Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Фармакогностическое изучение девясила иволистного

На правах рукописи

АЗАРОВА АННА ВЛАДИМИРОВНА

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ДЕВЯСИЛА ИВОЛИСТНОГО

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Курск-2014

005557654

005557654

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук, профессор Бубенчикова Валентина Николаевна

Официальные оппоненты:

Коновалов Дмитрий Алексеевич - доктор фармацевтических наук, профессор, Пятигорский медико-фармацевтический институт - филиал Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, заместитель директора по науке

Терешина Натальи Сергеевна - доктор фармацевтических наук, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующая лабораторией фармакогнозии НИИ фармации

Ведущая организация:

Государственное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений» (ВИЛАР)

Защита состоится «26» февраля 2015 г. в 14:00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.039.03 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (305041, г. Курск, ул. К. Маркса, д. 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО КГМУ Минздрава России и на сайте

http://www.kurskmed.com/diss2/load/uploads/fc3d9cf.pdf

Автореферат разослан

2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Овод Алла Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Из общего арсенала лекарственных средств, применяемых в России, 1/3 препаратов имеют растительное происхождение. На фармацевтических рынках США и в странах Европы доля растительных препаратов достигает 50%. Поэтому одним из приоритетов развития отечественной фармацевтической науки и практики является более полное использование собственных ресурсов дикорастущего растительного сырья и создание оригинальных фитопрепаратов на его основе, не уступающих по качеству зарубежным аналогам.

В связи с этим стоит вопрос расширения сырьевой базы лекарственного растительного сырья за счёт поиска новых источников. Одним из источников фитопрепаратов является девясил высокий. Корневища и корни девясила высокого используются в качестве отхаркивающего, противомикробного, противовоспалительного средства. Из них получают отвар и препарат «Алантон». Основными группами действующих веществ корневищ с корнями девясила высокого являются сесквитерпеновые лактоны - алантолактон, изоалантолактон и полисахарид инулин. Однако антропогенное воздействие человека на природу и в связи с этим значительные экологические изменения приводят к резкому сокращению запасов растительного сырья, в том числе и девясила высокого. Решить данную проблему позволит привлечение потенциала других видов девясила, в частности девясила иволистного, широко распространённого на территории Центрально-Черноземных областей России. Сведения о химическом составе и фармакологических свойствах как корневищ с корнями, так и травы девясила иволистного, носят фрагментарный характер. В связи с этим фармакогностическое изучение девясила иволистного с целью внедрения его в научную медицину наряду с девясилом высоким является актуальным.

Степень разработанности темы. В литературе имеются данные о выделении эфирного масла из надземной и подземной частей девясила иволистного. Однако данные о качественном его составе отсутствуют за исключением того, что для подземной части указано наличие алантолактона и изоалантолактона, а для надземной части - геленина. Из подземной части выделены тритерпен фриделин и стероид ситостерин, а также полисахарид инулин. В подземной части установлено присутствие алкалоидов, их количество достигает 0,06%. Наличие фенольных соединений установлено в надземной части, но отсутствуют данные об их характере и структуре. В цветках растения идентифицированы флавоноиды: апигенин и гиперозид и гидроксикоричные кислоты: кофейная и хлорогеповая.

Исследований по комплексному фармакогностическому изучению надземной и подземной части девясила иволистного не проводилось; не изучен состав основных групп биологически активных веществ и не разработаны методики их количественного определения.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилось фармакогностическое изучение корневищ с корнями и травы девясила иволистного, как перспективного источника лекарственного растительного сырья, а также стандартизация и диагностика сырья.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

- фитохимическое изучение корневищ с корнями и травы девясила иволистного;

- изучение состава основных групп биологически активных веществ;

- разработка методик количественного определения основных групп биологически

активных соединений;

- установление макро- и микроскопических признаков двух видов сырья: травы и

корневищ с корнями девясила иволистного;

- установление числовых показателей качества сырья;

- проведение фармакологического скрининга.

Научная новизна. Проведено изучение качественного состава и количественного содержания основных групп биологически активных веществ корневищ с корнями и травы девясила иволистного: эфирного масла, ссскнитсрпсновых лактонов, углеводов, азотсодержащих соединений, органических кислот, -гритерпеновых соединений, каротиноидов, фенольных соединений.

Впервые исследован минеральный и аминокислотный состав как подземной, так и надземной части. Установлено наличие 17 макро- и микроэлементов; 17 аминокислот.

Изучен состав лииофильной фракции методом газовой хроматографии - мас-спектрофотометрии (ГХ-МС); при этом идентифицировано 30 соединений, основными из которых являются в корневищах с корнями производное дитретбутилдиметоксибензола и диметиловый эфир тимогидрохинона, а в траве идентифицировано 11 веществ, основные из которых гексадекановая кислота и производное 1,4-ди-1-бутил-2,5-диметоксибензен.

Исследован состав фенольных соединений с помощью различных методов хроматографии (бумажной, тонкослойной, ВЭЖХ). В траве девясила иволистного идентифицировано 18 фенольных соединений, а в корневищах с корнями - 15. Из фенольных веществ идентифицированы кумарины: умбеллиферон, дикумарин, дигидрокумарин; флавоноиды: витексин, изовитексин, дигидрокверцетин, гесперидин, гиперозид, рутин, лютеолин-7-глюкозид; производные фенолкарбоновых кислот: галловая, цикориевая, хлорогеновая, кофейная, коричная, розмариновая; производные дубильных веществ: танин, эпикатехингаллат, катехин, эпикатехин. Новыми для девясила иволистного были 19 фенольных соединений.

Впервые выделены и изучены полисахариды травы девясила иволистного по фракциям: водорастворимый полисахаридный комплекс, пектиновые вещества, геми целлюлозы А и Ь. Изучен их качественный и количественный состав; определены функциональные группы пектиновых веществ.

Впервые проведены морфолого-анатомические исследования как надземной, так и подземной частей девясила иволистного. Установлены морфологические и микродиагностические признаки для определения подлинности сырья. Разработаны числовые показатели, регламентирующие качество сырья.

Проведены исследования по стандартизации травы и корневищ с корнями девясила иволистного, в результате чего разработаны методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид для травы девясила иволистного, суммы фруктозанов в пересчете на фруктозу для корневищ с корнями и суммы фенольных соединений в пересчете на хлорогеновую кислоту для двух видов сырья. Разработанные методики валидированы по показателям линейности, правильности, воспроизводимости и повторяемости.

Результаты скринипговых фармакологических исследований показали наличие у травы и корневищ с корнями девясила иволистного отхаркивающей, противовоспалительной и антибактериальной активности.

Практическая значимость.

В результате проведенных исследований получены новые данные о составе биологически активных веществ, фармакологической активности девясила иволистного.

Установлена близость качественного состава, количественного содержания сесквитерпеновых лактонов и фармакологической активности корневищ с корнями девясила иволистного и девясила высокого, что позволяет рекомендовать корневища с корнями девясила иволистного для дальнейшего изучения с целью внедрения его в научную медицину и использование наряду с девясилом высоким.

На основании проведенных исследований разработаны и внедрены:

- методика количественного определения суммы фруктозанов в корневищах с корнями девясила иволистного (Акт внедрения в работу кафедры фармакогнозии Пятигорского филиала ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» от 14 марта 2013 г.);

- методика количественного определения суммы флавоноидов в траве девясила иволистного (Акт внедрения в научную и учебно-методическую работу кафедры фармакогнозии и ботаники Курского государственного медицинского университета от 20 декабря 2013 г.);

- методика количественного определения суммы флавоноидов в корневищах с корнями девясила иволистного (Акт внедрения в научную и учебно-мстодическую работу кафедры фармакогнозии и ботаники и основами фитотерапии ГЬОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Минздрава России от 16 декабря 2013 года; Акт внедрения в работу фармацевтического факультета ФГБОУ ВПО «Северо-Осетинский государственный университет им. К.Л. Хета-гурова» от 20 ноября 2013 г.).

Методология и методы исследования.

Методологической основой выполненной диссертационной работы является выбор объекта исследования на основе принципа филогенетического родства и системный подход, включающий несколько блоков: информационно-исследовательский, фитохимический, стандартизационный, морфолого-анатомический и фармакологический. В процессе фармакогностического исследования использованы химические, физико-химические (УФ-спектроскопия, ВЭЖХ, масс-спекгроскопия), макроскопический, микроскопический, фармакологический и статистические методы анализа.

Положения выносимые на защиту:

- результаты фитохимического исследования травы и корневищ с корнями девясила иволистного;

- результаты выделения и исследования полисахаридов;

- разработка методик анализа, показателей качества сырья девясила иволистного;

- результаты морфолого-анатомических исследований девясила иволистного с целью выявления диагностических признаков для определения подлинности сырья;

- результаты фармакологического скрининга водных извлечений из травы и корневищ с корнями девясила иволистного.

Степень достоверности и апробация результатов. Научные положения и выводы диссертации базируются на достаточном объеме экспериментальных исследований и применении современных физико-химических, химических, морфолого-анатомических, фармакологических методов исследования, позволяющих получать достоверные и воспроизводимые результаты. Результаты исследований обработаны статистически.

Основные положения диссертационной работы доложены на научных конференциях: Международной научно-практической конференции «Фитодизайн в современных условиях» (г. Белгород, 2010 г.); II Российский фитотерапевтический съезд: сборник научных трудов съезда (г. Москва, 2010 г.); Разработка, исследование, маркетинг новой фармацевтической продукции (г. Пятигорск, 2011 г.); 77-й Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием: «Молодежная наука и современность» (г. Курск, 2012); III Международной научно-практической конференции «Молодые ученые в решении актуальных проблем науки» (г. Владикавказ, 2012); итоговой научной конференции сотрудников КГМУ, Центрально-Черноземного центра РАМН и отделения РАЕН, посвященной 78-летию Курского государственного университета и 90-летию со дня рождения профессора Н.Ф. Крутько (Курск, 2012 г.); VI Международной научно-практической конференции «Молодые ученые в решении актуальных проблем науки» (г. Владикавказ, 2013 г.)

Личный вклад автора. Автор принимал участие в выборе объектов исследования, постановке целей и задач. Диссертантом проведен научно-

информационный поиск литературы по объектам исследования, осуществлен сбор и анализ литературных данных. Автором выполнен фитохимический анализ, морфолого-анатомические и фармакологические исследования; разработаны методики количественного определения основных групп действующих веществ, проведена статистическая обработка результатов исследования, обобщены полученные результаты. Лично автором выполнено более 85% исследований.

Связь задач исследования с проблемами фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Курского государственного медицинского университета (номер государственной регистрации 01201161124).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 работ, из них 5 в журналах, рекомендуемых ВАК Минобрнауки России.

Объем и структура диссертации.

Работа изложена на 149 страницах машинописного текста, содержит 49 рисунков, 49 таблиц. Диссертационная работа состоит из введения, 5 глав (обзор литературы, глава «Объекты и методы исследований» и три главы, содержащие результаты собственных исследований), общих выводов, списка литературы, приложения.

Список литературы включает 198 источников, из них 22 на иностранных языках.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты II методы исследования. Объектами наших исследований явились трава и корневища с корнями девясила иволистного (Inula salicina L.), собранные в течение 2009-2013 годов в областях Центрального Черноземья: трава в фазу цветения, корневища с корнями - осенью. Сушку сырья проводили воздушно-теневым способом.

Качественный и количественный анализ биологически активных веществ проводили общепринятыми химическими, а также современными физико-химическими методами исследования: бумажной хроматографией (БХ), хроматографией в тонких слоях сорбента (ТСХ), а также высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ), газовой хроматографией с масс-селективным детектором (ГХ/МС), УФ-спекторофотометрией, атомно-эмиссионной спектро-фотометрией.

Морфолого-анотомические исследования изучаемого сырья проводили по общепринятым методикам. Микропрепараты готовили по методикам ГФ СССР XI издания; микропризнаки исследовали с помощью микроскопа «Биолам С-11» с цифровой насадкой. Фотографии обрабатывали на компьютере с помощью Adobe Photoshop7.0.

Отбор проб и товароведческий анализ сырья проводили в соответствии с требованиями ОФС 42-0013-03 «Правила приемки лекарственного растительного сырья и методы отбора проб» и ГФ XI, вып. 1, 2.

Эфирное масло получали гидродистилляцией по методу Клевенджера.

Фармакологические исследования проводили на лягушках, нелинейных белых мышах обоего пола, массой 18-20 г, нелинейных белых крысах обоего пола массой 180-220 г, белых кроликах массой 2,0-2,5 кг.

Статистическую обработку результатов исследований проводили согласно ГФ XI, использовали компьютерную программу Microsoft Exel.

Изучение качественного и количественного состава биологически активных веществ

При изучении биологически активных веществ проводили как их качественное, так и количественное определение. При качественном определении травы и корневищ с корнями девясила иволистного флоры Центрального Черноземья установили наличие эфирного масла, сесквитерпеновых лактонов, углеводов, азотсодержащих соединений, органических кислот, тритерпеновых соединений, каротиноидов, фенольных соединений, минеральных элементов.

Проведён количественный анализ биологически активных веществ девясила иволистного, который показал, что содержание дубильных веществ в траве составляет 17,19±0,44%, а в корневищах с корнями 7,20±0,20%; органических кислот в траве 5,91±0,17%, а в корневищах с корнями 3,74±0,09%; аскорбиновой кислоты в траве 0,47±0,02%, а в корневищах с корнями 0,51±0,01%; азотистых оснований в траве 0,83±0,04%, в корневищах с корнями 0,91±0,04%; тритерпеновых соединений в траве 0,05±0,001%, а в корневищах с корнями 0,09±0,001%; каротиноидов в траве 7,01±

0,27 мг %, а в корневищах с корнями 1,31±0,06 мг%, эфирного масла 0,47±0,02% в траве и 1,12± 0,01% в корневищах с корнями.

Методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором (ГХ/МС) изучены липофильные фракции девясила иволистного; идентифицировано 30 соединений в корневищах с корнями и 11 веществ в траве, относящихся к различным классам органических соединений.

Аминокислоты анализировали на аминокислотном анализаторе в стандартных условиях, используемых для разделения белковых гидролизатов.

Аминокислотный состав изучаемых видов сырья представлен 15 соединениями, из которых в траве и корневищах с корнями доминируют цистеин и аланин; корневища с корнями в значительных количествах накапливают также лейцин и аргинин. Сумма свободных аминокислот колеблется от 0,67 мг/100 мг в траве до 1,23 мг/100 мг в корневищах с корнями, из них суммарное содержание незаменимых аминокислот от 0,22 мг/100 мг в траве до 0,39 мг/100 мг в корневищах с корнями.

Проведено изучение минерального состава с использованием спектрального анализа. Результаты показывают, что трава девясила иволистного содержит достаточно высокую концентрацию меди, никеля, хрома, титана. Обращает внимание высокое содержание макроэлемента фосфора как в траве, так и в корневищах с корнями.

Показано, что содержание особо токсичных элементов (свинца, мышьяка, ртути, кадмия) в изученных видах сырья не превышает допустимого уровня, установленного Сан Пин 2.3.2.1078-01.

Содержание эфирного масла определяли по методу Клевенджера в течение 3 часов при соотношении сырья и воды 1:30. Экспериментально установили, что содержание эфирного масла в корневищах с корнями колеблется от 0,88% до 1,12%, а в траве от 0,33% до 0,47%.

При этом содержание эфирного масла в корневищах с корнями девясила иволистного сопоставимо с содержанием такового в корневищах с корнями девясила высокого.

Идентификацию сесквитерпеновых лактонов проводили методом тонкослойной хроматографии в хлороформных фракциях, полученных из корневищ с корнями и травы девясила иволистного. В исследуемых видах сырья с достоверными образцами идентифицированы изоалантолактон и алантолактон.

Количественное определение сесквитерпеновых лактонов, проведенное методом обратной алкалиметрии, показало, что их содержание в корневищах с корнями колеблется от 1,35±0,06% до 1,53±0,07%, а в траве от 0,87±0,03% до 1,22±0,21%.

Методами тонкослойной, бумажной хроматографии и ВЭЖХ по времени удерживания стандартных образцов в девясиле иволистном идентифицировали 22 соединения: из них 18 веществ в траве и 15 в корневищах с корнями (таблица 1).

Идентифицированные фенольные соединения представлены кумаринами: умбеллифероном, дикумарином, дигидрокумарином, скополетином; флавоноидами: витексином, изовитексином, дигидрокверцетином, гесперидином, гиперозидом, рутином, лютеолин-7-глюкозидом; производными фенолкарбоновых кислот: галловой, хлорогеновой, кофейной, коричной, розмариновой; производные дубильных веществ: эпикатехингаллатом, катехином, танином, эпикатехином.

Преобладающим кумарином в траве и корневищах с корнями девясила иволистного является дикумарин; среди флавоноидов в траве преобладает гесперидин; в корневищах с корнями - витексин и изовитексин; среди фенолкарбоновых кислот -хлорогеновая кислота в траве и цикориевая кислота в корневищах с корнями; среди производных дубильных веществ - эпикатсхингаллат в траве и танин в корневищах с корнями.

Таблица 1 - Фенольные соединения травы и корневищ с корнями девясила иволистного

Группа БАВ Наименование PCO Трава девясила иволистного Корневище с корнями девясила иволистного

Количественное соотношение, % Количественное соотношение, %

Кумарины Умбеллиферон 1,06 1,80

Дикумарин 5,81 10,31

Дигидрокумарин 0,81 5,57

Скополетин (7-окси-6-метоксикумарин) 0,72

Флавоноиды Витексин 3,91 -

Изовитексин 3,31 4,76

Дигидрокверцетин 3,95 -

Гесперидин 5,42 4,60

Гиперозид 2,74 -

Рутин - 0,61

Лютеолин-7-глюкозид - 0,42

Фенолкарбоновые кислоты Галловая кислота 4,37 12,09

Цикориевая кислота 10,16 27,75

Хлорогеновая кислота 15,87 4,49

Кофейная кислота 1,94 4,62

Феруловая кислота - 3,21

Коричная кислота 6,59 1,34

Розмариновая кислота 2,640 -

Дубильные вещества Эпикатехин - 3,10

Эпикатехингаллат 16,61 -

Катехин 0,41 -

Танин 2,43 5,04

Методом ВЭЖХ в исследуемом сырье девясила иволистного определено содержание основных флавоноидных соединений и фенолкарбоновых кислот; в траве из флавоноидных соединений определено содержание витексина (0,30%) и изовитексина (0,21%), из производных фенолкарбоновых кислот: хлорогеновой кислоты (1,48%) и розмариновой кислоты (0,65%); в корневищах с корнями -гсснсридина (0,14%), изовитексина (0,08%), цикориевой кислоты (0,71%) и галловой кислоты (0,20%).

В исследуемых видах сырья девясила иволистного изучены свободные сахара и полисахаридные комплексы. Методом бумажной хроматографии в траве идентифицирована глюкоза и галактоза, в корневищах с корнями фруктоза.

Для выделения водорастворимых полисахаридных комплексов использовали воздушно-сухой шрот сырья после экстракции полифенольных соединений. Полисахаридные комплексы получали последовательно фракционно: водорастворимые полисахаридные комплексы (ВРПС), пектиновые вещества (ПВ),

гемицеллюлоза (ГЦА и ГЦБ). Выход их составил ВРПС: из травы 6,87%, из корневищ с корнями 8,86%, ПВ - 3,23% и 15,10%, ГЦА - 3,34% и 3,07% и ГЦБ - 5,97% и 2,86% соответственно.

Мономерный состав полисахаридных комплексов устанавливали после гидролиза кислотой серной (1 моль/л) методом бумажной хроматографии.

В водорастворимом полисахаридном комплексе травы преобладающими моносахаридами являются арабиноза (11,6%) и галактоза (9,3%), корневищ с корнями - фруктоза (8,3%). Основу пектиновых веществ составляет галактуроновая кислота (86,4% в корневищах с корнями и 87,5% в траве). В гемицеллюлозс А и Б преобладающим моносахаридом является ксилоза (от 3,7% до 5,6%).

Проведено определение функциональных групп пектиновых веществ титрометрическим методом. Высокое содержание свободных карбоксильных групп у пектиновых веществ из корневищ с корнями девясила иволистного (10,88%) свидетельствует об их комплексообразующей способности и возможности рекомендации их в качестве детоксикантов.

Морфолого-анатомическис исследования

Возможность применения в медицинской практике девясила иволистного делает необходимым разработку характеристик подлинности сырья.

Нами проведено изучение морфолого-анатомического строения травы и корневищ с корнями девясила иволистного с целью выявления их диагностических признаков общепринятыми методиками ГФ XI издания.

Сырье «трава» представляет собой цельные или частично измельченные олиственные стебли, листья и цветки. Цвет стеблей - зеленоватый, листьев -серовато-зеленый, цветков - желтый. Запах слабый, вкус водного извлечения сладковато-горький, слегка вяжущий.

Микроскопическое исследование показало, что стебель в поперечном сечении округло-ребристый, пучкового типа строения. Устьица аномоцитного типа. Отмечено наличие клеток идиобластов. Стебель опушен простыми 5-7-клеточными толстостенными волосками, клетки которых часто заполнены бурым содержимым. Встречаются эфиромасличные железки, состоящие из 6-8 выделительных клеток (рис. 1).

Клетки нижнего эпидермиса листа более извилистые, чем верхнего; устьица аномоцитного типа, приурочены в основном к нижнему эпидермису. Эпидермис листа опушен многочисленными волосками. Так, на нижнем эпидермисе листа встречаются простые многоклеточные толстостенные волоски с кольцевыми утолщениями в местах соединения клеток, с заостренной конечной клеткой и укороченными 3-4 клетками у основания. Вдоль жилок расположены двух-пятиклеточные толстостенные волоски. Край листа опушен многоклеточными толстостенными волосками, часто прижатыми к эпидермису, пьедестал которых состоит из 2-5 укороченных прямоугольных клеток, конечные клетки удлиненные в числе 1-4. По краю листа встречаются гидатоды. По всей поверхности листа располагаются эфиромасличные железки, состоящие из 6-10 выделительных клеток (рис. 2).

Рисунок 1 - А - фрагмент поперечного среза стебля девясила иволистного: (Увел, х 200), Б - фрагмент поперечного среза корневища девясила иволистного (Увел, х 80), В - фрагмент поперечного среза корня (Увел, х 80)

Рисунок 2 - Лист девясила иволистного: А - фрагмент края листа (Увел, х 80), Б - фрагмент нижнего эпидермиса листа (Увел, х 140), В - фрагмент эпидермиса листа (Увел, х 200)

Рисунок 3 - Соцветия девясила иволистного: А - фрагмент края листочка обертки (Увел, х 200), Б - фрагмент верхушки листочка обертки (Увел, х 200), В - фрагмент эпидермиса ложноязычкового цветка с двурядной эфиромасличной железкой (Увел, х 200)

Обертка опушена простыми одноклеточными, реже двухклеточными, толстостенными волосками с вытянутой заостренной верхушкой, которые густо расположены к часто срастаются по 2-3 своими основаниями.

Для обертки также характерно наличие многоклеточных толстостенных волосков, пьедестал которых состоит из 3-4 укороченных прямоугольных клеток и одной конечной удлиненной клетки, встречаются ближе к верхушке листочков обертки. Чашечка трубчатого цветка густо покрыта одноклеточными остроконечными тонкостенными, прижатыми к поверхности волосками (рис. 3).

По поверхности трубчатого, ложноязычкового цветка встречаются двурялпые эфиромасличные железки.

Сырье корневища с корнями представляет собой цилиндрические цельные или разрезанные корневища и корни, снаружи продольно-морщинистые, в изломе зернистые.

Цвет корневищ и корней снаружи от светло-коричневого до коричневого, на изломе желтовато-белый. Запах слабый. Вкус водного извлечения сладковатый, слегка вяжущий. Корневище на поперечном срезе округлой формы. В центре сердцевина заполнена основной запасающей паренхимой. Центральный цилиндр имеет непучковое строение.

Первичная кора довольно объемная, заполнена основной паренхимой, в которой по кругу располагаются схизогенные вместилища с эфирным маслом, чередуясь с группами лубяных волокон. В паренхиме первичной коры, сердцевины, древесине встречаются клетки с глыбками инулина.

Корень первичного строения. Первичная кора занимает большой объем, в паренхиме которой встречаются клетки с глыбками инулина. Всю толщу центрального цилиндра занимает радиальный пучок.

Стандартизации сырья

Фитохимическое изучение девясила иволистного показало, что основными группами биологически активных веществ, содержащихся в нем наряду с эфирным маслом и сесквитерпеновыми лактонами, являются полисахариды и фенольные соединения (флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты).

В связи с этим для стандартизации корневищ с корнями девясила иволистного нами разработаны методики качественного и количественного определения фруктозанов, для стандартизации травы - методика определения суммы флавоноидов; для стандартизации двух видов сырья - содержание суммы фенольных соединений.

Для качественного определения фруктозы использовали методику хроматографии в тонких слоях сорбента на пластинках БогЬП!, в системе растворителей: н.бутанол - кислота уксусная - эфир этиловый - вода очищенная (9:6:3:1). В качестве проявителя использовали спиртовым раствор тимола 20% и раствор кислоты серной разведенной. Фруктоза проявлялась в виде пятна оранжево-красного цвета.

Для количественного определения фруктозанов нами использована методика спектрофотометрического их определения после кислотной трансформации. Эта методика основана на способности фруктозы при нагревании с концентрированными кислотами образовывать продукты, имеющие поглощение в области 200-380 нм. Сущность методики заключается в обработке водных извлечений, полученных из корневищ с корнями раствором кислоты хлористоводородной 5% при нагревании на кипящей водяной бане в течение 3 часов, при этом образуется 5-гидро-ксиметилфурфурол (продукт трансформации фруктозы), имеющий максимум поглощения в области 285 нм. При спектрофотометрировании использовали дифференциальный вариант спектрофотометрирования, т.е в качестве раствора сравнения использовали полученное извлечение с кислотой хлористоводородной без проведения гидролиза. Расчет содержания суммы фруктозанов вели с применением удельного показателя поглощения 5-гидроксиметилфурфурола, который равен 298. При разработке методики подобраны оптимальные условия экстракции фруктозанов и проведение их гидролиза. Наибольшее количество фруктозанов извлекается при экстракции водой очищенной в течение 3-х часов, оптимальный размер частиц -2 мм, время гидролиза - 3 часа. С использованием разработанной методики проанализирован ряд образцов корневищ с корнями девясила иволистного и определено, что содержание суммы фруктозанов в корневищах с корнями колеблется от 6,32±0,29% до 7,11±0,28%. Ошибка единичного определения с 95% вероятностью не превышает 3,01% (таблица 2).

Таблица 2 - Метрологические характеристики методик количественного определения _ суммы фруктозанов, флавоноидов, фенольных соединений _

F 1 х | Sx' | Sx | Р, % t(p,f) 1 Дх Е, %

Фруктозаны (корневище с корнями)

5 1 6,32 | 0,00472 | 0,0867 | 95 2,78 1 0,29 3,01

Флавоноиды (трава)

5 1 1,26 | 0,00027 | 0,01643 | 95 2,78 ! 0,05 4,46

Фенольные соединения (т] рава)

5 [ 9,37 | 0,02937 | 0,4200 | 95 2,78 1 1,17 3,45

Для количественного определения суммы флавоноидов в траве девясила иволистного был использован спектрофотометрический метод, в основу которого положена реакция комплексообразования с алюминия хлоридом в сочетании со спектрофотометрическим дифференциальным способом определения оптической плотности комплексов непосредственно в извлечениях из сырья.

В ходе исследования было установлено, что оптимальным растворителем, обеспечивающим максимальный выход суммы флавоноидов из травы девясила иволистного, является спирт этиловый 50%-70%. Свой выбор мы остановили на экстрагировании спиртом этиловым 70%, т.к. он наиболее часто используется для

экстрагирования флавоноидных соединений и извлекает наибольший качественный состав флавоноидов. Для извлечения флавоноидов нами использована экстракция до наступления равновесия. Установлено, что максимальный выход флавоноидов достигается через 45 минут при степени измельченности сырья 2 мм. Определение содержания суммы флавоноидов проводили в области максимума поглощения извлечения из сырья с алюминия хлоридом при длине волны 395 нм. Спектры поглощения извлечений из сырья с алюминия хлоридом и цинарозида с алюминия хлоридом совпадают, поэтому в качестве стандартного вещества был выбран цинарозид.

Расчет содержания суммы флавоноидов вели по удельному показателю поглощения цинарозида (лютсолип-7-глюкозида) с алюминия хлоридом, который равен 345. Установлено, что содержание суммы флавоноидов в траве девясила иволистного колеблется от 0,83±0,03% до 1,26±0,05%. Разработанной методикой определено содержание суммы флавоноидов и в корневищах с корнями, содержание их варьирует от 0,18±0,05% до 0,49±0,04%. Относительная ошибка методики не превышает 5,86% (таблица 2).

Сумму фенольных соединений девясила иволистного определяли методом прямой спектрофотомерии спирто-водного извлечения. Разработку методики проводили на сырье «трава».

Изучение УФ-спектров спирто-водного извлечения из травы девясила иволистного показало, что оно имеет максимум поглощения при длине волны 325 нм. В этой области УФ-спектра находится один из максимумов поглощения оксикоричных кислот, в частности хлорогеновой и кофейной кислот, которые присутствуют в траве девясила, что позволяет сделать вывод о том, что характер кривой поглощения спиртовых экстрактов из травы девясила определяется в основном оксикоричными кислотами. Расчет содержания суммы фенольных соединений вели с применением удельного показателя поглощения хлорогеновой кислоты в спирте этиловом 30% при длине волны 325 нм, который равен 504. В качестве раствора сравнения использовали спирт этиловый 30%.

Установлены оптимальные условия методики: степень измельчения сырья -1 мм, концентрация экстрагента - спирт этиловый 30% (при соотношении сырье -экстрагент 1:50); время экстракции - 45 минут.

Разработанной методикой проанализировано по три образца сырья травы и корневищ с корнями девясила иволистного, собранных в различных областях Центрального Черноземья. Установлено, что содержание суммы фенольных соединений в траве колеблется от 5,91±0,16% до 9,37±1,17%, а в корневищах с корнями от 12,89±1,29% до 18,12±0,43%. Относительная ошибка опыта не превышает 4,06% (таблица 2).

Проведена валидационная оценка разработанных методик количественного определения суммы фруктозанов, суммы флавоноидов, суммы фенольных

соединений. Предложенные методики валидированы по показателям линейности, диапозону использования, повторяемости, воспроизводимости.

Изучение фармакологической активности девясила иволистного

С целью изучения безопасности применения сырья девясила иволистного определяли острую токсичность настоя из травы и отвара корневищ с корнями в дозах от 2000 до 5000 мг/кг массы тела в пересчете на сухое сырье, а также полисахаридных комплексов, полученных из них, в дозе отЮО до 300 мг/кг. При этом гибели животных не наблюдали, что позволяет считать их нетоксичными в испытанном диапазоне доз. Значение 1ЛЭ50 в опытах установить не удалось вследствие ограничения объема их введения.

Девясил высокий в научной медицине используется прежде всего как отхаркивающее средство. Поэтому в первую очередь нами у девясила иволистного была определена отхаркивающая активность. О наличии отхаркивающих свойств судили по величине коэффициента ускорения движения ресничек мерцательного эпителия пищевода ля1ушки. Установлено, что исследуемые водные извлечения и полисахаридные комплексы повышают двигательную активность мерцательного эпителия пищевода лягушки, что свидетельствует о наличии у них отхаркивающих свойств. При этом более выраженной активностью обладает отвар из корневищ с корнями (наблюдалось увеличение двигательной активности на 32,33%). Выраженность отхаркивающего действия у него была сопоставима с отваром из корневищ с корнями официнального вида - девясила высокого (увеличение двигательной активности на 32,06%).

Противовоспалительную активность исследуемых водных извлечений и полисахаридных комплексов оценивали с учетом влияния на разные стадии воспалительного процесса. Установлено, что исследуемые водные извлечения и полисахаридные комплексы угнетали степень развития отека конечности белых мышей при асептическом воспалении, вызванном введением формалина. Максимал корневищ с корнямиьное уменьшение величины отека лапы по сравнению с контролем отмечено у ВПРС, при этом противовоспалительный эффект составил 29,50%. Антиэкссудативная активность отвара из корневищ с корнями девясила иволистного (уменьшение величины отека на 20,42%) сопоставима с таковой у отвара из корневищ с корнями девясила высокого (уменьшение величины отека на 22,61%).

Влияние фитопрепаратов на образование грануляционно-фиброзной ткани оценивали на модели «ватной гранулемы». Установлено, что под влиянием исследуемых фитокомплексов вес грануляционной ткани по сравнению с контролем достоверно уменьшался, что приводило к снижению воспалительного процесса. Наиболее выраженное уменьшение веса грануляционной ткани вызывают настой и полисахаридный комплекс травы девясила иволистного. В этом случае процесс развития гранулемы уменьшался на 39% и 35% соответственно.

Изучение капилляроукрепляющей активности показало, что в случае введения водных извлечений и полисахаридных комплексов латентный период появления 16

пятен окрашивания увеличивался с 4,54 мин. (отвар корневищ с корнями девясила иволисгного) до 7,82 мин. (полисахаридный комплекс трава девясила иволистного) по сравнению с контролем (3,96 мин.). Также регистрировалось достоверное уменьшение диаметра пятен окрашивания, более выраженное в случае использования полисахаридных комплексов (0,65 см у полисахаридного комплекса травы и 0,76 см у полисахаридного комплекса корневищ с корнями). Наблюдаемые в этом случае эффекты были сопоставимы с отваром из корневища с корнями девясила высокого.

Изучение антимикробной активности показало, что отвар из корневищ с корнями девясила иволистного, как и девясила высокого, проявляет более выраженную антимикробную активность в отношении грибов рода Candida, Proteus vulgaris. Настой травы девясила иволистного проявляет выраженную антимикробную активность в отношении грибов рода Candida и Pseudomonas aeruginosa.

ВЫВОДЫ

1. Проведено фитохимическое изучение травы и корневищ с корнями девясила иволистного. Установлено наличие углеводов, азотистых оснований (0,83±0,04% в траве и 0,91±0,04% в корневищах с корнями), органических кислот (5,91±0,17% в траве и 3,74±0,09% в корневищах с корнями), тритерпеновых соединений (0,05±0,001% в траве и 0,09±0,001% в корневищах с корнями), каротиноидов (7,01±0,27 мг% в траве и 1,31±0,06 мг% в корневищах с корнями), фенольных соединений, эфирного масла (0,47±0,02% в траве и 1,12±0,01% в корневищах с корнями), сесквитерпеновых лактонов, аминокислот, макро- и микроэлементов; изучен состав липофильной фракции.

2. Различными методами хроматографии (бумажной, тонкослойной, ВЭЖХ) в траве и корневищах с корнями идентифицировано 22 вещества фенольной природы: кумарины - умбеллиферон, дикумарин, дигидрокумарин, скополетин; флавоноиды -витексин, изовитексин, дигидрокверцетин, гесперидин, рутин, лютеолин-7-гликозид, гиперозид; производные дубильных веществ - танин, эпикатехингаллат, эпикатехин, катехин; производные фенолкарбоновых кислот - галловая, цикориевая, хлорогеновая, кофейная, феруловая, коричная, розмариновая кислоты. Впервые для девясила иволистного идентифицировано 19 фенольных соединений.

3. Впервые методом ВЭЖХ установлено количественное содержание основных флавоноидных соединений: витексина (0,3%) и изовитексина (0,21%) в траве и изовитексина (0,08%) и гесперидина (0,14%) в корневищах с корнями, а также фенолкарбоновых кислот: хлорогеновой (1,48%) и розмариновой (0,65%) в траве и галловой (0,20%) и цикориевой (0,71%) в корневищах с корнями.

4. Впервые из травы и корневищ с корнями девясила иволистного выделены

полисахариды по фракциям: водорастворимые полисахаридные комплексы, выход

которых составил 6,87% для травы и 8,86% для корневищ с корнями; пектиновые

вещества - 3,23% и 15,10%; гемицеллюлоза А - 3,34% и 3,07%; гемицеллюлоза Б -

5 97% и 2 86% соответственно. Изучен их качественный и количественный

17

моносахаридный состав. Определено содержание функциональных групп пектиновых веществ.

5. Впервые для корневищ с корнями девясила иволистного разработаны методики количественного определения основных групп действующих веществ: для корневищ с корнями методика спектрофотометрического определения суммы фруктозанов, по 5 гидроксиметилфурфуролу как продукту кислотной трансформации фруктозы. Содержание суммы фруктозанов колеблется от 6,32% до 7,11%; для травы методика дифференциального спектрофотометрического определения суммы флавоноидов, в пересчете на цинарозид, содержание которых колеблется от 1,03% до 1,29%; для травы и корневищ с корнями методика спектрофотометрического определения суммы фенольных соединений, содержание суммы фенольных соединений колеблется от 5,91% до 9,37% в траве и от 12,89% до 18,12% в корневищах с корнями. Разработанные методики валидированы по показателям линейности, диапозону использования, повторяемости, воспроизводимости и правильности.

6. Проведено количественное определение сесквитерпеновых лактонов методом обратной алкалиметрии. Установлено, что их содержание в корневищах с корнями колеблется от 1,35±0,06% до 1,53±0,07%, а в траве от 0,87±0,03% до 1,22±0,21%. Относительная ошибка метода с доверительной вероятностью 0,95 не превышает 5%.

7. Проведено изучение морфологических и микродиагностических признаков травы и корневищ с корнями девясила иволистного. Установлены микродиагностические признаки стеблей, листьев, цветков, листочков обертки, корневищ, корней девясила иволистного. Диагностическое значение имеют наличие различного типа волосков, эфирномасличных железок, состоящих из 6-10 выделительных клеток, расположенных в 2 ряда и 3-4 яруса на эпидермисе стебля, листа, листочков обертки, цветка.

Микродиагностические признаки корневищ заключаются в наличие схизогенных вместилищ с эфирным маслом в первичной коре; глыбок с инулином в паренхиме первичной коры, сердцевины и древесины.

8. Установлены числовые показатели, характеризующие качество сырья: влажность не более 13%, золы общей не более 5% для травы и не более 8% для корневищ с корнями, золы, нерастворимой в 10% хлористоводородной кислоте, не более 2% для травы и не более 4% для корневищ с корнями; экстрактивных веществ, извлекаемых спиртом этиловым 50%, не менее 25%.

9. Результаты скрининговых фармакологических исследований показали, наличие у корневищ с корнями и травы отхаркивающей, противовоспалительной и антимикробной активности. Отвар корневищ с корнями девясила иволистного (увеличение двигательной активности на 32,33%) по силе отхаркивающего действия не уступает отвару, полученному из корневищ с корнями официнального вида, девясила высокого (увеличение двигательной активности на 32,06%).

18

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Азарова, A.B. Изучение пектиновых веществ девясила иволистного / A.B. Азарова, К.А. Александрова // III Международная научно-практич. конф. «Молодые ученые в решении актуальных проблем науки»: сборник работ, Владикавказ. - 2012. -С. 146-147.

2. Азарова, A.B. Сесквитерпеновые лактоны девясила иволистного (Inula salicina L.) / A.B. Азарова, Д.Н. Пожидаева // IV Международная научно-практич. конф. «Молодые ученые в решении актуальных проблем науки»: сборник работ. Часть 1. Владикавказ.-2013.-С. 197-198.

3. Азарова, A.B. Исследование дубильных веществ прозанника крапчатого и девясила иволистного / A.B. Азарова, АЛО. Малютина // XVIII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство», сборник материалов конгресса: Москва. - 2011.-С. 584.

4. Азарова, A.B. Содержание дубильных веществ в девясиле иволистном (Inula salicina) / A.B. Азарова // Молодежная наука и современность : материалы конф. Курск. - 2011. - Часть II. - С.222.

5. Бубенчикова, В.Н. Изучение фенолкарбоновых кислот травы бородавника обыкновенного, девясила иволистного и прозанника крапчатого / В.Н. Бубенчикова, C.B. Логутев, A.B. Азарова, А.Ю. Малютина // XIX Российский национальный конгресс «Человек и лекарство»: сборник материалов конгресса. - М.: 2012. - С.358-359.

6. Бубенчикова, В.Н. Изучение полисахаридного комплекса травы Inula salicina L / В.Н. Бубенчикова, A.B. Азарова // Кластерные подходы фармацевтического союза : материалы научн.-практ. конф., Белгород.-2012.-С. 197-198.

7. Бубенчикова, В.Н. Азотистые основания девясила иволистного / В.Н. Бубенчикова, A.B. Азарова // Фитодизайн в современных условиях. Материалы конф. Белгород 14-17 июня 2010. - Под ред. В.К. Тохтарь, В.Н. Сорокопудова, Белгород. -Изд: БелГУ, 2010.-С. 354.

8. Бубенчикова, В.Н. Изучение пектиновых веществ травы вероники седой и корневищ с корнями девясила иволистного / В.Н. Бубенчикова, IO.A. Кондратова,

A.B. Азарова // XIX Российский национальный конгресс «Человек и лекарство»: сборник материалов конгресса. - М.: 2012. - С. 359.

9. Бубенчикова, B.II. Изучение флавонондов травы девясила иволистного /

B.Н. Бубенчикова, A.B. Азарова // Традиционная медицина / Научно-практич. журнал № 5. — 2012. - С.183-185.

10. Бубенчикова, В.Н. Исследование каротиноидов девясила иволистного / В.Н. Бубенчикова, A.B. Азарова // Современные аспекты разработки и совершенствования состава и технологии лекарственных форм / Курск. - 2011.- С. 297-298.

11. Бубенчикова, В.Н. Морфолого-анатомическое исследование травы девясила иволистного [Электронный ресурс] / В.Н. Бубенчикова, Ю.А. Кондра-

това, A.B. Азарова // Фундаментальный исследования № 5. - Часть 3. - 2014. -С. 519-522. Режим доступа: http://search.rae.ru/

12. Бубенчикова, В.Н. Разработка методики стандартизации корней девясила иволистного / В.Н. Бубенчикова, A.B. Азарова // Традиционная медицина / научно-практич. журнал № 5. - 2011. - С. 163-165.

13. Бубенчикова, В.Н. Состав и отхаркивающая активность водорастворимых полисахаридных комплексов девясила иволистного / В.Н. Бубенчикова,

A.B. Азарова // Научные ведомости Белгородского государственного университета Естественные науки № 9 (104). Выпуск 15/2. 2011. - С. 188-190.

14. Бубенчикова, В.Н. Стандартизация сырья девясила иволистного (Inula salicina L.) по содержанию гидроксикоричных кислот [Электронный ресурс] /

B.Н. Бубенчикова, A.B. Азарова // Современные проблемы науки и образования № 2. - 2014. - Режим доступа: http://www.science-education.ru/116-1243

15. Бубенчикова, В.Н. Тритерпеновые соединения девясила иволистного / В.Н. Бубенчикова, A.B. Азарова, О.И. Пугачева // II Российский фитотерапевтический съезд: сборник научных трудов съезда / Приложение к журналу «Традиционная медицина» №3 (22) 2010. - М.: Изд-во Профессиональной ассоциации натуропевтов, 2010. -

C. 103.

16. Печенин, О.Д. Исследование антибактериальной активности растений рода девясил / О.Д. Печенин, В.Н. Бубенчикова, A.B. Азарова // Разработка, исследование маркетинг новой фармацевтической продукции : науч.тр. / Пятигорск, гос. фармацевт, акад. - 2011. - Вып. 66. - С. 563-564.

Лицензия ЛР № 020862 от 30.04.99 г. Сдано в набор 12.12.2014 г. Подписано в печать 15.12.2014 г. Формат 30х42'/8 Бумага офсетная. Гарнитура Times New Rom. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 284(A). Издательство Курского государственного медицинского университета 305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3.