Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Фармакогностическое изучение лекарственных растений с использованием молекулярно-биологических методов

На правах рукописи

003477607

Баева Вера Михайловна

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ

ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОЛЕКУЛЯРНО--БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ

15.00.02- фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора фармацевтических наук

Москва - 2009

л г№>

003477607

Диссертационная работа выполнена в ГОУ ВПО Московская медицинская академия имени И.М. Сеченова Росздрава и в НИИ физизико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ имени М.В .Ломоносова

Научные консультанты:

член-корр. РАМН, доктор фармацевтических наук профессор

академик РАЕН, доктор биологических наук профессор

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, профессор

доктор фармацевтических наук

доктор фармацевтических наук, профессор

Ирина Александровна Самылина |Андрей Сергеевич Антонов!

Сокольская Татьяна Александровна Баландина Ирина Анатольевна Патудин Александр Васильевич

Ведущая организация:

ГОУ ВПО Ярославская Государственная медицинская академия

Защита состоится « _2009 г. в I 7 часов на заседании диссертационного совета

Д.208.040.09. при Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова (г. Москва, Никитский бульвар, 13).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова (117998, г. Москва, Нахимовский пр., д. 49).

Автореферат разослан « I У» 0$ 2009г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д.208.040.09.

доктор фармацевтических наук, Наталья Петровна Садчикова

профессор

Общая характеристика работы Актуальность проблемы. Перспективность исследований лекарственных растений народной медицины несомненна для современной отечественной фармации. При введении таких растений в медицинскую практику в первую очередь следует проводить комплекс исследований, устанавливающих их видовую принадлежность и очерченность границ вида.

Во многих родах, в том числе и лекарственных растений с богатым видовым составом,отмечено такое широко распространенное явление, как полиморфизм, который затрудняет видовую идентификацию растений и создает необходимость определения глубины этой изменчивости на уровне генома растения.

Многие лекарственные растения обладают аберратными формами размножения (например, апомиксисом) или склонны к образованию межвидовых гибридов. Эти проблемы характерны для большого числа лекарственных растений семейств: розоцветные, бобовые, гречишные, кипрейные, сложноцветные и др. Некоторые виды из этих семейств применяются в научной медицине, а такие как представители рода манжетка, язвенник, ястребинка, кипрей и многие другие являются перспективными для отечественной научной медицины.

Известно, что манжетки способны образовывать агамный комплекс [V.Grant 1981], который находится на стадии поздней зрелости и его агамоспермная суперструктура достигает полного развития.Такие популяции являются непрерыв ным источником возникновения агамоспермных микровидов.

В роде манжетка выделено четыре группы, одна из которых - Vulgares не является монотипной и её границы до сих пор не ясны [S. Fröhner, 1986], так как описано несколько амфимиктических видов и множество апомиктических ага-мных видов. Манжетки этой группы предложено трактовать, как агамный комплекс [V.Grant, 1981]. Для некоторых из них в пределах Европейской части России установлен факультативный апомиксис [К.П.Глазунова, 1977, 1987]. У манжетки обыкновенной высокая изменчивость проявляется в наличии многочисленных форм,групп особей или отдельных экземпляров,среди которых мно-

гие агамные виды описаны по морфологическим признакам: опушение, размеры и геометрическая форма вегетативных, генеративных органов или их частей. Кроме того, отмечено наличие многочисленных переходных форм и значительные колебания хромосомных чисел от 64 до 146. Только на территории Европейской части нашей страны описано более 56 видов манжетки. Некоторые исследователи относят к манжетке обыкновенной пять-шесть агамных видов, таких как м. балтийская, м. изящная, м.остролопастная, м. близкая, м. горная и м. голостебельная [К.П. Глазунова, 1990]. Другие исследователи к популяции манжетка обыкновенная относят до двенадцати видов [С.К. Черепанов, 1981], также с дискретно различающимися морфологическими вариантами, при этом часто их принадлежность к группе манжетка обыкновенная не совпадает у разных авторов.

Всё это затрудняет фармакогностическое изучение этих ценных лекарственных растений, разработку рекомендаций по сбору сырья и его осуществление.

Недостаточность одних лишь морфологических признаков для выявления внутрипопуляционной и внутривидовой изменчивости в роде манжетка заставило прибегнуть к привлечению молекулярно-биологических методов, в частности, для характеристики геномов.

Для многих других ценных лекарственных растений идентификация также не разработана на должном современном уровне, поэтому разработка методических подходов к изучению лекарственных растений с использованием молекулярно-биологических методов актуальна.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с научным направлением кафедры фармакогнозии и является фрагментом разрабатываемой комплексной темы: «Фармакогностическое изучение лекарственного растительного сырья, лекарственных сборов, лекарственных форм из сырья и разработка методов их стандартизации с учётом антропогенных факторов», № 01.200.110546.

Молекулярно-биологическая часть эксперимента выполнена в отделе эволюционной биохимии НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского

МГУ им. М.В. Ломоносова, по теме: «Геносистематика и молекулярная фило-генетика про- и эукариот», № госрегистации: 0187.0095927

Цель и задачи исследования. Цель исследования - разработать методические подходы к изучению лекарственных растений, обладающих аберратными формами размножения, используя молекулярно-биологические и фармакогнос-тические методы, направленные на прогнозирование перспективных сырьевых источников получения отечественных лекарственных средств. Для этого были поставлены следующие задачи:

1. Определить характер и оценить внутривидовую и популяционную изменчивость модельного рода манжетка - АкЬетШа Ь., с помощью полимеразной цепной реакции со случайными праймерами (11АРО-метод)

2. Провести сравнительное изучение с использованием ЛАРО-анализа сырья лекарственных растений различных семейств, родов и разных морфологических групп.

3. Показать возможность использования секвенирования ДНК на примере рода АпМуШ Ь. для изучения лекарственных растений.

4. Изучить химический состав полифенолов и аминокислот манжетки, исследовать его взаимосвязь со строением геномов лекарственных растений.

5. Провести стандартизацию сырья - трава манжетки, разработать критерии подлинности (внешние и анатомические признаки, качественные характеристики), числовые показатели и установить их нормы.

6. Определить перспективность манжетки обыкновенной, как нового сырьевого источника и разработать рациональные приемы сбора сырья.

7. Провести оценку безопасности и фармакологической активности настоя травы манжетки.

8. Разработать алгоритм изучения перспективных лекарственных растений с аберратными формами размножения.

Научная новизна результатов исследования. Показана возможность применения молекулярно-биологических методов для фармакогностического анализа. С использованием ЛАРБ-анализа, на примере рода манжетка проведено

5

изучение геномов перспективных лекарственных растений, определён характер изменчивости в популяциях рода и установлена генетическая дистанция между видами рода, что позволило подойти к решению проблемы внутривидовой и популяционной изменчивости.

Изучена взаимосвязь между особенностью строения геномов видов манжетки и химическим составом полифенольного и аминокислотного комплекса. Изучение полифенольного и аминокислотного состава травы манжетки от разных видов показало его сходство и позволило дать чёткие рекомендации по сбору сырья.

Показана перспективность применения молекулярно-биологических методов, ЛАРО-анализа и секвенирования, для идентификации лекарственного растительного сырья на примере растений семейства розоцветные, бобовые, яснотко-вые, буковые, гречишные, кипрейные, астровые.

Получены новые данные - геномные характеристики 17-ти видов сырья растений, 14-ти родов, относящихся к семи семействам.

Проведено ресурсоведческое изучение манжетки обыкновенной трех районов Московской области и Севера Тульской области, определены урожайность и объем ежегодных заготовок, с соблюдением ресурсосберегающих условий.

Разработаны критерии оценки подлинности и качества сырья - трава манжетки, как перспективного лекарственного сырья.

По результатам изучения безопасности настой травы манжетки отнесен к препаратам пятой категории токсичности, выявлена его антиметастатическая активность.

Приорететность научных исследований подтверждена заявкой на изобретение (регистрационный номер 2009115437). Способ получения средства из травы манжетки, снижающего токсичность циклофосфамида.

Разработан алгоритм изучения лекарственных растений, обладающих абер-ратными формами размножения.

Практическая значимость полученных результатов. На основании результатов фармакогностического, ресурсоведческого изучения и анализа геномов, для медицинского применения рекомендованы 13 видов рода АкНетШа Ь.

Разработаны оптимальные методики для идентификации свежего и высушенного лекарственного растительного сырья с использованием КАРБ-анализа. С использованием молекулярно-биологических, фармакопейных и ресурсоведчес-ких методов предложены показатели, нормы качества, ресурсные характеристики травы манжетки, которые включены в проект Фармакопейной статьи «Трава манжетки», проект «Инструкции по сбору и сушке», а также проект Общей фармакопейной статьи «КАРБ-анализ лекарственного растительного сырья».

Положения, выносимые на защиту:

1. Результаты оценки сравнительного изучения геномов 12 видов рода манжетка - А1скетШа Ь„ с использованием ЛАРО-анализа и определение характера изменчивости.

2. Данные применения ЯАРБ-анализа для идентификации 17-ти видов лекарственного сырья растений, 14 родов, относящихся к семи семействам.

3. Оценка применения секвенирования ДНК лекарственных растений для их фармакогностического изучения на примере рода АмЬуИх Ь.

4. Результаты сравнительного изучения состава полифенолов, аминокислот и его взаимосвязь со строением геномов изучаемых видов рода манжетка.

5. Результаты стандартизации, фармакогностического и ресурсоведческого изучения травы манжетки.

6. Оценка безопасности и фармакологической активности травы манжетки.

7. Результаты разработки алгоритма изучения лекарственных растений с аберратными формами размножения.

Апробация работы. Основные результаты исследований докладывались на Российской национальной конференции «Формирование приорететов лекарственной политики (Москва, 28-29 июля 1995), на Первом международном симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического

7

использования» (Пущино, 1-5 августа 1995), на научной конференции, посвященной 50-летию ботанического сада ММА им.И.М. Сеченова (Москва, 1996), на Международном конгрессе по аналитической химии (Россия, 1997), на У и УШ Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва. 2125 апреля 1998, и 2001), на научно-практической конференции «Традиционные методы лечения - основные направления и перспективы развития» (Москва, 1416 мая 1998), на интернациональном симпозиуме «Plant Evolution in Man-made Habitats" (Vena, August 10-15, 1998), на заседании Московского общества фитотерапевтов (Москва, ноябрь, 2000), на У1 Симпозиуме по фенольным соединениям (Москва, 28-30 апреля 2004г),на научно-практической конференции «Современные методы стандартизации и контроля качества лекарственных средств» Москва, (30 мая 2006); на Международном конгрессе «Традиционная медицина 2007» (1-Змарта 2007г).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 40 печатных работ в том числе в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК - 9.

Объем и структура диссертации

Работа изложена на 236 страницах машинописного текста, содержит 77 рисунков, 38 таблиц и 3 приложения. Состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, 5 глав экспериментальных исследований, общих выводов, списка литературы (250 источников, в том числе 118 на иностранных языках).

В обзоре литературы представлен анализ современного состояния проблемы изучения геномов растений, геносистематики, полиморфизма лекарственных растений показана перспективность использования молекулярно-биологичес-ких методов для решения сложных задач при изучении перспективных лекарственных растений, обладающих аберратными формами размножения. Охарактеризован агамно-половой комплекс Alchemilla vulgaris L - как источник ценного лекарственного сырья, его химический состав и перспективы применения.

Вторая глава посвящена описанию объектов исследования, методик и методов анализа, использованных в работе.

В третьей главе приведены результаты применения ЯАРО-анализа при изучении самых распространённых видов рода АккетШа, что позволило очертить круг производящих лекарственных растений для сырья - трава манжетки. Показана возможность практического применения полученных результатов позволивших предложить новый метод изучения лекарственных растений и использовать его для идентификации лекарственного растительного сырья.

В четвёртой главе показаны перспективы использования молекулярно-биоло-гических методов для изучения лекарственных растений: секвенирование ДНК растений (на примере рода АпЛуШ Ь.) и КАРБ-анализ различных видов сырья..

В пятой главе представлены результаты химического изучения полифенолов наиболее распространенных видов рода АккетШа, а также изучения аминокислотного и элементного состава.

Шестая глава посвящена стандартизации, фармакогностическому и ресур-соведческому изучению травы манжетки.

В седьмой главе представлены результаты оценки антиметастатической активности, острой и хронической токсичности водных извлечений травы манжетки.

В приложении представлены проекты нормативных документов по применению ЯАРО-анализа для идентификации лекарственного растительного сырья, Иструкции по сбору и сушке травы манжетки-ЬегЬа АккетШае, Фармакопейной статьи трава манжетки - кегЪа АккетШае.

Содержание работы Объекты и методы исследования. В качестве объектов исследования были собраны следующие виды АккетШа Ь.: манжетка голостебельная - АккетШа glabricaulus ЬМЬ/й., манжетка остролопастная - АккетШа асиШоЪа Ор1г., манжетка балтийская - АккетШа Ьа1-Нса & Бат.ех Лг., манжетка шерстистая - АккетШа МгБШксш1т £шс/6.у?/.,

манжетка близкая - АккетШа ргорщиа ЬШЬ/й.,манжетка горная - АккетШа

9

montícola Opiz., манжетка семиугольная - Alchemilla heptágono Juz., манжетка изящная - Alchemila gracilis Opiz., манжетка городчатая - Alchemilla subcrenata Buser., манжетка сарматская - Alchemilla sarmatica Juz.,манжетка полулунная-Alchemilla semihmaris Alech., манжетка волнистолистная - Alchemilla cymato-phylla Juz., манжетка шаровидно-скрученная -Alchemilla conglobata Lindb.fil (A.Juzepzukii Alech.).

Определение дикорастущих видов проводили по ключам-определителям, разработанным С.В. Юзепчуком (1939г.) и В.Н.Тихомировым (1966 г.). Выделение ДНК. ДНК выделяли с помощью модифицированной нами методики Дж. Дрейпера (1989) с использованием экстракции цетилтриметиламмония бромидом. Концентрацию ДНК оценивали с помощью спектрофотометрии или электрофореза в агарозном геле с окрашиванием бромистым этидием.

Выделение ДНК и сравнение геномов сначала проводили у хорошо определяемых видов и близких родовгманжетка (Alchemilla gracilis Opiz.) и лапчатка (Ро-tentilla erecta Натре.),а также репешок (Agrimonia eupatorio L.), собранных в Истринском районе Московской области. Там же собирали цветки таволги (Filipéndula ulmaria Max.) и лепестки розы (Rosa rugosa Thunb., сем. Rosaceae), траву горца почечуйного (Polygonum persicaria L., сем. Polygonaceae), череды трёхраздельной (Bidens tripartitus L.) и поникшей (Bidens cernuus L. сем. Astera-ceaé). Листья дуба черешчатого и красного (Quercus robur L. и Quercus rubra L. сем. Fagaceae) и траву язвенника (Anthylis vulneraria L.,csm. Fabaceae) собирали в ботаническом саду МГУ им.М.ВЛомоносова. Образцы других видов рода Anthylis были любезно предоставлены нам из коллекций гербариев МГУ им. М.В. Ломоносова, ГБС им. Н.В. Цицина, БИН им. В.Л. Комарова и др. Цветки иван-чая узколистного (Chamaenerium angustifolium (L.) Scop. и Ch. angustifolium var. Albiflorum Hausskn., сем. Onagraceae.) обычные и белой рассы собирали в Одинцовском районе Московской области. Листья мяты перечной (Menthapiperita L.) и монарды двойной (Monarda didyma L.),траву чабреца (Thymus serpillum L.) и мелиссы (Melissa officinalis L., сем. Lamiaceae) собирали в ботаническом

саду ГОУ ВПО ММА им.И.М. Сеченова. Цветки боярышника собирали там же

10

с боярышника кроваво-красного (Crataegus sanquinea Pall), а цветки боярышника кавказского (Crataegus caucasica С. Koch., Cratz.et Mesp.) собирали на Черноморском Побережье в Гагринском районе Абхазии. Для геномного анализа использовали листья перечисленных выше видов манжетки, собранных в разных районах Московской области.

Для построения филогении язвенника использовали молекулярные маркеры применяемые в геносистематике: внутренний транскрибируемый спейсер-inter-nal transcribed spacer(ITSl и 1Т82)участок 18S-5.8S-26S ядерного рибосомально-го цистрона-участок ДНК, отвечающий за единичную функцию [I.Alwres,2003]; хлоропластный участок petB-petD относящийся к интронам II группы и состоящий из куска экзона petB, межгенного спейсера, экзона petD, интрона и куска экзона /?e?D[C.Lohne, 2005];а также хлоропластный маркер экзон rps 16 из группы II интронов [M.Clegg,1993; B.Oxelman,1997],

Определение нуклеотидных последовательностей ДНК для язвенника проводили методом циклического секвенирования с использованием набора реагентов ABI Prism BigDye Terminator v. 3.1. с последующим анализом продуктов на автоматическом секвенаторе ДНК ABI Prism 3100-Avant (Applied Biosystems) в Межинститутском Центре коллективного пользования «Геном» (Институт молекулярной биологии РАН им. В.А. Энгельгардта).

Для изображения филогенетических деревьев использовали методы максимальной экономии, максимального правдоподобия и дистанционный.

Для исследований ценопопуляций манжетки была использована методика сбора и обработки материала, а также терминология, разработанная А.А.Урано-вым и его учениками (1973, 1975, 1980, 1987). Были рассмотрены разновозрастные популяции изучаемых видов манжетки. В качестве единицы счёта использовали, как элементарный источник фитогенного поля, особь.

При описании структуры и динамики ценопопуляций сбор сырья проводили в пределах одного участка ассоциации S=100 м2 (10x10) внутри её контура, на трансектах (метод трансект Л.Б.Заугольновой, 1976). В ресурсоведческой рабо-

те использовали методики разработанные А.И.Шретером (1966), и В.Б.Кувае-вым (1987). Урожайность сырья или плотность запаса рассчитывали на единицу площади (ц/га).

Фармакогностическое изучение сырья - трава манжетки: описание внешних признаков, микроскопический анализ, определение числовых показателей (влажность, зола общая и др.) проводили по фармакопейным методикам ГФ XI, т.1 (1987) и т.2 (1990).

Водные извлечения из сырья готовили в соответствии с ГФ XI, т.2(1990) в соотношении 1:10. Извлечения 30% спиртом, 70% спиртом и ацетоном готовили в соотношении 1:10.

Изучение полифенольного состава проводили с помощью хроматографичес-ких методов. В работе была использована бумажная, тонкослойная, колоночная хроматография и ВЭЖХ.

Для сравнительного изучения полифенольного, в частности флавоноидного состава настоев травы некоторых видов манжетки, наиболее часто встречающихся в естественных фитоценозах Подмосковья, был применён метод анализа - ВЭЖХ. Исследования проводили на хроматографе Perkin Elmer, Diode Array, Detektor 235 С при длине волны 255 нм для флавоноидов, и 280 нм - для фенол-карбоновых кислот. Колонка 150x4,6 мм с размером частиц 3 мкм,сорбент ги-персил С 18; элюент ацетонитрил (ACN): вода (pH 3,2).Компьютерную обработку полученных данных проводили по стандартной программе "Turbochrom ".

Определение содержания суммы флавоноидов проводили с помощью спектрофотометра Beckman DU-65. Количественное определение суммы флавоноидов проводили после модификации соответствующих фармакопейных методик. Статистическую обработку полученных результатов проводили в соответст-вии с требованиями ГФ XI (1987г) и с использованием пакета статистических программ "Statistica for".

Доклинические исследования настоя манжетки проводили на лабораторных мышах: DBA2; С57В16 ; гибриды BDFi и Fi; беспородные мыши SHK. В ис-

следовании использованы перевиваемые опухоли: лимфолейкоз Ы210, эпидер-моидная карцинома легкого Лыоис(ЬЬС) и саркома-37 асцитная и солидная. Методы оценки острой токсичности и антиметастатической активности. Изучение токсического действия настоя травы манжетки 1:10 и определение диапазона терапевтических доз на интактных животных проводили при перора-льном пути введения вещества в организм в диапазоне доз от неэффективной до максимально переносимой (МПД). Использовали диапазон однократных или курсовых доз (при любой длительности курса). Для каждой дозы определялся максимальный эффект по одному из возможных критериев. С помощью построения графика "доза-эффект" определяли ЕД20, ЕД50 и ЕД90 - расчетные дозы, вызывающие торможение роста опухоли (ТРО) на 20%, 50% и 90%, соответственно.

Определяли оптимальные схемы терапии. Оценку эффективности терапии устанавливали по увеличению продолжительности жизни, числу полных ремиссий или излечению животных.

Оценку эффективности лечения, противоопухолевого и антиметастатического эффекта определяли по торможению роста опухоли.

Степень торможения роста опухоли определяли по показателям ТРО и Т/С, вычисляемым по формулам: ТРО%=(Уконтроля-Уопыта)хЮО/Уконтроля,

Т/С%=Уопытах100/Уконтроля, где V- средний объем опухоли (ммЗ) в подопытной и контрольной группах, соответственно, на конкретный срок; Т - леченая группа; С - контрольная группа; Т/С - величина, обратная ТРО. Значимый противоопухолевый эффект должен сохраняться не менее 7 суток после окончания лечения.

Оценку антиметастатической активности проводили на карциноме легких Льюис, меланоме В-6 и Клаудмана, а также саркоме-37 характеризующихся высокой интенсивностью метастазирования и дающих макроскопические метастазы,доступные для качественной и количественной оценки простыми способами. Частота метастазирования опухоли - процент животных с метастазами по отношению к общему количеству животных в группе. В случае лимфогенного мета-

13

стазирования подсчитывали массу метастазов и среднее значение этого показателя в группе. Торможение метастазирования по средней массе легких (ТРМ%): ТРО%=(сред. m легких контроля-сред.m легких опыта) хЮО/Уконтроля. Изучение геномов видов рода манжетка (как модельного)ЯАРВ-методом

Для установления молекулярно-генетического родства между апогамными видами и популяциями манжетки обыкновенной был применён получивший широкое распространение в последнее десятилетие прошлого века метод поли-меразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами со случайной произвольной последовательностью - RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) - или AP (Arbitrary Primed) - анализ [Welsh J., 1990; Williams J.G.K, 199], который успешно используется для оценки степени сходства геномов близкородственных организмов, относящихся к самым разным таксономическим группам.

На первом этапе нами была предпринята попытка сравнительного изучения геномов нескольких хорошо определяемых в природе видов: м.балтийской, м. изящной и м.городчатой. Первые две отнесены одними авторами, а последние две - другими авторами - к манжетке обыкновенной; для сравнения, в качестве устойчивого вида, не образующего агамный комплекс, использовали лапчатку прямостоячую. Для выделения сумарной ДНК использовали методику, предложенную Дж.Дрейпером (1989) и случайные праймеры П17 и П20. Перед этим нами экспериментально были подобраны: реакционная смесь (объем полимеразы, количество магния хлорида, число, количество и состав праймеров: режим ПЦР и количество циклов. Для'ТЖА Thermal Cycler""Perkin Elmer Cetus" (USA) был подобран следующий режим: денатурация 94° С - 2 мин } 94°С - 1 мин }

отжиг 25°С - 2 мин } 2 цикла и 55°С - 1 мин } 40 циклов элонгация 70° С - 2 мин } 72°С - 1 мин }

В качестве контроля ставили пробу без ДНК и пробу без праймера. Продукты реакции (около 10 мкл из реакционной смеси) разделяли электрофорезом в

2% агарозном геле в трис-боратном буфере и фотографировали на пленку 'Ми-крат" в проходящем УФ-свете после окрашивания бромистым этидием.

В результате нами было установлено, что ДНК лапчатки прямостоячей отличается от ДНК манжеток по следующим молекулярным признакам: при одинаковых условиях амплификации у манжетки стабильно амплифицируется набор фрагментов, отличающихся молекулярной массой. Реакция хорошо воспроизводится в стандартных условия в диапазоне концентраций ДНК от 10 до 20 нг.

Схема электрофоре граммы фрагментов, по лученных при КАРП-анализе с одним праймером П17 ! с двумя праймерами П17+ П;о

Мол.! Манжетка ! Лапчатка ! Манжетка ! Лапчатка вес ! городчатая прямостоячая городчатая прямостоячая

750 пн

500 пп

Рис. 1 Наборы ЯАРО-фрагментов при амплификации ДНК манжетки городчатой и лапчатки прямостоячей.

При введении второго праймера у лапчатки меняется подвижность ну клеи-тидов (рис. 1), а у манжетки появляется четвертая полоса пуклеотидов, Сравнение продуктов амплификации ДНК репешка европейского, азиатского, лапчаток прямой, гусиной, ползучей и манжеток выявило различие наборов нуклео-тидов, отличающихся молекулярным весом и различной подвижностью, что показало возможность использовать эти праймеры для идентификации родов рас-

тений семейства розоцветные и позволило предположить возможность дальнейшего использования этого метода для идентификации видов рода манжетка.

Далее брали небольшое количество хорошо определяемых видов из определённых мест обитаний: манжетка балтийская, собранная в Истринском районе и манжетка балтийская, собранная в парке ботанического сада ММА им. И.М. Сеченова. Для них выявлены значительные отличия, а именно, наличие у первой - набора из восьми фрагментов амплифицированной ДНК,а у второй - только из пяти, причем, нижние две полосы, имеющие длину около 500 нуклео-тидов,(определённую относительно маркёра ^.Hmd-lll) менее четкие. При этом манжетки, собранные в одном фитоценозе (Истринский район), изящная и горо-дчатая, хорошо различающиеся по внешним признакам, проявляли явное сходство наборов RAPD-фрагментов по шесть одинаковых полос. Эти виды объединены С.К.Черепановым (1981) в одну группу - манжетка обыкновенная.

Набор фрагментов, амплифицированных для манжетки полулунной, из этого же фитоценоза и не относящейся вообще к манжетке обыкновенной, также как для манжетки балтийской представлен пятью полосами, но они отличаются по длине. Манжетка Линдберга, также как и полулунная, не относящаяся к группе манжетка обыкновенная и собранная в Щёлковском районе, давала на электро-фореграмме четыре фрагмента, из них последний - четвёртый более короткий, соответствующий фрагменту маркёра Хны-Ш длиной менее 500 пн, характерен только для этого вида.

Таким образом, проведённый RAPD-анализ ДНК манжеток дал обнадёживающие результаты, показавшие возможность его использования для идентификации представителей сложных агамных комплексов.

На следующем этапе для определения генетической дистанции между видами манжетки, для исследования объектами служили апогамные виды Alche-milla vulgaris L.s.anwliss.. собранные в период цветения в Московской области -A.baltica (1 - Бот.сад ММА им И.М.Сеченова, II - Истринский район), A.gracilis, A.subcrenata, A.hirsuticaulis (I - Щёлковский район, II - Истринский район,

К- Казахстан, предгорья Алатау, ин гродуцирова мая в Бот.еаду ММА), А. рго-ргщиа, А.и>к1Ыг£!ста и А.$ет>1ипаш. Собранные листья замораживали и хранили при -20°С до выделения ДНК,

Для определения генетической дистанции между видами манжетки, необходимо было подобрать оптимальные условия проведения реакции амплификации (концентрацию полимеразы, М^СЬ, праймера. температурный режим и др ) а также подходящий прайм ер.

М 1 2 3 4 5

Рио. 2. Электрофореграмма в 2% агароэном геле И АР О- фрагментов ДНК А.ШзиЬсстИя с разными прай мерами (П) М - маркёр длины - перевар ДНК фага X рестриктазой Р&й. ] -П,; 2 - П;; 3 -П3:4 - П4; 5 - П4

Для амплификации использовали 10-ти членные олигоиуклеотщщые прай-

меры ПрП4 с произвольной последовательностью:

П, -5'- СТСАСССГСС-З', Пг- 5'- АСОСТАССАО-З

ш - 5ОАТСАСССгСС-ЗГЦ - 5 - АООСОООААС-ЗДля каждого праймера необходимо было подобрать оптимальные условия, при которых амплифика-

ция происходит эффективно и даёт воспроизводимые результаты. Последующее строгое соблюдение этих условий проведения реакции гарантировало надежность полученных результатов.

Для подбора праймера использовали следующие оптимальные условия: реакционная смесь объёмом 20 мкл содержала 1 ед. Taq полимер азы "Prome-ga", в буферном растворе, предлагаемом фирмой, по 100 мкМ dATP, dTTP. dCTP, dGTP, ImxM праймера, 4 mM MgCl2 и 10-20 нг ДНК. ДНК а нотифицировал и в течение 36 циклов в програмируемом термостате "Циклотемп" (СТМ, Москва) в режиме; денатурация - 1 мин 94°С. отжиг - 1 мин 37°С, элонгация -2 мин 72°С. Проду кты реакции (около 10 мкл из реакционной смеси) разделяли электрофорезом в 2%-ном агарозном геле в трис-боратном буфере и фотографировали на пленк>; "Микрат" в проходящем УФ-спете (305 нм) после окрашивания бромистым этидием.

Компьютерный ввод изображений и их обработка проведены с использованием видеоденситометра и програмных продуктов фирмы "ittr (USA). Построение фенограммы осуществлено невзвешенным парно-групповым методом с арифметическим усреднением (UP GM А) с использованием пакета программ "'Восторг" (ИЦИГРАН, Новосибирск).

Четыре имевшиеся в нашем распоряжении праймера П1 - ГЬ были предварительно проверены в реакции амплификации с A.hirsulicaulis (рис. 2). Уста-новлено,что все праймеры активны в реакции амплификации и служат затравкой для синтеза наборов специфических фрагментов ДНК. Количество и длина амплифицироваииых с каждого праймера фрагментов, как и следовало ожидать, неодинаковы, В последующих опытах был использован праймер П^, приводящий к RAPD-спектру с наибольшим количеством полос (рис. 2).

Для оптимизации условий реакции амидификациибыло исследовано вяияя-ние изменения температуры отжига праймера, концентрации MgCl3 и концентрации ДНК на набор продуктов реакции. Установлено, что результаты хорошо воспроизводятся в диапазоне температуры отжига от 30 до 37°С и копцент-

рации Г^СЬ 2,5 - 4,0 мМ, а также при разведении исходных растворов ДНК в отношениях от 1:10 до 1:100. Для последующих опытов были использованы разведения 1:50, что соответствует содержанию 10-20 иг ДНК в реакционной смеси.

1=1:11

» м

М 1 2 3 45М6789 10 10 М

Рис. 3. Электрофоре]рамма в 2% агарозном геле (Sigma) RAPD-фрагментов ДНК 1A.semilunaris, 2.-A.gracilis, 3,-A.baltica (J), 4,-A.bahica (П), 5,- A.subcrenata, 6.-A.propinqua, 7.-A.iindbergiana, 8,- A.hisuticaulis (1), 9 - A.hisuticaulis (K), A.hirsuiicaulis (П) с праймером FU M - маркер длины - перевар ДНК фага X рестриктаюй Pi/I.

Разделение амгогафицированных фрагментов ДНК апогамных в шов популяций Aichemilla при электрофорезе в агарозном геле (рис. 3), с последующим сканированием и математической обработкой полученных результатов с помощью компьтерных программ позволило установить, что исследуемые апогам-ные виды и популяции характеризуются специфическими RAPD-спектрами. Различия касаются как наличия/отсутствия полос одинакового размера у раз-

ных видов, так и изменения относительной интенсивности некоторых полое. На рисунке 4 показано присутствие амплифицированных фрагментов ДНК с указанием их размеров, а в таблице 1 - матрица состояний бинарного признака наличия/отсутствия (1/0) полос с одинаковой электрофоретической подвижностью в КАР О - спектрах изученных растений. Минорные полосы слабо выявляющиеся на электрофореграммах рассматривались как отсутствующие, и им приписывалось значение 0,

123*56709 10 пн

Рис. 4. Распределение амплифицированных фрагментов ДМК разной молекулярной массы у исследованных видов манжетки (обозначения см. рис. 3).

По этим данным рассчитана матрица различий между видами и популяциями манжетки, по которой построена фенограмма (рис. 5). Полученные данные свидетельствуют,что как апогамные А,vulgaris L Ampliss., так и популяции одного вида различаются по RAPD-спектрам, при этом диапазоны уровней сходства между популяциями и видами могут перекрываться.

Обращает внимание, что две популяции Аhirsuticaulis из Московской области гораздо более сходны между собой, чем с популяцией того же вида из Казахстана. Какого-либо соответствия характера кластеризации на фенограмме со

схемами таксономии Alchemilla В.Ротмалера (1936) и C.B. Юзепчука (1941) не прослеживается.

Таким образом, полученные данные результов RAPD - анализа свидетельствуют об отсутствии различий уровней внутри- и межвидовой генотипической изменчивости в группе A.vulgarís.Определение степени изменчивости подмосковных видов рода манжетка показало, что из всех видов только A.gracilis и A.baldea ведут себя как монофилетические групппы, A.glaucescens и A.hirsuti-caulis вместе также образуют монофилетическую группу. Все остальные виды не проявляют себя как монофилетические.

Таблица 1. Матрица различий количества полос с одинаковой электрофоре-тической подвижностью в RAPD- спектрах манжеток

123456789 10

1. A. semilimaris 0

2. A. gracilis 6

3. A. bal tica (I) 4

4. A. báltica (И) 5

5. A. subcrenata 7

6. A. propinqua 6

7. A. lindbergiana 9

8. A. hirsuticaulis (I) 4

9. A. hirsuticaulis (К) 7

10.A. hirsuticaulis (II) 7

645769477 025965437 205745437 55045 10 382 97407 10 5 10 4 645707657 5 5 10 10 7 0 9 4 12 4 4. 3569073 338 10 5470 10 77247 12 3 10 0

A.glaucescem, A.hirsuticaulis, A.monticola и A.sarmatica вместе образуют монофилетическую группу. Все четыре вида относятся к секции Plicatae, согласно S. Fróhner (1990), но noV. Rothmaler (1936) они принадлежат, соответственно, к двум подсекциям. Образцы A.semilinaris образуют монофилетическую линию, а все образцы A. subcrenata объединяются вместе и близки к образцам секции Plicatae. A.acutiloba и A.gracilis перемешаны друг с другом, но по-видимому, вместе образуют монофилетическую группу. Положение A.glabricaulis a A. baltica неопределённо. A.gracilis, по-видимому, образует отдельную ветвь. Все ос-

тальные виды расположены вперемешку друг с другом и не могут считаться монофилетическими.

Расшифровка радиограмм и электрофореграмм, компьтерная математическая обработка полученных результатов анализа показала отсутствие в изучаемых популяциях манжетки предковых видов и невозможность построения из этих видов филогенетического дерева, хотя некоторые наборы RAPD-фрагментов были похожи для нескольких видов, особенно взятых из одного фитоценоза,

A. lindbergiana -"

A. hirsuticaulls (К) ————

A. gracilis ______

A. baltica (I) -

A. propinqua 1

A. semilunaris '

A. subcrenata ——————^

A. hirsutlcaulis (I) -

A. baltica (II) ___'

A. hirsuticaulis (II) —-—

-1-1-1-1-1-1-1- d, %

5 10 15 20 25 30 35

Рис. 5. Фенограмма сходства RAPD-спекгров ДНК видов

Рода Alchemilla, построенная методом UPGMA по данным матрицы в таблице 1; d -процент различий

что может говорить о их гибридогенном происхождении. Величина внутривидовой и внутрипопуляционной изменчивости оказалась очень высокой.

Таким образом, применение геномного анализа позволило характеризовать геномы видов манжеток, преимущественно как гибридные, что дает возможность рекомендовать для сбора траву всех видов манжеток, как близкородственных и обладающих близким биосинтезом БАВ, что дает возможность прогнозировать идентичный состав биологически активных веществ.

Применение RAPD - анализа для идентификации лекарственного растительного сырья.

Для изучения лекарственного растительного сырья с помощью молекулярно-

биологических методов прежде всего необходимо было адаптировать методику выделения ДНК из сухого сырья и подобрать условия амплификации.

Наилучшими оказались следующие условия проведения реакции амплификации для термоцикл ера фирмы Регкт Е1тег-СеШ5 1пз(ттеп1з: - денатурация - 94 °С - 1 мин; отжиг - 36° С - 1мин: синтез - 72°С -I мин. (* В последнем цикле эта стадия длится 3 мин). При сравнении результатов ампли-

Рис. 6. Электрофореграмма амплификатов ДНК свежих и высушенных листьев двух видов дуба-0иегст с праймером З'-СООССССТОТо'

1-молекулярный маркер; 2-контрольный опыт;

3-фрагменты ДНК свежих листьев дуба черегпчатого;

4-фрагменты ДНК высушенных листьев дуба черешчатого;

5-фрагменты ДНК высушенных листьев дуба красного

фикации установлено, что ЯДРО-набор ДНК свежего и высушенного сырья отличается по количеству и расположению фрагментов, вследствие деградации ДНК при сушке (ряс. 6). Разделение и обнаружение фрагментов ДНК, полученных в результате реакции амплификации, проводили методом электрофореза в 2 % геле агарозы. Выделение и амплификацию ДНК из сухого сырья: цветков с листьями боярышника кроваво-красного и боярышника кавказского, травы череды трехраздельной и череды поникшей, а также цветков иван-чая узколист-

кого (розовой формы и белой), травы горца почечуйного (растущих рядом зелёной и красной) проводили по модифицированной нами методике. Результат разделения представлен на рисунке 7.

М 1 2345678М

Рис. 7. Электрофореграмма в 2% агарозном геле (Sigma) проектов RAPD ДНК растительного сырья:

1- боярышника крововокрясного - Crataegus sanguínea Fall,),

2- боярышника кавказского - Crataegus caucasica C.Koch. Cratz.etKíesp.

3- череды трбхраздельноЙ - Bielens tripartitas L.

4- череды поникшей - Bidens се пиша L.

5- иван-чая узколистного - Chamaenerium angustifolium (L.) Scop.

6- иван-чая узколистного - Ch. angustifolium var. albißorum Hausskn.

1- горца почечуйного (красного)- Po ¡ygo пит persicaria L.

8- горца почечуйного (зеленого)- Polygonum persicaria L.

M - маркер длины (перевар ДНК фага X рестриктазой Psd)

lía полученных электрофоре граммах, (рис, 7) четко видны различия наборов RAPD-фрагментов боярышников и обоих видов череды; а RAPD-спекгры ДНК иван-чая розового и белого оказались идентичными, что говорит о их генетической равноценности. Также похожи RAPD-сиектры ДНК двух рас горца почечуйного.

1 2 3 4 5 6 7 ttoM

2.0 -

1000 -пн

750 -

600

3- w •» -

Рис. 8. Электрофореграмма в 2% агарозном геле продуктов RAPD ДНК

лекарственного растительного сырья, листьев:!- монарды двойчатой - Monarda didyma L, 2- мяты Перечной- Mentha piperita L\

травы: 3- чабреца- Thymus serpillum L.), 4- мелиссы-Melissa officinalis L.\ цветков 5-манжетки обыкновенной —AlchemiUa vulgaris L., 6-таволги вязолис-тной- Filipéndula и ¡mari a Max.), 7-розы морпшнистой - Rosa ivgosa Thunb, mM- маркер длины.

При изучении RAPD-спектров ДНК, выделенной из разных видов сухого сырья: цветков, листьев и травы растений, относящихся к разным семействам: Lamiaceae и Ros асе ае: листья монарды, листья мяты перечной, трава чабреца, трава мелиссы; цветки манжетки, цветки таволги, лепестки шиповника на элек-трофореграмме наблюдались дискретные полосы, выявляющие межвидовые различия - фрагменты ДНК отличающиеся подвижностью (размерами) и их ко-

Таблица 2. Этапы методики выделения и амплификации

Этап Сущность методики Теоретическое обоснование

1. Профподготовка измельчение до порошка (менее 0,5мм)

2.Экстрак-ция СТАВ буфером (70°С) + меркаптоэтанол —> пробирку встряхивают, инкубируют при Т= 70°С и центрифу гируют =>огбирают жидкую фазу Меркаптоэтанол добавляют для инактивации ферментов.

З.Очистка Жидкая фаза + смесь хлороформ: изоамиловый спирт (24:1) —> встряхивают —> центрифугируют => осадок денатурированных белков и Осаждение белка

4.Выделение ДНК жидкость над осадком + изопропанол 4 перемешивают стекл.капил -ляром => аморфный студнеобразный осадок ДНК и полисахарвдов. Далее ДНК «наматывают» на капилляр погружают в пробирку с 96% этанолом —» погружают в пробирку с водой до растворения ДНК. изопропанол добавляют для осаждения ДНК 96% этанол необходим для удаления полисахаридов, т.к. полисахариды осаждаюся в спирте, а ДНК растворяется в воде.

5. Реакция амплификации ДНК+ праймеры -(-буферный раствор Тпв-НСП-дезоксинуклеозидтрифосфаты + МдС12 + Taq-пoлимepaзa —»термоцикл ер—^разделение электрофорезом => окрашенные фрагменты ДНК.

личеством (рис. 8). Проведённые нами исследования показали возможность применения данного метода для идентификации сырья лекарственных растений. Нами разработаны оптимальные методики для ЛАРО-анализа сырья 17 растений, 14-ти родов, относящихся к 7 семействам, охарактеризованы и документированы их ЯАРО-спектры.

Применение секвенирования для изучения лекарственных растений и лекарственного растительного сырья

Применение секвенирования ДНК на примере филогенетического анализа рода ЛшИуНа Ь„ также показало перспективность его использования для изучения лекарственных растений медицины. Установлено, что род /ЬиИуИь Ь., про-

[7о

52

Ч»

Anthyllis cybsohfas 100

Anthylhs temiflora

Anthylhs ramburai

Anthylhs te/e<iensis

E Anthylhs (ayascana Ю

An thy I Us hermartnte»

—|э5

Anthyllis barb/) Jovi* Anthyllis comtcina Anthylhs totoides Anthyllis hamosa Anthyllis clrcmnaM Anthylhs vulnerana CyOnopms psvuikjcyltsus Lotus tetragonotobua Antop&hha abyasinlca Scorpiurus muficatus Hippocrepis emerus Psaudukitus vilkjsus

- PotMntua hi-).%stckloH#s » Om/thopus compressor

• Hosackia pinnata

- Dorycnopsis abysslnica

• Ottfeya irtaltensJs ■ Coronilia vimlnaus . Sesbania sesban

Рис. 9. Филогенетическое дерево, построенное методом NJ по участку ITS 1-2.

являет себя как монофилетическая группа с высокими уровнями поддержки при анализе как ядерных,так и хлоропластных маркеров. Изолированное положение на филогенетическом дереве вида Anthylis vulneraria ¿..(рис. 9) характеризуется рядом уникальных морфологических особенностей, как отдельный подрод, что подтверждается данными об инделях: вставках из 6 п.н (АТААСА) на участке petB-petD. Эти молекулярные маркеры (индели) также могут быть рекомендованы для идентификации лекарственного растительного сырья молекулярно-филогенетическими методами.

Изучение состава БАВ травы манжетки.

Нами было проведено изучение полифенольного комплекса: флавоноидов, фенолкарбоновых кислот, танинов и аминокислотного состава видов рода А1-chemilla ¿.Предварительное сравнительное изучение химического состава манжеток: остролопастной,балтийской,изящной, собранных в Истринском и Одинцовском районах Московской области показало сходство состава биологически активных веществ на основании изучения различных видов хроматограмм.

1 - галловая кислота; 2 - хлорогеновая кислота; 3 - кофейная кислота; 4 - рутин; 5 - коричная кислота; 6 - гиперозид; 7 - кверцетин

Далее исследование водных извлечений проводили с помощью метода ВЭЖХ. В водном извлечении были идентифицированы фенолкарбоновые кислоты: галловая, хлорогеновая, кофейная, коричная; флавоноиды - рутин, кверцетин, гиперозид (табл.3).

Таким образом, в результате сравнительного химического изучения разных видов манжетки, собранных в нескольких районах Московской и на севере Тульской области, нами было установлено сходство химического состава поли-фенольного комплекса этих видов.

Таблица 3. Содержание полифенолов в траве некоторых видов АШктШа Ь.

Вид манжетки Кислоты Флавоноид ы

галловая, % хлороге новая, % кофей ная, % корична я,% рути н % гипероз ВД % квер- цетин, %

A. gracilis 9,5 7,2 6,3 2,2 28,7 14,2 7,8

A. gracilis 8,5 6,9 6,2 7,2 28,0 11,9 7,6

A.baltica 11,2 3,7 6,9 5,6 39,4 10,5 7,0

A.hirsuti-caulis 6,5 10,8 8,2 5,1 35,8 29,0 3,5

A.conglo-bata 10,1 6,9 6,2 4,6 32,3 19,3 5,5

A. gracilis 10,3 7,8 6,6 2,9 32,2 15,3 7,6

Для изучения состава полифенольного комплекса фракционировали ацетоновое извлечение травы манжетки, в одной из фракций нами был идентифицирован олигомерный галлотанин - агримониин сравнением его спектра со спектрами известных образцов с помощью УФ, 'Н ЯМР, 13С ЯМР и ПМР анализа.

Рис.11. ВЭЖХроматограмма водного извлечения (1) и агримониина (2)

Время удерживания агримониина 27 минут (рис.10), а его УФ-спектр поглощения имеет максимумы при 220 и 280 нм.

В водном извлечении травы манжетки с использованием метода ВЭЖХ установлено наличие агримониина в составе его полифенольного комплекса (рис. 11).

Изучение аминокислотного состава (свободных аминокислот).

Изучение аминокислотного состава трех видов рода манжетка: показало его сходство (табл. 4). Из 18-ти обнаруженых аминокислот в водном извлечении преобладают пролин и оксшшзин (0,45 мг/мл и 0,13 мг/мл соответственно). Обладая высокой биодоступностью, они обуславливают, наряду с другими БАВ (полифенолы, макро- и микроэлементы) травы манжетки широту спектра фар-

30

макологической активности её препаратов и, наряду с другими, могут служить маркерами при идентификации сырья.

Таблица 4. Содержание свободных аминокислот в траве некоторых видов Alchemilla vulgaris L.

Аминокислота Содержание свободных аминокислот, в мг гга 1мл

м.изящная м. балтийская м.городчатая

Аспаргиновая кислота+ аспарпш 0.04 0.04 0.04

Треонин 0.06 0.06 0.06

Серин 0.07 0.07 0.07

Глутаминовая кислота+ Глутамин 0.09 0.09 0.09

Пролнн 0.45 0.45 0.45

Глицш 0.01 0.01 0.01

Алании 0.05 0.05 0.05

Цистин 0.02 0.02 0.02

Валин 0.06 0.06 0.06

Метионин 0.00 0.00 0.00

Изолейцин 0.04 0.04 0.04

Лейцин 0.03 0.03 0.03

Тирозин 0.01 0.01 0.01

Фенилаланин 0.03 0.03 0.03

Окснлшнн 0.13 0.13 0.13

Лизин 0.01 0.01 0.01

Гистидин 0.01 0.01 0.01

Аргинин 0.01 0.01 0.01

Сумма 1.14 1.14 1.14

Эти и данные полученные с помощью RAPD-анализа позволили нам рекомендовать к медицинскому применению, траву всех изученных видов рода Alchemilla L., - и рассматривать эти виды как производящие сырье - трава манжетки.

Стандартизация травы манжетки.

Для введения в медицинскую практику травы манжетки, как лекарственного сырья для получения лекарственных средств, нами проведены исследования по стандартизации, касающиеся формирования научного названия сырья от многочисленных видов манжетки, условий заготовки, показателей качества и условий хранения.

Научное название сырья трава манжетки - herba Alchemillae было сформировано нами без видовых эпитетов в связи с установленной равноценностью 13-ти видов манжетки. В качестве производящих растений указываются: манжетка голостебельная - Alchemilla glabricaulus Lindb.fil., манжетка остролопастная -Alchemilla acutiloba Opiz., манжетка балтийская - Alchemilla baltica G. Sam.ex Juz., манжетка шерстистая - Alchemilla hirsuticaulus Lindb.fil., манжетка близкая - Alchemilla propinqua Lindb.fil..манжетка горная - Alchemilla montícola Opiz., манжетка семиугольная - Alchemilla heptágono Juz., манжетка изящная - Aichemi la gracilis Opiz., манжетка городчатая - Alchemilla subcrenata Buser., манжетка сарматская - Alchemilla sarmatica Juz.,манжетка полулунная - Alchemilla semilunaris Alech., манжетка волнистолистная - Alchemilla cymatophyllaJuz., манжетка шаровидно-скрученная -Alchemilla conglobata Lindb.fil (AJuzepzukii Alech.). Всё многообразие рекомендуемых видов относится к семейству розоцветные -Rosaceae.

Для разработки характеристик подлинности сырья проведены исследования по сравнительному изучению морфолош-анатомическош строения вышеуказанных видов для выявления диагностических признаков с использованием традиционных фармакопейных методик.

Проведенное сравнительное изучение травы различных видов манжетки позволило выявить значительную вариабельность внешних признаков и опреде-

32

лить устойчивые диагностические признаки, позволяющие устанавливать подлинность цельного сырья, которые приведены в таблице 5.

Таблица 5. Диагностические признаки травы манжетки

№ п/п Диагностический признак Характеристика признака

СТЕБЕЛЬ

1 Форма Округлый

2 характер поверхности Опушенный

3 характер ветвления Разветвленный

4 Размеры длина диаметр до 10 см до 4 мм

5 Цвет светло-зеленый

ЛИСТЬЯ

1 Листорасположение очередное

2 форма листовой пластинки округло-почковидная и веерообразная

3 Размеры длина ширина до 6 см до 4 см

4 наличие черешка стеблевые у розеточных - сидячие - длиной до 5 см

5 строение листа простые, лопастные

6 Жилкование пальчатонервное

7 Край зубчатый

8 Опушение верхней стороны листа с нижней стороны малоопушенная более опушенная

9 Цвет верхней стороны нижней стороны зеленый светло-зеленый

ЦВЕТКИ

1 тип соцветия дихазиальное, клубочковидное

2 строение цветка строение околоцветника актиноморфный простой 4-х - мерный, чашечковидный с подчашием

3 Цвет желто-зеленые

Запах сырья Слабый

Вкус сырья Горьковатый

Особенности анатомического строения: стебля, листа, черешка и чашелистиков (табл.6), опушение, строение клеток-идиобластов с друзами (характерные для всех видов агамного комплекса Alchemilla vulgaris L.\ могут, служить диагностическими признаками подлинности цельного и измельченош сырья.

Таблица 6. Сравнительная характеристика микроскопических диагностических признаков травы манжетки отдельных видов

Диагностический признак A.gracilis A.baltica A.semilunaris A.hisuticaulis

1. кольцевое располо-

жение тканей стебля + + + +

2. аномоцитный

устьичный комплекс + + + +

3. волоски простые + + + +

4. друзы + + + +

5. три концентрических

сосудисто-волокнистых

пучка в черешках + + + +

Результаты изучения химического состава позволили выявить маркеры биологически активных веществ травы манжетки и использовать их при проведении качественных реакций и хроматографических проб: рутин, кверцетин, ги-перозид, галловая, кофейная, хлорогеновая кислоты, агримониин, пролин и оксилизин.

Экспериментально подобранные нами условия к пробоподготовке для ИАРБ -анализа позволяют проводить идентификацию цельного и высокой степени измельчения, как свежего так и высушенного сырья, соответственно характеризующегося набором из шести-восьми фрагментов амплифицированной ДНК, причем, нижние две полосы, имеют длину менее 500 пар нуклеотидов, (определённую относительно маркёра Хнт(Г111).

Числовые показатели для цельного и измельченного сырья, а также для порошка из него: сумма флавоноидов в пересчёте на рутин, влажность, зола общая, зола, нерастворимой в 10% растворе хлористоводородной кислоты, пожел-

34

тевшие и блёклые листья; черешки листьев и цветоносы длиннее 10 см, органическая примесь, минеральная примесь, характеризующие качество сырья, определены нами экспериментально и установлены их нормы (табл. 7) Таблица 7. Данные анализа цельного сырья - трава манжетки.

№ образца сумма флавоно адов в пересчет е на рутин,% влажное ть, % зола общая, % зола,нер аств. в 10% НС1,% пожелте вших листьев, % черешко в, стеблей длиннее 10 см,% органич. примеси ,% минерал примеси ,%

1 4,23 ±0,0 5 8,36±0,0 2 13,71±0,0 3 1,53±0,0 3 3,23±0,0 3 5,35±0,0 5 0,62±0,0 3 0,21 ±0,0 1

2 4,35±0,0 5 11,75±0, 01 17,82±0,0 2 1,71 ±0,0 3 1,52±0,0 5 1,57±0,0 3 0,15±0,0 1 0,83±0,0 2

3 4,57±0,0 3 7,67 ±0,0 5 19,53±0,0 5 1,82±0,0 5 4,85±0,0 5 6,77±0,0 5 0,72±0,0 3 0,39±0,0 1

4 3,75±0,0 5 11,38±0, 02 18,45±0,0 5 1,55±0,0 2 4,26±0,0 1 3,48±0,0 2 0,66±0,0 4 0,95±0,0 5

5 3,98±0,0 2 9,83±0,0 2 15,98±0,0 2 1,98±0,0 3 3,88 ±0,02 9,75±0,0 3 0,86±0,0 2 0,67±0,0 3

6 2,75±0,1 5 10,52±0, 03 17,95±0,0 5 1,91±0,0 2 2,57±0,0 3 4,55±0,0 5 1,97±0,0 1 0,72±0,0 3

7 2,52±0,0 3 7Д8±0,0 2 16,78±0,0 2 1,35±0,0 5 0,45±0,0 3 2,47±0,0 3 0,58±0,0 2 0,35±0,0 2

Нор мы соде ржа ния не менее 2,5 не более 12,0 не более 20,0 не более 2,0 не более 5,0 не более 10,0 не более 2,0 не более 1,0

Количественное определение суммы флавоноидов в пересчете на рутин позволило установить числовой показатель содержание биологически активных веществ и проведено по адаптированным нами фармакопейным спектрофото-метрическим методикам. Ошибка метода составила ±5,16%.

Валидационной проверке подвергались методики качественного и количественного определения биологически активных веществ: полифенолов, флавоноидов и агримонхшна квалификационные исследования заключались в оценке их воспроизводимости и устойчивости стандартных растворов, подверженных линейной зависимости аналитического сигнала от концентрации определяемого

вещества, достигаемой чувствительности определения, расчете метрологических характеристик и выявлению систематических погрешностей анализа. Результаты валидации показали высокую чувствительность определения (до 0,005 %) и строгость линейных зависимостей аналитических сигналов от содержания флавоноидов (коэффициенты корреляции составили 0,998), что определяет высокую точность анализа. Это выражается в хорошей воспроизводимости результатов, а также в статистически доказанной правильности определения. Сделанные выводы дают возможность считать разработанную методику пригодной для достоверного количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин для травы манжетки.

При разработке системы мероприятий, способствующих сохранению качества сырья, необходимо учитывать динамику содержания БАВ, в процессе хранения. Так как в траве манжетки флавоноиды относятся к одной из главных групп действующих веществ, обуславливающих основные фармакологические эффекты, проводили изучение стабильности содержания суммы флавоноидов в траве манжетки, заложенной на хранение в 1992 году в сухом, защищенном от света месте. Проведенное исследование показало, что со временем (по истечении двух лет хранения) этот показатель значительно уменьшается.

Результаты спектрофотометрического определения содержания суммы флавоноидов в пересчете на рутин представлены в таблице 8.

Таблица 8. Содержание суммы флавоноидов в траве манжетки _в зависимости от сроков хранения_

Дата сбора| Содержание суммы флавоноидов, Дата анализа

_в пересчете на рутин, %_

1996 2,85±0,15

1995 2,78±0,25

1994 2,43±0,18 } июнь 1997

1993 1,78±0,28

1992 1,75±0,33

Стабильность всех показателей качества сохраняется в течение двух лет.

Таким образом, трава манжетки должна храниться по общему списку в защищенном от света, хорошо проветриваемом помещении не более двух лет.

Данные полученные нами при изучении стандартизации легли в основу проекта Фармакопейной статьи трава манжетки - herba Alchemillae.

Изучение некоторых ресурсных характеристик манжетки обыкновенной

Ресурсоведческое изучение было направлено на определение урожайности, сроков восстановления заросли и рациональных приемов заготовки травы манжетки.

В результате изучения природных популяций манжетки установлено, что манжетка входит в ценокомплекс в составе злаково-манжетково-разнотравной ассоциации; разнотравье представлено следующими видами: купырь лесной -Anthriscus silvestris (L) Hoffm, дудник .iccnoii-Angelica sylvestris L., хвощ лесной - Equisetum sylvaticum L., вербейник монетчатый -Lysimachia nummularia L., герань лесная - Geranium sylvaticum L„ лапчатка прямостоячая - Potentilla erecta (L.) Raeusch., вероника дубравная-Veronica chamaedrys L.,горошек заборный -Vicia sepium L.,зверобой пятнистый - Hypericum quadrangulum L.,и др.

Для изученных популяций характерно доминирование A.gracilis (до 70%), A.baltica (15%), A.subcrenata (10%) и все остальные виды составляют менее 5%. Определено, что проективное покрытие в среднем охватывает 70±15% учетной площадки; одно растение дает 20-35 грамм свежего сырья, занимая площадь от 0,25 до 0,50 м2; коэффициент усушки - составил 25%. В результате расчетов определено, что 1% проективного покрытия даёт 0,9±0,1 грамм сухого сырья при ежегодной заготовке сырья с соблюдением ресурсосберегающих требований.

Расчеты среднего выхода сырья с одного квадратного метра проводили в течение пяти лег. Они составили: 56,32±5,87г (2001 г), 45,46±3,45г (2002г), 65,67±8,35г (2003г), 35,52±4,57г (2004г); 72,26±9,06 г (2005г).

Проанализировав полученные данные, установили, что урожайность травы манжетки находится в зависимости от погодных факторов вегетационного периода, при этом выход сухого сырья травы манжетки может составлять в среднем до 5,5±0,5 ц/га.

\ .ггас.;!;'.

Рис. 12, Диаграмма соотношения видов А1сИепи1р в популяции

Комплексное изучение биологии и химического состава травы манжетки позволило разработать критерии оценки подлинности и качества этого ценного сырья, а также разработать систему мероприятий по рациональному использованию природных ресурсов А1сИетШа ¿..у?.Последняя включает описание производящих растений, позволяющее определять их в природе; и проводить выявление зарослей, пригодных для сбора сырья; даны рекомендации по условиям сбора, сушки и хранения сырья, а также режим эксплуатации зарослей.

Определение острой токсичности и специфической активности

При введении в научную медицину нового вида лекарственного сырья для разработки инструкции по его применению необходимо определить острую токсичность и специфическую активность. Определение острой токсичности травы манжетки показало, что настой относится к препаратам пятой категории токсичности. В результате наблюдений не было обнаружено ни гибели животных, ни токсических проявлений, вызванных настоем травы манжетки.

Контрольные и опытные животные не обнаруживали видимых различий по показателям общего состояния, реакциям на внешние раздражители, базальной температуры, вегетативным проявлениям, двигательной активности, частоте и ритму сердечных сокращений и дыхательных движений, количеству потребляемой воды, кормов, диурезу и др. Максимально переносимая доза настоя МПД = 1Л)|0.

Анализ литературных данных по изучению фармакологической активности препаратов из травы манжетки пока-зал наличие гипогликемической, лимфо-тропной, противовоспалительной и др. активности [Зорина, 2009; Андреева, 2001].

Нами было проведено изучение противоопухолевой и антиметастатической активности. Установлено, что настой травы манжетки обладает антиметастатическим действием (ТРМ более 25%) при раннем начале лечения (на модели опухоли карциномы Льюис), при этом настой обладает способностью ингиби-

Таблица 9. Влияние настоя травы манжетки на процесс метастазирования

Группа мышей Средняя масса легких в мг ТРМ%

1 392,5±110,1 28

2 370,0±79,2 32

3 467,7±66,3 14

4 контроль 541,7±127,2 -

ровать процесс рецидивирования опухоли у животных. При пероральном введении настоя травы манжетки мышам в дозе 7,0 мг/кг способствует снижению метастазирования саркомы 37 на 29%. По предварительным данным настой травы манжетки в дозе 13,7 мг/кг per os значительно увеличивает среднюю продолжительность жизни мышей с саркомой-37 в сравнении с контролем. Определена перспективность его применения при комбинированной терапии.

Проведенные исследования позволили разработать научно обоснованные методические подходы (алгоритм) для изучения лекарственных растений Флоры России, обладающих сложной таксономией и аберратными формами размножения, образующих агамные комплексы и др. позволяющий наиболее полно изучать и эффективно внедрять их в научную медицину.

Научно обоснованная схема изучения лекарственных растений должна содержать следующие этапы:

- выявление лекарственного растения наиболее часто применяемого в традиционной медицине для лечения определенного вида патологий; и определение всего многообразия производящих видов для заготовки сырья;

- изучение жизненного цикла растения и возможности введения его в культуру;

- изучение природной сырьевой базы;

- выявление биологически активных веществ, определяющих фармакологическую активность лекарственного сырья;

- определение показателей подлинности и качества сырья;

- разработка нормативных документов на сырье;

- изучение биологической активности;

- клинические испытания и представлена на схеме 1.

На основании этого алгоритма были проведены исследования для разработки нормативных документов.

Схема 1. Алгоритм изучения лекарственных растений.

В результате изучения особенностей биологии лекарственных растений бы-ло установлено, что для идентификации видов, обладающих аберратными фор- мами размножения необходимо использовать молекулярно-биологические ме-тоды анализа. Они позволяют четко очертить круг видов, относящихся к растениям, производящим сырье, а также определить его подлинность в препаратах из него высокой степени измельчения.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. С помощью RAPD-анализа на примере 12 видов рода манжетка проведено изучение геномов перспективных лекарственных растений, что позволило подойти к решению проблемы внутривидовой и популяционноЙ изменчивости, определить характер изменчивости в популяциях рода и установить генетическую дистанцию между видами рода и гибридность их происхождения.

2. Разработаны методические подходы к использованию RAPD-анализа для идентификации лекарственного растительного сырья свежего и высушенного: разработаны оптимальные условия выделения ДНК и проведения реакции амплификации. Показана возможность применения RAPD-анализа для видоиден-тификации лекарственного растительного сырья на примере 17 видов сырья растений, относящихся к родам: Rosa, Potentilla, Agrimonia, Alchemilla, Crataegus, Filipéndula, Quercus, Monarda, Thymus, Mentha, Melissa, Polygonum, Cha-maenerium, Bidens 7-ми семейств.

3. Установлена возможность использования секвенирования ДНК перспективных лекарственных растений на основании изучения результатов секвенирования ДНК видов рода Anthylis L., и проведен филогенетический анализ. Установлено изолированное положение Anthylis vulneraria L., характеризуемого рядом уникальных морфологических особенностей, как отдельный подрод, что подтвердилось наличием вставки из 6 п.н (АТААСА). Определены молекуляр-

ные маркеры, которые могут быть рекомендованы для изучения лекарственных растений.

4. Изучена взаимосвязь между вариабильностью химического состава БАВ, полифенолов и аминокислот, и величиной внутривидовой и внутрипопуляцион-ной изменчивости на основе 11АР1>спектров видов рода манжетка. В качестве химических маркеров выявлены рутин, гиперозид, галловая и кофейная кислоты, агримониин, пролин и оксилизин.

5. В результате хроматографического изучения полифенольного и аминокислотного состава травы манжетки от разных производящих видов установлено его сходство, что позволило дать чёткие рекомендации по сбору сырья.

6. Разработаны критерии оценки подлинности и качества сырья - трава манжетки, как перспективного лекарственного сырья для отчественной медицины. Установлены их нормы для цельного, резанного и порошкованного сырья. Эти данные вошли в проекты Фармакопейной статьи и Инструкции по сбору и сушке.

7. Определены ресурсные характеристики манжетки обыкновенной, урожайность и приемы рациональной заготовки сырья. При соблюдении ресурсосберегающих условий урожайность составляет до 5,5±0,5 ц/га.

8. На основании изучения безопасности и эффективности травы манжетки, острой и специфической активности настой травы манжетки охарактеризован как препарат пятой категории токсичности. На модели опухоли карциномы легкого Льюис выявлена определенная антиметастатическая активность настоя травы манжетки (ТРМ более 25%), также установлена способность ингибировать процесс рецидивирования опухоли у лабораторных мышей.

9. В результате проведенного фармакогностического изучения перспективных лекарственных растений с использованием молекулярно-биологических методов обобщенны экспериментальные данные и дано теоретическое обоснование необходимости и возможности их применения при комплексном изучении перспективных лекарственных растений.

10. Разработан алгоритм изучения сложных в таксономическом отношении видов и родов этих растений в том числе и обладающих аберратными формами размножения.

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

1. Баева В.М. Динамика накопления дубильных веществ цветков иван-чая узколистного по фазам онтогенеза.-Деп.во ВНИИМИ, МРЖ, № 6, 1986, раздел ХХП, публ. 1051.

2. Баева В.М., Барабанов Е.И., Бабаскин B.C., Воробьёва Т.И. Биоморфологический анализ некоторых видов лекарственных растений. Сборник научных трудов «Актуальные проблемы современной фармации» 1ММИ им. И.М. Сеченова, МЗ СССР, М, 1986.- С. 116-119.

3. Баева В.М., Барабанов Е.И. Микроэлементный состав иван-чая узколистного и препарата "Ханерол" // Фармация, 1994, № 6.-С.4-6.

4. Баева В.М., Павкин A.B. Морфолого-анатомические особенности строения представителей рода манжетка II Сб."Актуальные вопросы медицины"-Материалы Всероссийской студенческой конференции, посвященной 50-летию АМН России, 4-6 октября 1994.М., 1994. - С.60.

5. Баева В.М., Сасов С.А. Сравнительное изучение химического состава представителей рода манжетка // "Современные аспекты изучения лекарственных растений". - Научные труды, т. ХХХ1У, М,- 1995,- С.242-244.

6. Баева В.М., Боброва В.К. Сравнительное изучение геномов представителей рода манжетка // Материалы докладов Российской национальной конференции "Формирование приорететов лекарственной политики".М., 1995 28-29 июня. -С.165-166.

7. Баева В.М., Боброва В.К. Геномный анализ рода манжетка // Тезисы докладов Первого международного симпозиума "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования" (1-5 августа 1995 г) Пущино- 1995,- С .24-25.

8. Баева В.М. Изучение манжеток ботанического сада ММА им. И.М.Сеченова // "Лекарственные растения ботанического сада" - Материалы тезисов научной конференции, посвященной 50-летию ботанического сада ММА им. И.М.Сеченова.- М., 1996. - С.40.

9. Баева В.М., Боброва B.K. RAPD - перспективный анализ для изучения лекарственных растений // Научные труды: «Фармацевтическая наука и практика в новых социально-экономических условиях», т. ХХХ1У, часть П. М., 1997.-С.174-177.

10. Баева В.М., Володин Ю.Ю., Толкачёв В.Н. Спектрофотометрическое определение суммы флавоноидов манжетки // Международный конгресс по аналитической химии 15-21 июня 1997 г. Тесизы докладов, М., 1997. - Россия. Абстракт, № 2. - С.46.

11. Баева В.М., Боброва В.К., Троицкий A.B., Антонов A.C. RAPD-анализ ДНК рода манжетка // Фармация, 1998 № 2,- С.38-41.

12. Баева В.М. Перпективы применения геномного анализа для изучения лекарственных растений // У Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». Тезисы докладов. М., 21-25 апреля 1998 г. - С. 345.

13. Баева В.М., Глазунова К.П. Применение пыльцевого анализа для определения качества лекарственного растительного сырья // У Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». Тезисы докладов. М., 21-25 апреля 1998 г.- С.346.

14. Баева В.М., Глазунова К.П. Манжетка обыкновенная -перспективное лекарственное растение // У Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». Тезисы докладов. М., 21-25 апреля 1998. - С.358.

15. Баева В.М., Сасов С.А. Флавоноидный состав цветков иван-чая узколистного // У Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» Тезисы докладов, М., 21-25 апреля 1998,- С. 358-359.

16. Баева В.М. Микроэлементный состав травы манжетки // Материалы научно-практической конференции «Традиционные методы лечения - основные направления и перспективы развития». МЗ РФ. М., 14-16 мая 1998. - С.109.

45

17. Баева В.М., Глазунова К.П. Применение пыльцевого анализа для определения загрязнённости лекарственного растительного сырья // Сб. «Фармацевтическая наука в решении вопросов лекарственного обеспечения». Научные труды, том ХХХУП, ч. П, М., 1998,- С.145-149.

18. Baeva V.M., Sepp S., Antonov A.S. et and. Genetic and morfological variabiliti in same microspecies of agamous Alchemilla L. II Inetemacional Symposium "Plant Evolution in Man-made Habitats. - August 10-15.1998. - S. 93.

19. Баева B.M., Глазунова К.П. Изучение морфо-генетической изменчивости у видов рода манжетка // Сб. «Современные проблемы фармацевтической науки и практики». Научные труды, том ХХХУШ, ч. П. М., 1999.- С.155-158.

20. Баева В.М., Коваленко Т.Ф. RAPD-анализ листьев дуба // Сб. «Фармация на современном этапе - проблемы и достижения». Научные труды, том XXXIX, часть П, М., 1999. - С.196-198.

21. Баева В.М.,Можайский A.M. Изучение полифенольного состава водных извлечений травы некоторых видов манжетки // Фармация, 2001, № 5,- С. 25-26.

22. Баева В.М., Козин C.B. Изучение токсичности настоя травы манжетки // УШ Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». Тезисы докладов М., апрель 2001. - С.442.

23. Баева В.М., Сасов С.А., Ярцева И.В. Изучение полифенольного состава травы манжетки // У1 Симпозиум по фенольным соединениям 28-30 апреля 2004 Москва. Тезисы докладов М., 2004,- С.96.

24. Баева В.М. Лечение растениями. Основы фитотерапии. М., 2004.- .202 С.

25. Баева В.М., Потанина О.Г., Самылина И.А., и др. Пыльца, как анатомо-диагностический признак при определении подлинности лекарственного растительного сырья // Материалы съезда и конференции. 9-й международный съезд «Фитофарм 2005». Конференция молодых учёных Европейского фотохимического общества (Растения и здоровье).С.-Петербург 22-25 июня 2005 г,-С.283-289.

26. Баева В.М.Полиморфизм лекарственных растений // Фармация, 2005, № 6.-С. 40-42.

27. Баева В.М. Изучение запасов перспективного лекарственного сырья - трава манжетки //«Традиционная медицина - 2007». Сб.научн.трудов конгресса, посвященного 30-летшо со дня открытия ЦНИИ рефлексотерапии.Москва, 1-3 марта 2007.-С.30-32.

28. Баева В.М., Сасов С.А.Полифенолы травы манжетки // Фармация, 2007, № 8,- С. 9-10. .

29. Баева В.М., Мурин И.И.Изучение аминокислотного состава настоя и порошка травы манжетки //«Традиционная медицина», № 1 [8] 2007,- С.53-56.

30. Баева В.М. Использование методов молекулярной биологии для идентификации лекарственного растительного сырья // «Традиционная медицина 2007». Сб. научн. трудов конгресса, посвященного 30-летию со дня открытия ЦНИИ рефлексотерапии. Москва, 1-3 марта 2007.-С.32-33.

31. Баева В.М., Ермакова В.А, Сорокина A.A., Самылина И.А.и др. Руководство к практическим занятиям по фармакогнозии. М., 2007,- 672 С.

32. Баева В.М. Современный подход к изучению лекарственных растений // Сб. научных трудов. Г.Москва 14-16 марта 2008 года. М .2008. - С. 268-271

33. Баева В.М. Фармакогностическое изучение и стандартизация сырья трава манжетки // Сб. научных трудов. Г.Москва 14-16 марта 2008 года. М .2008.-С.231-232.

34. Баева В.М., Сасов С.А. Полифенолы травы манжетки // Фармация. - 2007. -№ 8,- С.9-10.

35. Монастырева H.A., Баева В.М.Изучение состава полифенольного комплекса травы монарды методом ВЭЖХ.Тезисы итоговой научной студенческой конференции с международным участием «Татьянин день», посвященной 250-летию Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова. Москва.2007.-С.-22.

36. Мурин И.И, Баева В.М., Козлов A.M. Поиск потенциальных ингибиторов метастазирования злокачественных опухолей среди агентов растительного происхождения // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической

47

продукции: сб.науч.тр./под ред.М.В.Гаврилина/ Пятигорская ГФА.- Российская Федерация, г.Пятигорск, 2008.-Вып.63.-с.455-457,799 С.

37. Мурии И.И., Баева В.М., Козлов A.M. Влияние настоя травы манжетки на общую токсичность противоопухолевого препарата - циклофосфамида // Тезисы У Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины»- Российская Федерация, г. Москва,- 2008.-c.307, 545 С.

38. Баева В.М., Вальехо-Роман K.M., Самигуллин Т.Х. Перспективы изучения лекарственных растений с использованием секвенирования ДНК на примере рода AnthyllisL.ll Фармация.2009, № 3.- С.23-26.

39. Баева В.М., Монастырева H.A. Применение RAPD-анализа для изучения лекарственного растительного сырья // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2009, №2. - С. 29-31.

40. Мурин И.И., Баева В.М., Козлов A.M. Влияние агримониина и суммы полифенолов, выделенных из травы манжетки, на общую токсичность противоопухолевого препарата циклофосфамид // Российский биотерапевтический журнал. - 2009. - № 2 // Материалы УШ Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» Москва, 21-22 апреля 2009 г.- С.55.

Подписано в печать 07.09.2009 г. Формат 60x84 1/16, Усл. Печ. Лист 1,5 Тираж 100 экз. Заказ № 2841 Отпечатано в типографии «ДЦ «Каретный Двор»» 101000, Москва, ул. Покровка, д. 12, стр.1 Тел.: (495) 506-82-22 wvvw.allaprint.ru