Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Фитохимическое и фармакологическое изучение травы манжетки <a href=http://file-loads.ru/ >шансон скачать бесплатно без регистрации</a>

На правах рукописи

Илья Игоревич

ФИТОХИМИЧЕСКОЕ И ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ТРАВЫ МАНЖЕТКИ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия 14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата фармацевтических наук

2 7 2иГ,

Москва-2011

4843096

4843096

Работа выполнена в ГОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова

Научные руководители:

доктор фармацевтических наук доктор медицинских наук

Баева Вера Михайловна Козлов Алексей Михайлович

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, профессор

доктор фармацевтических наук

Муравьёва Татьяна Ивановна Баландина Ирина Анатольевна

Ведущее учреждение:

Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН

Защита состоится «Д^ » С^^сЦЛЯ, 2011 г. в Ц/ часов на заседании Диссертационного совета Д.208.040.09 при ГОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова (119019, г. Москва, Никитский бульвар, д. 13).

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной медицинской библиотеке ГОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова (117998, г. Москва, Нахимовский проспект, д. 49).

Автореферат разослан <ОУ» 2010 г.

Учёный секретарь

Диссертационного совета Д.208.040.09, доктор фармацевтических наук,

профессор ^ ^л (Л Садчикова Наталья Петровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Поиск новых растительных источников для получения потенциальных лекарственных средств, расширяющих арсенал фармакотерапии наиболее распространенных заболеваний, включая онкологические, является актуальной задачей для современной фармацевтической и фармакологической науки. Внедрение лекарственных препаратов в клиническую практику невозможно при отсутствии детального изучения их химического состава, безопасности и эффективности на уровне доклинических исследований.

По данным ВОЗ, в последние годы смертность от онкологических заболеваний занимает второе место в мире после патологии сердечнососудистой системы. Доказательной медициной установлено, что растительные препараты являются эффективными, наименее токсичными, а также способны потенцировать и снижать побочные действия химиотерапевтических средств.

Манжетка обыкновенная традиционно применяется как противовоспалительное, кровоостанавливающее, лимфотропное,

гипотензивное и гипогликемическое средство.

В последние десятилетия манжетка активно изучается как сердечнососудистое средство. Андреева В.Ю. (1998-2001 г.г.) и Зыков A.A. (2000 г.) изучали траву манжетки как лимфотропное, гиполипидемическое и антиишемическое средство.

Ряд исследователей изучали химический состав эндемичных манжеток Сибирского региона. Для них установлено наличие некоторых фенольных соединений (флавоноидов, дубильных веществ, фенолкарбоновых кислот) в спиртовом извлечении (Андреева В.Ю., 2001 г.). Химический состав водных извлечений из травы манжетки не изучался в полном объеме.

В литературе отсутствуют данные о применении манжетки обыкновенной для профилактики и лечения злокачественных новообразований. Вместе с тем в литературе имеются данные о противоопухолевой активности агримониина, выделенного из других растительных источников (Окис1а Т., 1990).

Таким образом, трава манжетки является перспективным растительным сырьем для применения в научной медицине и, в частности, в онкологии.

Цель и задачи исследования. Провести фитохимическое и

фармакологическое изучение травы манжетки.

Для реализации поставленной цели были решены следующие задачи:

1. Провести фитохимическое изучение травы и настоя манжетки по составу фенольных соединений, полисахаридов, аминокислот, соединений нуклеиновой природы, макро- и микроэлементов;

2. Разработать характеристики подлинности и показатели качества для травы манжетки;

3. Разработать нормы качества для настоя травы манжетки;

4. Оценить фармакологическую (противоопухолевую, антиметастатическую и антитоксическую) активность настоя травы манжетки;

5. Оценить фармакологическую (цитотоксическую и антитоксическую) активность суммы полифенолов и агримониина из травы манжетки

Научная новизна. Проведено комплексное изучение химического состава нового лекарственного сырья - трава манжетки - в связи с его фармакологической активностью. Качественно и количественно установлено содержание в сырье и настое флавоноидов, фенолкарбоновых кислот, полисахаридов, аминокислот, макро- и микроэлементов, витаминов. Получены новые данные о содержании азотистых основании: нуклеиновых кислот (НК) в настое травы манжетки. Впервые для настоя травы манжетки установлен спектр фармакологических эффектов, таких как

противоопухолевый, антиметастатический и антитоксический. Получен Патент на изобретение (№ 2403055, зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 10 ноября 2010 г., приоритет изобретения от 23 апреля 2009 г.) «Способ получения средства из травы манжетки, снижающего токсичность циклофосфамида». Впервые установлена цитотоксическая и антитоксическая активность суммы полифенолов и агримониина из травы манжетки. Получены 3 заявки на изобретения: от 14.04.2010 г. (входящий № 020921, регистрационный № 2010114834) - «Способ получения полифенольного средства из травы манжетки, снижающего токсичность циклофосфамида и обладающего цитотоксической активностью»; от 14.04.2010 г. (входящий № 020920, регистрационный № 2010114833) - «Способ получения агримониина» и от 14.04.2010 г. (входящий № 020919, регистрационный № 2010114832) -«Средство, снижающее токсичность циклофосфамида». Практическая значимость.

• В свете современных требований проведена валидация методики дифференциальной спектрофотометрии для количественного определения в траве манжетки суммы флавоноидов в пересчете на рутин. Получен Акт внедрения результатов валидации методики;

• Данные, полученные в результате проведенных исследований вошли в разделы проектов фармакопейной статьи «НегЬа А1сЬетШае - трава манжетки» 2009 г. и «Инструкции по сбору и сушке травы манжетки»;

• Установлена фармакологическая активность настоя травы манжетки: противоопухолевая, антиметастатическая, цитотоксическая и антитоксическая. Данные защищены публикациями и Патентом на изобретение. Также определена антитоксическая и цитотоксическая активность суммы полифенолов и агримониина из травы манжетки, защищенные публикациями и заявками на изобретения;

• Результаты проведенных исследований используются в учебном процессе на кафедре фармакогнозии ГОУ ВПО Первый МГМУ имени И.М. Сеченова. Получен Акт внедрения результатов научных достижений.

Положения, выносимые на защиту:

■ Результаты фитохимического изучения фенольных соединений, полисахаридов, аминокислот, соединений нуклеиновой природы, макро- и микроэлементов травы и настоя манжетки;

" Данные по разработке характеристик подлинности и показателей качества травы манжетки;

■ Данные норм качества настоя травы манжетки;

■ Оценка изучения фармакологической активности настоя травы манжетки;

■ Данные о фармакологической активности суммы полифенолов и агримониина из травы манжетки.

Публикация материалов исследования и апробация работы. По

теме диссертации опубликовано 7 работ, в том числе 2 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ. Материалы диссертационной работы представлены на научно-практических конференциях: 63-й региональной конференции по фармации и фармакологии (январь 2008 г., Пятигорск), конференции с международным участием «Татьянин день» (22-23 января 2009 г., Москва), VIII Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» (21-22 апреля 2009 г., Москва), симпозиуме, посвященном 75-летию академика В.Г. Кукеса, (сентябрь 2009 г., Москва).

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в ГОУ ВПО Первый МГМУ имени И.М. Сеченова в соответствии с планом научно-исследовательских работ кафедры фармакогнозии по теме:

«Фармакогностическое изучение лекарственного растительного сырья, лекарственных сборов, лекарственных форм из сырья и разработка методов их стандартизации с учетом влияния антропогенных факторов» (код темы 0407093).

Объём и структура диссертации. Работа изложена на

м

страницах

машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (I глава), экспериментальной части (4 главы), общих выводов, списка литературы и приложений; иллюстрирована ^¡Р рисунками и Зь таблицами. Список литературы включает 149 источников, в том числе 35 - на иностранных языках.

Во введении обоснована актуальность выбранной темы, определены цели и задачи исследования, показана научная и практическая значимость работы, основные положения, выносимые на защиту.

В обзоре литературы (глава 1) обобщены данные за последние годы о современном состоянии исследований химического состава, методов анализа, фармакологической активности лекарственного растительного сырья и фитопрепаратов, содержащих полифенолы, проанализированы модели опухолей, рекомендованные для проведения доклинических испытаний по отбору средств, обладающих потенциальной противоопухолевой и антиметастатической активностью.

Глава 2 посвящена описанию объектов и методов исследования.

В главе 3 изложены результаты фитохимического изучения травы и настоя манжетки.

В главе 4 приведены данные по разработке характеристик подлинности и показателей качества травы манжетки, а также данные по разработке норм качества для настоя травы манжетки и валидационные характеристики методики количественного определения суммы флавоноидов в траве манжетки.

Глава 5 посвящена изучению противоопухолевой, антиметастатической, цитотоксической и антитоксической активности настоя, суммы полифенолов и агримониина из травы манжетки.

Приложение включает проекты ФС «НегЬа АкИетШае - трава манжетки» и «Инструкции по сбору и сушке травы манжетки», Патент на изобретение, уведомления о поступлении и регистрации заявок на изобретения, акт внедрения результатов научных достижений, акт внедрения результатов валидации методики количественного определения, справка о фармакологической активности, а также спектральные и хроматографические характеристики по изучению химического состава травы и настоя манжетки.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследований служили:

♦ трава манжетки, собранная в период цветения в Истринском и Раменском районах Московской области в 2007 и 2008 годах. Сырье заготавливали на опушке смешанного хвойно-лиственного леса, на суходольных лугах, на расстоянии более 2 км от населенных пунктов и трасс, в сухую погоду;

♦ настой травы манжетки 1:10 из стандартного сырья, приготовленный по методике Государственной Фармакопеи XI издания;

♦ настой травы манжетки 1:5 из стандартного сырья, приготовленный сгущением настоя 1:10 в 2 раза;

♦ настой травы манжетки 1:50 из стандартного сырья, приготовленный разведением настоя 1:10 в 5 раз;

♦ мыши-самцы линии ВЭР1;

♦ мыши-самцы линии С57В1/6;

♦ беспородные мыши-самцы 8НУ/ку

Для фитохимического исследования использовали настой травы манжетки 1:10.

Для определения фенольных соединений в настое травы манжетки использовали метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на жидкостном хроматографе фирмы Perkin Elmer (США).

Полисахариды травы и настоя манжетки количественно определяли методом гравиметрии по методике Государственной Фармакопеи XI издания, вып.2 (частная фармакопейная статья «Herba Bidentis - трава череды»), качественный анализ проводили методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) на хроматографических пластинах марки «Сорбифил».

Определение аминокислот в траве и настое манжетки проводили по методике JI.A. Баратовой (1988 г.) на аминокислотном анализаторе, модель 835 фирмы «Хитачи» (Япония).

Для изучения нуклеиновых кислот и нуклеотидов в настое травы манжетки использовали методы ВЭЖХ (жидкостной хроматограф фирмы Perkin Elmer (США)) и ПЦР-РВ (прибор для ПЦР в реальном времени АНК-16/32 (Россия), тест-система «Растение/358/NOS скрининг»).

Определение макро- и микроэлементов в траве и настое манжетки проводили на оптическом ИСП-спектрометре «Оптима 3000» атомно-эмиссионным методом МУК 4.1.1482-03.

Разработку характеристик подлинности и показателей качества на траву манжетки по разделам «Внешние признаки», «Микроскопия», «Качественный анализ» и «Числовые показатели» проводили с использованием общепринятых методик Государственной Фармакопеи XI издания, вып.1. Анализ сырья по разделу «Количественное определение» проводили по проекту ФС «Herba Alchemillae - трава манжетки» 2009 г.

Разработку норм качества настоя травы манжетки по разделам «Определение окраски жидкостей» и «Определение рН» проводили по общепринятым методикам Государственной Фармакопеи XI издания, вып.1.

Определение сухого остатка настоя травы манжетки проводили по методике общей статьи ГФ XI «Настойки».

Для фармакологических исследований использовали линейных и беспородных животных и настои травы манжетки 1:5, 1:10, 1:50, а также агримониин и сумму полифенолов, выделенные из травы манжетки.

Для определения фармакологической активности использовали общепринятые методики «Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2005 г.).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ФИТОХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ТРАВЫ И НАСТОЯ МАНЖЕТКИ

Анализ литературных данных показал, что химический состав БАВ травы манжетки изучен не в полном объеме.

В связи с тем, что в настой травы манжетки переходит весь многокомпонентный комплекс биологически активных веществ вместе с макро- и микроэлементами, нами проведено комплексное фитохимическое изучение данных веществ.

Определение фенольных соединений методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Проведенное хроматографическое разделение при одновременном детектировании при длине волны 255 нм и 280 нм показало, что трава манжетки содержит фенольные соединения (детектирование при 280 нм) и соединения флавоноидной природы (детектирование при 255 нм).

Как показывает анализ полученных экспериментальных данных, при длине волны детектирования 255 нм, настой травы манжетки 1:10 содержит 41 соединение. В то же время при детектировании при 280 нм определен 81 компонент.

Для идентификации и количественной оценки использовали стандартные соединения: рутин, кверцетин, гиперозид, лютеолин, хлорогеновая кислота, кофейная кислота, галловая кислота, арбутин, аскорбиновая кислота и рибофлавин.

Нами определено содержание основных фенольных соединений, обнаруженных в настое травы манжетки: рутин 0,872±0,026 мг/мл, кверцетин 0,009±0,001 мг/мл, гиперозид 0,012±0,0005 мг/мл, лютеолин 0,019±0,001 мг/мл, хлорогеновая кислота 0,272±0,012 мг/мл, кофейная кислота 0,015±0,0006 мг/мл, галловая кислота 0,010±0,0005 мг/мл, арбутин 0,087±0,004 мг/мл, аскорбиновая кислота 0,352±0,016 мг/мл, рибофлавин 0,005±0,0002 мг/мл. Наибольшее содержание установлено для рутина, хлорогеновой и аскорбиновой кислот.

Определение полисахаридов в траве и настое манжетки. В опытных образцах травы манжетки и приготовленных из них настоев методом гравиметрии определили содержание полисахаридов в пересчете на абсолютно сухое сырье, которое колебалось от 7,55% до 12,63% для сырья (в среднем - 10,09±0,12%) и от 4,65% до 7,24% для настоя (в среднем -5,95±0,09%).

Методом ТСХ в траве и настое манжетки после гидролиза идентифицировали следующие моносахара: ксилоза, глюкоза и галактоза (рис. 1). Для идентификации использовали смесь PCO ксилозы, глюкозы, галактозы, арабинозы и маннозы.

Определение аминокислот в траве и настое манжетки. С помощью аминокислотного анализатора с использованием стандартных образцов соответствующих аминокислот в траве и настое манжетки нами определены 18 аминокислот (АК), из них 7 незаменимых (валин, лейцин, изолейцин, треонин, метионин, лизин и фенилаланин). В настое травы манжетки 1:10 определено наиболее высокое содержание пролина и оксилизина (0,45 мг/мл и 0,13 мг/мл соответственно), а в воздушно-сухом сырье - аспарагиновой

смесь PCO настой травы

моносахаридов манжет кя 1:10

Рис.1. Хроматограмма

моносахаридных компонентов травы

и настоя манжетки 1:10 после

полного гидролиза.

кси - ксилоза, глю — глюкоза, гал -

галактоза, ара - арабиноза, ман -

манноза.

кислоты, глютаминовой кислоты, глицина, валина и лизина (1,14 мг/мл, 1,87 мг/мл, 1,03 мг/мл, 1,12 мг/мл и 1,04 мг/мл соответственно). Определение азотистых оснований нуклеиновых кислот и нуклеотидов в настое травы манжетки. Изучение содержания азотистых оснований в настое травы манжетки проводили методом ВЭЖХ с использованием PCO цитозина, урацила, тимина и ксантина.

На рисунке 2 представлены хроматограммы настоя травы манжетки и стандартов азотистых оснований. Анализ спектральных особенностей исследованных компонентов позволил идентифицировать присутствие в настое травы манжетки азотистых оснований нуклеотидов и нуклеиновых кислот.

"1 . Рис. 2. Хроматограммы настоя травы

манжетки и стандартов азотистых «j j оснований: 1-цитозин; 2-урацил; 3-

■4 ! ксантин; 4-тимин

Определение эссенциальных и условно-эссенциальных макро- и микроэлементов в настое и траве манжетки. Ввиду большой значимости элементного состава сырья и значительного вклада его в фармакологическую активность, определили элементный состав травы и настоя манжетки. Результаты анализа представлены в таблице 1.

Следует отметить, что содержание калия, переходящее в настой определено до 269,4 мг/л, магния - до 19,44 мг/л, цинка - до 17,46 мг/л, кремния - до 14,91 мг/л, а также марганца - до 12,40 мг/л, что положительно влияет на его фармакологические свойства.

Таблица 1. Содержание эссенциальных и условно-эссенциальных элементов _в траве манжетки и в настое из травы манжетки 1:10_

Химический элемент Воздушно-сухая трава манжетки, мг/кг Настой травы манжетки 1:10, мг/л

Са 141 39

Со 0,175 <0,001

Сг 0,235 0,096

Си 3,56 2,304

Ре <0,001 <0,001

К 396 269,4

Мв 38,8 19,44

Мп 12,4 4,02

Мо 0,027 <0,001

Ыа 2,44 51

Р 24,7 <0,001

Б 15,4 <0,001

Бе <0,001 <0,001

гп 27 17,46

17,1 14,91

В 2,11 <0,001

РАЗРАБОТКА ХАРАКТЕРИСТИК ПОДЛИННОСТИ И ПОКАЗАТЕЛЕЙ КАЧЕСТВА ТРАВЫ МАНЖЕТКИ

Результаты морфолого-анатомического и фитохимического изучения травы манжетки легли в основу разработки характеристик подлинности по

разделам: «Внешние признаки», «Микроскопия» и «Качественный анализ». Результаты изучения внешних признаков сырья представлены в таблице 2.

Таблица 2. Диагностические (внешние) признаки травы манжетки

Диагностический признак Характеристика признака

СТЕБЕЛЬ

Форма округлый

Характер поверхности опушенный

Характер ветвления разветвленный

Размеры

Длина 10 см

Диаметр 4 мм

Цвет Светло-зеленый

ЛИСТЬЯ

Листорасположение очередное

Форма листовой пластинки Округло-почковвдная и веерообразная

Размеры

Длина 6 см

Ширина 4 см

Наличие черешка

Стеблевые Сидячие

Розеточные Длиной 5 см

Строение листа Простые, лопастные

Жилкование Пальчато-нервное

Край зубчатый

Опушение

С верхней стороны Мал оопуше иная

С нижней стороны Более опушенная

Цвет

С верхней стороны Зеленый

С нижней стороны Светло-зеленый

ЦВЕТКИ

Тип соцветия Дихазиальное, клубоч ко видное

Строение цветка Актиноморфный

Строение околоцветника Простой 4-х-мерный, чашечковидный с подчашием

Цвет Желто-зеленый

Запах Слабый, своеобразный, кумариновый

Вкус Травянистый, слегка терпкий

Анатомическое изучение травы манжетки позволило выявить микроскопические признаки сырья. Эти данные представлены в таблице 3. На рисунках 3 и 4 представлены такие устойчивые диагностические микроскопические признаки, как одноклеточные простые волоски и друзы.

Рис.3. Микропрепарат листа с поверхности (край листа). Увеличение х200

1-место прикрепления простого волоска

2-части простых волосков

Рис. 4. Микропрепарат листа с поверхности. Увеличение 7x40 1-друзы по жилке

Фитохимическое изучение биологически активных веществ (БАВ) травы манжетки позволило установить качественный состав сырья. Хроматографические пробы позволили идентифицировать флавоноиды, среди которых преобладал рутин. Таким образом, для раздела «Качественный анализ» нами разработан метод тонкослойной хроматографии (ТСХ) для спиртового извлечения травы манжетки. Установлено, что на хроматограмме раствора сравнения (PCO рутина) обнаруживается зона адсорбции коричневого цвета с Rf около 0,18 (рутин).

На хроматограмме испытуемого раствора обнаруживались зоны адсорбции коричневого цвета с Rf (по рутину): около 1,0 (рутин); зона адсорбции синего цвета с Rf около 2,0; зона адсорбции голубого цвета с Rf около 2,50 (рис. 5).

После опрыскивания пластинки 2% спиртовым раствором алюминия хлорида и нагревания на хроматограмме раствора сравнения обнаруживалась зона адсорбции зеленовато-желтого цвета с Rf(no рутину) 1,0 (рутин) и зоны адсорбции голубого цвета с Rf около 1,75-2,50.

Таблица 3. Микроскопические признаки травы манжетки

Диагностический признак Характеристика признака

ЭПИДЕРМИС

Характер клеточной стенки Верхний эпидермис - более прямостенный, с четковидными утолщениями. Нижний - извилистостенный

Устьичный комплекс На нижнем эпидермисе, устьица погруженные, округлые, с узкой щелью

Волоски Простые, удлиненные, до 1 мм, с толстостенной кутикулой

МЕЗОФИЛЛ

Строение Палисадная паренхима, как правило, двухрядная. Губчатая паренхима мезофилла лопастная

Кристаллические включения По жилкам располагаются тупоконечные друзы, с выраженным центром срастания и кристаллообразования

ш 2,5 9

ги 2,0 •

яг <Ц> 1.0 о

РСО рутина раствор А

Рис. 5. Хроматограмма спиртового извлечения из травы манжетки

Фотохимическое изучение травы манжетки позволило установить нормы содержания основных БАВ сырья. Эти данные дополняют раздел «Числовые показатели» проекта ФС «НегЬа А1сЬешШае - трава манжетки» 2009 г. Результаты приведены в таблице 4.

Таблица 4. Числовые показатели травы манжетки

Числовой показатель, % Норма значения

Суммы флавоноидов в пересчете на рутин Не менее 4%

Суммы полисахаридов в пересчете на абсолютно сухое сырье Не менее 7,5%

Пролина Не менее 0,9%

Оксилизина Не менее 0,2%

Калия Не менее 0,04%

Магния Не менее 0,004%

Цинка Не менее 0,003%

Кремния Не менее 0,002%

Влажность Не более 12%

Зола общая Не более 12%

Зола, нерастворимая в 10% растворе хлористоводородной кислоты Не более 2%

Пожелтевших листьев Не более 5%

Черешков и стеблей длиннее 10см Не более 5%

Органической примеси Не более 2%

Минеральной примеси Не более 1%

Для установления дозы вводимого настоя, необходимо было определить содержание действующих веществ, поэтому в собранных образцах травы манжетки методом дифференциальной спектрофотометрии определили содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин (таблица 4).

Для подтверждения отсутствия систематической ошибки методики проводили опыты с добавлением раствора стандартного образца (РСО) рутина. Относительная и абсолютная ошибки опытов с добавками РСО рутина находятся в пределах случайной ошибки использованного метода, что свидетельствует об отсутствии систематической ошибки.

Валидацию методики проводили по специфичности, линейности, повторяемости, воспроизводимости и правильности. Статистическую обработку данных проводили по ГФХ1, используя программу Microsoft Excel.

Валидационная оценка методики, проведённая по характеристикам: специфичность, линейность, правильность и прецизионность в соответствии с проектом ОФС «Валидация фармакопейных методов», подтвердила её пригодность для количественного определения суммы флавоноидов в траве манжетки.

Таблица 5. Метрологические характеристики методики (Р=95%, п=9)

параметры f X S2 S Р,% t(P,f) ±дх Е,% ^ОТНОСИТ» ^

значения 8 4,12 0,0479 0,2189 95 2,26 0,385 3,95% 1,27%

РАЗРАБОТКА НОРМ КАЧЕСТВА ДЛЯ НАСТОЯ ТРАВЫ МАНЖЕТКИ

Настой травы манжетки готовили согласно методике ГФХ1, с учетом коэффициента водопоглощения (Квп=4).

В результате фитохимического изучения настоя травы манжетки установили нормы содержания основных БАВ. Данные представлены в таблице 6.

В связи с фармакологическим изучением, необходимо было получить стандартное водное извлечение из травы манжетки.

Для этого провели оценку окраски настоя травы манжетки 1:10 в сравнении с эталонами цветности. Приготовленная серия настоев соответствовала фармакопейным эталонам от 1а до 16.

Установили, что приготовленная серия настоев травы манжетки имеет слабокислую реакцию среды (рН от 4,0 до 4,6), также определили сухой остаток настоя травы манжетки.

Таблица 6. Нормы качества настоя травы манжетки

Показатель Норма значения

Сухой остаток настоя, % Не менее 2,5%

Рутина, % Не менее 0,09%

Хлорогеновой кислоты, % Не менее 0,03%

Аскорбиновой кислоты, % Не менее 0,04%

Суммы полисахаридов, % Не менее 4%

Прсшина, % Не менее 0,05%

Оксилизина, % Не менее 0,015%

Калия, % Не менее 0,03%

Магния, % Не менее 0,002%

Цинка, % Не менее 0,002%

Кремния, % Не менее 0,002%

рН Не менее 4,0

Не более 4,6

Окраска настоя От темно-желтого до желто-зеленого

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ НАСТОЯ, СУММЫ ПОЛИФЕНОЛОВ И АГРИМОНИИНА ТРАВЫ МАНЖЕТКИ Изучение антиметастатической и противоопухолевой активности настоя травы манжетки. Изучили антиметастатическую и противоопухолевую активность настоя травы манжетки, используя в качестве модели перевиваемую карциному легкого Льюис (LLC). Полученные результаты представлены в таблицах 7,8, 9,10.

Таким образом, на фоне проведенного лечения отметили снижение интенсивности метастазирования карциномы легкого Льюис.

Кроме того, эффект лечения настоем травы манжетки оценили с учетом общепринятых критериев - ТРО% и ТРМ% (торможение роста опухоли и

торможение роста метастазов в %). Интенсивность метастазирования оценивали по приросту средней массы легких. Полученные результаты после статистической обработки представлены в таблицах 9 и 10.

Таблица 7. Выраженность процесса метастазирования опухоли карциномы _ легкого Льюис у мышей_

Группа мышей Высокая интенсивность метастазирования, %

1 33

2 20

3 40

4 контроль 63

Таблица 8. Влияние настоя травы манжетки на интенсивность

метастазирования карциномы легкого Льюис

Группа мышей Схема лечения Интенсивность метастазирования, %

1 настой травы манжетки 1:5 0,5 мл/мышьХ10 per os 33

2 настой травы манжетки 1:10 0,5 мл/мышьХ10 per os 20

3 настой травы манжетки 1:50 0,5 мл/мышьХ10 внутрибрюшинно 40

4 контроль вода очищенная 0,5 мл/мышьХ10 per os 63

Таблица 9. Влияние настоя травы манжетки на рост первичного опухолевого узла карциномы легкого Льюис

Группа мышей Средний объем опухоли в мм3 на сутки опыта ТРО% на сутки опыта

7-е 12-е 14-е 18-е 7 12 14 18

1 330,5± 191,2 1462,0 ±555,9 2397,5 ±1106,2 3671,0 ±1469,6 42 17 32 28

2 137,3± 273,0 1474,7 ±351,3 2322,7 ±77,9 3646,3 ±217,5 76 17 34 29

3 180,0± 81,6 1263,0 ±175,3 2204,0 ±261,6 4178,0 ±644,2 68 29 37 20

4 569,3± 120,6 1768,0 ±220,1 3525,3 ±477,7 5122,5 ±224,8

Таблица 10. Влияние настоя травы манжетки на процесс метастазирования карциномы легкого Льюис

Группа мышей Схема лечения Средняя масса легких в мг ТРМ%

1 настой травы манжетки 1:5 0,5 мл/мышьХ10 per os 392,5±110,1 28

2 настой травы манжетки 1:100,5 мл/мышьХЮ per os 370,0±79,2 32

3 настой травы манжетки 1:50 0,5 мл/мышьХ10 внутрибрюшинно 467,7±66,3 14

4 контроль вода очищенная 0,5 мл/мышьХЮ per os 541,7±127,2 -

Как видно из данных, представленных в таблицах 7, 8 и 10, настой травы манжетки обладает значимым антиметастатическим действием. ТРМ% более 25%.

Изучение противоопухолевой и антиметастатической активности настоя травы манжетки на модели опухоли саркома-37 (8-37). Изучили антиметастатическую и противоопухолевую активность настоя травы манжетки, используя в качестве модели перевиваемую опухоль саркома-37 (Б-37) (табл. 11 и 12).

Таблица 11. Влияние настоя травы манжетки на процесс метастазирования __саркомы-37 __

Группа мышей Схема лечения Суммарная масса метастазов в мг Масса метастазов в мг на одну мышь

1 настой травы манжетки 1:10 0,5 мл/мышьХЮ per os 739,0 105,6 (-29%)

2 контроль вода очищенная 0,5 мл/мышьХЮ per os 1045,0 149,3

В результате анализа полученных экспериментальных данных показали, что пероральное введение мышам настоя травы манжетки ингибирует процесс лимфогенного метастазирования саркомы-37 на 29%.

При изучении активности настоя травы манжетки выявили его способность пролонгировать продолжительность жизни животных с саркомой-37.

Таблица 12. Влияние настоя травы манжетки на среднюю продолжительность жизни мышей с саркомой-37

Группа мышей Схема лечения СПЖ, дни УПЖ, %

1 настой травы манжетки 1:10 0,5 мл/мышьХ10 per OS 46,3 ±2,6 34

2 контроль вода очищенная 0,5 мл/мышьХ10 per os 34,5 ± 1,9 -

При оценке УПЖ, установили, что средняя продолжительность жизни мышей в контрольной группе составила 34,5±1,9 дня, в группе, получавшей лечение настоем травы манжетки 1:10 - 46,3 ± 2,6 дня. Таким образом, показатель УПЖ составил 34%.

Изучение влияния настоя травы манжетки на общетоксическое действие циклофосфамида. Изучили влияние настоя травы манжетки 1:10 на общетоксическое действие противоопухолевого препарата циклофосфамид.

За критерий оценки общетоксического действия взяли среднюю продолжительность жизни (СПЖ) в 2-х группах животных.

Определили, что настой травы манжетки 1:10 снижает общетоксическое действие циклофосфамида. Средняя продолжительность жизни у мышей в группе при сочетанном применении циклофосфамида и настоя травы манжетки 1:10 в 1,8 раза больше, чем в группе, получавшей монотерапию циклофосфамидом.

Изучение влияния агримониина и суммы полифенолов на общетоксическое действие циклофосфамида. Изучили влияние агримониина и суммы полифенолов, выделенных из травы манжетки на общую токсичность циклофосфамид.

За критерии оценки общетоксического действия взяли среднюю продолжительность жизни (СПЖ), изменение массы тела и поведение мышей

в 3-х группах. Выявили, что агримониин и сумма полифенолов травы манжетки снижают общетоксическое действие циклофосфамида. Выживаемость и общее состояние животных в группах, получавших сочетанное лечение водными растворами агримониина и суммы полифенолов выше, чем в группе, получавшей монотерапию циклофосфамидом.

Изучение цитотоксической активности суммы полифенолов и агримониина, выделенных из травы манжетки. Изучили цитотоксическую активность суммы полифенолов и агримониина, выделенных из травы манжетки в МТТ-тесте. Полученные данные представлены на рисунках 6 и 7.

Кривая, отображающая выживаемость (в %) опухолевых клеток меланомы В-16 при добавлении в культуральную среду агримониина в концентрации от 1х10"3 до 1х10"9 моль свидетельствует о слабой цитотоксической активности препарата. Лишь при концентрации агримониина больше ШО"4 моль отметили снижение выживаемости опухолевых клеток (рис.6).

Суммарный препарат (сумма полифенолов) в том же тесте продемонстрировал значительную цитотоксичность. Индекс 1С50 (показатель концентрации, при которой выживаемость опухолевых клеток ингибируется на 50%) находился на уровне 5х10'6 моль (рис. 7).

120 100 80

Г

5 40 1

1»

-6 -5 -4 -I Логарифм конц&траики, Моль

Рис.6. Цитотоксическая активность агримонина Рис.7. Цитотоксическая активность суммы в отношении клеток экспериментальной полифенолов в отношении клеток меланомы В-16(линия Р-10) экспериментальной меланомы В-16(линия Р-10)

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Проведено фотохимическое изучение травы манжетки и настоя из нее. Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в настое травы манжетки определено качественное и количественное содержание флавоноидов (рутин, кверцетин, гиперозид, лютеолин), фенолкарбоновых кислот (кофейная, хлорогеновая) и некоторых других фенольных соединений (арбутин, галловая кислота), витаминов (аскорбиновая кислота, рибофлавин). Получены данные о присутствии азотистых оснований нуклеиновых кислот.

2. Методом ТСХ после гидролиза установлен состав моносахаров полисахаридного комплекса травы и настоя манжетки: ксилоза, глюкоза и галактоза. Определено количественное содержание полисахаридов в траве и настое манжетки - в среднем -10,09±0,12% и 5,95±0,09%;

3. Выявлено, что в траве и настое манжетки содержатся 18 аминокислот, в том числе 7 незаменимых (валин, лейцин, изолейцин, треонин, метионин, лизин, фенилаланин). В настое определено наиболее высокое содержание пролина и оксилизина, а в траве - аспарагиновой кислоты, глютаминовой кислоты, глицина, валина и лизина;

4. Установлено содержание эссенциальных и условно-эссенциальных макро- и микроэлементов в траве и настое манжетки. Выявлено, что некоторые элементы переходят в настой;

5. Разработаны характеристики подлинности и показатели качества для травы манжетки;

6. Валидирован метод дифференциальной спектрофотометрии для количественного определения суммы флавоноидов в траве манжетки в пересчете на рутин. Предложенная методика анализа обеспечивает получение достоверных и воспроизводимых результатов;

7. Разработаны нормы качества для настоя травы манжетки;

8. Впервые выявлено, что настой травы манжетки проявляет определенную противоопухолевую и антиметастатическую активность в отношении карциномы легкого Льюис (LLC) (ТРО% от 20 до 37%, ТРМ% от 28 до 32%);

9. Установлено, что настой травы манжетки ингибирует процесс лимфогенного метастазирования саркомы-37 (S-37) на 29 %, и способен увеличивать продолжительность жизни мышей (УПЖ=34%);

10. Выявлено, что настой травы манжетки снижает общетоксическое действие циклофосфамида;

11. Определено, что агримониин и сумма полифенолов из травы манжетки снижают общетоксическое действие циклофосфамида, а сумма полифенолов также обладает определенной цитотоксической активностью.

Список опубликованных работ:

1. Баева В.М., Мурин И.И. Изучение аминокислотного состава настоя и порошка травы манжетки // Традиционная медицина. - 2007. - №1[8]. - С. 5356.

2. Мурин И.И., Баева В.М., Козлов A.M. Поиск потенциальных ингибиторов злокачественных опухолей среди агентов растительного происхождения // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. / под ред. М.В. Гаврилина / Пятигорская ГФА. - Пятигорск, 2008. - Вып. 63. - С. 455-457.

3. Мурин И.И., Баева В.М., Козлов A.M. Влияние настоя травы манжетки на общую токсичность противоопухолевого препарата - циклофосфамида // сб.тез. V конференции молодых ученых с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», 2008. - С. 307.

4. Мурин И.И., Баева В.М., Козлов A.M. Влияние агримониина и суммы полифенолов, выделенных из травы манжетки на общую токсичность противоопухолевого препарата - циклофосфамида // Российский биотерапевтический журнал. - 2009. - №2(8). - С. 55.

5. Мурин И.И., Баева В.М., Козлов A.M. Оценка влияния препаратов растительного происхождения на процесс рецидивирования злокачественных опухолей // Изыскание и создание природных лекарственных средств: Межвузовский сборник научных трудов с международным участием, посвященный 25-летию кафедры фармакогнозии и ботаники Яросл. гос.мед. академии / под ред.проф. Н.С. Фурсы. - Ярославль : ООО «ЯрМедиаГруп», 2009.-С. 210-213, 396 с.

6. Мурин И.И., Баева В.М. Изучение полифенольных соединений настоя травы манжетки методом ВЭЖХ // Мат. VII Междунар. Симпоз. по фенольным соединениям: фундаментальные и прикладные аспекты. -М., 1923 октября 2009.-С. 180-181.

7. Мурин И.И., Баева В.М. Элементный состав травы и настоя манжетки // Фармация. - 2009. - №7. - С. 23-25.

I

/

Подписано в печать: 10.12.10

Объем: 1,5 усл.п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 765 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского,39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru

Актуальность темы. Поиск новых растительных источников для получения потенциальных лекарственных средств, расширяющих арсенал фармакотерапии наиболее распространенных заболеваний, включая онкологические, является актуальной задачей для современной фармацевтической и фармакологической науки. Внедрение лекарственных препаратов в клиническую практику невозможно при отсутствии детального изучения их химического состава, безопасности и эффективности на уровне доклинических исследований.

По данным ВОЗ, в последние годы смертность от онкологических заболеваний занимает второе место в мире после патологии сердечнососудистой системы. Доказательной медициной установлено, что растительные препараты являются эффективными, наименее токсичными, а также способны потенцировать и снижать побочные действия химиотерапевтических средств.

Манжетка обыкновенная традиционно применяется как противовоспалительное, кровоостанавливающее, лимфотропное, гипотензивное и гипогликемическое средство.

В последние десятилетия манжетка активно изучается как сердечнососудистое средство. Андреева В.Ю. (1998-2001 г.г.) и Зыков A.A. (2000 г.) изучали траву манжетки как лимфотропное, гиполипидемическое и антиишемическое средство.

Ряд исследователей изучали химический состав эндемичных манжеток Сибирского региона. Для них установлено наличие некоторых фенольных соединений (флавоноидов, дубильных веществ, фенолкарбоновых кислот) в спиртовом извлечении (Андреева В.Ю., 2001 г.). Химический состав водных извлечений из травы манжетки не изучался в полном объеме.

В литературе отсутствуют данные о применении манжетки обыкновенной для профилактики и лечения злокачественных новообразований. Вместе с тем в литературе имеются данные о противоопухолевой активности агримониина, выделенного из других растительных источников (Окиёа Т., 1990).

Таким образом, трава манжетки является перспективным растительным сырьем для применения в научной медицине и, в частности, в онкологии.

Цель и задачи исследования. Провести фитохимическое и фармакологическое изучение травы манжетки.

Для реализации поставленной цели были решены следующие задачи:

1. Провести фитохимическое изучение травы и настоя манжетки по составу фенольных соединений, полисахаридов, аминокислот, соединений нуклеиновой природы, макро- и микроэлементов;

2. Разработать характеристики подлинности и показатели качества для травы манжетки;

3. Разработать нормы качества для настоя травы манжетки;

4. Оценить фармакологическую (противоопухолевую, антиметастатическую и антитоксическую) активность настоя травы манжетки;

5. Оценить фармакологическую (цитотоксическую и антитоксическую) активность суммы полифенолов и агримониина из травы манжетки

Научная новизна. Проведено комплексное изучение химического состава нового лекарственного сырья — трава манжетки — в связи с его фармакологической активностью. Качественно и количественно установлено содержание в сырье и настое флавоноидов, фенолкарбоновых кислот, полисахаридов, аминокислот, макро- и микроэлементов, витаминов. Получены новые данные о содержании азотистых основаниях нуклеиновых кислот (НК) в настое травы манжетки. Впервые для настоя травы манжетки установлен спектр фармакологических эффектов, таких как противоопухолевый, антиметастатический и антитоксический. Получен Патент на изобретение (№ 2403055, зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 10 ноября 2010 г., приоритет изобретения от 23 апреля 2009 г.) «Способ получения средства из травы манжетки, снижающего токсичность циклофосфамида». Впервые установлена цитотоксическая и антитоксическая активность суммы полифенолов и агримониина из травы манжетки. Получены 3 заявки на изобретения: от 14.04.2010 г. (входящий № 020921, регистрационный № 2010114834) - «Способ получения полифенольного средства из травы манжетки, снижающего токсичность циклофосфамида и обладающего цитотоксической активностью»; от 14.04.2010 г. (входящий № 020920, регистрационный № 2010114833) - «Способ получения агримониина» и от 14.04.2010 г. (входящий № 020919, регистрационный № 2010114832) - «Средство, снижающее токсичность циклофосфамида».

Практическая значимость.

• В свете современных требований проведена валидация методики дифференциальной спектрофотометрии для количественного определения в траве манжетки суммы флавоноидов в пересчете на рутин. Получен Акт внедрения результатов валидации методики;

• Данные, полученные в результате проведенных исследований вошли в разделы проектов фармакопейной статьи «НегЬа А1сЬетШае - трава манжетки» 2009 г. и «Инструкции по сбору и сушке травы манжетки»;

• Установлена фармакологическая активность настоя травы манжетки: противоопухолевая, антиметастатическая, цитотоксическая и антитоксическая. Данные защищены публикациями и Патентом на изобретение. Также определена антитоксическая и цитотоксическая активность суммы полифенолов и агримониина из травы манжетки, защищенные публикациями и заявками на изобретения; Результаты проведенных исследований используются в учебном процессе на кафедре фармакогнозии ГОУ ВПО Первый МГМУ имени И.М. Сеченова. Получен Акт внедрения результатов научных достижений.

Положения, выносимые на защиту:

Результаты фитохимического изучения фенольных соединений, полисахаридов, аминокислот, соединений нуклеиновой природы, макро- и микроэлементов травы и настоя манжетки;

Данные по разработке характеристик подлинности и показателей качества травы манжетки;

Данные норм качества настоя травы манжетки;

Оценка изучения фармакологической активности настоя травы манжетки;

Данные о фармакологической активности суммы полифенолов и агримониина из травы манжетки.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Проведено фитохнмическое изучение травы манжетки и настоя из нее. Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в настое травы манжетки определено качественное и количественное содержание флавоноидов (рутин, кверцетин, гиперозид, лютеолин), фенолкарбоновых кислот (кофейная, хлорогеновая) и некоторых других фенольных соединений (арбутин, галловая кислота), витаминов (аскорбиновая кислота, рибофлавин). Получены данные о присутствии азотистых оснований нуклеиновых кислот.

2. Методом ТСХ после гидролиза установлен состав моносахаров полисахаридного комплекса травы и настоя манжетки: ксилоза, глюкоза и галактоза. Определено количественное содержание полисахаридов в траве и настое манжетки - в среднем - 10,09±0,12% и 5,95±0,09%;

3. Выявлено, что в траве и настое манжетки содержатся 18 аминокислот, в том числе 7 незаменимых (валин, лейцин, изолейцин, треонин, метионин, лизин, фенилаланин). В настое определено наиболее высокое содержание пролина и оксилизина, а в траве - аспарагиновой кислоты, глютаминовой кислоты, глицина, валина и лизина;

4. Установлено содержание эссенциальных и условно-эссенциальных макро- и микроэлементов в траве и настое манжетки. Выявлено, что некоторые элементы переходят в настой;

5. Разработаны характеристики подлинности и показатели качества для травы манжетки;

6. Валидирован метод дифференциальной спектрофотометрии для количественного определения суммы флавоноидов в траве манжетки в пересчете на рутин. Предложенная методика анализа обеспечивает получение достоверных и воспроизводимых результатов;

7. Разработаны нормы качества для настоя травы манжетки;

8. Впервые выявлено, что настой травы манжетки проявляет определенную противоопухолевую и антиметастатическую активность в отношении карциномы легкого Льюис (LLC) (ТРО% от 20 до 37%, ТРМ% от 28 до 32%);

9. Установлено, что настой травы манжетки ингибирует процесс лимфогенного метастазирования саркомы-37 (S-37) на 29 %, и способен увеличивать продолжительность жизни мышей (УПЖ=34%);

10. Выявлено, что настой травы манжетки снижает общетоксическое действие циклофосфамида;

11. Определено, что агримониин и сумма полифенолов из травы манжетки снижают общетоксическое действие циклофосфамида, а сумма полифенолов также обладает определенной цитотоксической активностью.

Заключение

Проведенный анализ литературных данных показал, что в арсенале научной медицины недостаточно малотоксичных и эффективных лекарственных средств на основе растительного сырья для лечения онкологических заболеваний, которые по летальности занимают второе место в мире. Необходимо активнее внедрять в клиническую онкологию растительные препараты. Литературные данные показали необходимость более глубокого фитохимического и фармакологического изучения манжетки обыкновенной. Изучение элементного состава травы манжетки и препаратов из нее в полном объеме не проводилось. Полностью отсутствуют литературные данные об эссенциальных макро- и микроэлементах в настое и траве манжетки. Трава манжетки предложена для научной медицины в качестве средства для лечения сахарного диабета, ишемической болезни сердца, артериальной гипертензии, воспалительных процессов различной локализации, но как противоопухолевое, антиметастатическое и антитоксическое средство не изучалась.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Характеристика объектов

Объектами исследований служили: трава манжетки, собранная в период цветения в Истринском и Раменском районах Московской области в 2007 и 2008 годах. Сырье заготавливали на опушке смешанного хвойно-лиственного леса, на суходольных лугах, на расстоянии более 2 км от населенных пунктов и трасс, в сухую погоду; настой травы манжетки 1:10 из стандартного сырья, приготовленный по методике Государственной Фармакопеи XI издания; настой травы манжетки 1:5 из стандартного сырья, приготовленный сгущением настоя 1:10 в 2 раза; настой травы манжетки 1:50 из стандартного сырья, приготовленный разведением настоя 1:10 в 5 раз; мыши-самцы линии ВБЕ!; мыши-самцы линии С57В1/б; беспородные мыши-самцы 8НУ4У

Для фитохимического исследования использовали настой травы манжетки 1:10.

Для фармакологических исследований использовали линейных и беспородных животных и настои травы манжетки 1:5, 1:10, 1:50, а также агримониин и сумму полифенолов, выделенные из травы манжетки.

2.2. Методы фитохимического анализа 2.2.1. Методика ВЭЖХ-определения фенольных соединений

Для определения фенольных соединений в работе использовали жидкостной хроматограф фирмы Perkin Elmer (США) высокого давления, снабжённый насосом для градиентного элюирования и диодноматричным детектором в УФ-области. Исследования проводили на колонках с обращенной фазой (сорбент - Диасферы-110-С-8, размер частиц 5 мкм). Элюенты - раствор А - 0,05% раствор ортофосфорной кислоты в воде (0,5 мл ортофосфорной кислоты в 1 л воды), раствор В - ацетонитрил (АСН). Градиент ацетонитрила от 4 до 64% за 60 мин.

Для количественной оценки исследуемых компонентов манжетки проводили идентификацию как по времени удерживания, так и по спектрам поглощения.

В связи с тем, что водное извлечение манжетки, содержат модифицированные формы витаминов, таннинов, фенолкарбоновых кислот, флавоноидов, агликонов, и, возможно, нуклеотидов, было принято решение: исследовать спектральные и хроматографические характеристики, которые в основном должны совпадать с используемыми стандартными соединениями и качественно оценить извлечение в целом как по основным компонентам, так и по минорным. Общим характерным признаком для исследуемых соединений является хромофорная группа, особенности которой можно экспериментально оценить по спектру поглощения основных соединений, выбранных в качестве рабочих стандартов. Исходя из природы компонентов манжетки, была выбрана длина волны детектирования 255 нм - для флавоноидов, основным из которых является рутин (255 нм) и 280 нм для выявления других фенольных соединений [15, 19].

2.2.2. Методика количественного определения полисахаридов в траве и настое манжетки

Для количественного определения полисахаридов в траве и настое манжетки использовали методику количественного определения по частной фармакопейной статье «НегЬа В1ёепйз — трава череды» (ГФ XI, вып.2, с. 305).

Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 0,5 мм. Около 10 г измельченного сырья помещают в колбу вместимостью 250 мл, прибавляют 100 мл воды, колбу присоединяют к обратному холодильнику и кипятят при перемешивании на электрической плитке в течение 30 мин. Экстракцию водой повторяют еще четыре раза по 100 мл в течение 30 мин каждый раз.

Также готовили настой травы манжетки 1:10 по методике Государственной Фармакопеи XI издания.

Водные извлечения центрифугируют с частотой вращения 5000 об/мин в течение 10 мин и декантируют в мерную колбу вместимостью 500 мл через 5 слоев марли, вложенной в стеклянную воронку диаметром 66 мм и предварительно смоченной водой. Фильтр промывают и доводят объем раствора водой до метки (раствор А).

25 мл раствора А помещают в центрифужную пробирку, прибавляют 75 мл 95% спирта этилового, перемешивают, подогревают на водяной бане при температуре 60°С в течение 5 мин. Через 30 мин содержимое центрифугируют с частотой вращения 5000 об/мин в течение 30 мин.

Надосадочную жидкость фильтруют под вакуумом при остаточном давлении 13-16 кПа через высушенный до постоянной массы при температуре 100-105°С стеклянны фильтр ПОР 16 диаметром 40 мм. Затем осадок количественно переносят на тот же фильтр и промывают 15 мл смеси 95% спирта этилового и воды (3:1). Фильтр с осадком высушивают сначала на воздухе, затем при температуре 100-105°С до постоянной массы.

Содержание полисахаридов в пересчете на абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле: т2-гп1)х500х ЮОхЮО mx25x(100-W) где mi - масса фильтра в граммах; т2 - масса фильтра с осадком в граммах; m — масса сырья в граммах; W — потеря в массе при высушивании сырья в процентах.

2.2.3. Методика ТСХ продуктов гидролиза полисахаридов травы и настоя манжетки

Для определения полисахаридов в траве и настое манжетки использовали метод хроматографии в тонких слоях сорбента (ТСХ).

Для анализа сырья воздушно-сухую навеску травы манжетки около 2 г дробно экстрагировали водой по 30 мл на электрической плитке с обратным холодильником.

Также готовили настой травы манжетки 1:10 по методике Государственной Фармакопеи XI издания.

Водные извлечения фильтровали через бязь в мерный цилиндр объемом 250 мл до 100 мл. Затем упарили на водяной бане досуха, прибавили 50 мл 1н кислоты серной, растворили порциями и поместили в коническую колбу объемом 200 мл. Колбу присоединили к обратному холодильнику и нагревали 2,5 часа. Затем отфильтровали через стеклянный фильтр. Фильтрат нейтрализовали бария карбонатом, затем упарили до 2-3 капель.

Хроматографирование проводили на хроматографических пластинах марки «Сорбифил» восходящим способом. Использовали систему растворителей н-бутанол : ледяная кислота уксусная : вода (24:12:11). Систему готовили смешивая в 1,5 л делительной воронке 400 мл н-бутанола, 200 мл ледяной кислоты уксусной и 183 мл воды дистиллированной. После отстаивания смесь разделили на две фазы, нижнюю водную фазу сливали и отбрасывали.

В качестве стандартных образцов использовали PCO ксилозы, арабинозы, глюкозы, галактозы и маннозы.

На линию старта хроматографической пластинки наносят раздельно полосами 10 мм 20 мют испытуемого раствора и 10 мкл раствора сравнения. Пластинку с нанесенными пробами сушат на воздухе, помещают в хроматографическую камеру и хроматографируют восходящим способом. Когда фронт подвижной фазы пройдет 100 мм, хроматограмму вынимают из камеры и сушат на воздухе до удаления следов растворителей, опрыскивают анисовым альдегидом (к свежеприготовленному раствору 0,5 мл анисового альдегида в 50 мл уксусной кислоты прибавляют 1 мл концентрированной серной кислоты), нагревают хроматограмму при 100-105°С до получения максимальной интенсивности окрашивания и рассматривают в УФ-свете при длине волны 366 нм [13, 18].

2.2.4. Методика определения аминокислот

Определение аминокислот в траве и настое манжетки проводили по методике JI.A. Баратовой [21]:

Кислотный гидролиз проводили в толстостенных стеклянных ампулах 1,0x7,0 см, предварительно промытых смесью (9:1) концентрированных серной и азотной кислот, деионизованной водой и высушенных. Гидролизаты готовили двумя способами: а) три образца по 30 мкг помещали в ампулы и прибавляли по 0,5 мл 5,7 н. хлористоводородной кислоты. Образцы замораживали, помещая ампулы в жидкий азот, откачивали воздух до 50 мкг и заплавляли ампулы под высоким вакуумом. Гидролиз проводили в термостате при 110°С в течение 24, 48 и 72 часов.

После охлаждения до комнатной температуры ампулы вскрывали, растворы количественно переносили в конические колбочки и упаривали досуха на роторном испарителе при температуре 65°С. Остаток соляной кислоты удаляли, добавляя в колбочку 2-3 раза по 0,5 мл деионизованной воды, и каждый раз упаривали раствор досуха. Сухие остатки растворяли в минимальном количестве 0,01 н. хлористоводородной кислоты, количественно переносили в маленькие конические пробирки на 1 мл, упаривали досуха в токе азота, вновь растворяли в 0,1 мл 0,1 н. хлористоводородной кислоты и центрифугировали при 5000 об/мин в течение 5 минут. б) три образца по 50 мкг помещали в три ампулы, прибавляли по 0,2 мл смеси (2:1 по объему) концентрированной хлористоводородной кислоты и концентрированной трифторуксусной кислоты (ТФУ), содержащей 0,0075 по объему свежеперегнанного фенола.

Образцы замораживали, помещая ампулы в жидкий азот, удаляли воздух и заплавляли ампулы под высоким вакуумом. Гидролиз проводили при 166°С (масляная баня) в течение 25, 50 и 75 минут. Дальнейшие операции проводили, как описано в пункте а.

Анализ аминокислотного состава полученных кислотных гидролизатов проводили на аминокислотном анализаторе, модель 835 фирмы «Хитачи» (Япония) на колонке 0,26x15 см. Для калибровки прибора использовали стандартную смесь аминокислот, содержащую по 3 нмоль каждой аминокислоты. Объем анализируемого образца кислотного гидролизата составил 25 мкл (0,1-1 нмоль). Температура 53°С в колонке поддерживалась постоянной в ходе всего анализа. Скорости подачи буферов и нингидринового реагента составляла соответственно 0,225 мл/мин, 0,3 мл/мин. Для элюции аминокислот использовали ступенчатый градиент из четырех буферных растворов: 0,2 н. Ка+-цитратный буфер рН 3,3, содержащий 13% этанола; 0,2 н. Ма+-цитратный буфер рН 3,3, содержащий 2% этанола; 0,2 н, Ыа+-цитратный буфер рН 4,3; 1,2 н. Na+-цитратный буфер рН 4,9. Детекцию аминокислот проводили при 570 нм, за исключением пролина, который определи при 440 нм. Количественный обсчет результатов аминокислотного анализа проводился автоматически [21].

2.2.5. Методики определения нуклеиновых кислот и их азотистых оснований

Изучение азотистых оснований нуклеиновых кислот в настое травы манжетки методом ВЭЖХ Для выявления азотистых оснований нуклеиновых кислот и нуклеотидов в настое травы манжетки 1:10 использовали жидкостной хроматограф фирмы Perkin Elmer высокого давления, снабжённый насосом для градиентного элюирования и диодно-матричным детектором в УФ-области. Хроматографирование проводили на колонках фирмы Dr.Masch GmbH размером 250x4,6 мм, сорбент ReproSil—Pur C-18AQ, размер частиц 5 мкм. Подвижная фаза ацетонитрил — 0,10% раствор ортофосфорной кислоты. Линейный градиент ацетонитрила от 4% до 44% за 50 мин. Скорость потока жидкости 1 мл/мин. Длина волны детектора 260 нм [9].

В качестве стандартов использовали свободные азотистые основания нуклеиновых кислот: цитозин, урацил, ксантин, тимин (фирма Sigma).

Изучение нуклеиновых кислот в настое травы манжетки методом ПЦР-РВ Переход нуклеиновых кислот из сырья в настой травы манжетки 1:10 изучали также с помощью тест-системы «Растение/3 5S/NOS скрининг». Метод основан на использовании полимеразной цепной реакции с детекцией результатов в режиме реального времени (ПЦР-РВ).

Метод выбрали для выявления растительного генетического материала в настое травы манжетки в условиях отсутствия специальной пробоподготовки растительного сырья (без его деструкции определенными реактивами). Цель - идентифицировать в настое универсальный растительный ген и его количество и, в случае его значительного содержания в настое, определить состав перешедших в водную фазу соединений нуклеиновой природы (нуклеиновых кислот и нуклеотидов).

Каждая пробирка с реакционной смесью «PacTeHHe-n35S-TNOS-BnK» содержит все необходимые реагенты для проведения одновременно четырех независимых реакции. Для определения специфического гена растения использовали две из них:

-Реакция №1 — Растение - позволяет обнаружить специфичный ген растений, который присутствует как в генно-модифицированных (ГМ), так и в обычных растениях. Положительная динамика для реакции №1 говорит о наличии в образце ДНК растения, пригодной для ПЦР-анализа. Протекание реакции детектируется с помощью специфического зонда, меченного красителем R6G;

-Реакция №4 - ВПК - реакция внутреннего положительного контроля (ВПК) - позволяет исключить ложноотрицательные результаты. Протекание реакции детектируется с помощью специфического зонда, меченного красителем Су5. Чувствительность тест-системы — не менее 10 копий ДНК растений.

Образец считали положительным по реакциям на растение при обнаружении в образце более 10 копий ДНК растения.

Анализ выделенной ДНК с помощью тест-системы «Растение/35S/NOS скрининг» включал следующие шаги:

I. Подготовка к проведению реакции ПЦР-РВ: а) Настой травы манжетки 1:10 готовили по методике ГФ XI; б) Реактивы для амплификации ДНК поставляются в готовом виде в пробирках для ПЦР объемом 0,2 мл.

Все последующие операции проводили в соответствии с правилами работы ПЦР - лаборатории, например, согласно МУК 4.2. 1913 - 04:

1. Взяли необходимое количество пробирок с реакционной смесью «Растепие-ПЗ5S-TNOS-ВПК» из расчета 2*N+4, где N - количество исследуемых образцов. Не допускали размораживания и повторного замораживания оставшихся пробирок со смесью.

2. После размораживания реакционной смеси, центрифугировали пробирки 30-60 секунд (скорость вращения ротора более 4000 об./мин. или 2500g). Для этого воспользовались ротором для пробирок 0,2 мл.

3. Поместили пробирки с реакционной смесью в штатив. Маркировали пробирки в соответствии с протоколом исследования в верхней части стенки пробирки.

4. ПКО-С1, ОКО и исследуемые образцы разморозили, перемешали на встряхивателе и центрифугировали 3-5 секунд для сброса капель.

5. Внесли в пробирки (на стенку пробирки) по 5 мкл ОКО, исследуемых образцов и, в последнюю очередь, ПКО-С1 в соответствии с маркировкой, используя наконечники с фильтром. Содержимое пробирок кратковременно перемешали на вортексе и центрифугировали 10-30 секунд.

6. Поместили пробирки в амплификатор.

II. Проведение реакции ПЦР-РВ на приборе для ПЦР в реальном времени АНК-16/32

III. Расчет значений пороговых циклов с помощью программного обеспечения прибора;

IV. Обработка результатов с помощью программы Microsoft Excel;

V. Анализ результатов и выводы

Контрольные образцы, включенные в каждую постановку указаны в таблице 4. Все контроли и исследуемые образцы анализировали в двух повторах [23].