяет получить достоверные результаты, воспроизводима в условиях лаборатории. Относительная ошибка опыта не превышает 5%. С использованием разработанной методики была определена динамика накопления суммы флавоноидов в надземной части G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre в разные фазы вегетации (таблица 4).

Таблица 4 - Результаты определения содержания флавоноидов (в % в пересчете на абсолютно-сухое сырье) в различные фазы вегетации в надземной части G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre

Объект Содержание ( лавоноидов (%) по фазам развития растения

Б Ц кЦ-нП П-нС

G. pratense 3,21±0,08 3,48±0,14 3,81±0,19 2,61±0,12

G. sylvaticum 3,65±0,15 2,22±0,04 3,42±0,17 2,93±0,15

G. palustre 2,70±0,14 2,27±0,11 1,89±0,09 2,18±0,09

Примечание. Б - бутонизация, Ц - цветение, кЦ-нП - конец цветения-начало плодоношения, П-нС - плодоношение-начало осыпания семян (массовое созревание плодов).

Наибольшее количество флавоноидов для G. pratense отмечено в фазу цветения-плодоношения. Для G. sylvaticum, G. palustre максимум содержания флавоноидов определен в период бутонизации.

Количественное содержание суммы таннидов в сырье определяли в сравнении двумя методами: перманганатометрическим титрованием по методике ГФ XI (метод 1) и спекгрофотометрически в пересчете на кислоту галловую согласно методике, разработанной для сырья на основе надземной и подземной частей G. pratense (метод 2).

При разработке спектрофотометрической методики определения суммарного содержания дубильных веществ длина волны 274 нм была предложена в качестве аналитической, т.к. максимумы поглощения УФ-спеюров водно-спиртовых вытяжек из надземной и подземной частей трех исследуемых видов совпадают с максимумами поглощения УФ-спекгров раствора кислоты галловой. Кислота галловая была выбрана в качестве стандартного образца еще и потому, что она была обнаружена ранее методом ВЭЖХ в свободном виде в трех исследуемых видах.

Установлены технологические параметры методик: а) для травы G. pratense оптимальная степень измельчения сырья составляет 2 мм; для полноты извлечения необходима однократная экстракция спиртом этиловым 40% на кипящей водяной бане в течение 30 мин при соотношении сырья и экстрагента 1:100; б) для корневищ с корнями G. pratense наиболее полное извлечение дубильных веществ достигается с использованием спирта этилового 40%, в образцах сырья со степенью измельченности 2 мм, при нагревании на кипящей водяной бане в течение 90 мин и соотношении сырья и экстрагента 1:125.

Проведена валидационная оценка разработанных методик. Установлено, что предложенные методики отвечают современным требованиям.

В результате использования двух методов количественного определения в образцах сырья трех иследуемых видов выявлена тенденция изменения содержания таннидов по фазам

вегетации растений (таблица 5). Для изученных образцов надземной и подземной частей видов герани результаты метода 1 коррелируют с результатами метода 2. При этом более высокие значения по содержанию таннидов во всех образцах (за исключением корневищ с корнями G. palustre) получены методом перманганатометрии, что может быть объяснено различной избирательностью данных методик в отношении этой группы фенольных соединений.

Таблица 5 - Количественное содержание дубильных веществ (в % в пересчете на абсолютно-сухое сырье) в траве и корневищах с корнями G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre

Вид герани Фаза вегетации Содержание дубильных веществ, %

трава корневища с корнями

метод 1 метод 2 метод 1 метод 2

Б 21,62±1,07 10,56±0,19 38,82±0,35 24,63±1,23

G. pratense Ц 22,62±1,12 11,13±0,21 32,70±0,85 16,04±0,73

кЦ-нП 23,90±0,57 10,83±0,39 34,07±1,53 17,15±0,81

П-нС 17,67±0,72 8,19±0,22 34,39±1,41 17,38±0,67

Б 28,80±0,71 13,22±0,44 42,05±1,77 13,58±0,64

G. sylvaticum нЦ 20,92±0,59 9,57±0,21 37,98±1,82 11,31±0,0б

кЦ-нП 26,78±0,86 12,54±0,42 38,64±1,41 13,71±0,54

П-нС 22,11±0,64 10,32±0,24 28,4б±1,17 11,57±0,53

Б 37,68±1,20 19,90±0,84 27,29±1,25 4,16±0,21

G. palustre Ц 34,27±0,34 17,88±0,29 28,79±1,35 5,27±0,17

кЦ-нП 30,58±1,29 15,94±0,29 28,74±1,52 4,23±0,20

П-нС 27,10±1,07 14,49±0,21 23,7111,05 3,23±0,06

Примечание. Обозначение - см. таблицу 4.

Наибольшее содержание дубильных веществ в надземной части G. sylvaticum и G. palustre, а также в корневищах с корнями G. sylvaticum и G. pratense отмечается в фазу бутонизации. В надземной части G. pratense максимум накопления таннидов приходится на период с начала цветения до начала плодоношения. В подземной части G. palustre максимальное количество дубильных веществ определено в фазу цветения.

Из надземной и подземной частей G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre были выделены свободные моносахариды (CMC) и полисахаридные комплексы: водорастворимые полисахариды (ВРПС, или полисахаридная фракция-1, ПФ-1) и полисахаридная фракция-2 (ПФ-2). CMC извлекали спиртом этиловым 82% из сырья, предварительно очищенного от липофильных веществ, ПФ-1 - водой из шрота, оставшегося после выделения свободных моносахаридов, ПФ-2 - раствором аммония оксалата и кислоты щавелевой 0,4% (1:1) при 80°С из шрота, оставшегося после выделения полисахаридной фракции-1. Хроматографическими методами (БХ, ГЖХ триметилсилильных производных) среди свободных моносахаридов надземной и подземной частей G. pratense, G. sylvaticum и G. palustre идентифицированы манноза, глюкоза, галактоза, рамноза, арабиноза. В составе CMC подземной части G. pratense, G. sylvaticum и G. palustre преобладает глюкоза.

Мономерный состав комплексов ПФ-1 (ВРПС) и ПФ-2 определяли методами БХ и ГЖХ после их гидролиза раствором кислоты трифторуксусной 2% и 20% соответственно.

Результаты показали, что комплексы ВРПС из надземной и подземной частей G. pratense, G. sylvaticum и G. palustre построены из остатков нейтральных моносахаридов: маннозы, глюкозы, галактозы, рамнозы, арабинозы, ксилозы - и кислоты галактуроновой. В составе ВРПС из образцов надземной части G. pratense, G. sylvaticum и G. palustre преобладает манноза и галактуроновая кислота. Основным мономерным звеном комплексов ВРПС подземной части G. pratense, G. sylvaticum и G. palustre является глюкоза. Для ВРПС подземной части G. palustre следует отметить кроме того высокое содержание галактуроновой кислоты.

Установлена динамика содержания CMC и ВРПС в сырье исследуемых видов по фазам вегетации спекгрофотометрическим методом после реакции с фенолом и кислотой серной концентрированной в пересчете на галактозу (таблица 6).

Максимальное накопление CMC наблюдалось в фазу бутонизации во всех объектах исследования, за исключением корневищ с корнями G. pratense. В подземной части G. pratense максимум содержания CMC приходился на фазу конца цветения - начала плодоношения. Для всех образцов сырья максимальное накопление ВРПС отмечалось в фазу цветения.

Таблица 6 - Содержание свободных моносахаридов (CMC) и водорастворимых полисахаридов (ВРПС) (в % в пересчете на абсолютно-сухое сырье) в различные фенофазы в надземной и подземной части G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre

Вид герани Фаза вегетации Содержание углеводов, %

надземная часть подземная часть

CMC ВРПС CMC ВРПС

G. pratense Б Ц кЦ-нП П-нС 10,7±0,5 10,0±0,4 10,4±0,5 7,8±0,3 7,5±0,3 8,8±0,4 5,5±0,2 6,8±0,3 6,9±0,3 8,3±0,4 9,3±0,4 9,3±0,2 6,2±0,2 6,9±0,3 3,4±0,1 5,9±0,1

G. sylvaticum Б нЦ кЦ-нП П-нС 10,5±0,5 9,3±0,4 9,8±0,4 7,9±0,3 5,9±0,2 7,5±0,2 5,9±0,1 5,9±0,2 9,0±0,3 8,3±0,3 8,4±0,4 6Д±0,2 2,9±0,1 6,4±0,3 2,б±0,1 5,8±0,3

G. palustre Б Ц кЦ-нП П-нС 5,3±0,2 3,8±0,2 3,8±0,1 4,4±0,2 2,8±0,1 3,9±0,1 2,2±0,1 2,7±0,1 7,1±0,3 6,8±0,2 2,2±0,1 2,8±0,1 2,9±0,1 5,5±0,2 2,3±0,1 3,0±0,1

Примечание. Обозначение - см. таблицу 4.

В составе комплексов ПФ-2 всех образцов установлено присутствие нейтральных (арабиноза, глюкоза, галактоза и рамноза) моносахаров. В составе ПФ-2, выделенных из образцов надземной части G. pratense, G. sylvaticum и G. palustre, обнаружена также галактуроновая кислота. Среди мономеров комплексов ПФ-2 образцов надземной части G. pratense, G. sylvaticum и G. palustre преобладает галактоза. Для ПФ-2, изолированных из образцов подземной части G. pratense, G. sylvaticum и G. palustre, основным мономерным звеном является глюкоза.

Изучение аминокислотного состава надземной части G. pratense, G. sylvaticum и G. palustre и подземной части G. pratense проводили методами БХ и ВЭЖХ фенилтиокарбаматных производных.

В надземной части G. pratense выявлено 20 аминокислот, из которых доминируют аргинин, серин, аспарагин (таблица 7). В надземной части G. sylvaticum обнаружены 19 аминокислот, из них по количественному содержанию преобладают аргинин, пролин, метионин, аланин. Надземная часть G. palustre в значительном количестве накапливает аргинин, пролин, метионин, серин, изолейцин среди 19 идентифицированных аминокислот. Среди обнаруженных свободных аминокислот надземной части G. pratense - 10 незаменимых (гистидин, аргинин, треонин, валин, изолейцин, лейцин, фенилаланин, лизин, метионин, триптофан). Все те же незаменимые аминокислоты (за исключением треонина) идентифицированы в надземной части G. sylvaticum и G. palustre.

Таблица 7 - Содержание свободных аминокислот (мг/г воздушно-сухого сырья) в надземной части G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre и подземной части G. pratense (сбор 2011 года, фаза конца цветения-начала плодоношения) __

Аминокислота подземная часть G. pratense надземная часть

G. pratense G. sylvaticum G. palustre

Аспарагин не обнаружен 1,17±0,14 0,36±0,04 0,050±0.006

Глутамин 0,42±0,05 0,93±0,11 0,58±0,07 0,23±0,02

о-Пролин 0,030±0,003 0,43±0,05 0,09±0,01 0,050±0,005

Серин 0,11±0,01 1,10±0,13 0,21±0,02 2,65±0,31

Глицин 0,20±0,02 0,16±0,02 0,17±0,02 0,22±0,02

Гистидин не обнаружен 0,08±0,01 0,18±0,02 0.12±0,01

Аргинин 0,34±0,04 1,60±0,19 1,32±0,15 1,84±0,22

Треонин не обнаружен 0,31 ±0,03 не обнаружен не обнаружен

Аланин 1,4б±0,17 0,11±0,01 1,21±0.14 0,32±0,03

Пролин 3,37±0,40 0,87±0,10 4,00±0,48 1,40±0,16

Тирозин 0,16±0,02 0,12±0,01 0,22±0,02 0,39±0.04

Валин 0,020±0,002 0,060±0,007 0,36±0,04 0,27±0,03

и-Лейцин 0,57±0,07 0,16±0,01 0,48±0,05 4,15±0,48

Лейцин 0,12±0,01 0,22±0,02 0,070±0,008 0,40±0,04

Фенилаланин не обнаружен 0,09±0,01 0,08±0,01 0,040±0,005

Лизин 3,02±0,36 0,30±0,03 0,160±0,019 0,040±0,004

Сумма Цисгин-Цистеин 0,12±0,01 0,84±0,10 0,160±0,017 0,110±0,013

Метионин 3,15±0,38 0,19±0,02 3,48±0,42 1.15±0,14

Триптофан 0,22±0,02 0,016±0,002 0,037±0,004 0,030±0,003

Суммарное содержание 13,31±1,59 8,76±1,05 13,17±1,58 13,46±1,61

В подземной части G. pratense идентифицировано 16 аминокислот, из которых 7 незаменимых. Установлено, что корневища с корнями G. pratense в значительных

количествах накапливают аланин, пролин, лизин метионин. Эти аминокислоты в подземной части накапливаются в больших количествах по сравнению с надземной частью G. pratense.

Общее содержание аминокислот составило 8,76, 13,17 и 13,46 мг/г воздушно-сухого сырья для надземной части G. pratense, G. sylvaticum и G. palustre соответственно. В корневищах с корнями G. pratense этот показатель составил 13,31 мг/г воздушно-сухого сырья, что выше, чем в надземной части.

Определение макро- и микроэлементов проводили атомно-абсорбционным методом на спектрофотометре «Квант-АФА». Полученные результаты представлены в таблицах 8, 9.

Таблица 8 - Содержание макроэлементов (в мг/г в пересчете на воздушно-сухое сырье) в надземной части и корневищах с корнями G pratense, G sylvaticum, G. palustre (сбор 2011 года, фаза конца цветения-начала плодоношения)

Объект Са Mr К

G. palustre надземная часть 20,3±0,7 3,96±0,02 10,8±0,1

подземная часть 47,2±0,9 2,28±0,10 3,70±0,18

G. pratense надземная часть 19,3±0,9 2,47±0,01 15,80±0,13

подземная часть 16,3±0,5 2,17±0,01 7,02±0,07

G. sylvaticum надземная часть 13,5±0,3 2,29±0,06 17,00±0,17

подземная часть 9,8±0,1 1,92±0,02 6,24±0,12

Установлено, что G. palustre и G. pratense аккумулируют Са и Mg в большем количестве по сравнению с G. sylvaticum (таблица 8).

Таблица 9 - Содержание микроэлементов (в мкг/г в пересчете на воздушно-сухое сырье) в надземной части и корневищах с корнями G pratense, G. sylvaticum, G. palustre (сбор 2011 года, фаза конца цветения-начала плодоношения)

Объект Fe Мп Zn Си Ni

G. palustre надземная часть 10,0±0,6 2,53±0,03 21,9±1,0 4,87±0,17 менее 0,1

подземная часть 4,38±0,13 2,55±0.07 95,1±0,9 2,67±0,21 менее 0,1

G pratense надземная часть 13,9±0,7 12Д±0,3 23,1±0,6 3,78±0,08 0,49±0,01

подземная часть 4,02±0,11 2,40±0,03 69,9±1,6 3,40±0,03 менее 0,1

G sylvaticum надземная часть 17,5±0,1 46,2±1,0 36,0±0,8 3,59±0,13 0,56±0,04

подземная часть 21,7±0,8 32,6±1,0 250±4 3,94±0,03 1,61±0,01

G. sylvaticum характеризуется значительно большим накоплением Fe, Мп и Zn в надземной части и корневищах с корнями в сравнении с G. palustre и G. pratense (таблица 9).

Сравнительное исследование острой токсичности G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre

В опытах на мышах токсичность определяли с использованием метода Прозоровского при внутрибрюшинном введении водных извлечений из надземной и подземной частей G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre. Средняя смертельная доза (LD50) составила 2060 мг/кг, 1640 мг/кг и 1910 мг/кг для надземной части G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre соответственно (мг воздушно-сухого сырья, из которого получали водное извлечение вышеописанным способом на кг массы тела животного). Для подземной части G. pratense и G. sylvaticum LDJ0 составила 1410 мг/кг и 971 мг/кг соответственно. Для корневищ с корнями G. palustre величину LD50 определить не удалось, т.к. при внутрибрюшинном введении отвара корневищ с корнями G. palustre в дозе до 5000 мг/кг (в пересчете на воздушно-сухое сырье) и включительно гибели мышей и симптомов отравления среди животных не наблюдали. Полученные значения LD5() свидетельствуют о том, что трава G. pratense, G. palustre и G. sylvaticum, корневища с корнями G. pratense и G. sylvaticum согласно градации Hodge и Sterner относятся к малотоксичным средствам при внутрибрюшинном введении в форме водного извлечения. Корневища с корнями G. palustre практически нетоксичны.

Урожайность G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre в Ленинградской области

Определение урожайности сырья G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre проводили в пределах конкретных зарослей методом учетных площадок для надземной части и методом модельных экземпляров для подземной части исследуемых видов. Урожайность воздушно-сухого сырья составила: для травы G. pratense - 90,4±10,4 г/м2, для травы G. sylvaticum -49,3±7,4 г/м2, для травы G. palustre - 62,5±б,0 г/м2. Урожайность воздушно-сухого сырья корневищ с корнями составила: для G. pratense - 161,6±26,8 г/м2, для G. sylvaticum -162,8±23,4 г/м2, для G. palustre - 83,2±11,5 г/м2.

Проведенные фотохимические исследования показали, что G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre близки по качественному составу полифенольных соединений, углеводов, аминокислот, микро- и макроэлементов, но отличаются по количественному содержанию отдельных компонентов названных групп Б AB. С учетом вышеполученных данных и результатов исследования острой токсичности и урожайности видов герани, надземная и подземная части G. pratense представляются наиболее перспективными объектами для введения в научную медицину.

Изучение антимикробной активности G. pratense

Определение антимикробной активности сухих экстрактов, полученных извлечением из сырья G. pratense спиртом этиловым 40%, проводили методом серийных разведений. Микробная нагрузка составила 103 клеток в 1 мл питательной среды. Максимальная концентрация экстрактов в опыте достигала величины 2 мг/мл питательной среды.

Сухой экстракт травы герани луговой обладал антимикробной активностью в отношении S. aureus и В. cereus, и не обладал в отношении Р. aeruginosa и Е. coli в условиях данного эксперимента (таблица 10). Сухой экстракт корневищ с корнями герани луговой обладал антимикробной активностью в отношении S. aureus, В. cereus и Р. aeruginosa и не обладал в отношении Е. coli в условиях данного эксперимента.

Таблица 10 - Минимальные ингибирующие и бактерицидные концентрации сухих экстрактов травы и корневищ с корнями G. pratense

Тест-микроорганизм Сухой экстракт ті равы G. pratense Сухой экстракт корневищ с корнями G. pratense

МИК, мкг/мл МБК, мкг/мл МИК, мкг/мл МБК, мкг/мл

S. aureus 1000 1000 250 500

В. cereus 1000 1000 1000 1000

Р. aeruginosa - - 2000 -

Е. coli - - - -

Примечание. МИК - минимальная ингибирующая концентрация; МБК - минимальная бактерицидная концентрация. Прочерк означает неэффективность экстракта в отношении указанной микробной нагрузки.

Разработка показателей подлинности и качества сырья «Герани луговой трава» и «Герани луговой корневища с корнями»

Для определения оптимальных сроков заготовки сырья G. pratense методом ВЭЖХ была исследована динамика накопления индивидуальных фенольных соединений в ее надземной и подземной частях в зависимости от фазы развития (таблицы 11, 12).

Таблица 11 - Содержание фенольных соединений в надземной части G. pratense в зависимости от фазы развития растения

Название соединения Время удерживания, мин Содержание идентифицированного фенольного соединения, среднее значение определения в мг/г абсолютно-сухого сырья G. pratense

Б Ц кЦ-нП П-нС

Галловая кислота 3,88 1,47 1,60 3,57 0,45

Эллаговая кислота 29,38 1,22 1,92 5,14 3,46

Протокатехо-вая кислота 6,95 0,30 0,37 0,23 0,18

Гиперозид 29,92 3,47 0,95 1,69 1,16

Изокверцитрин 30,39 0,17 - 0,24 -

Рутин 29,14 0,54 - - -

Примечение. Б - бутонизация, Ц - цветение, кЦ-нП - конец цветения-начало плодоношения, П-нС - плодоношение-начало осылания семян. Прочерк означает отсутствие компонента на хроматограмме.

В надземной части G. pratense содержание галловой и эллаговой кислот достигает максимальной концентрации в фазу цветения - плодоношения и заметно снижается в остальные фазы. Концентрация протокатеховой кислоты максимальна в фазу цветения. Содержание гиперозида максимально в фазу бутонизации и заметно снижено в остальные фазы. Установлено, что рутин определяется только в фазу бутонизации. Изокверцитрин определяется в достаточном количестве только в фазы бутонизации и цветения - начала плодоношения (таблица 11).

В подземной части G. pratense содержание галловой кислоты достигает максимума в фазу бутонизации. Эллаговая кислота определяется только в фазу цветения - плодоношения, при этом ее содержание достигает значительной величины (таблица 12).

Таблица 12 - Содержание фенольных соединений в подземной части G. pratense в зависимости от фазы развития растения

Название соединения Время удерживания, мин Содержание идентифицированного фенольного соединения, среднее значение определения в мг/г абсолютно-сухого сырья С.рпйетг

Б ц кЦ-нП П-нС

Галловая кислота 3,88 3,74 3,18 0,92 1,99

Эллаговая кислота 29,38 - - 8,83 -

Примечение. Обозначение - см. таблицу 11.

С учетом полученных данных заготовка надземной части G. pratense должна осуществляться в фазы цветения и цветения - начала плодоношения, т. к. в этот период отмечено максимальное содержание суммы флавоноидов, дубильных веществ, галловой и

эллаговой кислот. Заготовку подземной части G. pratense целесообразно проводить одновременно с надземной частью, т. е. в период цветения - начала плодоношения.

При изучении микроскопических признаков травы G. pratense, было выявлено, что препараты с поверхности листьев и чашелистиков имеют сходное строение по типу устьиц (аномоцитный) и наличию волосков двух типов: простые одноклеточные волоски и головчатые волоски, имеющие короткую одноклеточную ножку и овальную одноклеточную головку. Вдоль жилок чашелистиков располагаются головчатые волоски с одноклеточной головкой и длинной многоклеточной ножкой. В мезофилле листа вдоль жилок и в основании листовой пластинки присутствуют друзы кальция оксалата. Особенностью анатомического строения венчика следует считать сосочковидный извилистостенный эпидермис, наличие головчатых волосков с одноклеточной головкой и короткой многоклеточной ножкой. Стебель имеет пучковое строение, пучки открытого коллатерального типа. На периферии центрального осевого цилиндра располагается склеренхима перициклического происхождения, представленная древесными волокнами.

При исследовании анатомических признаков корневищ с корнями G. pratense установлено, что корневища имеют пучковое строение, пучки открытые коллатеральные, располагаются в один ряд по кругу. Подавляющее большинство паренхимных клеток коры, сердцевины и серцевинных лучей заполнено крахмальными зернами, в некоторых клетках отмечены друзы кальция оксалата. Корни по анатомическому строению отличаются от корневища наличием двухлучевой первичной ксилемы в центре. Клетки коры и сердцевинных лучей имеют строение аналогичное паренхиме корневищ, они в большинстве заполнены крахмальными зернами, однако друзы кальция оксалата в корнях отсутствуют.

Для определения подлинности травы и корневищ с корнями герани луговой предложена качественная реакция на дубильные вещества (с раствором желатина 1%), подлинность травы кроме того предложено подтверждать цианидиновой пробой.

Для оценки количественного содержания основной группы БАВ в траве и корневищах с корнями - дубильных веществ - использовали метод прямой спектрофотометрии. Содержание дубильных веществ определяли в пересчете на кислоту галловую. Оценку содержания флавоноидов в траве герани луговой проводили методом дифференциальной спектрофотометрии в пересчете на рутин. Метрологические характеристики разработанных методик представлены в таблице 13.

Таблица 13 - Метрологические характеристики методик количественного определения дубильных веществ в корневищах с корнями герани луговой (А), количественного определения дубильных веществ в траве герани луговой (Б), флавоноидов в траве герани луговой (В)

Методика / X 1 s s Р,% t(P,/) Дх s,%

А 5 16,06 0,1063 0,3261 95 2,SI 0,71 4,4

Б 5 11,13 0,00021 0,0143 95 2,57 0,15 1,3

В 5 2,91 0,00017 0,0129 95 2,57 0,12 4,1

В результате товароведческого анализа пяти партий сырья герани луговой установлены следующие числовые показатели, которые были включены в проекты ФС (таблица 14).

Таблица 14 - Числовые показатели - герани луговой травы и герани луговой корневища с корнями (цельного и измельченного сырья)

Наименование показателя Рекомендуемое значение показателя для травы герани луговой, % Рекомендуемое значение показателя для корневищ с корнями герани луговой, %

Цельное сырье Измельченное сырье Цельное сырье Измельченное сырье

Суммы флавоноидов в пересчете нарутин Не менее 2,0 Не менее 2,0 - -

Дубильных веществ в пересчете на кислоту галловую Не менее 9,5 Не менее 9,5 Не менее 12,5 Не менее 12,5

Потеря в массе при высушивании Не более 10 Не более 10 Не более 10 Не более 10

Золы общей Не более 10 Не более 10 Не более 10 Не более 10

Золы, нерастворимой в 10% растворе кислоты хлористоводородной Не более 0,5 Не более 0,5 Не более 1,0 Не более 1,0

Стеблей, в том числе отделенных при анализе Не более 40 - - -

Старые отмершие корневища - - Не более 5 Не более 5

Частиц, не проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 5 мм - Не более 5 - Не более 5

Частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 0,5 мм - Не более 5 - Не более 5

Частей сырья, изменивших окраску и поврежденных вредителями Не более 5 Не более 5 Не более 10 Не более 10

Органической примеси Не более 1 Не более 1 Не более 1 Не более 1

Минеральной примеси Не более 0,5 Не более 0,5 Не более 1 Не более 1

Примечание. Прочерк означает, что для данного сырья определение показателя не предусмотрено. Все партии сырья заготовлены в фазы цветения и цветения-начала плодоношения

Результаты анализа содержания основных групп действующих веществ, а также влажности, в образцах сырья, заготовленных в 2009-2010 году, показали, что срок годности травы и корневищ с корнями герани луговой составляет 3 года.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Проведена сравнительная оценка восьми видов рода Geranium по количественному содержанию дубильных веществ и антимикробной активности. Для дальнейших исследований были отобраны G. sylvaticum, G. pratense и G. palustre.

2. В результате общего фотохимического анализа установлено, что основными группами биологически активных веществ трех видов герани являются полифенольные соединения, полисахариды, аминокислоты.

Впервые с помощью методов ВЭЖХ было проведено сравнительное исследование компонентного состава, содержания отдельных фенольных кислот, флавоноидов и аминокислот трех исследуемых видов, а также исследована динамика накопления

индивидуальных фенольных соединений в надземной и подземной частях G. pratense по фазам вегетации растения.

3. Впервые методом ГЖХ изучен компонентный состав свободных моносахаридов и мономерный состав полисахаридных фракций, выделенных из сырья трех исследуемых видов. В результате исследования определена динамика накопления свободных моносахаридов и водорастворимых полисахаридов в сырье изучаемых видов рода Geranium.

Впервые определено содержание трех макро- и пяти микроэлементов в надземной и подземной частях трех исследуемых видов.

4. Разработаны спектрофотометрические методики количественного определения флавоноидов и дубильных веществ в сырье G. pratense. Разработанные методики использованы для исследования динамики накопления суммы флавоноидов и дубильных веществ в сырье G. pratense, G. sylvaticum и G. palustre по фазам развития растений, а также рекомендованы для стандартизации сырья G. pratense.

5. Определена острая токсичность водных извлечений из надземной и подземной частей изучаемых представителей рода герань. Для сухих экстрактов из травы и корневищ с корнями G. pratense определена минимальная бактерицидная концентрация в отношении S. aureus и В. cereus.

6. На территории Ленинградской области на конкретных зарослях определена урожайность сырья G. pratense. G. sylvaticum и G. palustre.

7. Разработаны проекты фармакопейных статей на новые виды сырья «Герани луговой трава» и «Герани луговой корневища с корнями», для которых установлены макро- и микроскопические признаки сырья и нормативы доброкачественности.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Разаренова, К. Н. Перспективные виды рода герань —■ Geranium L. / К. Н. Разаренова, Е. В. Жохова // Материалы межвузовской научной конференции Санкт-Петербургской Государственной Химико-Фармацевтической Академии «Фармация в XXI веке: эстафета поколений». — СПб., 2009. — С. 35.

2. Караваева, А. В. Антимикробные свойства некоторых видов рода герань флоры Северо-Запада / А. В. Караваева, К. Н. Разаренова, Е. В. Жохова // Материалы научно-методической конференции Санкт-Петербургской Государственной Химико-Фармацевтической Академии «Гаммермановские чтения-2011». — СПб., 2011. — С. 63—66.

3. Разаренова, К. Н. Определение содержания экстрактивных веществ и динамика их накопления в надземной и подземной частях герани лесной, г. луговой и г. болотной / К. Н. Разаренова, Е. В. Жохова // Разработка, исследование и маркетинг новой фарм. продукции: сб. науч. трудов / под ред. М. В. Гаврилина. — Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2011. — Вып. 66. — С. 167—171.

4. Разаренова, К. Н. Количественное определение дубильных веществ спектрофотометрическим методом в траве и корневищах с корнями герани лесной, герани

луговой и герани болотной / К. Н. Разаренова, Е. В. Жохова, А. Е. Ирза, К. Д. Коледенкова // Современная медицина и фармацевтика: анализ и перспективы развития. Материалы II междунар. научно-практической конф. (28.12.2011). —М., 2012. — С. 144—152.

5. Разаренова, К. Н. Сравнительная оценка содержания дубильных веществ в некоторых видах рода Geranium L. флоры Северо-Запада / К. Н. Разаренова, Е. В. Жохова // Химия растительного сырья. — 2011. — №4. — С.187—192.

6. Разаренова, К. Н. Разработка числовых показателей герани лесной травы, герани луговой травы, герани болотной травы / К. Н. Разаренова, Е. В. Жохова // Материалы международной научно-методической конференции «Сандеровские чтения», посвященной памяти Ю. К. Сандера. — СПб.: СПХФА, 2012. — С. 165—170.

7. Разаренова, К. Н. К определению запасов герани луговой, герани лесной, герани болотной / К. Н. Разаренова, Е. В. Жохова // Тезисы докладов Всероссийской научной конф. студентов и аспирантов с международным участием Санкт-Петербургской Государственной Химико-Фармацевтической Академии «Молодая фармация-потенциал будущего». — СПб., 2012, —С. 10—11.

8. Разаренова, К. Н. Динамика накопления некоторых фенольных соединений в надземной и подземной частях Geraniumpratense L. / К. Н. Разаренова, Н. Ю. Сипкина, Е. В. Жохова // Бутлеровские сообщения. — 2012. — Т. 31, № 7. — С. 93—97.

9. Разаренова, К. Н. Аминокислотный состав надземной части Geranium pratense L., Geranium sylvaticum L., Geranium palustre L. / К. H. Разаренова, A. M. Захарова, И. Д. Протасова, Е. В. Жохова // Бутлеровские сообщения. — 2012. — Т. 31, № 8. — С. 73—78.

10. Burakova, М. A. Antibacterial activity of Geranium pratense preparations / M. A. Burakova, A. V. Karavaeva, I. E Kauhova., K. N. Razaryonova, E. V Zhokhova // 16th International Congress Phytopharm 2012. — Saint-Petersburg, 2012. — P. 64.

11. Разаренова, К. H. Разработка методики количественного определения флавоноидов в траве герани луговой и ее валидация / Разаренова К. Н., Жохова Е. В. // Сборник материалов Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященная 30-летию фармацевтического факультета ЯГМА «Инновационные процессы в лекарствоведении». -Ярославль, 2012. -С. 270— 278.

12. Разаренова, К. Н. Минеральный состав некоторых видов рода Geranium / Разаренова К. Н., Жохова Е. В., Беляева А. И. // Раст. ресурсы. - 2013. - Т.60, вып. 1. - С. 118 -124.

Подписано в печать 12.03.2013. Формат 60x84/16 Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии ЗАО «КопиСервис». Печать ризографическая. Заказ №1/0318. П. л. 1.375. Уч.-изд.л. 1.375. Тираж 120 экз.

ЗАО «КопиСервис» Адрес: 197376, Санкт-Петербург, ул. Проф. Попова, д. 3. тел.: (812)327 5098