Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Фармакогностическое изучение золотарника кавказского (Solidago caucasica kem.-nath.)

На правах рукописи

ФЕДОТОВА ВИКТОРИЯ ВЛАДИМИРОВНА

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЗОЛОТАРНИКА КАВКАЗСКОГО (SOLIDAGO CAUCASICA KEM.-NATH.)

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

6 НОЯ 2014

005554379 Пятигорск-ом

005554379

Работа выполнена в Пятигорском медико-фармацевтическом институте -филиале государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор фармацевтических наук, профессор Коновалов Дмитрий Алексеевич

Куркин Владимир Александрович, доктор фармацевтических наук, профессор, ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Минздрава России, заведующий кафедрой фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии

Зилфикаров Ифрат Назимович, доктор фармацевтических наук, ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений, отдел фитохимии, главный научный сотрудник

ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия» Минздрава России

Защита состоится 24 декабря 2014 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 208.008.09 при ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздрава России (357532, Ставропольский край, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Пятигорского медико-фармацевтического института - филиала ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России и на сайте http://wvw.prnedpharm.ru

Автореферат разослан 28 октября 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Ремезова Ирина Петровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

Заболевания мочеполовой сферы в мире по данным Всемирной организации здравоохранения находятся на одном из лидирующих мест в общей структуре заболеваемости населения. На сегодняшний день среди мужчин старше 60 лет в 90% случаях диагностируются заболеваниями почек, мочевого пузыря и предстательной железы. У женщин старше 50 лет уролитиаз, цистит и т.п. отмечается в 70% случаев. Синтетические препараты успешно используются в качестве основных средств при фармакотерапии и профилактике заболеваний почек. Но, несмотря на высокую эффективность, они оказывают и неблагоприятное воздействие на функциональное состояние организма. Биологически активные соединения лекарственных растений обладают широким спектром действия, низкой токсичностью, что позволяет их рекомендовать для длительной терапии. Однако, выбор растительных лекарственных препаратов, оказывающих комплексное нефропротекторное воздействие, ограничен.

Перспективным источником с точки зрения получения нового вида лекарственного растительного сырья (ЛРС) является ранее неизученный представитель флоры Кавказа - золотарник кавказский (Solidago caucasica Kem.-Nath.). Лекарственные средства на основе некоторых видов рода золотарник широко используются в мировой медицинской практике. Так, экстракт травы золотарника канадского входит в препарат «Марелин» (Украина), применяемый в качестве спазмолитического, диуретического и противовоспалительного средства при лечении и профилактике оксалатного и уратного уролитиаза, а также в состав препарата «Простанорм» (Россия), рекомендуемого при простатите. Экстракт травы золотарника обыкновенного входит в состав препарата «Фитодолор» (Германия), противовоспалительная активность которого сопоставима с таковой индометацина. Подземная часть золотарника входит в состав БАД «Мен'с формула Простата форте», а также используется в народной медицине Кавказа в качестве ранозаживляющего средства.

В связи с этим изучение золотарника кавказского мы посчитали целесообразным.

Степень разработанности темы

Золотарник кавказский является неизученным научной медициной представителем флоры Северного Кавказа.

Цель и задачи исследования

Целью работы являлось фармакогностическое изучение золотарника кавказского и научное обоснование возможности использования его в качестве источника сырья для получения лекарственных средств, оказывающих влияние на мочевыде-лительную систему. Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить данные научной литературы по распространению, фитохимиче-скому и фармакологическому изучению представителей рода Solidago.

2. Оценить ресурсные характеристики золотарника кавказского в некоторых районах Северного Кавказа и исследовать возможность его культивирования.

3. Определить морфолого-анатомические признаки травы и корневищ с корнями золотарника кавказского.

4. Исследовать качественный состав и количественное содержание основных групп биологически активных соединений (БАС) травы и корневищ с корнями золотарника кавказского.

5. Провести предварительное изучение «острой» токсичности, диуретической и антибактериальной активности травы и сухого экстракта золотарника кавказского.

6. Разработать проект фармакопейной статьи предприятия на «Золотарника кавказского траву».

Научная новизна

В результате проведенных исследований нами впервые:

- определены ресурсы золотарника кавказского в отдельных районах его произрастания на Северном Кавказе и изучена возможность его культивирования;

- предложены морфологические и анатомо-диагностические признаки, позволяющие установить подлинность травы и корневищ с корнями золотарника кавказского;

- методом ВЭЖХ установлено, что в траве золотарника кавказского содержатся 24 соединения, из которых идентифицированы флавоноиды (рутин, вице-нин, гесперидин), кумарины (умбеллиферон, эскулетин, дигидрокумарин), фенол-карбоновые кислоты (галловая, цикориевая, хлорогеновая и кофейная);

- в составе органических кислот в траве золотарника кавказского методом ВЭЖХ идентифицированы лимонная, яблочная и янтарная;

- изучены углеводы травы золотарника кавказского, основными по содержанию являются фракции пектиновых веществ (ПВ) и гемицеллюлоз (ГМЦ);

- установлено, что трава золотарника кавказского содержит тритерпено-вые гликозиды — производные олеаноловой кислоты;

- в корневищах с корнями золотарника кавказского обнаружено соединение полиацетиленовой природы - матрикариаэфир;

- методом ГЖХ-МС в траве золотарника кавказского обнаружены жирные кислоты (дигидроксипропионовая, тригидроксимасляная, гидроксимасляная, пальмитиновая, линолевая, линоленовая, стеариновая), многоатомные спирты и их производные (глицерин, ксилит, рибит, инозит, мио-инозит, сцило-инозит, глюцитол) и др.;

- методом жидкостной хроматографии на автоматическом аминокислотном анализаторе в траве золотарника кавказского обнаружены 15 аминокислот, из которых 9 являются незаменимыми:

- установлено, что трава золотарника кавказского содержит 5 макроэлементов и 16 микроэлементов. Из них эссенциальными являются 11 элементов, ус-ловно-эссенциальными - 6 и условно-токсичными - 4 элемента;

- установлено количественное содержание суммы флавоноидов, фенол-карбоновых кислот, органических кислот, тритерпеновых гликозидов, дубильных веществ в траве и фенолкарбоновых кислот и дубильных веществ в корневищах с корнями золотарника кавказского;

- методом ВЭЖХ в сухом экстракте золотарника кавказского установлено содержание 18 соединений, из которых идентифицированы рутин, лютеолин-7-

гликозид, умбеллиферон, вицеиин, эскулетин, гесперидин, галловая, цикориевая, хлорогеновая и кофейная кислоты;

- установлено содержание суммы флавоноидов и фенолкарбоновых кислот в сухом экстракте золотарника кавказского;

- изучена токсичность «Золотарника кавказского травы», определена диуретическая и антимикробная активность, полученного из нее экстракта.

Теоретическая и практическая значимость работы

Изучена возможность использования «Золотарника кавказского травы» для получения суммарного препарата («Золотарника кавказского травы экстракта сухого»), обладающего диуретической и антимикробной активностью.

Проведен качественный и количественный анализ травы золотарника кавказского, который установил наличие фенольных соединений, тритерпеновых гликози-дов, органических кислот и полисахаридов. Разработана технологическая схема производства сухого экстракта травы золотарника кавказского. Разработаны нормы, позволяющие стандартизовать траву золотарника кавказского и сухой экстракт из нее с учетом современных требований, предъявляемых к качеству ЛРС и извлечений на его основе.

Методология и методы исследования

В работе приведены результаты комплексных фармакогностических исследований (макро- и микроскопических, фитохимических и ресурсоведческих). В рамках отдельных технологических и фармакологических экспериментов с использованием соответствующих методов исследования были получены предварительные данные, позволившие обосновать возможные направления использования данного вида ЛРС. Фитохимические исследования проводились с использованием бумажной, тонкослойной, газожидкостной хроматографии, высокоэффективной жидкостной хроматографии, газожндостной хромато-масс-спектрометрии, спектрофотомет-рии в УФ, видимой и ИК областях.

Положения, выносимые на защиту:

- результаты ресурсоведческих и интродукционных исследований золотарника кавказского;

- результаты морфолого-анатомического изучения травы и корневищ с корнями золотарника кавказского;

- результаты фитохимического изучения основных групп БАС в траве и корневищах с корнями золотарника кавказского;

- методики стандартизации «Золотарника кавказского травы» и сухого экстракта на ее основе;

- результаты предварительных фармакологических исследований.

Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность полученных результатов определяется объемностью изученной информационной базы и обширностью исследования, использованием различных современных физико-химических методов анализа, математико-статистической обработкой полученных данных.

Основные положения диссертационной работы представлены на Международной научной конференции «Рациональное использование природных биологических ресурсов» (Рим-Флоренция, 2013); на II Международной научно-практической конференции «Кластерные подходы фармацевтического союза: образование, наука и бизнес» (Белгород, 2012); на XX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2013); на региональных конференциях «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2012, 2013, 2014); на научно-практической конференции молодых ученых и студентов ВолгГМУ "Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины" (Пятигорск, 2014); на региональном подготовительном этапе Конкурса молодежных проектов Всекавказского молодежного Форума «Машук-2013» (Пятигорск, 2013); на Северо-Кавказском молодежном Форуме «Машук-2013» (Пятигорск, 2013). По материалам диссертации опу бликовано 16 работ, в том числе 7 статей - в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Личный вклад автора

Автор участвовал во всех этапах экспериментальных работ, в получении исходных данных, их обработке и интерпретации, оформлении диссертационной работы. Автором проведен фитохимический анализ травы и корневищ с корнями золо-

тарника кавказского, исследованы запасы травы в некоторых районах Северного Кавказа и изучена возможность интродукции золотарника кавказского, установлены морфологические и анатомо-диагностические признаки сырья, проведены предварительные фармакологические исследования экстракта из травы золотарника кавказского.

Объем и структура диссертации

Работа изложена на 163 страницах текста компьютерного набора и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, 4 глав собственных исследований, заключения, списка цитируемой литературы, включающего 164 источника, из которых 86 на иностранном языке, и приложения. Диссертация иллюстрирована 53 рисунками и 35 таблицами.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объектами исследования являлись трава и корневища с корнями золотарника кавказского. Трава заготавливалась в начале цветения путем срезания верхней части длиной 25-30 см в 2009-2013 гг. на территории Северного Кавказа: Карачаевский район Карачаево-Черкесской Республики; Чегемский и Зольский районы Кабардино-Балкарской Республики. Также исследовалась трава, заготовленная в 2011-2013 гг. от интродуцируемых растений. Траву золотарника кавказского сушили на воздухе в тени под навесами и в хорошо проветриваемых помещениях. Корневища с корнями заготавливали от интродуцируемого золотарника кавказского ранней весной 2014 г., выкапывая вручную. Корневища с корнями очищали от остатков почвы, промывали и сушили в хорошо проветриваемом помещении.

Изучение природных запасов золотарника кавказского и возможностей введения его в культуру

В результате проведенных ресурсоведческих исследований выявлены некоторые районы произрастания золотарника кавказского на Северном Кавказе: Республика Карачаево-Черкесия, Карачаевский район (перевал Гумбаши, ущелье р. Даут к перевалу Учкулан, верховье р. Даут на перевале Эпчик), Республика Кабардино-

Балкария, Чегемский район (г. Чегем) ц Зольский район (урочище Джилы-Су). Урожайность, определенная методом учетных площадок, составляет 173-195 кг/га в зависимости от района произрастания. Определение запасов проводили на конкретных зарослях. Биологический запас на обследованной территории - 5353 кг, эксплуатационный - 4630 кг, рекомендуемый объем ежегодных заготовок - более 1 т.

Для сохранения дикорастущих зарослей золотарника кавказского нами была предпринята попытка введения его в культуру. Посадочный материал был заготовлен в урочище Джилы-Су Кабардино-Балкарской Республики.

При определении лабораторной всхожести семян установлено, что семена нуждаются в дозаривании. Полевая всхожесть семян при осенних и весенних сроках посева не превышает 20%. Семенной способ размножения золотарника имеет ряд затруднений: мелкие семена, медленный рост всходов, зарастание посевов сорняками, выход товарной продукции лишь на третий год развития золотарника кавказского (таблица 1).

Таблица 1 - Исследования способов размножения золотарника кавказского в условиях интродукции

Семенное размножение Размножение отрезками корневищ

Лабораторная всхожесть Полевая всхожесть не более 20% Приживаемость при осенней посадке около 80% Приживаемость при весенней посадке около 65%

После сбора Через полгода Через год

30% 82% 74%

Генеративная фаза на третий год жизни Генеративная фаза в первый год жизни

Более перспективным является размножение отрезками корневищ. Максимальная приживаемость отрезков корневищ наблюдается при осенней посадке (около 80%). Урожайность травы при размножении золотарника кавказского отрезками корневищ при осенней посадке составила 204±5,6 кг/га, а корневищ с корнями - 143 ± 4,8 кг/га.

Морфологическое и анатомо-диагностическое изучение травы и корневищ с корнями золотарника кавказского

«Золотарника кавказского трава» представляет собой смесь цельных или измельченных листьев, верхушек цветущих побегов длиной 25-30 см, отдельных осыпавшихся цветков, недозрелых плодов, их хохолков, а также целых соцветий. Стебли цилиндрические. Листья яйцевидно-продолговатые, продолговато-ланцетные или ланцетные, пильчатые, суженые в окрыленный черешок, короче листовой пластинки. Корзинки мелкие 15-20 мм шириной, собранные в колосовидное соцветие. Цветки мелкие желтые. Плод - семянка с хохолком из тонких белых волосков. Запах специфический, вкус горьковатый, слабо вяжущий. Отличительными морфологическими признаками золотарника кавказского являются 2-, 3-рядная обвертка, корзинки 15-20 мм шириной, ножки корзинок обычно без прицветников.

Корневища с корнями золотарника кавказского представляют собой цельные или разрезанные куски корневищ с корнями, корневища цилиндрические, твердые, плотные, слегка изогнутые, не очищенные от опробковевшего слоя, придаточные корни тонкие. Поверхность корневищ продольно-бороздчатая, кора тонкая, пробка местами отслаивается. Излом шероховатый, неровный. Корневища с корнями 3-7 см длиной, 0,3-0,6 см толщиной. Цвет снаружи серовато-коричневый, при отслаивании пробки желтоватый, на изломе желтоватый, вкус горьковатый.

Основные анатомо-диагностические признаки «Золотарника кавказского травы» (рисунок 1): клетки эпидермиса с извилистыми стенками и слабо выраженной продольно-морщинистой кутикулой, устьица аномоцитного типа. На обеих сторонах листа встречаются многочисленный простые и головчатые волоски.

Волоски простые многоклеточные остроконусовидные, тонкостенные с гладкой поверхностью; места их прикрепления обычные или у основания некоторых волосков образуется розетка из клеток эпидермиса.

Головчатые волоски короткие на одно-, двухклеточной ножке и с одноклеточной головкой. Характерной особенностью золотарника кавказского является то, что участки колленхимы коры стебля чередуются с хлоренхимой, а эндодерма содержит хлоропласта.

е)

Рисунок 1 - Диагностические признаки «Золотарника кавказского травы»: а - фотография верхнего эпидермиса (ув. *640); б - фотография нижнего эпидермиса (ув. *640); в - рисунок нижнего эпидермиса: 1 -клетки эпидермиса, 2 - устьице, 3 - головчатый волосок, 4 - простой многоклеточный волосок; г - рисунок и схема фрагмента строения

стебля: 1 - эпидермис, 2 - колленхима уголковая, 3 - паренхима коры, 4 - эндодерма, 5 - склеренхима, 6 - флоэма, 7 - камбий, 8 - ксилема, 9 - сердцевинный луч, 10 - паренхима сердцевины, 11 - волосок простой многоклеточный, 12-хлоренхима, 13 - волосок головчатый; д - эфирномасличная железка листочка обвертки (ув. х640); е - пыльца (ув. ><640)

J

На эпидермисе листочков обвертки встречаются эфирномасличные железки типа астровых. Пыльца округлая, поверхность шиповатая, трехбороздная.

На поперечном срезе корневище (рисунок 2) округлое, покровная ткань представлена перидермой. Кора, которая занимает небольшой объем, представлена клетками паренхимы. Центральный цилиндр занимает большую часть корневища, проводящая система пучкового типа. Пучки коллатеральные, открытые, расположены по кругу, тип стели - эустель. Над флоэмой в области эндодермы располагаются эфирномасличные канальца схизогенного происхождения, овальной формы, их количество соответствует количеству проводящих пучков.

мИшг

6 7

Рисунок 2 - Фотография микроструктуры корневища золотарника кавказского на поперечном срезе (ув. х 128): 1 - перидерма. 2 - паренхима коры, 3 - перициклическая склеренхима, 4 - эфирномасличный каналец, 5 - флоэма, 6 - ксилема, 7 - паренхима

Придаточный корень на поперечном срезе имеет округлую форму (рисунок 3). тип анатомического строения - первичное. Покровная ткань представлена эпибле-мой (эпидермисом). Кора занимает около 50% объема. В ней различают экзодерму, мезодерму и эндодерму. Центральный цилиндр включает проводящие ткани и пери-цикл. В области перицикла имеются семь эфирномасличных каналец овальной формы. Флоэма располагается прерывистым кольцом, которое окружает ксилему, со-

держащую крупные сосуды, расположенные беспорядочно.

2

3

4

5

6

7

8

9

Рисунок 3 - Фотография микроструктуры придаточного корня золотарника кавказского на поперечном срезе (ув. х160) 1 - этшблема, 2 - экзодерма, 3 - мезодерма, 4 - эндодерма, 5 - перицикл, 6 - эфирномасличный каналец, 7 - флоэма, 8 - ксилема, 9 - паренхима

Фитохимическое изучение травы и корневищ с корнями золотарника кавказского

Первоначально для идентификации фенольных соединений травы золотарника кавказского нами была использована бумажная хроматография в различных системах растворителей. В качестве метода экспресс-анализа флавоноидов предложена ТСХ в системе уксусной кислоты 15%. После проявления спиртовым раствором алюминия хлорида 2% обнаруживается зона адсорбции с 0,71±0,02, соответствующая рутину.

Изучение фенольных соединений проводили методом ВЭЖХ на хроматографе фирмы «СЛэйл» с использованием стандартных образцов веществ-свидетелей. Впервые установлено, что в траве золотарника кавказского содержатся 24 соединения, из которых идентифицированы флавоноиды (рутин, виценин, гесперидин), ку-марины (умбеллиферон, эскулетин, дигидрокумарин). фенолкарбоновые кислоты (галловая, цикориевая, хлорогеновая и кофейная) (таблица 2).

Таблица 2 - Фенольные соединения, обнаруженные в траве золотарника кавказского

методом ВЭЖХ

Группа БАС Идентифицированные соединения Концентрация, % от суммы фенольных соединений в извлечении

Флавоиоиды рутин 4,77

виценин 3,07

гесперидин 2,84

Кумарины умбеллиферон 15,48

эскулетин 1,85

дигидрокумарин 2,18

Фенолкарбоновые кислоты галловая кислота 18,31

кофейная кислота 6,27

хлорогеновая кислота 2,16

цикориевая кислота 2,42

Количественное содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин в «Золотарника кавказского траве», определенное методом дифференциальной спектро-фотометрии составляет от 1,57±0,03% до 1,95±0,05% (таблица 3, рисунок 4).

Таблица 3 - Содержание флавоноидов в «Золотарника кавказского траве»

в пересчете на воздушно-сухое сырье

Год Место сбора

г. Чегем (Чегем-ский район, КБР) урочище Джилы-Су (Зольский район, КБР) перевал Гумбаши (Карачаевский район, КЧР) ущелье р. Даут к перевалу Уч-кулан (Карачаевский район, КЧР) верховье р. Даут на перевале Эпчик (Карачаевский район, КЧР) Интроду-цируемый золотарник кавказский

2010 1,83±0,05 е = 2,82 1,68±0,04 е = 2,54 1,76±0,04 £ = 2,37 1,82±0,04 £=1,98 1,85±0,03 £=1,53 -

2011 1,57±0,03 Е = 2,01 1,75±0,07 £ = 3,84 1,88±0,04 £ = 2,05 1,70±0,02 8= 1,36 1,91±0,07 £ = 3,49 1,91±0,05 £ = 2,69

2012 1,72±0,06 е = 3,68 1,60±0,02 £= 1.35 1,81±0,06 £ = 3,32 1,86±0,06 £ = 3,04 1,82±0,04 £ = 2,00 1,95±0,05 8 = 2,81

Для подтверждения пригодности методики количественного определения флавоноидов в пересчете на рутин в траве золотарника кавказского проводили ее валидацию.

Рассчитанное значение коэффициента корреляции составило 0,992. Значение коэффициента корреляции максимально приближено к 1, поэтому можно утверждать о наличии линейной зависимости значений оптической плотности от содержания флавоноидов в траве золотарника кавказского.

Для определения внутри лабораторной воспроизводимости методики содержание флавоноидов определяли в разных навесках сырья по разработанной методике. Содержание флавоноидов в траве золотарника кавказского, найденное спекгро-фотометрическим методом, составило 1,72%, а относительное стандартное отклонение равно 2,97%.

Правильность данной методики устанавливали с помощью определения количественного содержание флавоноидов в пересчете на рутин в извлечениях, полученных путем добавления стандартного образца рутина к навеске сырья. Средний процент открываемое™ составил 100,37%, а относительное стандартное отклонение -2,40%, что соответствует величине Г18П, оптимальному для данного метода анализа.

Количественное содержание фенолкарбоновых кислот в пересчете на кофейную кислоту и воздушно-сухое сырье в траве золотарника кавказского (рисунок 5) определенное методом спектрофотометрии, составляет 0,88±0,03%; в корневищах с корнями интродуцируемого золотарника кавказского - 1,35±0,05%.

Установлено количественное содержание дубильных веществ в пересчете на воздушно-сухое сырье методом перманганатометрического титрования: в траве -9,50±0,20%, а в корневищах с корнями -7,27±0,13%.

Органические кислоты травы золотарника кавказского определяли методом ВЭЖХ. В результате были идентифицированы лимонная, яблочная и янтарная кислоты (водное извлечение, детектирование при длине волны 190 нм). Количественное содержание свободных органических кислот, определенное титриметрически в пересчете на воздушно-сухое сырье, составило 1.31±0,03%.

0,1 200

Рисунок 4 - Спектр поглощения комплекса суммы флавоноидов золотарника кавказского с алюминия хлоридом (определение флавоноидов)

Рисунок 5 - УФ спектр извлечения из травы золотарника кавказского спиртом этиловым 40% (определние фенолкарбоновых кислот)

В результате проведенного исследования по методике проф. Э.Т. Оганесяна было установлено количественное содержание суммы агликонов тритерпеновых гликозидов в пересчете на олеаноловую кислоту, которое составило 1,01±0.03% в пересчете на воздушно-сухое сырье (рисунок 6).

Для выделения полиацетиленовых соединений из корневищ с корнями золотарника кавказского в качестве экстрагента использовали эфир петролейный. который впоследствии отгоняли, сухой остаток растворяли в гексане и исследовали методом двумерной ТСХ. В результате была обнаружена зона адсорбции с голубой флуоресценцией в УФ свете с 11(=0,53-0,55, ее элюировали эфиром петролейным и регистрировали УФ спектр. Полученный УФ спектр с максимумами при длинах волн 239, 251, 263, 278 нм по литературным данным соответствует полиацетилену матрикариаэфиру (рисунок 7).

0,7 0,5

0,4

Рисунок 6 - УФ спектр раствора агликонов тритерпеновых гликозидов травы золотарника кавказского в серной кислоте концентрированной

Рисунок 7 - УФ спектр магрикариаэфира корневищ с корнями золотарника кавказского

Углеводы из травы золотарника кавказского выделяли по методу, описанному в монографии Н.К. Кочеткова и статье М. Sinner. Полученные водорастворимые полисахариды (ВРПС) и пектиновые вещества (ПВ) относятся к галактанам, а геми-целлюлозы (ГМЦ) - к ксиланам. Наибольшее количество галактозы обнаружено в во фракциях IIB.

Основными по содержанию являются фракции ПВ и ГМЦ (таблица 4).

Таблица 4 - Содержание и моносахаридный состав углеводов травы золотарника кавказского

Полисахариды Выход полисахаридов, % Соотношение моносахаридных остатков Содержание

Gal Glc Ara Xyl Rha UAc, %

ВРПС 3,10 4,8 1,3 1,0 1,2 сл. 25,3

IIB 6,23 40,0 сл. 7,2 4,0 1,0 74,2 .

ГМЦ 6,60 1,0 1,1 1,0 7,6 - 15,8

Примечание: Gal - галактоза, Glc - глюкоза, Ara - арабиноза, Xyl - ксилоза,

Шт -рамноза, 1/Ас-уроновые кислоты

Методом ГЖХ-МС в траве золотарника кавказского обнаружены жирные кислоты (дигидроксипропионовая, тригидроксимасляная, гидроксимасляная, пальмитиновая, линолевая, линоленовая, стеариновая кислоты), многоатомные спирты и их производные (глицерин, ксилит, рибит, инозит, мио-инозит, сцило-инозит, глю-цитол) и др.

Методом жидкостной хроматографии на автоматическом аминокислотном анализаторе в траве золотарника обнаружены 15 аминокислот, из которых 9 являются незаменимыми: треонин, валин, метионин, лейцин, изолейцин, фенилаланин, гисти-дин, лизин и аргинин.

Определение содержания макро- и микроэлементов в траве золотарника кавказского проводили с помощью полуколичественного спектрального метода. Элементы, содержащиеся в этом сырье, по степени полезности для организма человека можно разделить на следующие группы: 1). Эссенциальные элементы: Са, К, Mg, Ыа, Р, Сг, Си, Бе, Мп, 7л. Мо. 2). Условно-эссенциальные микроэлементы: Ag, А1,

17

В. 51, V. 3). Условно-токсичные микроэлементы: Ва, Т1, 7л, 5г. Содержание условно-токсичных элементов не превышало предельно допустимых уровней.

Разработаны нормы стандартизации «Золотарника кавказского травы» (таблица 5).

Таблица 5 - Показатели подлинности и доброкачественности

«Золотарника кавказского травы»

Показатели Методы Нормы

1 2 3

Внешние признаки Органолептические, невооруженным глазом (с помощью лупы) ГФХ1, вып. 1,с. 256257 Листья яйцевидно-продолговатые, продолговато-ланцетные или ланцетные, пильчатые. Корзинки мелкие 15-20 мм шириной, собранные в колосовидное соцветие. Обвертка 2-, 3-рядная, конически-колокольчатая. Цветки мелкие желтые. Плод - семянка.

Микроскопия Микроскопический ГФ XI, вып. 1,с. 278279 Клетки эпидермиса с извилистыми стенками и продольно-морщинистой кутикулой, аномоцитный тип устьичного аппарата. Волоски простые многоклеточные остроконусовидные, тонкостенные с гладкой поверхностью. Головчатые волоски короткие на одно-, двухклегочной ножке и с одноклеточной головкой.

Качественная реакция Цианидиновая реакция розовое окрашивание (флавоноиды)

Спектрофотомерия Извлечение спиртом этиловым 70%, регистрация спектра 410 ± 2 нм (дифференц. спектр рутина)

Хроматография тех На хроматограмме испытуемого извлечения должна обнаруживаться зона адсорбции с 1У 0,71^0,02, соответствующая рутину

Числовые показатели: - содержание флавонои-дов в пересчете на рутин Спектрофотометрия Не менее 1,0%

- экстрактивные вещества (зкстрагент спирт этиловый 50%) ГФ XI, вып.1, с. 295 Не менее 24%

- влажность ГФ XI, вып.1, с. 285 -286 Не более 8%

- зола общая ГФ XII, 4.1, с. 115 Не более 7%

- зола, нерастворимая в хлористоводородной кислоте 10% ГФ XI, вып.2, с.25 Не более 1,5%

- частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями 7 мм ГФ XI, вып. 1, с. 275276 Не более 10%

1 2 3

- пожелтевшие и побуревшие листья ГФ XI, вып.1, с. 276 Не более 10%

- стебли ГФ XI, вып.1, с. 276 Не более 15%

- органические примеси ГФ XI, вып.1, с. 276 Не более 3%

- минеральные примеси ГФ XI, вып.1, с. 276 Не более 1,5%

Микробиологическая чистота ГФХИ, ч.1, с. 160, ОФС 42-0067-07 Категория 4А

Срок годности ГФ XII, ч. 1, с. 488-492, ОФС 42-0075-07 3 года

«Золотарника кавказского травы экстракт сухой» получен по схеме: 1) экстракция спиртом этиловым 50% методом дробной мацерации в 4 стадии; 2) фильтрация полученного извлечения; 3) упаривание до густого состояния; 4) сушка полочная в условиях пониженного давления. Выход конечного продукта составил 24% в пересчете на воздушно-сухое сырье.

Полученный экстракт представляет собой порошок темно-коричневого цвета со специфическим ароматным запахом и слабо горьким вкусом; содержание влаги составило 4,2±0,13%. Содержание тяжелых металлов в экстракте составляет не более 0,01%. Сухой экстракт выдерживает требования по микробиологической чистоте, указанные в ГФ XII, вып.1, с. 160, ОФС 42-0067-07 (категория 3.2).

Методом ВЭЖХ в сухом экстракте были идентифицированы флавоноиды (рутин, виценин, гесперидин), кумарины (умбеллиферон, эскулетин), фенолкарбоновые кислоты (галловая, цикориевая, хлорогеновая, кофейная).

Количественное содержание флавоноидов в пересчете на рутин в экстракте золотарника, определенное методом дифференциальной спектрофотометрии, составляет 3,03±0,02%. Валидационные характеристики методики: значение коэффициента корреляции 0,996. При определении внутрилабораторной воспроизводимости относительное стандартное отклонение составило 2,85%; при определении правильности -2,61%.

Содержание фенолкарбоновых кислот в пересчете на кофейную кислоту в экстракте золотарника кавказского составляет 1,72±0,04%.

Определена стабильность экстракта методом естественного старения. По результатам анализа было сделано заключение, что сухой экстракт в течение 24 меся-

цев хранения в естественных условиях остается стабильным, количественный состав меняется незначительно.

Эксперимент по определению острой токсичности спиртового извлечения из травы золотарника кавказского при пероральном введении показал, что извлечение относится к малотоксичным (ЛД50=4173±900,7 мг/кг).

При изучении патоморфологических изменений в органах (печени, почках, сердце, легких, надпочечниках, желудке), вызванных введением извлечения из травы золотарника кавказского в дозе 10000 мг/кг, установлено, что смерть животных наступает по причине нарушения гемодинамики в результате системного тромбооб-разования и кровоизлияния в жизненно важные органы.

Для изучения диуретической активности (таблица 6) сухой экстракт золотарника кавказского в виде водного раствора вводили за час до создания водной нагрузки. Ингактная группа животных получала эквиобъемное количество воды.

Таблица 6 - Влияние сухого экстракта золотарника кавказского на диурез

Показатель Исследуемые группы, доза

Интактные Экстракт, 100 мг/кг Экстракт, 300 мг/кг Экстракт, 500 мг/кг

Объем мочи за 2 часа, мл/200 г 1,67±0,198 1,86±0,193 2,74±0,278* +64% 2,33±0,204* +40%

Примечание* - достоверно (Р<0,05) по отношению к интактной группе животных

В ходе исследования было установлено, что введение сухого экстракта золотарника кавказского оптимально в дозе 300 мг/кг, это приводит к достоверному увеличению диуреза на 64% по сравнению с интактными животными.

Для определения антибактериального действия были приготовлены водные растворы сухого экстракта золотарника кавказского в концентрациях 20%, 10%, 5%, 2,5%, 1%.

Антибактериальное действие полученных растворов изучали способом «колодцев». Проведенные исследования выявили антибактериальное действие по отношению как к грамположительным бактериям: стафилококкам и бациллам, так и к грамотрицательным бактериям: протею и синегнойной палочке. Наиболее широкий спектр антибактериального действия отечен у 20%-ого водного раствора экстракта

в отношении Staphylococcus aureus, S. epidermidis, Bacillus subtilis, Вас. anthracoides, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa. Антибактериальное действие 10%-ого раствора существенно не отличалось от 20%-ого раствора, но было ниже у 5%-ого, 2,5%-ого растворов и почти отсутствовало у 1%-ого раствора.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных исследований экспериментально подтверждена возможность использования травы золотарника кавказского в качестве источника биологически активных соединений. В итоге были сделаны следующие выводы:

1. В результате анализа литературных данных были обобщены и систематизированы сведения о видах рода Золотарник, произрастающих на территории Российской Федерации.

2. Ресурсные обследования флоры Кабардино-Балкарской и Карачаево-Черкесской Республик выявили отдельные места произрастания золотарника кавказского и позволили оценить его эксплуатационные запасы. При изучении возможности введения золотарника кавказского в культуру было установлено, что наиболее эффективным является размножение отрезками корневищ.

3. Морфолого-анатомические исследования позволили определить характерные для травы и корневищ с корнями золотарника кавказского морфологические и анатомо-диагностические признаки, необходимые для установления их подлинности.

4. Проведенное фитохимическое изучение выявило наличие в траве золотарника кавказского флавоноидов (рутина, виценина, гесперидина), кумаринов (умбеллиферона, эскулетина, дигидрокумарина), фенолкарбоновых кислот (галловой, цикориевой, хлорогеновой и кофейной), дубильных веществ, органических кислот (лимонной, яблочной, янтарной), тритерпеновых гликозидов (производных олеаноловой кислоты), углеводов, жирных кислот, многоатомных спиртов и их производных, аминокислот. В корневищах с корнями золотарника кавказского обнаружены фенолкарбоновые кислоты, дубильные вещества, полиацетиленовые соединения, тритерпеновые

гликозиды, углеводы и аминокислоты. Разработана методика количественного определения флавоноидов в пересчете на рутин в траве золотарника кавказского. Количественно определено содержание в пересчете на воздушно-сухое сырье флавоноидов (в траве - 1,57-1,95%); фенолкарбоновых соединений в пересчете на кофейную кислоту (в траве - 0,88±0,03%; в корневищах с корнями - 1,35±0,05%); дубильных веществ (в траве -9,50±0,20%; в корневищах с корнями - 7,27±0,13%); органических кислот (в траве - 1,31±0,03%); агликонов тритерпеновых гликозидов (в траве -1,01±0,03%); углеводов (в траве - 15,93%).

5. Установлено, что трава золотарника кавказского является малотоксичной. Экспериментально подтверждено диуретическое и антибактериальное действие сухого экстракта травы золотарника кавказского.

6. Разработаны нормы качества на траву золотарника кавказского и сухой экстракт на ее основе, которые вошли в проекты ФСП «Золотарника кавказского трава» и ФСП «Золотарника кавказского травы экстракт сухой». Предложен проект Инструкции по заготовке и сушке травы золотарника кавказского.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Федотова, В.В. Морфологическое и анатомо-диагностическое изучение корневищ с корнями золотарника кавказского / В.В. Федотова, Л.М. Елисеева, Д.А. Коновалов // Современные проблемы науки и образования. - 2014. - № 3. Режим доступа: http://www.science-education.ru/117-13292 (дата обращения: 30.05.2014).

2. Определение «острой» токсичности сухого экстракта золотарника кавказского. Патоморфоло-гические изменения в органах, вызванные введением экстракта золотарника кавказского в дозе 10000 мг/кг / В.В. Федотова, Д.А. Коновалов, А.Ю. Терехов [и др.] // Современные проблемы науки и образования. - 2014. - № 1. Режим доступа: http.V/www.science-education.ru/115-11846 (дата обращения 17.03.2014).

3. Федотова, В.В. Изучение фенольных соединений золотарника кавказского (Solidago caucasi-са Kem.-Nath.) / В.В. Федотова, В.А. Челомбитько // Научные ведомости БелГУ. Серия Медицина, Фармация.-2012. -№ 10(129), Вып. 18. - С. 175-177.

4. Федотова, В.В. Виды рода золотарник (Solidago): значение для медицинской практики, перспективы изучения / В.В. Федотова, В.А. Челомбитько // Научные ведомости БелГУ. Серия Медицина, Фармация. - 2012.-№ 16(135), Вып. 19.-С. 136-145.

5. Федотова, В.В. Изучение органических кислот золотарника кавказского (Solidago caucasica Kem.-Nath.) и черноголовника многобрачного (Poterium polygamum Waldst. & Kit.) /

В.В.Федотова, A.B. Охремчук, В.А. Челомбитьш // Научные ведомости БелГУ. Серия Медицина, Фармация. - 2012. - №16 (135), Вып. 19. - С." 173-175.

6. Федотова, В.В. Фенольные соединения и антибактериальное действие сухого экстракта золотарника кавказского (Solidago caucasica Kem.-Nath.) / B.B. Федотова, В.А. Челомбитыю, Н.В. Постникова// Меднцпнскнп альманах. -2013. Л"; 1 (25). - С. 185-188.

7. Федотова, В.В. Изучение углеводов травы Solidago caucasica / B.B. Федотова, В.А. Челом-битъко, М.Х. Маликова // Химия природ, соединений. - 2013. -№4. - С. 621-622.

8. Федотова, В.В. Аминокислотный и минеральный состав травы золотарника кавказского (Solidago caucasica Kem.-Nath.) / B.B. Федотова, В.А Челомбитъко // Кластерные подходы фармацевтического союза: образование, наука и бизнес: сб. материалов II Междунар. науч,-практ. конф. 26 апр. 2012 г. - Белгород: ИПК НИУ «БелГУ», 2012 . - С. 184-187.

9. Федотова, В.В. Анатомо-диагностическое изучение золотарника кавказского (Solidago caucasica Kem.-Nath.) флоры Северного Кавказа / Федотова В.В., Челомбитьш В.А. // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2012.-Вып. 67.-С. 128-131.

10. Федотова, В.В. Изучение водорастворимых органических кислот золотарника кавказского сухого экстракта / В.В. Федотова, В.А. Челомбитъко // Человек и лекарство: тез. докл. юбилейного XX рос. нац. конгр. 15-19 апр. 2013 г.-М., 2013. - С. 451.

11. Федотова, В.В. Ресурсоведческое исследование Solidago caucasica Kem.-Nath. / В.В. Федотова, В.А. Челомбитьш // Успехи современного естествознания. - 2013. - №4. - С. 164-165.

12. Федотова, В.В. Товароведческие показатели золотарника кавказского травы (Solidago caucasica Kem.-Nath.) и получение сухого экстракта / В.В. Федотова, В.А. Челомбитъко // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. — Волгоград, 2013. - Вып. 68.-С. 113-114.

13. Изучение диуретической активности экстракта золотарника кавказского / В.В. Федотова, АЛО. Терехов, A.A. Кобин [и др.] // Современные тенденции в образовании и науке: сб. науч. тр. по материалам Междун. науч.-пракг. конф. 31 окт. 2013 г.: в 26 ч. - Тамбов: ТРОО «Бизнес-Наука-Общество», 2013. -Ч 6. - С. 132-133.

14. Федотова, В.В. Тритерпеновые гликозиды травы Solidago caucasica Kem.-Nath. / В.В. Федотова, Э.Т. Оганесян, В.А. Челомбитъко // Фармация и фармакология. - 2014. —Хз 4 (5). - С. 5256.

15. Федотова, В.В. Определение флавоноидов в золотарника кавказского траве / В.В. Федотова, Д.А. Коновалов // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2014. - Вып. 69. - С. 85-88.

16. Федотова, В.В. Количественное определение флавоноидов в пересчете на рутин в сухом экстракте золотарника кавказского / В.В. Федотова, Д.А. Коновалов // Проблемы фармацевтической науки и практики: материалы IV Межрегиональной науч.-практ. конф. с междунар. участием 30-31 мая 2014 г. -Владикавказ, 2014,- С. 22-25.

***

Выражаем благодарность доктору фармацевтических наук, профессору Вячеславу Александровичу Челомбитько за оказанную помощь в изучении травы золотарника кавказского.

ФЕДОТОВА ВИКТОРИЯ ВЛАДИМИРОВНА

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЗОЛОТАРНИКА КАВКАЗСКОГО (SOLIDAGO CAUCASICA KEM.-NATH.)

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Подписано в печать 23 октября 2014 года. Формат 60x84/16 Бумага книжно-журнальная. Печать ротапринтная. Усл. печ. л. 1,0 Тираж 100 экз.

Пятигорский медико-фармацевтический институт -филиал ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России (357532, Ставропольский край, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11)