Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Фармакогностическое исследование некоторых видов рода Stellaria и возможность их использования в медицинской практике

005010089

На правах рукописи

ГОРИНА ЯНА ВАЛЕРЬЕВНА

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ НЕКОТОРЫХ ВИДОВ РОДА БТЕЫАША И ВОЗМОЖНОСТЬ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В МЕДИЦИНСКОЙ ПРАКТИКЕ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

1 6 ОЕЗ

ПЕРМЬ-2012

005010089

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский

государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель: Доктор фармацевтических наук, профессор Краснов Ефим Авраамович ГБОУ ВПО Сибирский госуд арственный медицинский университет Минздравсоцразвития России

Официальные оппоненты: Доктор фармацевтических наук, профессор

Белоногова Валентина Дмитриевна ГБОУ ВПО Пермская государственная фармацевтическая академия Минздравсоцразвития России

. Доктор фармацевтических наук, профессор Ханина Миниса Абдуллаевна ГБОУ ВПО Новосибирский государственный медицинский университет Минздравсоцразвития России

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится «13» марта 2012 года в 13.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.068.01 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: 614990, г. Пермь, ул. Полевая, д. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО ПГФА Минздравсоцразвития России по адресу: 614070 г. Пермь, ул. Крупской, 46. Дата размещения объявления о защите диссертации на сайте Министерства образования и науки Российской Федерации http://www.mon.gov.ru #4 2012 г и на сайте ПГФА http://www.pfa.ru «Л/ь Р/ 2012 г.

Автореферат разослан «<^» 2012 г.

Учёный секретарь

диссертационного совета Д 208.68.01, ,у //

кандидат фармацевтических наук, доцент ^И. А. Липатникова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последние десятилетия значительно возрос интерес к препаратам растительного происхождения, и в современной традиционной медицине всё более пристальное внимание учёных привлекают к себе лекарственные растения. Актуальность поиска обусловлена неблагоприятной экологической обстановкой, влиянием разнообразного типа ксенобиотиков, развитием нежелательных лекарственных реакций, которыми часто сопровождается применение многих синтетических препаратов. Кроме того, в состав большей части лекарственных препаратов входят синтетические соединения со сложным химическим строением, синтез которых является трудоемким и дорогостоящим процессом. Осуществить синтез многих соединений, в том числе и биополимеров, не представляется возможным как вследствие их сложного строения, так и ввиду того, что структура многих из них до конца не установлена.

Следует отметить, что многие растения, в том числе и представители рода Stellaria, целебные свойства которых издавна используются народами мира для лечения различных заболеваний, остаются недостаточно изученными,'что ограничивает их применение в официнальной медицине. В связи с этим одним из приоритетных направлений научных исследований является изучение растений, находящих широкое применение в народной медицине, выделение из них биологически активных веществ и разработка на их основе высокоэффективных лекарственных средств.

В последнее время появился ряд публикаций [Q. Dong, 2007; R. Gautam et al., 2007], посвященных изучению химического состава и фармакологических свойств видов рода Stellaria сем. Caryophyllaceae, которые свидетельствуют о значительных потенциальных возможностях этих растений. Перспективными в этом плане является звездчатка Бунге (Stellaria bungeana Fenzl.), звездчатка злаковая (Stellaria graminea L.), звездчатка ланцетолистная {Stellaria holostea L.) и звездчатка средняя (Stellaria media L,), что обусловлено их большим ресурсным потенциалом на всей территории России и разнообразным применением в народной медицине. Фармакологические исследования

показали, что водный экстракт и фракция водорастворимых полисахаридов (ВРПС) звездчатки средней обладают выраженной гепатопротективной и антиоксидантной активностью. Проведенные нами фитохимические исследования указывают на высокое содержание в надземной части растений полисахаридов, которые проявляют противовоспалительную, иммуномодулирующую и антиоксидантную активность [J. R. Chen et al., 2010; J. Li et al., 2011],

Таким образом, исследования химического состава и фармакологических свойств растений рода Stellaria и создание на их основе нового высокоэффективного фитопрепарата является актуальной проблемой.

Цель работы. На основании результатов химико-фармакогностического и фармакологического исследований обосновать возможность использования растений рода Stellaria в медицине.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести сравнительное исследование основных групп биологически активных веществ надземной части звездчатки Бунге, звездчатки злаковой, звездчатки ланцетолистной и звездчатки средней.

2. Осуществить фракционное выделение полисахаридов звездчатки средней и охарактеризовать полученные фракции с помощью химических и современных физико-химических методов.

3. Провести исследование гепатопротективной и антиоксидантной активности сухого экстракта и фракции водорастворимых полисахаридов звездчатки средней.

4. Провести анатомическое исследование 4-х видов рода Stellaria и выявить их диагностические признаки.

5. Разработать методики стандартизации надземной части растения и проект фармакопейной статьи «Звездчатки средней трава».

6. На основании проведенных исследований предложить способ получения сухого экстракта с гепатопротективной и антиоксидантной активностью и определить основные показатели его качества.

Научная новизна. Впервые проведен сравнительный фитохимический анализ надземной части звездчатки Бунге, звездчатки злаковой, звездчатки ланцетолистной и звездчатки средней. Изучен макро- и микроэлементный состав 4-х видов рода 51е11апа и содержание биоэлементов в надземной части звездчатки средней в зависимости от места произрастания.

Впервые из надземной части звездчатки средней выделена доминирующая группа биологически активных веществ - полисахариды и охарактеризован ее компонентный состав. Разработаны методики качественного обнаружения и количественного определения полисахаридов в надземной части звездчатки средней. Изучено содержание полисахаридов в надземной части звездчатки средней в зависимости от фазы развития и места произрастания растения.

Впервые проведено сравнительное анатомическое исследование надземной части 4-х видов звездчатки и выявлены их диагностические признаки.

Впервые экспериментально обоснована возможность использования звездчатки средней в качестве источника гепатопротективного средства, и целесообразность стандартизации растения по полисахаридам.

На основании полученных экспериментальных данных предложен способ получения сухого экстракта с гепатопротективной и антиоксидантной активностью и определены основные показатели его качества.

Практическая значимость.

1. На основании фармакогностических и фармакологических исследований для медицинской практики предложен новый вид лекарственного растительного сырья в качестве источника гепатопротективного средства.

2. Результаты фитохимических и анатомических исследований использованы для разработки методик определения качества и диагностики надземной части звездчатки средней и заложены в проект Фармакопейной статьи (ФС) «Звездчатки средней трава».

3. Для углубленных фармакологических исследований в качестве гепатопротективного средства предложен сухой экстракт звездчатки средней.

4. Получено положительное решение о выдаче патента на изобретение по заявке №2010119385/15(027562) «Гепатопротективное средство, обладающее антиоксидантной активностью и способ его получения».

Степень внедрения. Теоретические положения и результаты экспериментальных исследований, изложенные в диссертационной работе, используются в учебном и научно-исследовательском процессе кафедры фармацевтической химии и кафедры фармакогнозии с курсами ботаники и экологии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России, кафедры фармакогнозии и ботаники ГБОУ ВПО НГМУ Минздравсоцразвития России.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Результаты фитохимического изучения надземной части звездчатки Бунге, звездчатки злаковой, звездчатки ланцетолистной и звездчатки средней.

2. Результаты исследований по выделению и характеристике полисахаридного комплекса звездчатки средней.

3. Результаты исследований гепатопротективной и антиоксидантной активности сухого экстракта и фракции водорастворимых полисахаридов звездчатки средней.

4. Результаты анатомического исследования 4-х видов рода 51е11аМа.

5. Методики стандартизации надземной части и сухого экстракта звездчатки средней.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на IV Всероссийской конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2009); на международной научно-практической конференции «Фармация Казахстана: интеграция науки, образования и производства» (Шымкент, Казахстан, 2009); на межрегиональной научно-практической конференции «Фармацевтическая наука и практика: достижения и перспективы» (Кемерово, 2009); на VII Всероссийской конференции с молодежной научной школой «Химия и медицина, 0рхимед-2009» (Уфа, 2009); на 65-й региональной конференции «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2010); на Всероссийской конференции «Химия и полная

переработка биомассы леса» (Санкт-Петербург, 2010); на Всероссийской конференции «Фундаментальные и прикладные аспекты современной биологии» (Томск, 2010); на научных семинарах кафедры фармацевтической химии СибГМУ (Томск, 2009-2011).

Работа выполнена в соответствии с планом научных исследований кафедры фармацевтической химии Сибирского государственного медицинского университета и комплексной целевой программой СО АМН Российской федерации «Здоровье человека в Сибири» (№ государственной регистрации 01.9.2002479).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ, в том числе 4 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Экспериментальные исследования по теме диссертации выполнялись на кафедрах фармацевтической химии и фармакогнозии с курсами ботаники и экологии СибГМУ (г. Томск), а также в сотрудничестве с коллективами других научных организаций: Центральная научно-исследовательская лаборатория СибГМУ (г. Томск); Научно-аналитический центр Томского политехнического университета (г. Томск); Институт физиологии Коми научного центра Уральского отделения РАН (г. Сыктывкар). Выражаем искреннюю благодарность сотрудникам указанных подразделений и научных учреждений.

Личный вклад автора. Основные экспериментальные результаты, приведенные в диссертации, получены самим автором или при его непосредственном участии. Автор проводил обработку, обобщение всех полученных результатов и формулировал основные выводы.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 5 глав экспериментальных исследований, выводов, списка цитируемой литературы и приложения. Материалы работы изложены на 176 страницах, включают 30 таблиц, 39 рисунков и приложения на 35 страницах. Библиографический указатель включает 232 наименований источников, из которых 123-зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования

Объектами для исследования служили надземные части звездчатки Бунге (Stellaria bungeana Fenzl.), з. злаковой (Stellaria graminea L.), з. ланцетолистной [Stellaria holostea L.) и з. средней (Stellaria media L.), заготовленные в 20062010 гг. в Томской области, Красноярском крае, Алтайском крае, Республике Алтай и Республике Хакасия.

Обнаружение основных групп биологически активных веществ проводили с помощью общепринятых методов и приемов фитохимического анализа. Для фракционного разделения полисахаридов з. средней применяли избирательную жидкостную экстракцию, ионообменную хроматографию и гель-фильтрацию. Характеристику выделенных фракций проводили с использованием УФ-спектроскопии, ГЖХ и ВЭЖХ.

Количественный анализ полисахаридов в пересчете на глюкозу проводили методом спектрофотомерии после реакции сахаров, полученных при гидролизе полисахаридов, с антроном в присутствии серной кислоты; сапонинов в пересчете на олеаноловую кислоту - методом спектрофотомерии после реакции с концентрированной серной кислотой; суммы дубильных веществ и аскорбиновой кислоты - титриметрическим методом по ГФ XI,

ВЫП.1.

Изучение элементного состава 4-х видов звездчатки проводили методом нейтронно-активационного анализа (НАА) на реакторе ИРТ-Т (Россия) и атомно-эмиссионной спектрометрии (АЭС) на приборе атомно-эмиссионный спектрометр с индуктивно-связанной плазмой «iCAP 6300 Duo» (Thermo Scientific, США).

Определение товароведческих показателей з. Бунге, з. злаковой, з. ланцетолистной и з. средней проводили согласно методикам ГФ XI. При разработке проекта ФС на сырье руководствовались ОСТ 91500.05.001-00 «Стандарты качества лекарственных средств».

Микроскопические признаки надземных частей 4-х видов звездчатки устанавливали на основании анатомического исследования частей растений.

Просмотр и фотографирование плоскостных препаратов выполняли с помощью микроскопа МББ - 1АУ4.2 (увеличения х120, х200, х400), цифрового фотоаппарата «Olympus Camedia» digital compact camera с- 4000 zoom (Япония) и фотонасадки МФН - 3. Снимки обрабатывались на компьютере в программе «Photoshop CS 2».

Исследование гепатопротективной и антиоксидантной активности экстракта и фракции водорастворимых полисахаридов (ВРПС) з. средней выполняли на 70 белых беспородных крысах-самцах массой 180-220 г с острым токсическим поражением печени тетрахлорметаном. Гепатит вызывали введением 50% масляного раствора тетрахлорметана в дозе 1 мл/кг массы крысы в течение 4 дней. В последующие 6 дней животным вводили экстракт, полученный на воде очищенной, фракцию ВРПС з. средней и препарат сравнения (карсил) в дозе 100 мг/кг массы крысы - внутрижелудочно в виде суспензии на воде очищенной, а также эквиобъемное количество растворителей.

Острую токсичность экстракта з. средней определяли по методике Е. Buchby (1963) на крысах массой 180-200 г при внутрижелудочном способе введения.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили, используя пакет программ StatSoft Statistica v6.0 с определением среднего арифметического значения (М) и средней квадратичной ошибки (т). Достоверность результатов оценивали, используя параметрический (t-критерий Стьюдента) и непараметрический (критерий Вилкоксона и Манна-Уитни) методы. Различия считались достоверными при р < 0,05.

Результаты исследования Сравнительный фитохимический анализ надземной части звездчатки Бунге, з. злаковой, з. ланцетолистной и з. средней

В результате проведенных исследований установлено содержание основных групп БАВ надземной части 4-х видов звездчатки: полисахаридов,

тритерпеновых гликозидов, кумаринов, флавоноидов, фенолкарбоновых кислот, дубильных веществ, каротиноидов, аскорбиновой кислоты (табл. 1).

Данные количественного анализа свидетельствуют, что исследуемые виды существенно отличаются по содержанию групп природных соединений. Выявлено, что наибольшее количество БАВ из 4-х видов рода 5ге//апа накапливается в надземной части з. средней (табл. 1).

Таблица 1 - Химический состав растений рода Яіеііагіа

Название группы БАВ Звездчатка Бунге Звездчатка злаковая Звездчатка ланцетолистая Звездчатка средняя

Алкалоиды - - - -

Карденолиды - - -

Сапонины тритерпенового ряда, % 0,75±0,03 1,07+0,07 0,51 ±0,04 2,23±0,13

Экдистероиды - - - -

Иридоиды - - - -

Полисахариды, % 2,43±0,08 0,45±0,03 1,31 ±0,07 3,94±0,14

Флавоноиды сл сл сл сл

Кумарины + + + +

Фенолкарбоновые кислоты сл сл сл сл

Дубильные вещества, % 0,34±0,03 2,59±0,24 1,09±0,05 6,24±0,18

Антрахиноны - - _ _

Аскорбиновая кислота, мг% 29,83±0,95 45,46±2,91 21,53±0,95 63,56±4,23

Каротиноиды + + + +

Примечание: знаком «-» отмечено отсутствие группы веществ; «+» - обнаружение группы веществ; ел - следовые количества веществ; количественное содержание приведено в пересчете на абсолютно сухое сырье.

Элементный состав надземной части исследуемых видов по качественным характеристикам существенно не различается и представлен 41 химическим элементом. Высоким содержанием отличаются такие биоэлементы, как калий (от 21,75 до 49,00 мг/г), кальций (от 5,20 до 13,00), магний (от 1,96 до 4,20), натрий (от 0,21 до 5,20), железо (0,29 до 0,90), цинк (от 0,02 до 0,06) и кремний (от 0,09 до 0,55 мг/г).

С целью оценки влияния природно-климатических условий, проведено сравнительное исследование элементного состава надземной части з. средней, собранной в различных районах. Полученные данные свидетельствуют, что

данный фактор не оказывает значимого влияния на диапазон концентраций химических элементов в растении.

Рассматривая полученные нами результаты фитохимического анализа четырех исследуемых видов, а также анализируя имеющиеся литературные данные, можно заключить, что наибольший интерес для дальнейшего изучения представляют полисахариды и сапонины з. средней, поскольку данное растение отличается наибольшим их содержанием по сравнению с тремя другими видами. К тому же указанные группы соединений з. средней практически не изучены.

Выделение и характеристика полисахаридного комплекса звездчатки средней

Выделение полисахаридов проводили по схеме, представленной на рис. 1.

Измельченный воздушно-сухой растительный материал

Обработка хлороформом, при 60 ° С, 12 ч________

Шрот№1

Экстракция водой, 80 °С, 6 ч

хлорофилл и сопутствующие липофильные вещества

Отхол

Водный экстракт

Концентрирование, осаждение этиловым

Шрот №2

Экстракция водой, подкисленной НС1 (pH 4,0) 50 °С, 3 ч

Водно-кислотный

экстракт

спиртом, диализ, лиофилизация

Концентрирование, осаждение этиловым

Фракция вМ 1

Шрот №3

Экстракция 0,7% оксалатом аммония, 70 ЧС, 6 ч

Оксалатный

экстракт

спиртом, диализ, лиофилизация

Концентрирование, осаждение этиловым

Фракция БМ 2

спиртом, диализ, лиофилизация

Шрот №4

Отход

Рисунок 1 - Схема выделения полисахаридов из звездчатки средней

Методом последовательной экстракции и осаждения этиловым спиртом из воздушно-сухой надземной части растения получены три полисахаридные

фракции: вМ 1, БМ 2 и БМ 3, выход которых приведен в табл. 2.

Таблица 2 - Характеристика фракций полисахаридов звездчатки средней

Фракция Выход, %' Содержание, %

GalA Белок Метоксилы Glc Gal Man Ага Xyl Rha

% степень

SM 1 1,86 13,22 55,26 2,03 93,04 8,05 5,78 2,38 5,34 0,36 2,22

SM2 0,09 19,41 22,54 2,30 71,80 12,46 8,51 2,77 4,79 0,79 2,51

SM3 1,17 75,96 15,52 2,02 14,24 3,29 2,23 0,41 1,98 1,21 1,64

Примечание. 1 - выход рассчитан от массы воздушно-сухого сырья; 3 - массовые проценты.

Фракции SM 1 и SM 2, содержащие ВРПС, представляют собой аморфные порошки светло-коричневого цвета, растворимые в воде, в водных растворах кислот и щелочей, но нерастворимые в органических растворителях. После кислотного гидролиза фракций получены положительные реакции с реактивом Фелинга.

Фракция SM 3, содержащая пектиновые вещества (ПВ), представляет собой аморфный порошок светло-серого цвета, растворимый в воде с образованием вязкого раствора. ПВ из водного раствора осаждаются 1%-ным раствором сульфата алюминия с образованием пектатов.

Количественный моносахаридный состав фракций полисахаридов был определен методом ГЖХ после полного кислотного гидролиза образцов трифторуксусной кислотой с последующим ацетилированием полученных моносахаридов. Установлено, что углеводные цепи выделенных полисахаридов главным образом представлены остатками арабинозы (Ага), глюкозы (Glc) и галактозы (Gal), а в качестве минорных компонентов идентифицированы остатки рамнозы (Rha), ксилозы (Ху1) и маннозы (Man) (табл. 2).

В состав всех фракций полисахаридов входят остатки галактуроновой кислоты, содержание которой определено спектрофотометрически по реакции с 3,5-диметилфенолом в присутствии концентрированной серной кислоты с измерением величины оптической плотности при двух длинах волн - 400 и 450 нм. Установлено, что фракция SM 3 отличается высоким их содержанием (76%), что указывает на принадлежность к классу пектинов.

Идентификацию галактуроновой кислоты во фракциях полисахаридов проводили ферментативным гидролизом образцов а-1,4-полигалактуроназой с последующим анализом гидролизата методом бумажной хроматографии (БХ) в системе растворителей н-бутанол-пиридин-вода (6:4:3) и детекцией пятен кислым фталатом анилина.

Степень метилэтерифицирования остатков галактуроновой кислоты определяли спектрофотометрическим методом по реакции с 2,4-пентандионом и калибровочному графику, построенному для метанола, при длине волны 412 нм. Установлено, что часть остатков галактуроновой кислоты полисахаридов всех выделенных фракций метилэтерифицирована. Полисахариды фракций SM 1 и SM 2 являются высоко метилэтерифицироными (степень метилэтерификации 93% и 72%, соответственно), тогда как полисахариды фракции SM 3 имеют низкую степенью метилэтерифицирования карбоксильных групп остатков галактуроновой кислоты (степень метилэтерификации 14%). Содержание метоксильных групп в полисахаридах представлено в табл. 2.

В состав всех фракций входит значительное количество белка, содержание которого составляет от 15 до 55% (табл. 2).Для определения степени гомогенности выделенных образцов полисахаридов, использовали метод ионообменной хроматографии (ИОХ) на DEAE-целлюлозе с элюентами от 0,01 М/л до 1 М/л NaCl.

При этом установлено, что выделенные фракции (SM 1, SM 2 и SM 3) гетерогенны: состоят из смеси полисахаридов, отличающихся содержанием галактуроновой кислоты (от 2,17 до 72,12%) и белковых компонентов (от 17,3 до 92,8%). Выход полученных фракций приведен в табл. 3.

Таблица 3 - Характеристика полисахаридов звездчатки средней после разделения на ОЕАЕ-целлюлозе

Фракция Элюент N*0, М/л Выход, %' Содержание^

Са1А Белок Ма Ага Ху! Мап С1с ва!

БМ 1 0,01 5,70 2,17 41,63 1,12 18,81 1,40 8,65 13,65 10,77

0,1 36,56 13,20 60,25 3,31 6,43 1,05 0,93 4,06 8,13

0,2 21,58 13,16 68,77 2,96 3,43 0,46 0,86 4,75 4,35

0,3 6,71 9,75 75,44 1,71 2,29 0,38 0,83 5,68 2,57

0,4 3,11 7,40 80,26 1,1 3,55 0,69 0,03 3,42 3,13

1 8,14 1,58 89,78 0,16 0,57 сл сл 1,52 0,31

БМ 2 0,01 9,09 2,95 76,27 1,10 2,52 0,63 1,40 8,58 4,11

0,1 20,42 35,94 49,21 1,09 5,51 0,72 0,78 1,45 5,15

0,2 25,14 35,61 47,59 1,12 6,33 0,78 1,34 2,38 3,48

0,3 2,81 11,87 77,22 0,82 2,82 0,86 0,03 3,11 2,48

0,4 1,88 8,76 85,46 0,33 1,48 0,25 0,24 0,54 0,91

1 4,77 1,94 92,81 0,18 0,83 сл сл 0,87 0,48

БМЗ 0,01 1,53 23,39 55,64 6,33 4,43 1,29 0,35 2,26 5,24

0,1 22,01 29,64 61,79 1,47 1,91 0,20 0,21 1,13 2,13

0,2 26,84 63,34 30,92 0,80 1,13 0,22 0,15 0,75 0,98

0,3 19,14 70,68 24,97 0,43 1,33 0,33 0,09 0,24 1,20

0,4 2,38 72,12 17,29 3,96 1,74 0,72 0,50 1,57 1,90

1 3,91 3,97 85,95 0,96 0,17 сл сл 0,09 0,13

Примечание. - выход рассчитан от массы воздушно-сухого сырья; * - массовые

проценты; сл - следовые количества.

Определение молекулярно-массовых характеристик, доминирующих по выходу полисахаридов (табл. 4), проводили методом ВЭЖХ на колонке ОНрак БВ-804 Н(3 (БЬосЬх, США). Наличие в образцах полисахаридов 2-4 пиков с широким диапазоном молекулярных масс (от 5,15 до 2040,17 кДа) свидетельствует об их гетерогенности по молекулярной массе (табл. 4).

Таблица 4 - ВЭЖХ анализ фракций полисахаридов звездчатки средней, полученных при хроматографировании на ПЕЛЕ-целлюлозс

Образец Площадь, % Мп, кДа Му», кДа М\у/Мп

БМ 1-1 (0,1 М/лИаС1) 1,23 951,05 1371,43 1,44

14,24 81,47 94,83 1,15

84,53 6,58 12,70 1,93

БМ 1-2 (0,2 М/л N301) 100 15,40 41,78 2,71

БМ 2-1 (0,1 М/л№С1) 4,15 1893,96 2040,17 1,08

5,30 560,34 668,72 1,19

59,98 24,11 45,76 1,90

30,58 3,92 5,15 1,32

БМ 2-2 (0,2 М/л ЫаС1) 100 20,59 124,85 6,06

БМ 3-1 (0,1 М/л №С1) 2,47 636,66 1069,95 1,68

98,53 7,47 13,13 2,56

БМ 3-2 (0,2 М/л №С1) 100 20,87 55,72 2,67

ем 3-3 (0,3 М/л №С!) 100 55,08 106,90 1,94

Примечание. Мп - среднечисловая молекулярная масса, - срсдневесовая

молекулярная масса, М\у/Мп - полидисперстность.

Для очистки исследуемых образцов БМ 1-1...БМ 3-3 (табл. 5) от белковых компонентов использовали гель-хроматографию на сефакриле Б-ЗОО, однако не удалось освободиться от белка, содержание которого уменьшилось незначительно. Полученные данные могут свидетельствовать о наличии ковалентной или ионной связи меяеду белковыми и углеводными компонентами в выделенных фракциях.

Исследование сапонинов звездчатки средней

Для проведения химических исследований из надземной части растения получали экстракт на 70% водном этаноле (выход 27,2%), который затем фракционировали рядом растворителей с возрастающей полярностью (хлороформом, этилацетатом, бутанолом-1). Полученные фракции исследовали хроматографией в тонком слое с достоверными образцами в системе растворителей хлороформ-метанол-вода (61:32:7) и детекцией пятен 25% спиртовым раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты. В результате в бутанольной фракции обнаружили 3 тритерпеновых гликозида. Разделение суммы сапонинов проводили методом адсорбционной колоночной хроматографии на силикагеле (Ь 40/100), а элюирование осуществляли системой растворителей хлороформ-метанол-вода (61:32:7). В результате из бутанольной фракции были выделены три вещества (стеллярозид А, В и С), которые подвергались полному кислотному гидролизу. Методом хроматографии в тонком слое с достоверными образцами в системе растворителей хлороформ-этанол (8:2) было установлено, что агликоном является олеаноловая кислота (ЯГ=0,48), а моносахаридный состав стеллярозида А представлен глюкозой, галактозой, стеллярозида В -галактозой, арабинозой, стеллярозида С — глюкозой, арабинозой и глюкуроновой кислотой (С1сА).

Изучение гепатопротективной и антиоксидантной активности звездчатки средней Рассматривая полученные нами результаты фитохимического анализа основных групп БАВ з. средней, можно заключить, что доминирующими природными соединениями данного растения являются вещества гидрофильного характера, в частности полисахариды. В связи с этим, наибольший интерес для фармакологических исследований представляет водный экстракт з. средней, использующийся в народной медицине при многих заболеваниях, в том числе и при патологии печени, а также фракция

ВРПС, выделенная из водного извлечения путем осаждения 96% этанолом, обладающая широким спектром биологической активности.

Гепатопротективную активность оценивали по морфологическим и биохимическим показателям, антиоксидантную - по влиянию на процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) в печени и сыворотке.

После курса применения экстракта и фракции ВРПС з. средней у крыс с токсическим гепатитом наблюдалось усиление репаративных процессов в печени. Наблюдавшаяся положительная динамика обусловлена нормализацией процессов ПОЛ за счет активации антирадикальной системы (повышение активности каталазы и антирадикальной активности до нормы). Эти процессы способствовали восстановлению мембран гепатоцитов, нормализации их функционального состояния и предотвращали повышенный выход ферментов в кровь, о чем свидетельствовали параметры содержания аминотрансфераз -Ал Ат и Ас Ат, которые не отличались от контрольной группы. В этих же условиях у крыс нормализовалась желчевыделительная функция (уровень щелочной фосфатазы в норме). При этом экстракт з. средней по сравнению с действием фракции ВРПС несколько в большей степени усиливал активность щелочной фосфатазы и активировал систему антиоксидантной защиты (активность каталазы и антирадикальную активность).

Морфологические показатели свидетельствуют, что применение экстракта и фракции ВРПС з. средней препятствовали развитию структурнофункциональных и метаболических нарушений печени, что проявляется в снижении содержания некротизированных клеток, гепатоцитов с дистрофией, плотности клеточного инфильтрата. Однако количество двуядерных гепатоцитов возросло по сравнению животными с гепатитом, что указывает на благоприятное воздействие экстракта и фракции ВРПС, стимулирующих белок-синтетические и пролиферативные процессы печеночной клетки.

Таким образом, установлено, что экстракт и фракция ВРПС з. средней, обладают гепатозащитным и антиоксидантным действием аналогично карсилу - известному антигепатотоксичному препарату, полученному из лекарственного растительного сырья.

Испытания на острую токсичность показали, что сухой экстракт в дозе 10 г/кг массы крысы не вызывает гибель животных, следовательно не обладает острой токсичностью, что соответствует IV классу опасности «вещества малоопасные» (ГОСТ 12.1.007-76 «Вредные вещества»)

Разработка параметров стандартизации надземной части звездчатки средней

В результате анатомического исследования надземной части з. средней были определены следующие диагностические признаки, позволяющие отличить ее от близкородственных видов (з. Бунге, з. злаковой и з. ланцетолистной): наличие волосков различного типа - головчатых волосков с многоклеточной ножкой и одноклеточной головкой у основания листа и по центральной жилке чашелистика цветка, многоклеточных тупоконусовидных волосков у основания прицветного листа; непучковый тип строения стебля.

Числовые показатели для цельного и измельченного сырья определяли в соответствии с методиками ГФ XI. Влажность сырья составила 7,4±1,2%; зола общая - 18,2±0,44%; зола, нерастворимая в 10% растворе кислоты хлористоводородной 1,0±0,3%; органическая примесь 1,0±0,1%; минеральная примесь 0,4±0,1%. Основная часть измельченного сырья проходит сквозь сита с диаметрами отверстий 1-5мм (87,7%). Сквозь сито с диаметром отверстий 7 мм не проходит 3,3±0,9%. Через сито 0,25 мм отсеивается 0,8±0,2%.

Подлинность и содержание действующих веществ определяли по полисахаридам, которые, по полученным нами данным, имеют существенное значение в проявлении гепатопротективной и антиоксидантной активности экстракта з. средней. Предварительно были отработаны условия проведения экстракции (соотношение сырье-экстрагент, температура, кратность и время экстракции, степень измельчения сырья).

Установлено, что оптимальными условиями экстракции являются: трехкратная экстракция водой очищенной в соотношении 1:25 в течение 1 ч при температуре 80 °С сырья, проходящего сквозь сито с диаметром пор 2-4 мм (рис. 2).

Для установления подлинности надземной части з. средней предложены следующие реакции: на полисахариды - реакция осаждения этанолом, на галактуроновую кислоту (входящей в состав полисахаридов) - реакция с 3,5-диметилфенолом.

Количественное определение полисахаридов проводили методом спектрофотометрии на основе реакции сахаров, полученных при гидролизе полисахаридов, с антроном в присутствии серной кислоты. Расчет процентного содержания полисахаридов проводили с использованием калибровочного графика, построенного по глюкозе.

Валидационную оценку методики количественного определения полисахаридов проводили по следующим показателям: повторяемость,

правильность и воспроизводимость. Содержание полисахаридов в надземной части з. средней должно быть не менее 2%. При этом значение относительной погрешности составляет менее 3 % при доверительной вероятности 0,95.

Используя разработанную методику, установлено, что максимальное содержание полисахаридов наблюдается в период массового цветения и составляет 4,7±0,1 %.

На основании проведенных исследований разработан проект ФС «Звездчатки средней трава».

111

60

70

2-4

5-7 мм

90 °С

Рисунок 2 - Влияние условий экстракции на выход полисахаридов (%) из надземной части звездчатки средней: соотношение сырья и экстрагента (1), время экстракции (2), кратность экстракции (3), температура (4) и степень измельчения сырья (5)

Получение сухого экстракта из надземной части звездчатки средней и его стандартизация

Установленные при разработке методики количественного определения полисахаридов в надземрой части з. средней оптимальные параметры экстракционного процесса, при которых достигается наиболее полный выход действующих веществ (полисахаридов), позволили предложить способ получения средства, обладающего гепатопротективной и антиоксидантной активностью, заключающийся в экстракции надземной части з. средней, измельченной до размеров частиц 2-4 мм, водой очищенной при температуре 80 °С в течение 1 ч при соотношении сырье-экстрагент 1:25 и кратности экстракции 3 с последующим удалением экстрагента при пониженном давлении и высушиванием досуха полученного экстракта.

Сухой экстракт з. средней представляет собой сыпучий порошок темнокоричневого цвета со своеобразным запахом. Его стандартизация проведена по методикам ГФ XI издания. Определены потеря в массе при высушивании (3,88±0,12%) и проведены испытания на тяжелые металлы (не более 0,01%). В основу стандартизации сухого экстракта положены методики определения подлинности и количественного содержания полисахаридов, описанные ранее для надземной части. Содержание полисахаридов в сухом экстракте з. средней составило 8,8±0,2% при относительной ошибке 2,6%.

ВЫВОДЫ

1. С помощью химических, хроматографических и спектральных методов установлено содержание в надземной части S. bungeana Fenzl, S. graminea L., S. holostea L., S. media L. следующих групп БАВ: полисахаридов, тритерпеновых гликозидов, олеоноловой кислоты, кумаринов, дубильных веществ, каротиноидов, аскорбиновой кислоты и показано, что в данных растениях, произрастающих в Западносибирском регионе, в отличии от европейского происхождения, флавоноиды и фенолкарбоновые кислоты содержаться лишь в следовых количествах.

2. Впервые осуществлено углубленное исследование полисахаридов S. media. Набором современных методов (ИОХ, гель-хроматография, ГЖХ,

ВЭЖХ) выделены и охарактеризованы 3 фракций, при этом в состав углеводных цепей двух фракций водорастворимых полисахаридов (SM 1 и SM 2) входят остатки метилэтерифицированной галактуроновой кислоты, глюкозы, галактозы, арабинозы, рамнозы, ксилозы и маннозы, а третья фракция представлена пектиновым полисахаридом с преимущественным содержанием галактуронана.

3. В результате анатомического исследования надземных частей 4-х видов рода Stetlaria установлены диагностические признаки листа, стебля и цветка, заключающиеся в степени извилистости клеток эпидермы, типе устьичного аппарата, строении и количестве волосков, особенностях кутикулы и наличии полости сердцевины стебля, позволяющие различать виды друг от друга.

4. Установлено, что сухой экстракт и фракция водорастворимых полисахаридов S. media при ежедневном в течение 6 дней пероральном применении в дозе 100 мг/кг у крыс с экспериментальным токсическим гепатитом активируют регенераторно-репаративные процессы в печени и систему антиоксидантной защиты, что свидетельствует о наличии гепатопротекторной и антиоксидантной активности, по выраженности сопоставимой с активностью стандартного гепатопротекторного средства карсила. Фракция водорастворимых полисахаридов в указанных условиях восстанавливает показатели иммунологической реактивности, проявляя выраженный иммуномодулирующий эффект.

5. Разработанные методики стандартизации сырья и на их основе проект ФС «Звездчатки средней трава» дают возможность ее внедрения в качестве сырьевого источника получения гепатопротективного средства.

6. Впервые предложен способ получения сухого экстракта из надземной части S. media, обладающего гепатопротективной и антиоксидантной активностью, при котором достигается максимальное извлечение полисахаридов (степень измельчения сырья 2-4 мм, соотношении сырье-экстрагент (вода очищенная) 1:25, время экстракции 1 ч, температура 80 °С и кратность экстракции 3), и определены основные показатели его качества.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Горина, Я. В. Анатомическое изучение растений рода Звездчатка / Я. В. Горина, JI. Г. Бабешина, Е. А. Краснов// Фармация.-2010.-№6-С. 22-24.

2. Горина, Я. В. Фитохимическое исследование некоторых видов рода Stellaria / Я. В. Горина, Е. А. Краснов // Журнал Сибирского федерального университета. Химия. - 2010. - №3. - С. 200-203.

3. Горина, Я. В. Гепатопротективные свойства водного экстракта из надземной части Stellaia media {Caryophyllaceae) / Я. В. Горина, Э. В. Сапрыкина, Е. А. Краснов // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. -2010.-№10.-С. 35-39.

4. Горина Я. В. Сравнительное анатомическое исследование некоторых видов рода Stellaria / Я. В. Горина, Л. Г. Бабешина, Е. А. Краснов // Вестник ТГУ. Биология. - 2011. - Т. 15, №3. - С. 71-74.

5. Краснов, Е. А. Химический состав некоторых перспективных видов флоры Сибири и возможность их практического использования / Е. А. Краснов, Я. В. Горина, И. П. Каминский, Т. В. Кадырова // Тез. докл. IV Всеросс. конф. «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья». -Барнаул, 2009.-Т. 2.-С. 181-182.

6. Горина, Я. В. Фармакогностическое и фитохимическое исследование надземной части Stellaria media L. / Я. В. Горина, Л. Г. Бабешина, Е. А. Краснов //Тез. докл. междуиарод. науч.-практ. конф. «Фармация Казахстана: интеграция науки, образования и производства». - Шымкент, Казахстан, 2009. - С. 218-220.

7. Горина, Я. В. Сравнительная характеристика химического состава и особенностей анатомического строения двух видов рода Stellaria / Я. В. Горина, Л. Г. Бабешина, Е. А. Краснов // Тез. докл. межрегион. науч.-практ. конф. «Фармацевтическая наука и практика: достижения и перспективы». - Кемерово, 2009. - С.41-42.

8. Горина, Я. В. Химико-фармакологическое исследование водного экстракта из надземной части Stellaria / Я. В. Горина, Э. В. Сапрыкина, Е. А. Краснов // Тез. докл. VII Всеросс. конф. «Химия и медицина, 0рхимед-2009». -Уфа, 2009.-С. 154-155.

9. Бабешина, Л. Г. Биоэлементный состав растений рода Stellaria и Sphagnum / Л. Г. Бабешина, Я. В. Горина, Н. К. Рыжакова, С. Г. Метляева, Е. А. Краснов // Тез. докл. 65-ой регион, конф. «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции». - Пятигорск, 2010.-С. 11-13.

10. Горина, Я. В. Исследование химического состава видов Stellaria и возможность использования их в медицине / Я. В. Горина, Э. В. Сапрыкина, Е. А. Краснов // Тез. докл. Всеросс. конф. «Химия и полная переработка биомассы леса». - Санкт-Петербург, 2010. - С. 260-261.

11. Горина, Я. В. Исследование химического состава и анатомических признаков некоторых видов рода Stellaria / Я. В. Горина, Л. Г. Бабешина, Е. А. Краснов // Тез. докл. Всеросс. конф. «Фундаментальные и прикладные аспекты современной биологии». - Томск, 2010. — С. 264-266.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АЭС - атомно-эмиссионная спектроскопия;

Б АВ - биологически активные вещества;

БХ - бумажная хроматография;

ВРПС - водорастворимые полисахариды;

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография;

ГЖХ - газожидкостная хроматография;

ИОХ - ионообменная хроматография;

НАА - нейтронно-активационный анализ;

ПВ - пектиновые вещества;

ПОЛ - перекисное окисление липидов;

УФ - ультрафиолетовый;

ФС - фармакопейная статья.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает искреннюю признательность и благодарность к.б.н., доц. кафедры фармакогнозии с курсами ботаники и экологии Бабешиной Л. Г за помощь в выполнении анатомического исследования изучаемых растений; к.б.н., с.н.с. ЦНИЛ СибГМУ Сапрыкиной Э. В. и к.м.н. Перевозчиковой Т. В. за руководство фармакологическими и биохимическими исследованиями; д.х.н., академику, директору Института Физиологии Коми НЦ УрО РАН Оводову Ю. С., к.х.н., доц. Головченко В. В. за руководство и помощь в выполнении исследований полисахаридов.

Горина Яна Валерьевна (Россия)

Фармакогностичсскос исследование некоторых видов рода Лг//япл н возможность их использования в медицинской практике

Проведен сравнительный фитохимический анализ надземной части звездчатки Бунге, звездчатки злаковой, звездчатки ланцетолистной и звездчатки средней. Изучен макро- и микрозлементный состав 4-х видов рода и содержание

биоэлементов в надземной части звездчатки средней в зависимости от места произрастания. Из надземной части звездчатки средней выделена доминирующая группа биологически активных веществ — полисахариды и охарактеризован ее компонентный состав. Разработаны методики качественного обнаружения и количественного определения полисахаридов в надземной части звездчатки средней. Изучено содержание полисахаридов в надземной части звездчатки средней в зависимости от фазы развития и места произрастания растения. Проведено сравнительное анатомическое исследование надземной части 4-х видов звездчатки и выявлены их диагностические признаки. Экспериментально обоснована возможность использования звездчатки средней в качестве источника гепатопротективпого средства, и целесообразность стандартизации растения по полисахаридам. На основании полученных экспериментальных данных предложен способ получения сухого экстракта с гспатопротективной и антиоксидантной активностью и определены основные показатели его качества.

Gorina Yana (Russia)

Pharmacognostical study of Stellaria genus some species and possibility of it’s using in medical practicc

The comparative phytochemical analysis of the aerial parts of Stellaria bungeana, Stellaria gratrtinea, Stellaria holostea and Stellaria media was carried out. It is studied macro- and microelement composition of four species of Stellaria genus. The content of bio-elements in Stellaria media aerial part depending on a growth place was studied. The polysaccharides as a dominant group of biologically active substances were isolated from Stellaria media aerial part and its composition was described. The techniques of qualitative and quantitative determination of Stellaria media polysaccharides were elaborated. The content of Stellaria media polysaccharides depending on a vegetation phase and a plant growth place was studied. The comparative anatomic research of four species of Stellaria genus was carried out and diagnostic characteristics were revealed. The possibility of Stellaria media using as a source of hepatoprotective remedy and expediency of plant standardization by polysaccharides was experimentally proved. On the basis of experimental data the way of obtaining of a dry extract with hepatoprotective and antioxidant activity was offered. The basic quality indicators were determined.

Подписано в печать «24» января 2012 г.

Уел. печ.листов 1,5 Печать на ризографе. Отпечатано в лаборатории оперативной полиграфии СибГМУ 634050, г. Томск, Московский тракт, 2, тел. 53-04-08 Заказ №_18_ Тираж 110 экземпляров