Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Особенности фенотипа и цитокинового профиля децидуальных лимфоидных клеток при гестозе

Г Г Б ОД

10 ¡НО;! ¿0-2

На правах рукописи

АСТРАУХ Наталия Владимировна

ОСОБЕННОСТИ ФЕНОТИПА И ЦИТОКИНОВОГО ПРОФИЛЯ ДЕЦИ-ДУАЛЬНЫХ ЛИМФОИДНЫХ КЛЕТОК ПРИ ГЕСТОЗЕ

14.00.36. - Аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2002 г.

Работа выполнена в Государственном учреждении Ивановском Научно-исследовательском институте Материнства и детства им. В.Н.Городкова МЗ РФ и Ивановской государственной медицинской академии МЗ РФ

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Наталья Юрьевна Сотникова Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Марина Александровна Стенина доктор медицинских наук, профессор Виктор Фадеевич Семенков

Ведущее учреждение -

Научный Центр акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН

Защита диссертации состоится «_»_200.. г.

в_часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.05

в Российском государственном медицинском университете по адресу (117997, Москва, ул. Островитянова, д.1 .)•

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке РГМУ Автореферат диссертации разослан «_»_2002 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета

доцент Т.Е.Кузнецова.

Актуальность работы.

Проблема гестоза беременных является одной из актуальных в современном акушерстве, так как гестоз относится к наиболее распространенным и тяжелым осложнениям беременности. По литературным данным гестоз развивается в 817% случаев, и на сегодняшний день этот показатель не имеет тенденции к снижению (Иванян А.Н. и др., 1998; Рожковская Н.Н., 1998). Гестоз представляет серьезную опасность доя здоровья матери и плода (Стрижаков А.Н. и др., 2001; Стрижова Н.В. и др., 1998; Сидорова И.С., 1996). В то же время, несмотря на большое число фундаментальных исследований, посвященных различным аспектам гестоза беременных, механизмы, определяющие его развитие, до сих пор полностью не установлены.

В последнее время в литературе широко дискутируется вопрос о ведущей роли иммунных нарушений в патогенезе гестоза. Проведенные исследования иммунологических параметров периферической крови женщин с гестозом свидетельствуют о том, что гестоз сопровождается выраженными изменениями популяционного состава иммунокомпетентных клеток, продукции цитокинов, угнетением показателей гуморального звена и значительной активацией клеток фагоцитарного ряда. (Нецеевская М.А., 2000; Redman C.W. et al, 1999; Saito S. et al, 1999; Sacks et al, 1998). Однако, большинство работ посвящено изучению периферических популяций лимфоцитов с классическим фенотипом, а имеющиеся данные крайне противоречивы (Козлова С.Н., 2001; Медвинский И.Д. и др., 1999; Боровская Т.Ф. и др., 1998). Остается практически неизученной роль различных субпопуляций клеток с цитотоксической активностью, характер экспрессии активационных маркеров лимфоидными клетками и механизмы формирования иммунного ответа как на системном, так и на локальном уровне.

В последние годы отмечается резкий всплеск в изучении цитокинового профиля при гестозе, однако большинство работ посвящено определению содержания цитокинов в сыворотке крови и экстрактах плаценты (Козлова С.Н. и др., 2001; Нецеевская М.А., 2000; Sargent I.L., 1998). В то же время закономер-

ности синтеза цитокинов как периферическими, так и децидуальными моно-нуклеарными клетками описаны недостаточно.

Результаты многочисленных исследований отводят плаценте центральную роль в регуляции взаимоотношений между матерью и плодом (Clark D.A., 1998; Chaouat G., 1998; Wegmann Т., 1986). Помимо роли пассивного анатомического фильтра, позволяющего кислороду и питательным веществам проникать к плоду, плацента выполняет эволюционно сложившуюся роль в представлении антигенов, в том числе и отцовского происхождения, иммунокомпетент-ным клеткам матери (Billington W.D., 1998; Chaouat G., 1993). Более того, на современном этапе считается, что именно иммунологические события, происходящие на локальном уровне, определяют успех или неуспех беременности (Saito S., 1998, Raghupathy R., 1998). В связи с этим, изучение иммунорегуля-торных процессов в интерфазе мать-плод представляет особый интерес.

Рядом авторов показано, что при гестозе нарушается инвазия трофобла-ста в спиральные артерии, наблюдается дисфункция эндотелия сосудов, активируются процессы перекисного окисления липидов ( Габелова К.А. и соавт., 2000; Clark P. et al, 1998; Zhou Y. et al, 1997). Следствием всех этих нарушений является развитие гипоксических процессов в плаценте и формирование фето-плацентарной недостаточности. В то же время, практически отсутствуют работы, посвященные изучению иммунологических процессов, происходящих на локальном уровне при данной патологии. Не установлена связь между степенью тяжести гестоза и нарушениями иммунорегуляторных процессов в плаценте. В связи с этим, особую актуальность приобретает изучение соотношения различных субпопуляций лимфоидных клеток децидуальной оболочки плаценты, процессов их активации и синтеза цитокинов, поскольку именно эти клетки играют ведущую роль в регуляции материнского иммунного ответа на антигены развивающегося плода. Более того, выявление иммунных механизмов, лежащих в основе развития гестоза, позволит уточнить многие общие вопросы взаимодействия клеток в ходе иммунного ответа. Выяснение механизмов регуляции иммунного ответа в интерфазе мать-плод и выявление уровня их нару-

шений при гестозе разной степени тяжести поможет лучше понять патогенез заболевания, что, в свою очередь, позволит подойти к решению многих вопросов тактики ведения таких больных. Цель работы.

Установить особенности фенотипического и цитокинового профиля лимфоидных клеток на системном и локальном уровне при неосложненной беременности III триместра и гестозе различной степени тяжести, на основании чего уточнить патогенетические механизмы гестоза.

Задачи исследования.

1. Выявить особенности популяционного состава и активации лимфоцитов периферической крови у женщин с гестозом различной степени тяжести.

2. Дать характеристику популяционного состава и активации лимфоидных клеток децидуальной оболочки зрелой плаценты при гестозе в зависимости от степени тяжести гестоза.

3. Провести сравнительный анализ фенотипического профиля лимфоцитов на системном и локальном уровнях у женщин с физиологической беременностью и гестозом.

4. Установить особенности продукции цитокинов лимфоидными клетками децидуальной оболочки плаценты в зависимости от степени тяжести гестоза.

Научная новизна.

1. Впервые установлены отличия популяционного состава и активации лимфоцитов децидуальной оболочки плаценты от параметров периферической крови у женщин с физиологической беременностью.

2. Выявлены особенности фенотипического профиля лимфоцитов периферической крови у женщин с гестозом.

3. Установлены закономерности изменения содержания различных популяций децидуальных лимфоидных клеток с цитотоксической активностью при гестозе легкой и средней степени тяжести.

4. Установлены особенности активации децидуальных лимфоцитов в зависимости от тяжести гестоза.

5. Выявлены особенности спонтанной продукции цитокинов мононуклеар-ными децидуальными клетками при различных степенях тяжести гестоза.

Практическая значимость работы.

Установлены нормативные параметры функционирования лимфоидных клеток периферической крови.

Определены новые информативные дополнительные критерии диагностики степени тяжести гестоза.

Установлены особенности участия лимфоидных клеток периферической крови и децидуальной оболочки плаценты в патогенезе развития гестоза.

Апробация и внедрение результатов работы. Материалы диссертации доложены на II съезде иммунологов России (Сочи, 1999), European Meeting of Immunology and Reproduction (Рим, 1999), на конференции молодых ученых Ивановской государственной медицинской академии (Иваново, 2000), 4-й Научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2000), на Пироговской межвузовской конференции студентов и молодых ученых в Российском государственном медицинском университете (Москва, 2000), 5-й Научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2001), VIII International Congress of Reproductive Immunology (Хорватия, 2001). По материалам диссертации опубликовано 11 работ, из них 7 в центральной печати, 4 в международной печати. Реализация результатов работы.

Результаты диссертационной работы вошли в дополнение к унифицированной программе последипломного обучения врачей по актуальным вопросам акушерства и гинекологии «Иммунологический мониторинг для профилактики осложнений гестационного периода» (МЗ РФ, 2000 г.). Материалы исследования используются в учебном процессе кафедры патофизиологии с курсом иммунологии ИГМА.

Основные положения, выносимые на защиту.

Развитие гестоза на всех уровнях иммунного ответа сопровождается нарушением функций клеток с цитотоксической активностью, при этом на системном уровне происходит повышение содержания ЕК-клеток, усиливается активация лимфоцитов периферической крови, а в децидуальной оболочке плаценты отмечается угнетение функции ЕК-клеток и снижение продукции цитокинов ТЬ-1 типа на фоне усиленного синтеза провоспалительных цитокинов. Характер локального иммунного ответа при гестозе зависит от степени тяжести заболевания: при легкой степени наблюдается гиперактивация лимфоидных клеток децидуальной оболочки плаценты, а при средней степени - угнетение их активности.

Структура и объем диссертации.

Материалы диссертации изложены на/3^ страницах машинописного текста. Работа состоит из Введения, 4 глав собственных исследований, Обсуждения, Выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, включающего /^источника, из них/.¿^иностранных. Работа иллюстрирована рисунками и таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материалы и методы исследования.

Обследовано 45 женщин, из них 15 женщин с физиологически протекавшей беременностью (38-40 недель гестации), 30 женщин, беременность которых осложнилась гестозом. Женщины с гестозом были разделены на две подгруппы в зависимости от степени тяжести - с водянкой-15; с нефропатией (1-Н)-15.

Обследование женщин осуществлялось в лаборатории клинической иммунологии ГУ Ивановского НИИ Материнства и детства им. В.Н. Городкова МЗРФ.

Материалом для исследования служили периферическая венозная кровь и децидуальная оболочка плаценты. Клиническая характеристика обследованных

женщин любезно предоставлена к.м.н., врачом акушером-гинекологом И.А.Пановой.

Общее число исследований-2700.

Плаценты получали сразу же после родов. Материал немедленно помещали в холодный физиологический раствор, забуференный фосфатами (ЗФР) (рН=7,2-7,4). Суспензию децидуальных лимфоцитов получали стандартным неферментативным методом. Для выделения обогащенной фракции мононукле-арных клеток (МНК) децидуальной оболочки плаценты использовали центрифугирование в градиенте плотности фиколла-верографина (d=l,078). МНК собирали в интерфазе среда-фиколл-верографин и отмывали дважды в Среде 199. Жизнеспособность клеток определяли окрашиванием трипановым синим, и она составляла не менее 95%.

Выделение лимфоцитов из периферической крови осуществлялось стандартным методом скоростного центрифугирования в градиенте плотности фиколла-верографина (d-1,078).

Для оценки экспрессии поверхностных CD-маркеров, децидуальные МНК и лимфоциты периферической крови использовали в конечной концентрации 2x106 кл/мл.

Уровень экспрессии CD маркеров на поверхности периферических и децидуальных лимфоцитов определяли методом одно- и двухцветной проточной цитофлюориметрии на проточном цитофлюориметре FACScan ("Becton Dickinson", USA). Для анализа неспецифического окрашивания использовали Simultest Control (мышиные IgGl-FITC + IgG2a-PE) ("Becton Dickinson", USA). Клетки метили анти-Н1е-1 и анти-Ьеи-МЗ - антителами с целью наложения оптимального окна дискриминации (гейта) на точечном графике прямого и бокового светорассеяния, которое включало в плаценте более 90% и в периферической крови- более 98% клеток с фенотипом CD45+CD14-. В качестве флюоро-хромной метки использовали флюоресцеинизотиоцианат (FITC) и фикоэритрин (РЕ). Анализ результатов проводили в программе Lysys II.

Для исследования использовали следующие моноклональные антитела:

анти-CDlö, -CD25, -CD71, -CDllb, -CD95, -CD45RA, -HLA-DR, коньюгиро-ванные с FITC и анти-СОЗ, -CD4, -CD8, коньюгированные с РЕ ("МедБиоС-пектр", Россия).

Для более полного изучения функционального состояния лимфоцитов деци-дуальной оболочки плаценты женщин с физиологической беременностью и гестозом исследовали ответ МНК на стимуляцию ФГА по изменению экспрессии поверхностных маркеров in vitro. Клетки инкубировали с ФГА при t-37° С в течение 1 часа, отмывали от митогена, помещали в среду RPMI 1640 и инкубировали при t-37° С в течение 24-часов. Контролем служили децидуальные лимфоциты, культивируемые в тех же условиях в среде RPMI 1640 без добавления митогена. После окончания срока инкубации оценивали уровень экспрессии ак-тивационных маркеров на поверхности лимфоцитов децидуальной оболочки плаценты методом проточной цитофлюориметрии.

Спонтанную продукцию цитокинов ФНОа, ИФНаи ИФНу, ИЛ-lß, ИЛ-8 (ТОО «Цитокин», С.-Петербург, Россия) и ЭФР ("ACCUCYTE" Cytimmune, USA) децидуальными МНК оценивали в трех повторах методом твердофазного ИФА по их содержанию в пулированных супернатантах короткоживущих культур клеток децидуальной оболочки плацент рожениц с физиологической беременностью, рожениц с водянкой и нефропатией беременных. Чувствительность тест-систем составляла для ФНОа, ИЛ-lß и ИЛ-8 - 30 пкг/мл, для ИФНа и ИФНу - 19 пкг/мл, для ЭФР - 0,195 нг/мл. Измерение проводили на микропланшетном ридере Multiscan EX ( Labsystems, Finland). Расчет концентрации проводился в пкг/мл с использованием программного обеспечения «Point to point».

Статистическая обработка данных включала определение среднего арифметического и ошибки среднего арифметического. Достоверность различий рассчитывали по t-критерию Стьюдента.

Результаты работы и их обсуждение.

Установлено, что иммунологический профиль периферических лимфоцитов зависел от степени тяжести гестоза (таблица 1). При водянке беременных

повышалось содержание CD4+, CD8+, CD 16+ клеток по сравнению с аналогичными показателями при физиологической беременности (р<0,001, р<0,01; р<0,001, соответственно). Полученные нами результаты, свидетельствующие о высоком содержании CD 16+ клеток при гестозе, хорошо согласуются с имеющимися литературными данными о повышении содержания периферических лимфоцитов с цитотоксической активностью в группе женщин с данной патологией (Козлова С.Н. и др., 2001; Matthiesen L. et al, 1999). Одной из причин усиления активности цитотоксических клеток на системном уровне у женщин с гестозом может быть наличие вирусного инфицирования. Так, рядом авторов было показано, что при гестозе в периферической крови женщин определялись было показано, что при гестозе в периферической крови женщин определялись маркеры TORCH-инфекции (Козлова С.Н. и др., 2001). Известно также, что некоторые инфекции могут способствовать развитию гестоза (Sacks et al, 1998). С другой стороны, установлено, что при гестозе нарушена барьерная функция плаценты, следствием чего является избыточное попадание микроворсин тро-фобласта в системный кровоток матери ( Sargent I.L., 1998). Персистенция этих антигенов плодового происхождения на системном уровне может стимулировать развитие специфического иммунного ответа, и, как следствие, приводить к активации цитоксических лимфоцитов у женщин с гестозом.

Обращало на себя внимание резкое увеличение периферического пула лимфоцитов с фенотипом CD4+CD8+ (р<0,05) у женщин с водянкой. У женщин с нефропатией отмечались сходные изменения иммунологических параметров, но они были выражены в меньшей степени. Кроме того, при нефропатии отсутствовало повышение уровня Т-хелперов (р>0,05).

Анализ экспрессии активационных маркеров на поверхности лимфоцитов периферической крови показал, что у женщин с гестозом достоверно повышалось содержание активированных лимфоцитов (CD71+, CD95+, HLA-DR) и Т-хелперов (CD4+CD25+) в периферической крови, но снижалось содержание цитотоксических лимфоцитов (ЦТЛ), экспрессирующих маркер ранней активации (CD8+CD25+) (р< 0,05, во всех случаях) по сравнению с аналогичными пара-

10

метрами при физиологической беременности. Следует отметить, что у женщин с водянкой возрастало содержание С08+НЬА-0Я+ клеток (р<0,001), при неф-ропатии-СБ4+НЬА-ОЯ+ лимфоцитов (р<0,05).

Наши результаты согласуются с литературными данными об усиление Т-клеточной активации у женщин с беременностью, осложненной гестозом (Ма1-Мепзеп Ь. е1 а1, 1995). Возможным объяснением усиления активации периферических лимфоцитов у женщин с гестозом может быть упоминавшееся выше вирусное инфицирование. Подтверждением этого предположения может служить вьивленное нами усиление экспрессии НЬА-ОЯ молекул на поверхности СБ8+ лимфоцитов, что часто наблюдается при вирусной инфекции. С другой стороны, циркулирующие в кровотоке матери тканевые антигены плодового происхождения также могут оказывать стимулирующее воздействие на лимфоциты и приводить к их активации.

Усиление процессов активации лимфоцитов при гестозе сопровождалось повышением количества наивных Т-хелперов (СВ4+СБ4511А+) в периферической крови, при чем оно было максимальным у женщин с водянкой (р<0,001).

Следует особо отметить, что в периферической крови женщин с нефропа-тией по сравнению с показателями при физиологической беременности повышалось общее количество С011Ь+ лимфоцитов (р<0,05). Известно, что молекула СШ1Ь относится к классу (32- интегринов, которые связываются со многими лигандами, представляющими собой трансмембранные белки и обеспечивающими выполнение сигнально-трансдукторной функции (Пальцев М.А. и др., 1995). Кроме того, СОНЬ молекулы могут связываться с 1САМ-1и 1САМ-2, которые являются интегральными мембранными гликопротеидами, широко представленными на различных клетках организма, в том числе и на эндотелиоци-тах. Выявленное нами повышение экспрессии СБПЬ молекул периферическими лимфоцитами у женщин с более тяжелой формой гестоза может свидетельствовать об усиленном выходе активированных лимфоцитов из сосудистого русла в ткани с последующим развитием патологических реакций на тканевом уровне.

Таким образом, в целом состояние иммунной системы женщины при гес-тозе на системном уровне характеризовалось увеличением содержания ЕК, гиперактивацией лимфоцитов, повышением уровня наивных и незрелых Т-клеток. При водянке активация затрагивала в основном популяцию ЦТЛ, а при нефро-патии - популяцию Т-хелперов. Кроме того, при нефропатии усиливалась экспрессия адгезионных молекул на лимфоцитах.

Для выявления особенностей формирования локального иммунного ответа у женщин с гестозом нами был проведен сравнительный анализ направленности изменений популяционного состава и параметров активации лимфоцитов на системном и локальном уровне как в норме, так и при патологии (таблица 1).

Было установлено, что при физиологической беременности популяцион-ный состав лимфоцитов децидуальной оболочки плаценты по сравнению с лимфоцитами периферической крови характеризовался более низким уровнем Т-лимфоцитов (р<0,001) и Т-хелперов (р<0,001) и более высоким содержанием пула незрелых Т-клеток (С04+СЭ8+) и ЕК (р<0,05, р<0,001, соответственно). Известно, что на поздних сроках беременности усиливаются местные цитоток-сические реакции, по-видимому, связанные с подготовкой организма к родам, в связи, с чем высокое содержание ЕК в децидуальной оболочке плаценты женщин с физиологической беременностью представляется вполне логичным.

При физиологической беременности в лейкоцитарном инфильтрате децидуальной оболочки плаценты по сравнению с параметрами периферической крови также значительно возрастал уровень активированных (СЭ71+, С095+, НЬА-ЭК+, СБ11Ь+) лимфоцитов (р<0,001, во всех случаях), при чем как Т-хелперов (С04+С025+ и СВ4+НЬА-ОЯ+) (р<0,001, во всех случаях), так и ЦТЛ (С08+С025+, СБ8+С071+ и СБ8+НЬА-ВЯ+) (р<0,05, во всех случаях). При этом содержание СЭ8+С011Ь+ (р<0,05) лимфоцитов в децидуальной оболочке плаценты снижалось, что предположительно обусловлено ослаблением супрес-сорной активности Т-лимфоцитов.

При гестозе изменения популяционного состава децидуальных лимфоцитов не зависел от формы патологии. Как при водянке, так и при нефропатии на

12

локальном уровне по сравнению с системным уровнем отмечалось снижение содержания CD3+ (р<0,001, во всех случаях) и CD4+ (р<0,001, во всех случаях) клеток и повышение CD16+ (р<0,001, во всех случаях) лимфоцитов, что соответствовало изменениям, отмечаемым нами при физиологической беременности. В то же время, при гестозе отмечалось снижение содержания CD8+ клеток (р<0,01, р<0,001, соответственно), что позволяет предположить нарушение формирования местных цитотоксических реакций, обусловленных Т-лимфоцитами.

У женщин с гестозом, как и в норме, отмечалось усиление активации де-цидуальных лимфоцитов по сравнению с показателями периферической крови, однако при гестозе характер экспрессии активационных маркеров на поверхности регуляторных субпопуляций децидуальных лимфоцитов был иным, и зависел от степени тяжести гестоза. Так, при водянке беременных возрастал уровень ЦТЛ, экспрессирующих на своей поверхности рецептор для трансферрина (CD8+CD71+) (р<0,001) и снижалось содержание CD8+CDllb+ (р<0,05) клеток, чего не наблюдалось при нефропатии. При обеих формах гестоза возрастало содержание Т-хелперов, экспрессирующих маркер поздней активации лимфоцитов (CD4+HLA-DR+) (р<0,001, во всех случаях), дополнительно наблюдалось усиление экспрессии рецептора для ИЛ-2 (р<0,001, во всех случаях) и Fas АГ на поверхности ЦТЛ (CD8+CD25+; CD8+CD95+) (р<0,01, р<0,05, соответственно).

Заслуживает особого внимания достоверное снижение на локальном уровне при различных формах гестоза содержание наивных лимфоцитов, а также количество Т- хелперов (CD4+CD45RA+) (р<0,001. р<0,05, соответственно) и ЦТЛ (CD8+CD45RA+) (р<0,001, р<0,01, соответственно), тогда как при физиологической беременности нами отмечалось повышение уровня этих клеточных популяций в децидуальной оболочке плаценты.

Таким образом, локальный иммунный ответ у женщин с гестозом отличался от такового при физиологической беременности более низким уровнем ЦТЛ и наивных Т-клеток как среди Т-хелперов, так и ЦТЛ.

При сравнении фенотипического профиля децидуальных лимфоцитов у женщин с гестозом и физиологической беременностью выявлено, что для водянки беременных было характерно снижение преимущественно ЕК (р<0,01), а для нефропатии - снижение уровня ЦТЛ и ЕК (р<0,01, в обоих случаях) (таблица 1).

Изменения экспрессии активационных маркеров децидуальными лимфоцитами у женщин с гестозом также имели неодинаковую направленность при различных степенях тяжести заболевания. Так, у женщин с водянкой в дециду-альной оболочке плаценты отмечалось достоверное повышение содержания активированных Т-хелперов с фенотипом С04+С071+ (р<0,01+) и ЦТЛ, экспрес-сирующих СБ25 и СЭ71 молекулы (р<0,001, р<0,05, соответственно). Это позволяет говорить о высоком содержании клеток, находящихся на ранних этапах активации, и об усилении пролиферации децидуальных лимфоцитов у женщин с легкими формами гестоза. Напротив, при нефропатии количество активированных лимфоцитов значительно снижалось (С071+ (р<0,001), СБ95+ (р<0,05), НЬА-БШ- (р<0,01), С011Ь+ (р<0,001)) по сравнению с таковым при физиологической беременности. Это согласуется с приведенными выше данными о снижении содержания ЦТЛ при более тяжелых формах гестоза и также свидетельствует об угнетении локальных специфических цитотоксических реакций, обусловленных Т-лимфоцитами. По-видимому, падение уровня цитотоксических лимфоцитов в децидуальной оболочке при гестозе играет роль в развитии данной патологии. Помимо этого, при обеих формах гестоза отмечалось увеличение пула С04+СЭ95+ лимфоцитов (р<0,001, р<0,01, соответственно), что может косвенно свидетельствовать об элиминации активированных клонов Т-хелперов в децидуальной оболочке плаценты при нефропатии. Угнетение ЦТЛ на фоне элиминации активированных клонов Т-хелперов может отражать истощение иммунного ответа при нефропатии.

14

Кроме того, полученные данные свидетельствуют о различном уровне активации лимфоцитов в норме и при гестозе различной степени тяжести.

Результаты эксперимента по изучению ответа лимфоцитов на митоген-ный стимул in vitro подтверждают предположение о различном уровне исходной активации децидуальных лимфоцитов при водянке и нефропатии беременных. При физиологической беременности 24-часовая инкубация децидуальных лимфоцитов с ФГА приводила к усилению экспрессии лимфоцитами всех изучаемых активационных маркеров (CD25+ (р<0,05), CD71+ (р<0,01), HLA-DR+ (р<0,05), CD95+ (р<0,01), CDllb+ (р<0,05)), при водянке в этих же условиях нами наблюдалось лишь увеличение содержания CD95+ лимфоцитов (р<0,05). Это может быть следствием исходного высокого уровня активации клеток при водянке, когда дополнительная стимуляция приводит лишь к апоптозу активированных клонов клеток.

Ответ децидуальных лимфоцитов на стимуляции ФГА при нефропатии характеризовался усилением экспрессии CD25, CDllb и CD95 молекул (р<0,01, во всех случаях). Отсутствие усиления экспрессии маркеров поздних этапов активации при нефропатии, в отличие от физиологической беременности, может быть обусловлено угнетением функциональной активности децидуальных лимфоцитов при тяжелых формах гестоза. Это может быть как отражением функционального дефекта, служащего предпосылкой развития гестоза, так и может быть связано с воздействием антигенного стимула, в роли которого может выступать инфекционный агент. Это предположение подтверждается данными Sacks G.P. и Sargent I.L., которые предположили, что гестоз развивается только на те инфекционные агенты, которые стимулируют синтез ИЛ-12.

Таким образом, как спонтанный уровень экспрессии активационных молекул децидуальными лимфоцитами, так и ответ лимфоцитов на антигенную стимуляцию in vitro свидетельствуют о том, что на локальном уровне при водянке отмечалась активация лимфоцитов, тогда как при нефропатии, напротив, угнетение функциональной активности клеток.

Усиленная активация децидуальных лимфоцитов при водянке сопровождалась также снижением содержания наивных С04+ (С04+СБ4511А+) и СБ8+ (С08+С045ЯА+) клеток (р<0,001, в обоих случаях). Вероятно, это обусловлено увеличением содержания коммитированных лимфоцитов и высоким уровнем напряженности локальных иммунных реакций при легких формах гестоза. При этом у женщин с нефропатией наблюдалось достоверное повышение общего количества наивных лимфоцитов (С04511А+) (р<0,01). Одновременно содержание некоммитированных Т-хелперов при нефропатии (СВ4+С045ЯА+) снижалось, как и при водянке, в то время как уровень СВ8+С045ИА+ лимфоцитов в децидуальной оболочке плаценты женщин с нефропатией не изменялся (р<0,001, р>0,05, соответственно).

Таким образом, при гестозе, по-видимому, наблюдается увеличение содержания коммитированных Т-хелперов и пула клеток памяти, однако диффе-ренцировка Т-хелперов происходит, скорее всего, не за счет пула ТЫ клеток, так как не отмечается усиление активности локальных цитотоксических реакций, как это имеет место при физиологической беременности. По-видимому, у женщин с гестозом формируется преимущественно ТЬ2- зависимый тип иммунного ответа, чрезмерная активация которого может вести к развитию аутоиммунных реакций немедленного типа. Все это свидетельствует о том, что при гестозе отмечается извращенный тип иммунного ответа.

Полученные нами данные о продукции цитокинов децидуальными МНК подтверждают это предположение.

Было установлено, что при водянке достоверно снижалась продукция децидуальными мононуклеарами как ИФНа, так и ИФНу (р<0,001, во всех случаях), в то время как содержание ИЛ-10, ИЛ-8 и ЭФР В СН 24-часовых культур децидуальных МНК, напротив, возрастало (р<0,001, во всех случаях) по сравнению с показателями при физиологической беременности. Вероятно, снижение продукции ИФНу и усиление синтеза ИЛ-1Р и ИЛ-8 в децидуальной оболочке плаценты при водянке способствует нарушению дифференцировки Т-хелперов и чрезмерной активации ТЬ2. С другой стороны, усиленная продукция

16

ЭФР приводит к активации и пролиферации лимфоидных децидуальных клеток при водянке, что согласуется с приведенными выше данными о повышении уровня активированных и пролиферирующих Т-лимфоцитов в децидуальной оболочке плаценты при водянке.

Следует отметить, что изменения продукции интерферонов у женщин с нефропатией были сходны с таковыми при водянке, однако, уровень синтеза ИФНу (р<0,001) при нефропатии был снижен более резко, чем при водянке. Вероятно, отмеченные нами нарушения формирования ТЫ типа иммунного ответа при водянке значительно усиливаются по мере нарастания выраженности гестоза. Это позволяет предположить, что угнетение локальной продукции ИФНу и нарушение функции цитотоксических клеток играет особую роль в патогенетических механизмах развития гестоза.

В то же время, при нефропатии отмечались изменения в синтезе цитоки-нов характерные только для этой патологии. Так, только при нефропатии отмечалось снижение продукции ЭФР децидуальными мононуклеарами (р<0,001). Физиологическая роль ЭФР пока не совсем ясна. Вероятно, как и ТФРа, он участвует в регуляции пролиферации клеток. Снижение продукции ЭФР также косвенно свидетельствует о снижении пролиферативного ответа децидуальных лимфоцитов при нефропатии.

Заслуживает особого внимания тот факт, что только для нефропатии было характерно локальное усиление продукции ФНОа и ИЛ-1Р (р<0,001, во всех случаях). Поскольку эти цитокины способны влиять на состояние сосудов и активировать эндотелиальные клетки, усиление их продукции децидуальными клетками также может играть важную роль в патогенезе гестоза, индуцируя воспалительный каскад. Известно, что ФНОа напрямую активирует тканевую протромбиназу, что, в свою очередь, ведет к усилению прокоагуляционной активности эндотелиальных клеток и развитию коагулопатии (КпаскБ1еск М. et а1, 2001). ИЛ-1 обладает широкой биологической активностью и действует в синергизме с ФНОа и ИЛ-6. Особо хочется отметить, что ИЛ-1 активирует пролиферацию и дифференцировку ТЬ2, синтез Т-лимфоцитами ИЛ-2 и экс-

17

прессию рецепторов для ИЛ-2 ( Ярилин A.A., 2000). ИЛ-1 активирует макрофаги, способствует синтезу белков острой фазы, компонентов комплимента, коллагена и коллагеназ (Фрейдлин И.С., 2000). Повышение уровня ИЛ-1 в крови ассоциируется с активацией эндотелиальных клеток. Кроме того, ИЛ-1 способен активировать синтез других цитокинов (Ковальчук Л.В. и др., 2001). Однако клетки организма не способны к спонтанному синтезу ИЛ-1, и вырабатывают его только под влиянием какого-либо стимула, например, инфекции, токсинов или других цитокинов.

Суммируя полученные нами результаты, можно сделать вывод о том, что развитие гестоза на всех уровнях иммунного ответа сопровождается нарушением функций цитотоксических клеток, предположительно за счет развития локального иммунного ответа Th2 типа. В децидуальной оболочке плаценты при гестозе снижается продукция цитокинов Thl типа, но усиливается синтез про-воспалительных цитокинов. При этом у женщин с водянкой отмечается гиперактивация децидуальных лимфоцитов, а при нефропатии, напротив, происходит снижение активации лимфоцитов и угнетение функции клеток с цитотокси-ческой активностью.

Выводы:

1.Гестоз беременных сопровождается изменениями иммунного ответа как на системном, так и на локальном уровне, проявляющимся в изменении характеристик популяционного состава, параметров активации лимфоцитов и синтеза цитокинов. Характер изменений иммунного ответа при гестозе зависит от степени тяжести заболевания: при водянке наблюдается гиперактивация лим-фоидных клеток, а при нефропатии - угнетение их активности.

2. Фенотипический профиль лимфоцитов периферической крови женщин с гестозом независимо от степени тяжести характеризуется повышенным содержанием ЦТЛ (CD8+) и EK(CD16+), а также незрелых (CD4+CD8+) и активированных лимфоцитов (CD71+, CD95+ и HLA-DR+), активированных Т-хелперов (CD4+CD25+, CD4+CD95+), некоммитированных Т-хелперов

(CD4+CD45RA+) и снижением уровня CD8+CD25+ лимфоцитов. Отличительной чертой лимфоцитов периферической крови женщин с водянкой беременных является повышение содержания CD4+ и CD8+HLA-DR+ лимфоцитов, нефропатией - высокий уровень CD4+HLA-DR+, CDllb+ и CD8+CD45RA+ клеток.

3. При физиологической беременности популяционный состав лимфоид-ных клеток децидуальной оболочки плаценты отличается от параметров периферической крови снижением содержания Т-лимфоцитов, Т-хелперов и CD8+CDllb+ клеток, повышением уровня ЕК и незрелых CD4+CD8+ лимфоцитов, усилением активации как Т-хелперов, так и ЦТЛ, повышением количества CD95+ лимфоцитов и пула наивных лимфоцитов преимущественно CD4+ клеток.

4. У женщин с гестозом децидуальные лимфоциты отличаются от периферических более низким содержанием клеток с классическим фенотипом (CD3+, CD4+, CD8+), наивных клеток и повышенным уровнем ЕК (CD16+), Т-хелперов, экспрессирующих HLA-DR АГ, и ЦТЛ, экспрессирующих CD25 и CD95 молекулы. При этом, на поверхности децидуальных лимфоцитов женщин с водянкой беременных повышается экспрессия рецепторов к трансферрину, Fas антигена и адгезионных молекул, увеличивается количество ЦТЛ с фенотипом CD71+ и снижается содержание CD8+CD11Ь+ клеток, а в группе женщин с нефропатией повышается количество лимфоцитов, экспрессирующих рецептор к ИЛ-2.

5. Фенотипический профиль децидуальных лимфоцитов при гестозе беременных отличается от такового у женщин с физиологической беременностью снижением уровня ЕК клеток и повышением количества Т-хелперов, экспрессирующих CD95 молекулу. Помимо этого, в децидуальной оболочке плаценты женщин с водянкой беременных по сравнению с показателями при физиологической беременности отмечается высокое содержание незрелых клеток (CD4+CD8+), активированных Т-хелперов (CD4+CD71+) и ЦТЛ (CD8+CD25+, CD8+CD71+), снижение количества некоммитированных CD4+ и CD8+ лим-

фоцитов; при нефропатии отмечается снижение содержания CD3+, CD8+ клеток, наивных Т-хелперов, экспрессии активационных молекул CD71, CD95, CD lib, HLA-DR и повышение уровня наивных клеток (CD45RA+) в общей популяции лимфоцитов.

6. В эксперименте in vitro при физиологической беременности дециду-альные лимфоциты отвечают на стимуляцию ФГА повышением экспрессии всех активационных молекул (CD25, CD71, CD95, CD1 lb, HLA-DR), при водянке беременных - только Fas антигена, а нефропатии - CD25, CD1 lb и CD95 молекул.

7. Спонтанная продукция цитокинов коротко-живущими культурами МНК децидуапьной оболочки плаценты при гестозе по сравнению с таковой у женщин с физиологической беременностью характеризуется снижением синтеза ИФНу, ИФНа и повышением синтеза ИЛ-lß. Помимо этого, для женщин с водянкой беременных характерным является усиление синтеза ИЛ-8 и ЭФР, а женщин с нефропатией - повышение синтеза ФНОа и снижение продукции ЭФР.

Практические рекомендации.

1. Для диагностики гестоза в периферической крови женщин в III триместре беременности рекомендуется определять содержание CD4+CD8+ лимфоцитов.

2. Для уточнения степени тяжести гестоза рекомендуется определять в периферической крови беременных женщин с гестозом уровень CD4+, HLA-DR+, CD45RA+ и CDllb+ лимфоцитов, при этом высокое содержание CD4+ и CD8+HLA-DR+ лимфоцитов следует расценивать как диагностический признак водянки, а высокий уровень CD4+HLA-DR+, CDllb+ и CD8+CD45RA+ клеток - как диагностический признак нефропатии.

Список научных трудов, опубликованных по теме диссертации:

1 .Особенности иммунного реагирования при позднем гестозе на локальном и системном уровне // Медицинская иммунология. - 1999.- т.1., №3-4.- с. 37-38. (соавторы Сотникова Н.Ю., Крошкина Н.В., Кудряшова А.В., Панова И.А., Фи-линова НЛО.).

2. Иммунологические механизмы развития родового акта // Медицинская иммунология. - 1999.- т.1., №3-4,- с. 38-39. (соавторы Сотникова Н.Ю., Крошкина Н.В., Кудряшова А.В., Панова И.А., Филинова Н.Ю.).

3. Экспрессия акгивационных маркеров децидуальными лимфоидными клетками при нефропатии // Russian Journal of Immunology.-1999.-V.4, Suppl.l.-p.206. (соавторы Сотникова Н.Ю., Крошкина Н.В., Кудряшова А.В., Панова И.А.).

4. Local immune response in the progress of normal gestation // Abstr. Of European Meeting of Immunology and Reproduction.- Rome.- 1999.-p.101. (соавторы Sotnik-ovaN.Yu., Antsiferova Yu.S,, Kroshkina N.V., Kudryashova A.V., Solovjeva T.A.).

5. Local immunoregulatoiy mechanisms in gestosis: cell activation and cytokine synthesis // Abstr. of Congress of ESRADI .- Poznan, Poland.- Sept.19-21, 2000.- p. 122. (соавторы Sotnikova N.Yu., Kroshkina N.V., Panova I.A., Czarkova R.H.).

6. Продукция интерферона-у в децидуальной оболочке при гестозе // Медицинская иммунология. - 2000. - том 2, №2. - с. 187. (соавторы Сотникова Н.Ю., Панова И.А., Крошкина Н.В., Царькова Р.Х.)

7. Локальный иммунный ответ в динамике неосложненной беременности И Медицинская иммунология. - 2000. - том 2, №2. - с.194-195. (соавторы . Сотникова Н.Ю., Анциферова Ю.С., Крошкина Н.В., Кудряшова А.В., Соловьева Т.А., Букина Е.А.).

8. Характеристика продукции цитокинов в децидуальной оболочке плаценты при гестозе // Медицинская иммунология,- 2001.- т.З.- №2,- с.253.(соавторы Сотникова Н.Ю., Крошкина Н.В., Панова И.А., Царькова Р.Х.).

9. Immune events at maternal-fetal interface in normal and complicated by gestosis pregnancy // Am. J. Reprod. Immun.- 2001 .-v.46.-№1 .-p.94.(соавторы Sotnikova N., Kroshkina N., Kudryashova A., Panova I., Tzarkova R.).

10. Особенности процессов активации и продукции регуляторных цитокинов на локальном уровне при гестозе // Медицинская иммунология.- 2001.- т.З.- №2,-с.249-250.(соавторы Сотникова Н.Ю., Крошкина Н.В.).

11. Экспрессия изотопов молекул СБ45 при гестозе // Медицинская иммунология 2001,- т.З,- №2,- с.252.(соавторы Сотникова Н.Ю., Крошкина Н.В.).

Таблица 1.

Фенотипический профиль лимфоидных клеток на системном и локальном уровне при физиологической беременности и гестозе.

Показатель Периферическая кровь Децидуальная оболочка плаценты

(%) Физиологическая Водянка бере- Нефропатия (1-Н) Физиологическая Водянка бере- Нефропатия (1-Н)

беременность менных беременных беременность менных беременных

(п=15) (п=15) (п=15) (п=15) (п=15) (п=15)

СЭЗ+ 68,8311,09 69,52±1,57 76,2910,84 31,8611,68 33,2910,78 25,6711,28

С04+ 39,48±0,82 45,43±0,86 41,6911,42 20,0111,27 22,14+0,48 21,710,56

СЭ8+ 23,07±0,91 26,1810,67 26,7910,76 23,3110,48 23,2110,65 19,91+1,05

СЭ16+ 11,7410,38 14,1310,43 15,5711,30 32,83+1,96 25,5811,07 25,1911,90

С04+С08+ 1,4110,43 5,4411,59 2,8410,49 2,78+0,35 6,31+1,28 3,110,16

С025+ 6,19±0,64 6,6510,47 5,1410,38 5,8210,49 7,32Ю,56 7,1110,61

С071+ 6,52±0,67 8,6710,54 9,1410,68 12,5910,72 12,4310,90 8,0310,95

НЬ\-ОЯ+ 9,83±0,42 14,2210,67 11,7610,26 16,3511,05 14,9910,93 11,8910,74

С095+ 8,93±0,93 13,5510,89 11,3810,60 16,5110,75 17,2310,86 13,32Ю,95

С011Ь+ 12,54+0,96 11,0211,06 16,1210,90 23,43+1,11 14,9511,28 14,1711,24

С045ЯА+ 32,07±4,57 48,98+1,59 57,8213,34 45,7911,64 35,0713,54 56,6412,74

С04+/25+ 2,1010,19 3,5810,48 3,8810,25 4,0710,49 3,4210,20 4,7410,70

С04+/71+ 6,34±0,95 6,1210,80 7,2610,46 3,3310,46 6,0010,57 4,5210,55

С04+ЯЖ+ 1,94±0,43 2,5910,42 3,3610,40 7,5310,59 6,4910,74 9,0110,45

СЭ4+/95+ 3,77±0,52 11,0810,87 7,010,45 4,2910,42 7,4110,62 8,6011,31

С04+/45ЯА+ 3,37±0,81 31,1515,17 8,7211,38 12,8711,01 6,6710,74 5,0710,59

С08+/25+ 1,52±0,23 0,3610,10 0,7510,18 2,6210,34 5,3510,60 3,3210,54

С08+/71+ 2,87±0,60 1,6810,39 4,110,60 4,8611,01 7,5110,75 4,9310,49

С08+/НЬА-Ш1+ 4,2410,63 10,1311,24 4,1910,46 7,7711,18 10,2511,08 5,810,75

С08+/95+ 4,55±0,69 4,9510,91 6,2810,45 7,6311,57 9,0511,25 9,5211,24

С08+/45ЯА+ 11,7±1,84 15,4510,39 19,1312,08 14,4811,01 8,3310,76 12,810,63

С08+/11Ь+ 13,03+1,93 11,811,10 9,0210,63 7,7910,90 8,7610,72 7,6510,48

Формат бумаги 60x84 1/16. Тираж 80 экз.

Печать плоская. Заказ 539

Отпечатано в ОМТ МИБИФ 153003, г. Иваново, ул. Рабфаковская, 34, оф. 101, тел. (0932) 38-37-36