Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Фармакогностическое изучение энотеры двухлетней Oenothera biennis L.

На правах рукописи

ЧЕРНОВА ЕЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЭНОТЕРЫ ДВУХЛЕТНЕЙ OENOTHERA BIENNIS L.

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

21 НОЯШ

ПЯТИГОРСК - 2013

005539444

Диссертация выполнена в Пятигорском медико-фармацевтическом институте - филиале ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации и Институте органической химии Уфимского научного центра РАН

Научный руководитель: ДЕНИСЕНКО ОЛЕГ НИКОЛАЕВИЧ

доктор фармацевтических наук, профессор

Официальные оппоненты: Бубенчнкова Валентина Николаевна

доктор фармацевтических наук, профессор, ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет» Минздрава России, заведующая кафедрой фармакогнозии и ботаники Куль Ирина Яковлевна кандидат фармацевтических наук, доцент, Пятигорский медико-фармацевтический институт -филиал ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России, доцент кафедры фармацевтической химии

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Самарская государственная фармацевтическая академия»

Минздрава России

Защита состоится 1екабря 2013 года в Ю00 часов на заседании диссертационного совета Д.208.008.09. при ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздрава России (357532, Ставропольский край, г. Пятигорск, пр. Калинина, II).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Пятигорского медико-фармацевтического института - филиала ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздрава России (357532, Ставропольский край, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11).

Автореферат разослан »^£^-¿^2013 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

Ремезова Ирина Петровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Эссенциальные жирные кислоты (витамин F), являясь универсальными эндогенными биорегуляторами, привлекают внимание исследователей, а поиск источников данных соединений является весьма актуальной задачей. F-витаминные свойства растительных масел связывают с наличием в их составе триацилглицеридов ненасыщенных жирных кислот семейства о>-3 или (0-6. Известно множество, главным образом, импортных лекарственных препаратов и биологически активных добавок к пище, содержащих витамин F и зарегистрированных в РФ: эссенциале, липостабщт, эгамол, фитос- F, омеганол, омегамама «9 месяцев», омакор и др.

Еще в начале 80-х годов были установлены преимущества энотеры двулетней (э. двухлетней), как экономически наиболее перспективного растительного источника эссенциальных жирных кислот, в том числе со-6 у-линоленовой кислоты (ГЛК), содержание которой в масле семян может достигать 10%. За рубежом э. двухлетнюю относят к пищевым, медоносным, кормовым, техническим, лекарственным и декоративным растениям. В отечественной литературе представителям рода Oenothera уделяется недостаточное внимание: в научно-практической медицине, фармацевтической, пищевой промышленности нашей страны семена и жирное масло энотеры не используются и в промышленных масштабах не производятся. Между тем, некоторые виды рода энотера представляют научный и практический интерес, т.к. довольно широко представлены во флоре Кавказа (э. двухлетняя) и могут служить новыми источниками биологически активных веществ (БАВ) и фитопрепаратов.

Поэтому весьма актуальным являются ресурсные исследования э. двухлетней в дикорастущей флоре (на территории Краснодарского края) и возможности ее интродукции в условиях Ставропольского края с целью выявления источника жирного масла с высоким содержанием эссенциальных жирных кислот, а также технологических приемов для его выделения, переработки и рационального комплексного использования.

Степень разработанности темы. В Институте химии растительных веществ АН РУЗ в Ташкенте в результате исследований липидов э. двухлетней флоры Узбекистана были идентифицированы ряд оксигенированных ацилглицервдов и 5 классов липофильных веществ. В Белгородском государственном университете при изучении масла семян э. двухлетней, произрастающей на территории Белгородской области, было установлено, что основными ненасыщенными жирными кислотами масла являются линолевая, олеиновая и у-линоленовая. В Государственном НИИ органической химии и технологии совместно с ВИЛАРом разработан комплексный метод извлечения ценных компонентов из жмыха семян э. двухлетней. Методом перекристаллизации путем образования комплексов включения жирных кислот с мочевиной китайским исследователям Wang H., Ling M. и др. удалось получить из масла семян э. двухлетней фракцию жирных кислот, на 95,6% обогащенную ГЛК. В семенах, корнях и надземной части энотеры двухлетней выявлено значительное количество дубильных веществ, фенолкарбоновых кислот, флавоноловых гликозидов гиперозида и изокверцетрина, антоцианов, тритерпеновых сапонинов, ситостерина, аскорбиновой кислоты, слизи, смолы.

Исследований по введению в культуру, ресурсных исследований, изучения фотохимического состава э. двухлетней в условиях интродукции и сравнительному изучению дикорастущих и интродуцированных видов не проводилось.

Цель н задачи работы. Цель - экспериментальное обоснование применения э. двухлетней как сырьевого источника масла, содержащего у-линоленовую кислоту; проведение фотохимических исследований надземной части с целью комплексного использования сырья.

Для реализации поставленной цели необходимо решение следующих задач:

1. Интродуцировать э. двухлетнюю на базе ботанического сада ПМФИ -филиала ВолгГМУ Минздрава России и определить ее сырьевые запасы в дикорастущей флоре Краснодарского края;

2. Выделить, изучить, идентифицировать различные классы липидов семян;

3. Провести фитохимическое исследование надземной части растения;

4. Дать фармакологическую оценку противовоспалительного действия масла семян и острой токсичности сухого экстракта травы э. двухлетней;

5. Установить морфолого-анатомические диагностические признаки и товароведческие показатели сырья;

6. Разработать нормативную документацию на масло из семян э. двухлетней.

Научная новизна. Впервые проведены ресурсные исследования (определены сырьевые запасы и величины возможных ежегодных заготовок семян и масла) э. двухлетней во флоре Краснодарского края; осуществлена интродукция данного вида на базе ботанического сада ПМФИ - филиала ВолгГМУ Минздрава России, определена сырьевая продуктивность семян и надземной части э. двулетней в условиях интродукции. Впервые проведено сравнительное изучение качественного состава и количественного содержания БАВ семян дикорастущих растений и культивируемых образцов э. двухлетней {подробно изучен состав нейтральных и полярных липидов, неомыляемой фракции, позиционно-видовой состав триацилглицеридов, а также установлено высокое содержание в масле св-6 у-линоленовой кислоты и значимое количество ш-З а-линоленовой кислоты). Изучен химический состав травы э. двухлетней (установлено содержание и состав фенольных соединений, гидролизуемых дубильных веществ, полисахаридов, аминокислот) определены товароведческие показатели сырья. Получен сухой экстракт травы э. двухлетней, определены оптимальные параметры экстракции. Установлено, что сухой экстракт является малотоксичным и может представлять несомненную перспективу для дальнейших фармакологических исследований в качестве средства, обладающего кардиотоническим действием. Установлено, что масло семян обладает противовоспалительной активностью.

Проведено морфолого-анатомическое изучение надземной части э. двухлетней, установлены диагностические признаки и товароведческие показатели сырья.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Теоретическая значимость. В результате проведенных экспериментальных исследований состава семян э. двухлетней доказана целесообразность ее применения как источника жирного масла с высоким содержанием эссенциальных жирных кислот, в особенности со-б у-линоленовой кислоты. Результаты определения химического состава травы и предварительные фармакологические исследования свидетельствуют о необходимости дальнейшего более глубокого изучения надземной части э. двухлетней для получения новых лекарственных препаратов.

Практическая значимость. Методики анализа масла семян э. двухлетней, включенные в проект ФСП «Масло семян энотеры», апробированы в ГУЗ «Республиканский центр контроля качества и сертификации лекарственных средств Министерства Здравоохранения РСО-Алания» (акт апробации от 17.02.2012г.). Материалы информационного письма «Изучение позиционно-видового состава триацилглицеридов методом панкреатического гидролиза» включены в лекционный курс и практические занятия кафедры органической химии ПМФИ - филиала ВолгГМУ по курсу: «Липиды» (акт о внедрении от 04.02.2013 г.). Разработана «Инструкция по сбору и сушке травы и семян энотеры двулетней» (утверждена ПМФИ - филиалом ВолгГМУ 05.02.2013 г.). Методология и методы исследования. Методология фармакогностического исследования подразумевает научно обоснованную и целесообразно организованную последовательность действий и включает несколько блоков: информационно-исследовательский, фотохимический, технологический, стандартизационный и фармакологический. При проведении работы использовались следующие методы исследований: биологические, химические, физико-химические (ГЖХ, УФ-спектрофотометрия, ВЭЖХ, жидкостная хроматография, масс-спектроскопия и др.), микробиологические, технологические и фармакологические. Положения, выносимые на защиту:

1. Результаты изучения липидов семян э. двухлетней.

2. Результаты фитохимического изучения надземной части э. двухлетней.

3. Результаты ресурсных и интродукционных исследований э. двухлетней.

4. Результаты морфолого-анатомических исследований надземной части э. двухлетней.

5. Результаты технологических исследований по разработке сухого экстракта травы.

Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность полученных результатов достигается благодаря использованию современных химических, физико-химических, технологических, биологических и фармакологических методов, позволяющих получать воспроизводимые и однозначные результаты. Результаты измерений статистически обработаны. Апробация методик анализа липидов в условиях ГБУЗ «Республиканский центр контроля качества и сертификации лекарственных средств» МЗ РСО-Алания показала их воспроизводимость, что также подтверждает достоверность полученных данных.

Основные положения диссертационной работы доложены на научных конференциях ГБОУ ВПО Пятигорской ГФА «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» в январе 2008, 2009, 2010 и 2011 г. {г. Пятигорск). По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, в т.ч. 3 - в журналах, рекомендованных ВАК.

Основное содержание работы Объектом исследования явились семена и надземная часть э. двухлетней, собранные в фазу созревания плодов (семян) с различных мест произрастания и с опытных делянок ботанического сада ПМФИ - филиала ВолгГМУ (табл.1).

Таблица 1 - Объекты исследования

Исследуемый вид Место произрастания (сбора)

Oenothera biennis L. Окрестности г. Казань республики Татарстан

Окрестности г. Уфа республики Башкортостан

Майкопский район Краснодарский край

Ботанический сад ПМФИ - филиала ВолгГМУ

а

Изучение химического состава вегетативных и репродуктивных органов з. двухлетней Изучение липидов семян э. двухлетней

Масличность семян э. двухлетней с различных мест произрастания составила 19,4-21,9%, что позволяет отнести семена к высокомасличным.

Реализуя главную цель исследования - установление содержания ПНЖК, методом ГЖХ на хроматографе «СС-2014» ^¡тас^и) определяли жирнокислотный состав масла семян э. двухлетней с различных мест произрастания (табл. 2). Условия анализа: капиллярная колонка «Огг^а\уах 250» длиной 30,0 м, диаметром 0,25 мм, сорбент - полиэтиленгликоль, 1 колонки -205°С, 1 испарителя - 250°С, I детектора - 260°С, газ-носитель - гелий, скорость подачи газа - ЗОмл/мин.

Таблица 2 - Состав жирных кислот НЛ семян э. двухлетней

Жирные кислоты Образцы эноте ры двухлетней

I II III IV

Лауриновая (12:0) Сл. 0,1 0,1 0,1

Миристиновая (14:0) 0,1 0,1 Сл. 0,1

Пентадекановая (15:0) - - _

Пальмитиновая (16:0) 5,9 6,4 7,5 7,8

Пальмитолеиновая (16:1) - - Сл.

Маргариновая (17:0) - - _ _

Стеариновая (18:0) 0,2 1,8 1,7 1,1

Олеиновая (18:1) ш-9 5,0 14,1 14,7 16,9

Олеиновая (18:1) ш-7 - 0,5 0,7 0,2

Линолевая (18:2) 84,4 69,8 67,4 67,7

у-линоленовая (у-18:3) 4,4 7,2 7,8 6,1

а-линоленовая (а-18:3) Сл. -

Арахиновая (20:0) - - Сл. _

Гондоиновая (20:1) - - 0,1

Бегеновая (22:0) - -

Эруковая (22:1) - - - _

г "насыщенных жирных кислот.% 6,2 8,4 9,4 9,1

У ненасыщенных жипных кислот. % 93,8 91,6 90,6 90,9

I - Oenothera biennis L. (окрестности г. Казань)

II - Oenothera biennis L. (окрестности г. Уфа)

III - Oenothera biennis L. (Майкопский район Краснодарский край)

IV - Oenothera biennis L. (Ботанический сад Пятигорской ГФА).

Основными кислотами (>1%) для э. двухлетней с различных мест произрастания являются пальмитиновая (16:0), олеиновая (18:1), линолевая (18:2) и у-линоленовая (у 18:3). Среди ненасыщенных кислот изученных видов лидирующей является линолевая (от 67,4 до 84,4%). Олеиновой кислоты (18:1) больше содержится в э. двухлетней, интродуцированной в ботаническом саду ПМФИ, и ее количество, как показывают наши данные, может меняться в пределах от 5% до 17% в зависимости от места произрастания. Содержание FJIK в исследуемых образцах колеблется незначительно - от 4,4 (окрестности Казани) до 7,8% (Майкопский район Краснодарского края).

Для выделения нейтральных липидов (HJ1) измельченные воздушно-сухие семена экстрагировали гексаном исчерпывающе методом настаивания при комнатной температуре.

Методом ПТСХ на силикагеле нейтральные липиды разделили на классы: сложные эфиры тритерпеновых соединений (СЭТС), триацилглицериды (ТАГ), свободные жирные кислоты (СЖК), токоферолы, диацилглицериды (ДАГ), тритерпеновые соединения, моноацилглицериды (МАГ) (табл. 3). Количественное содержание классов липидов определили гравиметрически.

Таблица 3 - Состав нейтральных липидов семян э. двухлетней

Классы нейтральных липидов Содержание, %

I II III IV

Сложные эфиры тритерпеновых соединений 4,2±0,04 4,1±0,04 4,3±0,03 4,4±0,04

Триацилглицериды 90,1 ±1,93 90,5± 1,93 90,9±1,86 90,8± 1,76

Свободные жирные кислоты+токоферолы 1,3±0,02 1,1 ±0,02 0,9±0,03 1,2±0,04

Диацилглицериды 2,0±0,08 2,1 ±0,08 1,8±0,09 1,6±0,06

Тритерпеновые соединения 1,8±0,05 1,0±0,05 1,0±0,02 1,2±0,03

Моноацилглицериды 1,8±0,07 1,2±0,07 1,1 ±0,06 0,8±0,05

Как видно из данных таблицы 3, состав НЛ э. двухлетней с различных мест произрастания практически не различался ни по набору отдельных классов, ни по их содержанию. Основным классом НЛ были триацилглицериды (ТАГ) (около 90%), вторым классом в количественном отношении были СЭТС {от 4,1 до 4,4%).

Окисленные липиды, о выделении которых из семян э. двухлетней сообщалось ранее, в исследуемых образцах не обнаружены.

Из шрота, оставшегося после отделения НЛ, смесью хлороформ-спирт метиловый (2:1) выделили полярные липиды (Г1Л). которые методом ПТСХ разделили на гликолипиды (ГЛ) и фосфолипиды (ФЛ).

В составе ФЛ семян э. двухлетней, интродуцированной в ботаническом саду Пятигорской ГФА, идентифицировали 7 компонентов, главными из которых были фосфатидилхолин и фосфатидилинозитол (табл.4).

Кроме классов, представленных в таблице 4, в ГЛ обнаружили компонент, который по своей подвижности на ТСХ совпадал с урсоловой кислотой и давал качественную реакцию с кислотой серной, реактивом Либермана-Бурхарда и Сальковского.

Таблица 4 - Состав ПЛ э. двухлетней, интродуцированной в бот. саду ПМФИ

№ Группа ПЛ Содержание, % от группы ПЛ (ГЛ или ФЛ)

Гликолипиды

1. Моногалактозилдиацилглицериды 22,3±0,5

2. Стерилгликозиды 23,б±0,5

3. Дигалактозилдиацилглицериды 54,1 ±0,6

Фосфолипиды

1. Кардиолипин 3,6±0,05

2. Фосфатидилглицерин 10,0±0,3

3. Фосфатидилэтаноламин 2,0±0,06

4. Фосфатидилхолин 39,9±0,9

5. Фосфатидилинозит 22,9±0,1

6. Лизофосфатидилхолин 5,0±0,09

7. Фосфатидная кислота 16,6±0,2

Методом ГЖХ определили жирнокислотный состав фракций нейтральных и полярных липидов исследуемых образцов энотеры двухлетней и установили, что ГЛК присутствовала во всех классах НЛ в количестве от 1,2% до 7,4% (во фракции ТАГ).

Таблица 5 - Состав жирных кислот классов HJI семян э. двухлетней (Казань -1; Уфа- II; Краснодарский край - III; Бот. сад ПМФИ - IV)

Кислоты сэттс ТАГ ДАГ МАГ

I II III IV I II III IV I II III IV I II III IV

12:0 Сл. - - Сл. 0,9 Сл. Сл. Сл. 0,2 0,9 0,8 0,1 6,3 1,1 3,4 0,7

14:0 Сл. 8,5 1,4 0,1 Сл. Сл. Сл. 0,1 0,2 2,5 2,4 0,1 12,6 5,6 5,3 4,8

15:0 - - - - - - - - - 0,7 0,6 - - - - .

16:0 13,4 28,5 26,4 15,1 1,7 8,2 7,9 7,3 4,2 17,8 9,4 6,9 15,9 14,2 14,9 13,9

16:1 6,5 6,6 -

17:0 - 6,8 7,1

18:0 4,5 2,3 2,1 2,7 Сл. 1,7 1,5 1,1 0,6 6,9 8,8 1,7 14,0 5,0 6,7 11,3

18:1 6,6 9,8 8,4 10,1 5,2 16,1 17,1 14,3 7,1 23,0 21,1 12,8 7,5 17,9 14,3 10,9

18:1со-9 - 0,5 - Сл. - 0,5 0,4 0,2 - 1,0 0,6 0,4 - 0,7 0,4 0,1

18:2са-7 73,7 40,5 49,7 69,5 91,0 66,1 66,2 73,7 85,9 43,1 51,9 76,1 42,1 44,5 44,4 57,1

18:3 у 1,8 3,1 4,8 2,5 1,2 7,4 6,9 3,3 1,8 4,1 4,4 1,9 1,6 4,4 4,0 1,2

18:3 а Сл. - - - Сл. - - . - - _ _ . - _

20:0 - - - - - Сл. - - - - - - ■ 0,1 - -

20:1

21:0

22:0

17,9 46,1 37,1 17,9 2,6 9,9 9,4 8,5 5,2 28,8 22,0 8,8 48,8 26,0 30,3 30,7

£2 82,1 53,9 62,9 82,1 97,4 90,1 90,6 91,5 94,8 71,2 78,0 91,2 51,2 74,0 69,7 69,3

Таблица 6 - Состав жирных кислот классов ПЛ семян э. двухлетней (Казань -1; Уфа- II; Краснодарский край - III; Бот. сад ПМФИ - IV)

Кислоты Фосфолипиды Гликолипиды

I II III IV I II III IV

Лауриновая (12:0) Сл. Сл. 7,6 2,0 Сл. 3,2 3,4 1,1

Миристиновая (14:0) Сл. - 1,3 1,5 Сл. Сл. 3,0 0,6

Пентадекановая (15:0) - - - - - - -

Пальмитиновая (16:0) 17,3 17,2 16,7 18,9 20,0 23,1 20,1 22,8

Пальмитолеиновая (16:1) - - - - - - - -

Маргариновая (17:0) - - 2,4 - - - - -

Стеариновая (18:0) 25,0 20,4 4,7 13,9 11,0 10,3 6,8 8,9

Олеиновая (18:1) ю-9 16,7 16,9 13,0 16,1 11,0 26,2 39,8 23,6

Олеиновая (18:1) со-7 - - 0,2 0,1 - - 0,1 0,2

Линолевая (18:2) 28,3 37,1 47,2 45,1 46,9 33,1 24,6 41,4

Линоленовая (18:3) у 7,0 5,6 3,8 2,4 5,0 4,1 - 1,4

Линоленовая (18:3) а 2,9 2,8 Сл. - 2,3 - Сл. -

Арахиновая (20:0) - - 1,6 - - - - -

Гондоиновая (20:1) - - - - - - - -

Генейкозановая (21:0) 1,8 - - - Сл. - - -

Эруковая (22:0) 1,0 - - - 3,8 - - -

у ^насыщенных жирных кислот 45,1 37,6 36,8 36,3 34,8 36,6 35,5 33,4

у ^ненасыщенных жирных кислот 54,9 62,4 64,2 63,7 65,2 63,4 64,5 66,6

В ПЛ ГЛК также присутствовала в значимых количествах (от 4,1 до 7%). Наименьшее содержание ГЛК отмечено в масле семян э. двухлетней, произрастающей в окрестностях Казани (1,2%), наибольшее — в масле семян э. двулетней, собранной в окрестностях Уфы. Как видно, содержание ГЛК в масле зависит от многих факторов внешней среды (условий произрастания растения). Что касается а-линоленовой кислоты в изученных образцах семян, то в незначительных количествах она присутствовала только в ПЛ (2,3-2,9%). Доминирующей ненасыщенной жирной кислотой является линолевая (18:2), содержание которой варьировало от 24,6% (в ГЛ э. двухлетней, выращенной на территории Краснодарского края) до 91,0% (в ТАГ э. двухлетней, произрастающей в окрестностях Казани). Насыщенные жирные кислоты, лидирующей среди которых является пальмитиновая, в заметных количествах присутствуют в СЭТС, ДАТ и МАГ.

В неомыляемой фракции методом хромато-масс-спектрометрии на квадрупольном жидкостном хромато-масс-спектрометре ЬСМ8-2010 ЕУ (БЫтас^и) во фракции тритерпеновых соединений идентифицировали стерины: Р-ситостерин, кампестерин и стигмастерин; тритерпеновые спирты: лупеол, циклоартенол и 24-метиленциклоартенол.

Содержание витамина Е в масле энотеры, определенное методом ВЭЖХ, составило 8,17 мг/100 г масла. Каротиноидов в масле семян энотеры не обнаружили.

Методом панкреатического гидролиза установили позиционно-видовой и типовой составы ТАГ э. двухлетней (табл. 7).

Всего видов ТАГ было 38, из них в таблице 7 приведены 17 видов, содержание которых превысило 1%. Типовой состав ТАГ представлен 6, из которых почти 95% - это типы с ненасыщенной жирной кислотой во 2-м положении.

Таблица 7 — Позиционно-видовой состав триацилглицеридов семян

э. двухлетней с содержанием видов >1%

Виды ТАГ Содержание, моль%

18:2-П-18:2 2,4

18:2-18:1-18:2 8,7

П-18:1-18:2+18:2-18:1-П 3,4

18:1-18:1-18:2+18:2-18:1-18:1 3,8

18:2-18:1-18:3+18:3-18:1-18:2 2,0

П-18:2-П 1,2

18:1-П-18:1 1,4

18:2-18:2-18:2 28,5

18:2-18:3-18:2 3,3

П-18:2-18:1+18:1-18:2-П 2,4

П-18:2-18:2+18:2-18:2-П 11,4

П-18:2-18:3+18:3-18:2-П 1,2

18:1-18:2-18:2+18:2-18:2-18:1 12,4

18:1-18:2-18:3+18:3-18:2-18:1 1,4

18:3-18:2-18:2+18:2-18:2-18:3 6,4

П-18:3-18:2+18:2-18:3-П 1,4

18:1-18:3-18:2+18:2-18:3-18:1 1,4

Остальные —21 вид 7,3

П- сумма 16:0+18:0

Исследования по изменению органолептических, физических показателей и жирнокислотного состава масла в процессе хранения позволили установить срок хранения масла — 2 года.

Изучение химического состава надземной части энотеры двухлетней Поскольку э. двухлетняя обладает большой биомассой, было целесообразно изучить фитохимический состав ее надземной части с целью обоснования возможности комплексного использования ценного сырья. В траве э. двухлетней обнаружили и определили количественное содержание флавоноидов (1,6+0,03%), гиперозида (0,39+0,03%), дубильных веществ (0,99±0,02%), аминокислот (2,99%), полисахаридов (5,63±0,17%).

Для выделения полисахаридов (ПС) использовали известную методику, с помощью которой полисахаридные комплексы были разделены на фракции, содержащие водорастворимые полисахариды, извлекаемые последовательно экстракцией холодной и горячей водой (ВРПС1 и ВРПС2), пектиновые вещества

{ПВ, экстракция 0,5% раствором аммония оксалата), гемицеллюлозы А и Б (ГМ А и ГМ Б, экстракция 10% раствором натрия гидроксида). Состав моносахаридов выделенных фракций устанавливали с помощью кислотного гидролиза (1% кислота серная в течение 36 часов). Соотношение фракций полисахаридов ВРПС1: ВРПС2: ПВ: ГЦ А: ГЦ Б в траве энотеры двухлетней составляет 1:1: 2,6: 4,1: 2,2. Основными мономерными единицами полисахаридов являются глюкоза, арабиноза, галактоза и глюкуроновая кислота (табл. 8).

Таблица 8 - Состав полисахаридных фракций травы э. двухлетней

Название фракции Моносахаридный состав

ВРПС 1 Глюкоза, галактоза, глюкуроновая кислота

ВРПС2 Глюкоза, арабиноза, галактоза, глюкуроновая кислота

ПВ Глюкоза, галактоза

ГЦА Глюкоза, галактоза

ГЦВ Глюкоза, глюкуроновая кислота

Анализ фенольных соединений травы э. двухлетней проводили методом ВЭЖХ на жидкостном хроматографе «ИЬБТОЫ», модель 305, инжектор ручной,

модель RHEODYNE 7125 USA с последующей компьютерной обработкой результатов с помощью программы Мультихром для «Windows». Использовали металлическую колонку размером 4,6x250 мм KROMASIL С18, размер частиц 5 микрон, подвижной фазы - спирт метиловый - вода - кислота фосфорная концентрированная - тетрагидрофуран (370:570:5:60). Скорость подачи элюента 0,8 мл/мин. Детектирование осуществляли с помощью УФ - детектора «GILSTON» (UV/VIS модель 151) при длине волны 254 нм.

Таблица 9 - Состав фенольных соединений травы э. двухлетней

Время, мин Высота пика, mV Площадь пика, шУхсек Содержание (метод внутренней нормализации), % Название соединения

3,42 178,88 5017,15 12,32 Галловая кислота

4,03 115,03 7291,35 17,90 Изоферуловая кислота

6,04 43,36 3085,76 7,58 Эпикатехин

8,36 20,06 1997,11 4,91 Кофейная кислота

10,50 12,20 1823,48 4,47 Дигидрокверцентин

16,22 27,32 2113,01 5,19 Гиперозид

20,83 5,08 377,49 0,93 Нарингин

56,30 3,42 961,09 2,36 Коричная кислота

Таким образом, в траве э. двухлетней при наличии доступных стандартов идентифицировано 8 веществ фенольной природы. Методом внутренней нормализации определены среди идентифицированных веществ превалирующие: изоферуловая кислота (17,90%), галловая кислота (12,32%) и эпикатехин (7,58%).

На аминокислотном анализаторе Amino acid analyzer Т339М определили общее содержание аминокислот в надземной части б. лекарственного - 29,92 г/кг, из которых 34,9% составляют незаменимые. В числе незаменимых аминокислот преобладают валин (2,28 г/кг), треонин (2,01 г/кг) и лейцин (1,23 г/кг), в числе заменимых - глицин (4,51 г/кг), аспарапш (3,71 г/кг) и аланин (3,45 г/кг).

Используя метод эмиссионного спектрального анализа после озоления в траве обнаружено 19 макро-, микро- и ультрамикроэлементов, преобладающими среди которых были калий (30%) и кальций (20%).

Результаты проведенных исследований состава травы свидетельствуют о перспективности комплексного использования э. двухлетней (семена и трава).

Иитродукционные исследования и определение сырьевых запасов э. двухлетней в дикорастущей флоре

Одним из основных источников ценного лекарственного растительного сырья являются его естественные природные запасы в дикорастущей флоре. С целью решения задачи сырьевого обеспечения нами была проведена работа по учету запасов сырья э. двухлетней на конкретных зарослях с использованием различных методик определения урожайности.

Таблица 10 - Сырьевые запасы семян э. двухлетней в исследуемых районах Краснодарского края и республики Адыгеи

Исследованный район Средняя арифметическая урожайность, кг Общий биологический запас, кг Эксплуатационный запас, кг Величина возможных ежегодных

Майкопский район (Адыгея) 0,052 520 468 234

Мостовской 0,046 460 414 207

Усть-Лабинский 0,025 250 225 113

Лабинский 0,034 340 306 153

Новокубанский 0,068 680 612 306

Как следует из таблицы 10, наибольшие величины возможных ежегодных заготовок семян энотеры двулетней без ущерба для воспроизводства растения — в Новокубанском районе Краснодарского края (306 кг) и Майкопском районе Адыгеи (234 кг).

Проведены исследования биологических особенностей развития э. двухлетней в условиях Ставропольского края. В результате проведенных исследований в онтогенезе энотеры двухлетней выделили три периода и семь возрастных состояний: латентный период (покоящиеся семена); виргинильный период (проростки, ювенильное, имматурное и виргинильное возрастные состояния); генеративный период (молодое, средневозрастное и старое генеративное возрастные состояния). Определена всхожесть семян в лабораторных (85,8%) и полевых (75,3%) условиях. Установлено, что урожайность Семян э. двухлетней в условиях интродукции составляет около 60 г/ м2, т.е. около 600 кг/Га, надземной части - около 2 кг /1 м2, т.е. около 20 т/ Га.

Морфолого-анатомическое изучение надземной части э. двухлетней, установление норм качества предлагаемых видов сырья

Одним из основных этапов стандартизации сырья является определение его подлинности на основании анатомо-диагностических признаков.

Для листа диагностическими признаками являются: тип строения -дорзовентральный, амфистоматический; трихомы в виде простых одноклеточных волосков, имеющих розетку в основании из 7-8 клеток, и более мелких головчатых волосков (рис.1, 2).

Для стебля характерны - цилиндрическая форма на поперечном сечении; утолщение покровной ткани в нижней его части за счет деятельности пробкового камбия; проводящая система непучкового типа в средней и нижней части стебля при сохранении внутренней флоэмы и ксилемы в виде сосудов и либриформа (рис.3).

Рисунок 1 - А - верхняя эпидерма; Б - нижняя эпидерма

(ув. объектива х10) (ув. объектива х40)

Рисунок 3 - Фрагмент поперечного среза стебля (ув. х8)

Нормативная документация на ЛРС предусматривает обязательное определение числовых показателей, регламентирующих качество сырья. В связи с этим нами на 6 сериях проведены товароведческие исследования и разработаны нормы качества (числовые показатели) для сырья э. двухлетней (табл.11).

Рисунок 2 - А - сегмент поперечного среза листа; Б

проводящий пучок

Таблица 11 - Товароведческие показатели сырья э. двухлетней

Товароведческий показатель/результаты определения Трава Семена

Влажность Не более 10% Не более 9%

Содержание золы общей Не более 6% Не более 8%

Содержание золы нерастворимой в растворе кислоты хлористоводородной 16% Не более 2% Не более 2%

Экстрактивные вещества / масличность для семян Не менее 7% Не менее 18%

Органической примеси Не более 2% Не более 3%

Минеральной примеси Не более 1% Не более 1%

Частиц, не проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 7 мм Не более 12%

Частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 0,5 мм Не более 10% Не более 2%

Пожелтевших, побуревших и почерневших частей растения Не более 4% Не более 1%

Содержание радионуклидов в траве энотеры двухлетней не превышало предельно допустимых уровней содержания в пищевых продуктах.

Получение сухого экстракта и предварительные фармакологические

исследования

Экспериментально определены оптимальные параметры экстракции (экстрагент - спирт этиловый 70%; размер частиц сырья - 0,5-1,0 мм; соотношение сырья и экстрагента 1:50; кратность экстрации-3).

Технологическая схема получения сухого экстракта травы э. двухлетней предусматривает стадии экстракции, упаривания полученного извлечения, очистку и сушку концентрированного экстракта. Фильтрацию экстракта проводили традиционно с помощью нутч-фильтра. Сгущение экстракта проводили в вакуум-аппарате до удаления экстрагента примерно на 3Л. Далее (в

лабораторных условиях) проводили сушку полуфабриката в сушильном шкафу при температуре 60°С до содержания влаги в экстракте 5±0,03%.

Готовый продукт — сухой экстракт травы э. двухлетней представляет собой аморфный порошок светло-желтого цвета со слабым специфическим запахом.

В результате предварительных фармакологических исследований установлено, что масло и сухой экстракт э. двухлетней по классификации К.К. Сидорова и в соответствии с ГОСТом 12.1.007 — 76 являются веществами 4 класса токсичности, т.е. малотоксичными. Изучение противовоспалительной

активности на модели «ватно-шариковой гранулемы» показало, что величина отека при применении масел э. двухлетней и облепихи была на 11% и 12% достоверно ниже, чем в контрольной группе. Процесс синтеза соединительной ткани на фоне масел э. двухлетней и облепихи был достоверно более выражен, чем в контрольном опыте и составил в среднем 43%. В сравнительном аспекте влияние масла энотеры и масла облепихи на экссудативную и пролиферативную фазы воспалительного процесса не носило достоверного различия. Заключение

Подробно изучен состав нейтральных и полярных липидов семян э. двухлетней, проведено фитохимическое изучение травы, технологические исследования по разработке сухого экстракта и определена острая токсичность и противовоспалительная активность выделенного масла. Методики анализа масла семян энотеры, включенные в проект ФСП «Масло энотеры для наружного применения», апробированы на базе ГБУЗ «Республиканский центра контроля качества и сертификации лекарственных средств» Минздрава РСО-Алания.

Итоги исследования:

1. Подробно изучен состав нейтральных и полярных липидов семян энотеры двухлетней. Установлено, что наибольшее количество у-линоленовой кислоты концентрируется в триацилглицеридах.

2. Методом хромато-масс-спектрометрии определен состав липофильных компонентов, в которых идентифицировали: стерины - р - сито-, стигма-и кампестерины; тритерпеновые спирты - 24-метиленциклоартенол и лупеол.

3. Методом панкреатического гидролиза установлено, что типовой состав триацилглицеридов представлен 6 типами, из которых почти 95% - это типы с ненасыщенной жирной кислотой во 2-м положении.

4. В траве э. двухлетней установлено присутствие флавоноидов (1,60±0,03%), в том числе гиперозида (0,39±0,03%); гидролизуемых

дубильных веществ (0,99±0,02%), полисахаридов (5,63±0,17°/ аминокислот (2,99%). В составе фенольных соединений мажорны явились изоферуловая кислота (17,90%), галловая кислота (12,32%) эпикатехин (7,58%). Превалирующими макроэлементами явили кальций и калий.

5. Получен сухой экстракт травы энотеры двухлетней. Определен оптимальные параметры экстракции.

6. Проведены предварительные фармакологические исследования установлено, что сухой экстракт и масло семян энотеры двухлетн являются малотоксичными; масло семян облада противовоспалительной активностью.

7. Определены сырьевые запасы и величина возможных ежегоднь заготовок семян энотеры двухлетней в некоторых район Краснодарского края и Майкопском районе республики Адыге Установлено, что наибольшие величины возможных ежегоднь заготовок семян без ущерба для воспроизводства растения -Новокубанском районе Краснодарского края (306 кг/га) и Майкопско районе Адыгеи (234 кг/га).

8. Проведены исследования биологических особенностей развития энотер двухлетней в условиях Ставропольского края. Определена всхожее семян в лабораторных (85,8%) и полевых (75,3%) условия Установлено, что урожайность семян в условиях интродукци составляет около 60 г /м2, т.е. около 600 кг/Га, надземной части - око 2 кг/м2, т.е. около 20 т/Га.

9. Проведено морфолого-анатомическое исследование и установлен

основные диагностические признаки, позволяющие достоверн

идентифицировать растение.

10. Проведены товароведческие исследования и разработаны нормы качества (числовые показатели) для травы и семян энотеры двухлетней. Определено содержание радионуклидов в траве энотеры двухлетней. П. Разработан проект ФСП «Масло семян энотеры двухлетней» и «Инструкция но сбору и сушке сырья».

Таким образом, проведенные исследования липидного состава семян интродуцированных и дикорастущих видов э. двухлетней показали их идентичность и возможность применения в качестве растительного источника у-линоленовой кислоты. Богатый фитохимический состав травы, в т.ч. высокое содержание пшерозида представляет интерес для проведения исследований с целью разработки лекарственных препаратов кардиотонического действия. Список опубликованных по теме диссертации работ

1. Липиды семян Oenothera L. с различных мест произрастания. Сообщение II / С.Г. Юнусова, М.С. Юнусов, О.Н. Денисенко, Е.В. Чернова // Башкир, химич. журн. - 2009. - № 2. - С. 114-118.

2. Липиды семян Oenothera с различных мест произрастания. Сообщение I / С.Г. Юнусова, М.С. Юнусов, А.Р. Каримова, В.Ф. Миронов, С.Г. Минзанова, А.И. Коновалов, Ю.Я. Ефремов, О.Н. Денисенко, Е.В. Чернова И Химия природ, соед. - 2007. - № 5. - С. 430-433.

3. Изучение жирнокислотного состава полярных липидов некоторых представителей флоры Кавказа (Helleborus abchasicus A.Br, и Helleborus caucasicus A.Br., Borago officinalis L„ Oenothera biennis L.) / З.В. Ищенко, C.C. Ляшенко, Е.В. Чернова [и др.] // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2013.- № 3. - С. 52-56.

4. Изучение липидов семян энотеры двулетней - Oenothera biennis / О.Н. Денисенко, С.Г. Юнусова, М.С. Юнусов, Е.В. Чернова // Естествознание и гуманизм: сб. науч. работ. - Томск, 2006. - т.З, № 3. - С. 46.

5. Некоторые представители семейств онагровые (Onagraceae) и

бурачниковые (Boraginaceae), интродуцированные в ботаническом саду Пятигорской ГФА, как источники эссенциальных жирных кислот / С.С. Ляшенко, Е.В. Чернова, О.Н. Денисенко, С. Г. Юнусова // Фармация и общественное здоровье: материалы ежегодной конференции 18 апреля 2012. - Екатеринбург, 2012. - С. 180-182.

6. Чернова, Е.В. Влияние сроков хранения семян энотеры двулетней (Oenothera biennis L.) на состав биологически активных соединений / Е.В. Чернова [и др.] // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2011. - Вып. 66. -С. 215-216.

7. Чернова, Е.В. Изучение некоторых показателей семян и масла Oenothera biennis / Е.В. Чернова, О.Н. Денисенко, С.Г. Юнусова // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2007. - Вып. 62. - С. 122-123.

8. Чернова, Е.В. Изучение распространения и запасов энотеры двулетней в Майкопском районе Краснодарского края/ Е.В. Чернова, О.Н. Денисенко // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2010. - Вып. 65.-С. 147-148.

9. Чернова, Е.В. Микроморфологическое исследование энотеры двулетней (Oenothera biennis L.) / Е.В. Чернова, Ф.К. Серебряная, О.Н. Денисенко // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2008. - Вып. 63. - С. 107-109.

Ю.Чернова, Е.В. Фенольные соединения энотеры двулетней / Е.В. Чернова, С.Г. Юнусова, О.Н. Денисенко // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2009. -Вып. 64.-С. 122-123.

11.Изучение жирнокислотного состава масел энотеры двухлетней (Oenothera biennis L.) и морозника кавказского (Helleborus caucasicus

А.Вг.) в процессе хранения / Е.В. Чернова [и др.] // Молодые ученые в решении актуальных проблем науки: сб. работ молодых ученых 4 междунар. научн.-практ. конференции. - Владикавказ, 2013. - С.261 -263.

12. Идентификация некоторых фенольных соединений 4 видов лекарственных растений (бурачника лекарственного, энотеры двухлетней, морозника кавказского, морозника абхазского) методом ВЭЖХ / С.С. Ляшенко, Е.В. Чернова [и др.] // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. -Пятигорск, 2013. - Вып. 68. - С. 65-67.

13.Интродукционные исследования энотеры двулетней (Oenothera biennis L.), на базе ботанического сада Пятигорской ГФА / Е.В. Чернова [и др.] // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2012. - Вып. 67. - С. 137-138.

14.Определение содержания пигментов в жирных маслах некоторых представителей флоры Северного Кавказа / З.В. Ищенко, Е.В. Чернова, С.С. Ляшенко, О.Н. Денисенко // Аюуальные проблемы науки фармацевтических и медицинских вузов: от разработки до коммерциализации: Материалы научно-практической конференции с международным участием, посвященной 75-летию Пермской государственной фармацевтической академии (7-9 декабря 2011 г.). -Пермь, 2011 г. - С. 207-208.

15.Поиск перспективных растительных источников липидов флоры Северного Кавказа / З.В. Ищенко, Е.В. Чернова, С.С. Ляшенко, О.Н. Денисенко // Молодые ученые в решении актуальных проблем науки: сб. работ молодых ученых 2 междунар. научн.-практ. конференции. -Владикавказ, 2011. - С.208 - 211.

Приносим глубокую благодарность старшему научному сотруднику, канд. хим наук ЮнусовоиС.Г. и директору ИОХ УНЦРАН, действительному члену академии наук РФ

Юнусову М.С.

ЧЕРНОВА ЕЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЭНОТЕРЫ ДВУХЛЕТНЕЙ OENOTHERA BIENNIS L.

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Подписано к печати «Г7^ » к£>Л^рА 2013 г., формат 60x84 1/16 Бумага книжно-журнальная. Печать - ротапринтная. Усл. печат. л. 1,0 Тираж 100 экз. Заказ № /»¿93

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ПЯТИГОРСКИЙ МЕДИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ-ФИЛИАЛ ВОЛГОГРАДСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО МЕДИЦИНСКОГО УНИВЕРСИТЕТА МИНЗДРАВА РОССИИ» (357532, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11)