Автореферат и диссертация по медицине (14.00.23) на тему:Фенотип сократительных клеток и экстрацеллюлярный матрикс в эмбриональных сосудах и плаценте человека

р г Б ОД 2 1 М№ Ю9Г7

На правах рукописи

НАНАЕВ Азизбек Касымкулович

ФЕНОТИП СОКРАТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ЭКСТРАЦЕЛЛЮЛЯРНЫЙ МАТРИКС В ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СОСУДАХ И ПЛАЦЕНТЕ ЧЕЛОВЕКА [ИММУНОМОРФО ЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.00.23 — гистология, цитология и эмбриология

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ ДОКТОРА МЕДИЦИНСКИХ НАУК

М ос к па — 1997

Работа выполнена в Институте экспериментальной кардиологии Кардиологического научного центра Российской Академии медицинских наук и в Институте Анатомии Медицинского факультета Аахенского университета Северной Рейн-Вестфалии, Германия.

Научный к о н с у л ь т а Ii т:

Президент Международной ассоциации плацентологов, Председатель Европейской группы плацентологов, профессор П. КАУФМАН

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Б. В. ВТЮРИН

доктор медицинских наук,

профессор А. Б. ШЕХТЕР

доктор биологических наук,

профессор Г. Е. ОНИЩЕНКО

Ведущая организация: Московская Государственная Академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К. И. Скрябина.

Защита диссертации состоится « ¿¿Ъ 'UJifrM' 1997 г. в час. на заседании Специализированного Совета Д 001.04.01 при НИИ морфологии человека РАМН по адресу: 117418, Москва, ул. Цюрупы, 3

Автореферат разослан «с?/» иг&б-гхл^ 1997 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ морфологии человека РАМН

Ученый секретарь Специализированного Совета, кандидат биологических наук

И. Н. ЕМЕЛЬЯНЕНКО

Заказ 242 Поди, к печати 31.03.97 г. Тираж 120 Печ. л. 2

Типография ВИЛ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Проведенное исследование направлено на решение фундаментальных проблем, касающихся дифференцировки сократительных клеток и формирования экстрацелотолярного матрикса (ЭЦМ) в разные сроки эмбрионального развития. В настоящей работе одной из важнейших задач является исследование фенотипических особенностей сократительных клеток в эмбриональных сосудах, что позволит глубже понять их роль в норме и при патологии кровеносных сосудов во взрослом организме. Нами предполагалось, что в зависимости от сроков эмбрионального развития можно наблюдать различные стадии дифференцировки гладкомышечных клеток (ГМК), что проявляется в разной степени экспрессии цитоскелетных и сократительных белков, а также своеобразии их ультраструктуры.

Подробное сравнительное иммуногистохимическое исследование эмбриональных сократительных клеток поможет выявить фенотипнчесхие особенности ГМК и их роль при патологических процессах в сосудах, в. частности, при атеросклерозе. В осложненных атероматозных бляшках аорты были обнаружены ГМК, содержащие десмин, хотя в нормальной интнме аорты такие клетки отсутствовали (Kocher, Gabbiani, 1986; Бабаев с соавт., 1990). Более того, часть ГМК не экспрессирует гладкомышечный (гм) миозин, что, по мнению авторов, обусловлено модуляцией ГМК в атеросклеротических бляшках (Бабаев с соавт., 1990). При экспериментальном повреждении эндотелия и в атеросклеротических бляшках обнаружено, что содержание а-актина в ГМК аорты снижается (Kocher et al., 1984; Gabbiani et ai., 1984; Kocher, Gabbiani, 1986; Barja et al., 1986). Изменение фенотипа ГМК во взрослом организме выявлено в процессе старения и при сосудистых заболеваниях (Dilley et al., 1987; Schwartz et al., 1986). По многим ультраструктурным и биохимическим характеристикам фенотип ГМК интимы аорты приближается к эмбриональным ГМК (Gerrity, 1975; Kocheret al., 1984;Sprinkle, Subbiah, 1987).

Имеются многочисленные данные по изучению механизма влияния ЭЦМ на дифференцировку и пролиферацию клеток, взаимодействия компонентов ЭЦМ между собой и с клетками (Sappino et al., 1990; Leslie et al., 1992; Schürch et al., 1992; Desmouliere et al., 1993). Однако, мы не нашли сведений о строении и распределении компонентов ЭЦМ в эмбриональных сосудах, а также о сократительных или стромальных клетках, которые продуцируют ЭЦМ в онтогенезе человека. Кроме того, отсутствуют четкие представления о строении и распределении ЭЦМ в артериальной стенке в норме и при атеросклерозе (Barnes, 1985; Маупе, 1986).

Для изучения фенотипов ГМК, строения и распределения ЭЦМ, а также клеток его продуцирующих, удобной моделью может служить система мать-плод, а именно:

кровеносные сосуды эмбриона, пупочный канатик и плаценту человека. С одной стороны, все эти структуры являются эмбриональными тканями, которые имеют определенный срок внутриутробного развития и могут содержать такие же высоко-дифференцированные клеточные элементы, ответственные за синтез ЭЦМ, как и ткани взрослого организма. С другой стороны, данные структуры выполняют различные функции, что, несомненно, сказывается на дифференцировке ГМК и стромальных клеток, экспрессии ими цитоскелетных и сократительных белков, а также компонентов ЭЦМ.

Существуют многочисленные, хотя и разрозненные сведения об экспрессии цитоскелетных и сократительных белков как стромальными клетками в пупочном канатике (Rasper et al., 19В8; Takechi et al., 1993; Eyden et al., 1994), так и стромальными клетками в ворсинах плаценты (van Muijen et al., 1987; Beham et al., 1988; Bradbury, Ockleford, 1990; Spam eta!., 1994; Kohnen et al., 1995, 1996; Derair et al., 1996), Однако, отсутствуют или очень мало данных по экспрессии цитоскелетных и сократительных белков в ГМК, которые расположены в кровеносных сосудах эмбриона (Nikkari et al., 1988), пупочного канатика, а также плаценты (Kohnen et al., 1995, 1996) человека. Также мало изучена экспрессия и локализация ЭЦМ в сосудах эмбриона и пупочного канатика человека. Более полно исследовано распределение ЭЦМ в плаценте человека (Amenta et al., 1986; Autio-Harniainen et al., 1991; Nanaev et al., 1991 a; Castellucci et al., 1993 a; Frank et al., 1994).

В настоящей работе при исследовании сосудов эмбриона, пупочного канатика и плаценты в процессе эмбрионального развития основное внимание было уделено поиску таких фенотипических особенностей ГМК и стромальных клеток, которые выражаются в характере экспрессируемых цитоскелетных и сократительных белков, а также в составе и распределении ЭЦМ. Актуальность данной проблемы заключается в том, что подробное сравнительное иммуногистохимическое исследование эмбриональных сократительных клеток поможет понять фенотипические изменения ГМК в норме и при патологических процессах в тканях. Цель исследования

Основная цель исследования - выявить общие закономерности и особенности дифференцировки эмбриональных сократительных клеток кровеносных сосудов, экспрессии ими цитоскелетных и сократительных белков, а также компонентов ЭЦМ. Показать фенотипические особенности стромальных клеток, которые окружают эмбриональные сосуды и проявляют свойства миофибробластов. Задачи исследования

Для решения выдвинутой проблемы были поставлены следующие задачи: - выявить фенотипы ГМК в эмбриональных сосудах плода человека на разных стадиях беременности;

- выявить фенотипы сократительных и стромальных клеток в пупочном канатике человека в разные сроки эмбрионального развития;

- выявить фенотипы сократительных и стромальных клеток з ворсинах плаценты человека в разные сроки беременности;

- проанализировать состав и строение ЭЦМ в эмбриональных сосудах плода человека на разных стадиях беременности;

- показать состав и строение ЭЦМ в пупочном канатике человека в разные сроки эмбрионального развития;

- проанализировать состав и строение ЭЦМ в ворсинах и фибриноиде плаценты человека в разные сроки беременности;

- сопоставить дифференцировку сократительных сосудистых клеток и стромальных клеток;

- провести сравнительный анализ сосудистых и несосудистых ГМК. Научная новизна

В настоящей работе впервые показано, что в сосудах эмбриона человека на всех этапах эмбрионального развития существует популяция гетерогенных ГМК. В артериях эластического и мышечного типов у эмбриона человека найдены десмин-негативные ГМК, в то время как в венозных сосудах - десмин-позитивные ГМК. Десмин-положительные ГМК эмбриональной вены имеют одинаковый фенотип с несосудистыми ГМК пищевода и мочеточника эмбриона человека.

При исследовании сосудов раннего и зрелого пупочного канатика человека на всем протяжении вплоть до разветвлений сосудов в крупных стволовых ворсинах плаценты впервые показано, что ГМК артерии и вены имеют разный фенотип. Присутствие десмина в ГМК может служить маркером для дифференциальной диагностики между артериями и венами в средних и малых стволовых ворсинах, а также в промежуточных ворсинах плаценты, что не удается установить при просмотре гистологических препаратов, окрашенных гематоксилин-эозином.

Нами установлены определенные фенотипы внесосудистых стромальных клеток, которые относятся к миофибробластам, находящимся на разных стадиях дифференцировки и обладающие сократительной способностью. Это позволяет по-новому взглянуть на роль таких клеток, которые образуют своеобразную внесосудистую сократительную систему.

В стенке эмбриональных сосудов образование компонентов ЭЦМ происходит в ранние сроки эмбрионального развития. Компоненты ЭЦМ в крупных эмбриональных сосудах экспрессируются ГМК, эндотелиальными и стромальными клетками. В мелких сосудах, где медия представлена всего лишь одним или двумя слоями ГМК, экспрессия компонентов ЭЦМ осуществляется исключительно ГМК.

Впервые показано, что стенки каналов и щелей вартонового студня пупочного канатика содержат белки базальной мембраны, а именно: коллаген IV типа, ламинин,

гепаран сульфат протеогликан. Впервые доказано, что эти каналы и щели окружены тонкими веретеновидными клетками, которые по иммуногистохимическим и ультраструктурным свойствам относятся к миофибробластам и преимущественно соответствуют ВДАГМ-типу клеток (В - виментин, Д - десмин, А - а-актин, Г - у-актин, М - миозин).

При сравнительном иммуногистохимическом анализе в строме пупочного канатика и в строме плаценты впервые выявлены определенные фенотипы внесосудистых миофибробластов. В частности, в строме ворсин плаценты человека установлено пять подтипов внесосудистых стромальных клеток: В-, ВД-, ВДА-, ВДАГ- и ВДАГМ-тип клеток. В-тип клеток (мезенхимальные клетки) являются наиболее

недифференцированным типом клеток, которые созревают через стадию фнбробластов (ВД-тип) и далее через различные стадии миофибробластов от ВДА-типа до ВДАГ- и ВДАГМ-типа клеток. Последние два клеточных типа имеют иммуногистохимическое и ультраструктурное сходство с ГМК.

Впервые показано, что в ворсинах плаценты в направлении от трофобластического слоя к центру популяция менее дифференцированных миофибробластов сменяется высоко дифференцированными клетками. При этом во всех зонах пупочного канатика в направлении от покровного эпителиального слоя к центру присутствуют только высоко дифференцированные миофибробласты.

При проведении сравнительного иммуногистохимического и иммуноцитохимического анализа впервые установлены закономерные особенности в распределении компонентов ЭЦМ в строме ранней и зрелой плаценты человека, а также в фибриноидах различных типов.

Методом иммуноцитохимии с использованием антител, меченных коллоидным золотом, впервые достоверно выявлена локализация коллагена IV типа вне базальных мембран в строме ворсин зрелой плаценты. Практическая ценность работы

С помощью сравнительного иммуногистохимического анализа в эмбриональных сосудах различного типа выявлены разные по фенотипу популяции ГМК. Присутствие десмина в ГМК может служить надежным маркером при решении задач, связанных с выяснением какой именно фенотип ГМК принимает непосредственное участие в том или ином патологическом процессе в кровеносных сосудах. Подобная ситуация может возникнуть в большом числе случаев при воспалительных или атеросклеротических процессах в сосудах, при радиационном повреждении сосудов, а также при ангиогенезе, что имеет место, например, при опухолевых процессах. Наконец, подобный маркер ГМК позволяет провести дифференциальную диагностику между артериями и венами в тех случаях, когда это не удается, установить при исследовании гистологических препаратов, окрашенных гематоксилин-эозином.

Полученные данные по строению и распределению ЭЦМ в эмбриональных сосудах имеют практическое значение при диагностике патологических процессов в сосудах, где изменяется как количественное, так и качественное соотношение компонентов ЭЦМ. Установленные общие закономерности и особенности локализации компонентов ЭЦМ в ворсинах и фибринонде плаценты человека также могут иметь практическое значение при изучении патологии плаценты. Особенно это важно при изучении таких форм патологии, которые сопровождаются тяжелыми осложнениями (пре-эклампсия, внутриматочная задержка роста плода) и в конечном итоге могут привести к смерти плода.

Полученные данные, касающиеся популяций разных фенотипов ГМК, внесосудистых стромальных клеток, а также строение и распределение ЭЦМ в эмбриональной ткани, представляют ценную научную информацию, которая может быть использована в учебном процессе в курсе общей и частной гистологии на биологическом и медицинском факультетах высших учебных заведений. Основные положения, выносимые на защиту

1. В эмбриональных сосудах существуют разные по фенотипу популяции ГМК. В зависимости от экспрессии цитоскелетнык и сократительных белков различают десмин-положительные и десмин-отрицательные ГМК. Наличие и соотношение этих клеток зависит от типа кровеносных сосудов.

2. Внесосудистые стромальные клетки пупочного канатика и ворсин плаценты представляют собой разные фенотипы миофибробластов, которые различаются между собой разной степенью экспрессии цитоскелетных и сократительных белков, а также ультраструктурными особенностями.

3. Степень дифференцировки ГМК и внесосудистых стромальных клеток в пупочном канатике и в ворсинах плаценты в направлении от наружного покровного слоя к центру зависит от места их локализации и сроков эмбрионального развития.

4. Формирование и локализация компонентов ЭЦМ обусловлены степенью дифференцировки сократительных клеток, а также присутствием других несосудистых клеток и их количественным соотношением.

Апробация работы

Основные материалы диссертации доложены на 13 Всесоюзной конференции по электронной микроскопии, Москва, 1988; 12 Рочестерской трофобластической конференции, Рочестер, Америка, 1992; V конференции Европейской плацентарной группы, Манчестер, Великобритания, 1993; 89 конференции Анатомического общества, Марбург, Германия, 1994; VI конференции Европейской плацентарной группы совместно с Рочестерской трофобластической конференцией, Шра, Бельгия, 1995; 12 симпозиуме Международного Анатомического общества, Вюрцбург, Германия, 1995; 90 конференции Международного Анатомического общества, Грац, Австрия, 1995; 13 Рочестерской трофобластической конференции, Бэнф, Канада, 1996,

Внедрение научных результатов

Полученные нами научные данные используются на лекциях и практических занятиях по гистологии в Институте Анатомии медицинского факультета Аахенского университета Северной Рейн-Вестфалии в Германии. Публикации

По теме диссертации опубликовано 28 научных работ, из них 21 в зарубежной печати.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена 334 страницах машинописного текста, состоит из введения, материалов и методов исследования, 7 глав, каждая из которых включает обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, общего заключения, выводов, библиографии. Текст иллюстрирован 93 рисунками и 6 таблицами. Список цитируемой литературы включает 339 источников. Глава 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Характеристика материалов исследования

1. В работе проведено исследование экстрацеллюлярного матрикса (ЭЦМ) и клеток его продуцирующих, а именно, гладкомышечных клеток и миофибробластов в эмбриональных сосудах и окружающей их строме. Для этого были изучены сосуды эмбриона человека, сосуды пупочного канатика и плаценты человека в разные сроки эмбрионального развития.

2. Для сопоставления фенотипа сосудистых и внесосудистых ГМК проведено исследование клеток и ЭЦМ мочеточника и пищевода эмбриона человека.

3. В работе охарактеризованы различные фенотипы гладкомышечных клеток в маточно-плацентарных сосудах морской свинки при разных сроках беременности.

4. Кроме того, иследовали все основные гистологические структуры плаценты, такие как: основные типы ворсин, периворсинчатый фибриноид, цитотрофобластические островки,' базальную и хориокальную пластины, краевой синус.

Как правило, после иссечения тканей, кусочки, предназначенные для исследования, замораживали в жидком азоте и хранили при -70° С. Перед замораживанием кусочки тканей заключались в Tissue Тек (Lab-Тек Products, USA) для предохранения их от высыхания и получения более качественных срезов.

С целью отработки метода иммуноэлехтронной микроскопии и выяснения локализации соответствующих антигенов использовали культуру гладкомышечных клеток аорты кролика (культура клеток была любезно предоставлена с. н. с. В. П. Ширинским).

Для решения поставленных задач были использованы методы иммуногистохимии, электронной микроскопии и ммуноэлектронной микроскопии. Моноклональные антитела

В таблице 1 приведен перечень всех первых антител, как поликлональных, так и моноклинальных антител, которые были использованы в данной работе. Моноклональные антитела, которые были получены разными авторами в лабораториях и зачастую отсутствуют в соответствующих каталогах, выпускаемых коммерческими фирмами, имеют следующие характеристики.

Моноклональные антитела IST-9, ВС-1, IST-4 были любезно предоставлены Dr. L. Zardi (Cel! Biology Laboratoty, Instituto Nazionale per la Rícerca sul Cancro, Genova, Italy). Моноклональные антитела IST-9 специфически реагировали с ED-A последовательностью (дополнительный домен А) фибронектина (Sekiguchi et al., 1985; Borsi et al., 1987; Carnemolla et al., 1987 a, b). Поскольку домен А отсутствует в фибронектине плазмы, моноклональные антитела IST-9 позволяли идентифицировать синтез фибронектина в клетках in situ. Поэтому в наших исследованиях данный фибронектин мы называли клеточным фибронектином. Моноклональные антитела ВС-1 реагировали с ED-B последовательностью (дополнительный домен В), который присутствует только в эмбриональном фибронектине и фибронектине опухолей (Sekiguchi et al., 1986; Carnemolla et al., 1989; Borsi et al., 1991), поэтому иначе его еще называют онко-фетальным фибронектином. Моноклональные антитела IST-4 взаимодействовали с эпитопом, который является общим у всех форм фибронектина (Sekiguchi et al., 1986). Моноклональные антитела 4.29 полученные против плазменного фибронектина перекрестно реагировали с другими формами фибронектина (Koteliansky 5t al., 1982).

Моноклоначьные антитела ELM2, специфически реагирующие с энтактином, были тредоставлены А. В. Любимовым (Онкологический научный центр, Москва). Энтактин шляется одним из основных компонентов базальных мембран и имеет молекулярный iec 150 кД (Ljubimov et al., 1986). 1оликлональные антитела

Поликлональные антитела против калдесмона (Shirinsky et al., 1991) и калпонина Birukov et al., 1991) были предоставлены В. П. Ширинским (Кардиологический аучный центр, Москва). Оба типа антител специфически взаимодействовали с надкомышечными клетками стенки кровеносных сосудов и в культуре клеток, что оказано иммуногистохимическим и иммуноцитохимическим методами исследования м. главу 1 и 3).

олученне поликлональных антител к миозину гладкой мышечной ткани (выделение иозина гладкомышечной ткани и иммунохимический анализ антител проводились щместно с с. н. с. В. П. Ширинским).

пя получения специфической антисыворотки очищенный гладкомышечный миозин из глудков кур (Chacko et al., 1977) в полном адыованте Фрейнда в дозе 1 мг на животное одили кроликам подкожно в несколько точек вдоль позвоночника. На 3-ю и 5-ю дели проводили подстегивающие инъекции антигена в неполном адьюваите

Таблица 1. Перечень первых антител использованных в данной работе. пАТ -поликлональные антитела; мАТ - моноклональные антитела; ФС - флюоресценция; Стр-б - стрептавидин-биотининовый метод

Антитела

Специфичность Клон Разведение Источник ФС/Стр-б

коллаген тип I пАТ, кролик 1:20 Nanaev et al., 1991a

коллаген тип III пАТ, кролик 1:20 Nanaevet al., 1991a

коллаген тип IV пАТ, кролик 1:20 Nanaev et al., 1991a

коллаген тип IV мАТ, CIV 22 1:50/1:250 Dako

коллаген тип VI мАТ, 5С6 1:50 Biomol

коллаген тип VII мАТ, II, 32 1:50 Biomol

гепарак сульфат мАТ, 7Е12 1:10 Boehringer

протеогликан

В-1 часть ламинина мАТ, С1 1:50 Telios

человека

энтактин мАТ, ELM2 1:10 Ljubimov et al., 1986

плазменный мАТ, 4.29 1:100 Koteliansky et al.,

фибронектин 1982

домен В мАТ, ВС-1 1:4 Carnemolla et al., 1989

фибронекткна

домен А мАТ, IST-9 1:4 Carnemolla et al., 1987

фибронехтина a

фибронектин мАТ, IST-4 1:4 Borsi et al., 1987

фибриноген пАТ, кролик 1:50 Sigma

фибрин мАТ, Е8 1:50 Immunotech

виментин мАТ, V9 1:10/1:10 Dako

von Willebrand мАТ, F8/86 1:25/1:25 Dako

фактор

эндотелий мАТ, QB-end 40 1:10/1:10 Quantum Biosystems

десмин пАТ, кролик 1:30/1:100 Laboserv

десмин мАТ, DE-U1 1:50/1:100 Sigma

десмин мАТ, DE-B-5 1:20 Debus et al., 1983

а-изоформа актина мАТ, 1А4 1:500/1:700 Sigma

у-изоформа актина мАТ, В4 1:500/1:700 ICN Biomedicals

гм миозин мАТ, hSM-V 1.200/1:200 Sigma

цитокератин 5, 6, 8, мАТ, MNF 1 1:80/1:500 Dako

17, 19

калдесмон пАТ, кролик 1:20 Shírinsky et al., 1991

калпонин пАТ, кролик 1:20 Birukov et al., 1991

Ki-67 антиген, мАТ, MIB-1 1:20 Dianova

пролиферирующие

клетки

Анти-коллаген I Анти-коллатен III Антн-коллаген IV Анти-коллаген IV Анти-коллаген VI Анти-коллаген VII Анти-гепаран сульфат протеогликан Анти-ламинин

Анти-энтактин Анти-фибронектин

Анти-фибронектин

Анти-фибронектин

Анти-фибронектин Анти-фибриноген Анти-фибрин Анти-виментин Анги-фактор VIII

Анти-эндотелий

Анти-десмин Анти-десмин Аити-десмин Анти-а-гм актин Анти-у-гм актин Анти-гм миозин Анти-цитокератин

Аити-калдесмон

Анти-калпонин

MIB-1

Фрейнда в дозе 0,5 мг на животное. Титр антител определяли, используя метод иммуноферметного анализа. Кровь у кроликов забирали через 3 дня после последней инъекции с интервалом в 2 дня. Для устранения перекрестного реагирования антисыворотки к миозину гладкой мышечной ткани с немышечным миозином антисыворотку пропускали через аффинную колонку с иммобилизованным миозином из тромбоцитов человека (Sellers et al., 1981). Антитела к гладкомышечному миозину

выделяли из антисыворотки к миозину гладкой мышечной ткани на аффинной колонке с иммобилизованным гладкомышечным миозином из желудков кур. Аффинные сорбенты получали конъюгацией очишеняых белков с CNBr-активированной сефарозой 4В (Pharmacia, Sweden) по методике фирмы изготовителя. Специфичность полученных антител проверялась методом иммуноблоттинга (Towbin et al., 1979). Электрофорез проводили в полиакриламидном rene в присутствии додецилсульфата натрия по Laemmli (1970).

Получение поликлональных антител к коллагену I, III, IV, V типов (выделение коллагена различных типов и иммунохимический анализ антител проводили в совместной работе с с. н. с. С. П. Домогатским).

Коллаген I, III, IV и V типов получали из плаценты человека. Плаценту предварительно измельчали ножницами, промывали дистиллированной водой и обрабатывали пепсином. Затем экстрагировали коллаген I, III, IV и V типов 0,5 М уксусной кислотой, pH 2,8. Коллагены указанных типов разделяли последовательной дифференциальной преципитацией в кислых и нейтральных растворах NaCl (Chung and Miller, 1974; Furuto and Miller, 1980; Glanville et al., 1979; Sage and Bornstein, 1979). Кислые растворы NaCl содержали 0,5 М уксусную кислоту, pH 2,8, нейтральные растворы NaCl - 0,05 М трис-HCl, pH 7,5.

Дальнейшую очистку коллагенов I, III, IV и V типов проводили на ДЭАЭ-целлюлозе, В качестве сравнительного и контрольного белка был использован коллаген II типа, экстрагированный из хряща. Степень очистки коллагенов проверяли электрофорезом в SDS-полиакриламидном геле в присутствии меркаптоэтанола (Рис. 2). Для получения антисыворотки к коллагену человека I, III, IV и V типов кроликов иммунизировали подкожно 0,5 мг раствора коллагена, смешанного с полным адьювантом Фрейнда. Иммунную сыворотку собирали после подстегивающей иммунизации, которую проводили не менее 3-4 раз с интервалом в 3 недели, с неполным адьювантом Фрейнда. Чтобы исключить наличие неспецифически реагирующих антител, иммунные сыворотки всех типов коллагена пропускали через колонку с белками плазмы человека, иммобилизированными на сефарозе.

Наличие и титр антител к коллагену исследовали с помощью иммуноферментного анализа. Для этого 0,5 мкг очищенного коллагена адсорбировали на стенки лунок планшет фирмы Microtiter plates, Linbro в натрий-карбонатном буферном растворе, pH 9,3. Антисыворотка в норме перекрестно реагировала с более чем одним типом коллагена, что свидетельствует о наличии общих антигенных детерминант. Чтобы получить специфическую антисыворотку, ее пропускали через колонку с иммобилизированными коллагенами разных типов, за исключением того типа коллагена, который использовался для иммунизации. Очистку антител проводили с помощью аффинной хроматографии.

Специфичность антител к разным типам коллагена устанавливали с помощью конкурентного иммуноферментного анализа. Полное торможение реакции наблюдали в случаях, когда определенный тип коллагена преинкубировался с соответственными этому типу коллагена антителами. Лиофилизированные коллагены растворяли в 0,5 М уксусной кислоте, нейтрализовали, затем диализовали против забуференного Трис физиологического раствора, pH 7,5 (ТФР) и центрифугировали при 11 ООО об/мин. Концентрации коллагена определялись степенью поглощения и полученные результаты коррелировались с начальным весом препаратов. Коллагены растворяли в ТФР и готовили концентрации растворов в разведениях от 100 мкг до 1 мг/мл. Пробы коллагена (0,1 мл) смешивали с равным объемом растворов антител (ТФР) до получения оптимальной реакции при иммуноферментном анализе. После инкубации 1 ч при 20° С образцы из дунок, где отсутствовала абсорбция, переносили в покрытые коллагеном лунки и проводили иммуноферментный анализ по общепринятой методике (Rennard et al., 1980). Полученные с помощью AutoReader MR580 (Dynatech) с длиной поглощения 490 нм результаты представлены в виде графика, где показаны подсчет соотношения весов коллаген/антитело. В каждом случае выраженное торможение реакции наблюдали с соответственным типом коллагена, в то время как с другими типами коллагенов реакция практически не менялась, несмотря на десятикратный избыток коллагена. Стократный избыток коллагена давал некоторое торможение связывания. Этот эффект, возможно, связан с присутствием незначительных примесей других типов коллагена в препарате. Подобная возможность в биохимических исследованиях не может быть исключена в 1 % случаев.

Специфичность каждой партии антител, кроме того, проверяли при непрямом иммунофлюоресцентном исследовании срезов различных органов человека (сердце, печень, почки, кожа). Так например, на срезах почки коллаген III типа был обнаружен в интерстиции вокруг почечных канальцев, капсулы Боумена и в адвентиции сосудов. Коллаген IV типа был локализован в базальных мембранах клубочков и канальцев, а также в мезангиальном матриксе. Метод ичмуногистохимии

Непрямой метод иммунофлюоресценции. Серийные срезы органов (толщиной 8-10 мкм), полученные в криостате при -20° С, подсушивали при комнатной температуре и фиксировали в течение 5-10 мин. в абсолютном ацетоне при +4° С. Предметные стекла предварительно покрывали адгезионной средой APES (3-aminopropyltriethoxysitane, Sigma, Deisenhofen, Germany). Иммуногистохимическую реакцию проводили после фиксации или же срезы хранили при -20°С для последующего проведения иммуногистохимической реакции. Используемые антитела и их разведения указаны в таблице 1. Срезы преинкубировали в течение 20 мин. в забуференном физиологическом растворе (ЗФР) содержащем 1,5 % бычьего сывороточного альбумина (Bovine serum albumin, Sigma, Deisenhofen, Germany). Далее срезы инкубировали с первыми

поликлонаяьными или моноклональными антителами в течение 60 мин. при комнатной температуре с последующим промыванием в ЗФР. На следующем этапе применяли вторые антитела, коньюгировакные с флюоресцешшзотиоцианатом (ФИТЦ) (1 : 30, DAK.O, Hamburg, Germany) или с Техасским красным (1 : 50, Amersham, london, UK.) против IgG кролика и мыши. Непрямой метод иммунофлюоресценции проводили согласно Sternberger (1986).

Непрямой метод иммунофлгаорссцсишш с двойной меткой, К выше указанному методу добавляли вторую иммунохимическую реакцию с использованием соответствующих поликлональных или моноклональных антител, в зависимости от того, какие антитела использовали на первом этапе. После промывки в ЗФР срезы инкубировали при комнатной температуре в течение 60 мин. с биотинилированными антителами против IgG кролика или мыши (1 : 50, DAKO, Hamburg, Germany). Затем вновь промывали в ЗФР и инкубировали 30 мин. с Техасским красным коньюгированным с стрептавидином (1 : 50, Amersham, london, UK). После окончательной промывки в ЗФР срезы заключались в специальную среду (aqua polymount, PolysciencesLtd., Eppelheim, Germany).

Стрептавндин-бнотин пероксидазный метод. При исследовании данным методом были использованы как парафиновые, так и криостатные срезы органов. Эндогенную лероксндазу инактивировали инкубацией срезов в 1 % перекиси водорода в абсолютном метаноле. Проводили преинкубацию с неиммунной сывороткой кролика или козы, а затем с первыми антителами в течение 60 мин. при комнатной температуре. Вторые антитела против IgG кролика или мыши были использованы из коммерческого набора (Histostain SP Kit, Zymed, San Francisco, CA, USA) с применением хромогена AEC (3-amino-9-ethylcarbazol). Срезы докрашивали гематоксилином. Электронная микроскопия

После фиксации в 2,2 % глютаральдегиде кусочки тканей промывали в 0,1 М фосфатном буфере pH 7,3 и затем фиксировали 2 ч. в 1 % OsOn растворенном 0,07 М фосфатном буфере pH 7,3. После промывки в фосфатном буфере кусочки тканей обезвоживали по восходящей концентрации в этаноле, окрашивали в 1 % уранил ацетате в этаноле и заливали в аралдит (Merk, Darmstadt, Germany) с пропилен оксидом. Полутонкие срезы толщиной 0,5 мкм окрашивали толуидиновым синим. Затем проводили отбор участков представляющих интерес для последующей заточки блока и приготовления ультратонких срезов. Ультратонкие срезы толщиной 60-90 нм докрашивали уранил ацетатом и цитратом свинца. Просмотр и съемку ультратонких срезов проводили в электронном микроскопе JEM-100 СХ или Philips ЕМ 300. Метод нммуноэлектронной микроскопии

В нммуноэлектронной микроскопии широко применяют антитела, меченные пероксидазой, ферритином и холлоидным золотом. В более ранних исследованиях (Childs et al., 1986; Liesi, 1983; Mar et al., 1987) в основном проводили инкубацию

антителами криостатных срезов или монослоя культуры клеток до или после заливки в смолу, например, элон или аралдит, используя в последнем случае различные методы травления с целью более полного обнажения антигенных детерминант. В настоящее время все чаще стали применять акриловые водорастворимые смолы: Lowicryl К.4М и НМ20, К11М и НМ23, LR-White и LR-Gold (Polysciences, Eppelheim, Germany), которые позволяют хорошо выявлять структуру с сохранением антигенности. Это дает возможность проводить инкубацию антителами ультратонких срезов после заливки исследуемого материала в акриловую смолу без предварительного травления (Newman and Hobot, 1987). Указанные смолы, за исключением LR-White, полимеризуются при низкой температуре (от -20° С до 70° С) и одновременном ультрафиолетовом облучении.

Ряд основных этапов иммуноэлектронной микроскопии: конъюгация антител с коллоидным золотом, заливка в акриловые водорастворимые смолы, инкубация ультратонких срезов с антителами - имеют свои существенные особенности и модификации. С целью отработки метода и выяснения локализации соответствующих антигенов в настоящей работе исследовали раннюю (10-12 недель) и зрелую (39-40 недель) плаценту человека, эндомиокардиальные биоптаты сердца больных алкогольной кардиомиопатией и культуру гладкомыиечных клеток аорты кролика. В качестве первых антител использовали поликлональные кроличьи антитела к III и IV типам коллагена человека и к калдесмону гладких мышечных клеток, полученному из желудка цыпленка (Shirinsky et al., 1991). В качестве вторых антител применяли козьи антитела к IgG кролика, меченные коллоидным золотом. Гранулы коллоидного золота получали размером 5 нм (Muhlpfordt, 1982).

Конъюгирование вторых антител с коллоидным золотом начинали с предварительного их диализа в 2 гаМ Borax Hcl pH 9,0 в течение 12 ч и последующего центрифугирования в течение 30 мин при 100 000 об/мин и +4° С. Антитела сливали в раствор коллоидного золота при интенсивном помешивании на магнитной мешалке. Затем для стабилизации конъюгата добавляли 10 % бычий сывороточный альбумин (БСА) в конечной концентрации 1 %. Далее конъюгат освобождали от несвязавшихся иммуноглобулинов трехкратным центрифугированием при 100 000 об/мин и +4° С в течение 2 ч и ресуспендировапи в 20 mM Tris-HCI, 150 тМ NaCl, 20 тМ NaN3, 1 % БСА, pH 8,2 (буфер А). Исходный концентрированный раствор конъюгага готовили таким образом, чтобы при разведении 1:15 его поглощение составляло 0,25 при 520 нм. Перед инкубацией срезов концентрированный раствор конъюгата для удаления агрегатов осветляли центрифугированием при 5000 об/мин и +4° С в течение 20 мин. Для осаждения коллоидных частиц надосадочную жидкость центрифугировали при 100 000 об/мин и +4° С в течение 1 ч. Осадок суспендировали в буфере А с тем расчетом, чтобы из исходного концентрированного раствора конъюгата получить рабочий раствор в разведении 1:3.

Для заливки кусочков плаценты и культуры гладкомышечных клеток использовали следующие типы акриловых смол: Lowicryl К4М и НМ20, LR-White и LR-Gold (Polysciences, Eppelheim, Germany) (Acetarin et al., 1986; Bendayan et al., 1987; Newman and Hobot, 1987). Согласно исследованиям выше указанных авторов, применение различных типов акриловых водорастворимых смол не отразилось на качестве препаратов. По нашим же данным, наиболее достоверные и воспроизводимые результаты были получены лишь при использовании LR-Gold. Процедура приготовления препарата была нами упрощена: на этапе обезвоживания был использован этанол вместо метанола и поливинил пироллидона, изменена концентрация смолы и режим заливки, укорочено время полимеризации смолы с 7 суток до 24 ч, вместо конъюгата белок А-коляоидное золото использовали антитела, меченные коллоидным золотом. Приводим данный метод полностью.

Кусочки исследованных тканей фиксировали в 2 % параформальдегиде в 0,1 М фосфатном буфере, pH 7,2 в течение 2 ч при комнатной температуре (для культуры гладкомышечных клеток время фиксации сократили до 40 мин), затем переносили в 50 шМ NH<C! в забуференном физиологическом растворе (ЗФР), где выдерживали 30 мин для блокирования альдегидных групп, и промывали в ЗФ? в течение 15-18 ч при +4° С. Далее проводили обезвоживание в спиртах по восходящей концентрации: 50 % - 15 мин при О" С, (в последущем всю процедуру проводили при -20° С) 70 % - 1 ч, 90 % - 1 ч, 100 % - 30 мин. В полиэтиленовые капсулы (ВЕЕМ, Polysciences, Eppelheim, Germany) при -20° С заливали акриловую водорастворимую смолу LR-Gold в соответствующем разведении 100% этанолом: 1:1 - 30 мин, 3:7 - 1 ч, без этанола - 1 ч, с добавлением 0,5 % катализатора - 1 ч, с добавлением 0,5 % катализатора - на ночь. Полимеризацию смолы проводили в течение суток при -20° С с использованием ультрафиолетовой лампы (длина волны 360 нм).

Серебристо-желтого цвета ультратонкие срезы помещали на никелевые сетки (300 ячеек) с формваровой подложкой. Всю процедуру промывки и инкубации срезов, за исключением инкубации с первыми антителами, проводили при комнатной температуре в каплях соответствующих растворов, причем сетки плавали в каплях срезами вниз. Вначале срезы обрабатывали 50 mM NiLCl - 10 мин, затем в трис-буфере, содержащем 1 % БСА - 10 мин, и в течение ночи инкубировали с первыми антителами, разведенными в трис-буфере, содержащем 1 % БСА, в конечной концентрации 0,05 мг/мл при +4° С. После этого срезы обрабатывали в трис-буфере, содержащем 1 % БСА - 10 мин, затем только в трис-буфере - 1 мин, и, наконец, инкубировали со вторыми антителами, меченными коллоидным золотом - 1,5 ч. После этого срезы вновь промывали в трис-буфере, содержащем 1 % БСА - 10 мин и затем - в бидистиллированной воде - 5 мин. Срезы контрастировали 2 % уранилацетатом - 15 мин и цитратом свинца - 1 мин. Просмотр и съемку ультратонких срезов проводили в электронном микроскопе JEM-

100 СХ (Japan). Исследование проводили под контролем непрямого иммунофлюоресцентного метода.

Для апробации метода иммуноэлектронной микроскопии были исследованы биоптаты сердца больных алкогольной кардиомиопатией и культура ГМК.

При исследовании биоптатов сердца больных алкогольной кардиомиопатией антитела к III типу коллагена были обнаружены в склерозированном интерстиции миокарда по ходу гонких коллагеновых волок он, которые, как правило, имели тесную связь с толстыми коллагеновыми волокнами I типа. В кардиомиоцитах и клетках соединительной ткани частицы золота отсутствовали. В культуре гладкомышечных клеток аорты кролика антитела к калдесмону располагались на актиновых филаментах.

Постоянная воспроизводимость, четкая специфическая метка коллоидным золотом с минимальным неспецифическим фоном были получены только при использовании смолы LR-Gold. Необходимо учитывать, что для каждого конкретного случая следует подбирать оптимальные условия проведения обработок, учитывая специфические свойства антигенов.

Результаты собственных исследований

Глава 2. Дифферениировка стромальных клеток и архитектура пуповины человека.

При исследовании срезов пуповины мы не обнаружили существенных различий в антигенном составе стромальных клеток и в распределении ЭЦМ по продольной оси от дистального до проксимального конца пупочного канатика. В то же время, было обнаружено, что в направлении поперечной оси строма пупочного канатика человека может быть подразделена на три различные зоны согласно распределению белков ЭЦМ и цитоскелетному составу стромальных клеток. В указанные зоны входят адвентиция сосудов, вартонов студень и субамниотическая область. Стромальные клетки всех этих зон находятся на различных стадиях дифференцировки в направлении от фибробластов к миофибробластам. Эти результаты согласуются с данными Takechi с соавторами (1993), которые предполагают, что стромальные клетки, заключенные в коллагеновую сеть, являются миофибробластами. Согласно результатам наших исследований число дифференцированных клеток возрастает по мере увеличения сроков беременности. Но при этом дифференцировка стромальных клеток зависит не только от сроков развития пупочного канатика (от первого триместра до образования зрелой пуповины), но и от места локализации клеток в строме пупочного канатика (Рис. 1).

В первом триместре развития пупочного канатика клетки, которые расположены в зоне адвентиции, экспрессируют все исследованные нами антигены, тем самым соответствуя ВДАГМ-типу клеток.

Стромальные клетки вартонова студня в большей мере соответствуют ВДА- или ВДАГ-типу клеток (более центральное расположение, поздняя стадия) или даже ВД-

в В е

1

в в вд

1 1

вд вд ВДАМ

1 ; 1

ВДА вд ВДАЩМ

4 \ ^

ВДАГ ВДА ВДА{Г)М

12 недель вдагм вдаг

берем. | | | 4 16 недель] вдагм] вдаг

берем. | ' } I

мш М НИ

40 неДЭЛЫВДАГМ ВДДГМ|ВДАГ(М)! ВДА(Г) I ВДАГМ I берем.

Рис. 1. Схематическое изображение часто пупочного канатика человека. В стромальных зонах, расположенных между пупочным сосудом и амниотическим эпителием, представлены стадии дифференцировки стромальных клеток. По горизонтали внизу схемы указаны цитоскелэтныэ белки в разных зонах в течение беременности. Прерывистая линия на рисунке ниже субамниотической зоны представляет зону слияния бывшей амниотической мезодермы с внеэмбриональной мезодермой соединяющего стебелька, что наблюдается в первые 40 дней эбрионального развития. На самой поздней стадии беременности представленная в более полном объеме картина экспрессии цитоскелегных белков клетками в наружном стромальном слое отражает скорее всего их развитие из амниотической мезодермы, чем из соединяющего стебелька внеэмбриональной мезодермы. В -виментин, Д - десмин, А - а-гм актин, Г - у-гм актин, М - гм миозин. Аббревиатура антигенов, заключенных в скобки, означает, что эти цитоскелетные филаменты экспрессируются только в некоторых соответствующих клетках. *: Данные стадии не исследовались. Соответствующая картина экспресии цитоскелегных филаментов высказывается лишь как предположение.

типу (более периферическое расположение, ранняя стадия).

Большая часть стромальных клеток субамниотической зоны характеризуются увеличением содержания цитоскелетных и сократительных белков и соответствуют ВДАМ- или даже ВДАГМ-типу клеток.

Во втором триместре развития пупочного канатика (16 недель) картина дифференцировки стромальных клеток в периферическом слое вартонова студня сдвигается в сторону ВД-типа, достигая стадии ВДА-типа клеток.

И, наконец, в самой поздней стадии беременности в зрелом пупочном канатике большинство стромальных клеток принадлежали к полностью дифференцированному ВДАГМ-типу клеток. В этом сроке лишь отдельные периферические клетки вартонова студня непосредственно под субамниотической зоной не экспрессировали гм миозин (ВДАГ-тип), а иногда даже - у-гм актин (ВДА-тип).

Проведенное нами электронномикроскопическое исследование показало, что клетки, относящиеся к ВДАГ-типу, соответствуют умеренно зрелым миофибробластам, в то время как клетки ВДАГМ-типа соответствуют полностью зрелым миофибробластам или даже фенотипу гладкомышечных клеток.

Исследование распределения ЭЦМ показало, что во всех трех зонах пупочного канатика можно наблюдать положительную иммунную реакцию с антителами против интерстициальных коллагенов I, III и VI типов и против молекул базальной мембраны, таких как коллаген IV типа, ламинин, гепаран сульфат протеогликан. Иммуногистохимическим и ультраструктурным методами установлено, что белки базальной мембраны в виде частиц и конгломератов могут быть распределены гетерогенно по всей строме пупочного канатика, т. е. независимо и вне связи с клеточной поверхностью клеток. Мы полагаем, что компоненты ЭЦМ в сгроме пупочного канатика продуцируются миофибробластами на разных стадиях дифференцировки в течение всего эмбрионального развития пуповины.

Следует особо отметить, что в вартоновом студне пупочного канатика мы обнаружили систему каналов и щелей, стенки которых содержали не только интерстициальный коллаген, но и базальноподобньщ материал, т. е. белки базальной мембраны, а именно: коллаген IV типа, ламинин, гепаран сульфат протеогликан. Кроме того, эти каналы и щели были окружены тонкими веретеновидными клетками, которые по иммуногистохимическим и ультраструктурным свойствам относятся к выше описанным миофибробластам. Данные миофибробласты продуцируют полный спектр цитоскелетных белков и преимущественно соответствуют ВДАГМ-типу клеток.

На основании результатов наших исследований мы предполагаем, что сложная система стромальных каналов, окруженных сетью коллагеновых волокон и сократительных миофибробластов, участвует не только в питании эмбриональных сосудов, но и, в конечном итоге, ответственна за регуляцию тургора пупочного канатика, что исключительно важно для предохранения от компресии, сгибания и

скручивания пуповины и соответственно ее сосудов.

Глава 3. Гетерогенность гладкомышечных клеток и экстрацеллюлярпый матрикс в кровеносных сосудах при эмбриональном развитии

Результаты исследования показали, что во всех исследованных нами эмбриональных сосудах, а также пищеводе и мочеточнике человека на всех этапах эмбрионального развития как сосудистые, так и несосудистые ГМК всегда проявляют положительную реакцию с антителами к гм миозину и виментину. Эти результаты вполне соответствует ранее полученным многочисленным данным, подтвержденными различными методами (Frank and Waren, 1931; Gabbiani et al., 1981; Travo et al., 1982; Yaoita et al., 1985; Osborn et al., 1987). В то же время результаты наших исследований показали, что дополнительное использование антител к десмину, наряду с антителами к гм миозину, виментину и калпонину, позволяет установить гетерогенность ГМК.

Полученные результаты по распределению миозина, виментина и десмина в сосудистых и несосудистых ГМК эмбриональной ткани человека представлены в таблице 2.

В артерии эластического типа, к которой относится аорта эмбриона человека, на раннем этапе эмбрионального развития (18-20 недель беременности) отсутствуют десмин-положительные ГМК. Иначе говоря, ГМК эмбриональной аорты содержат гм миозин, виментин и одновременно представляют собой десмин-негативные ГМК. К концу эмбрионального развития (39-40 недель беременности) в аорте уже содержатся десмин-положительные ГМК, количество которых все же значительно меньше, чем десмин-негативных ГМК.

В эмбриональных артериях мышечного типа (бедренная и плечевая артерии) содержатся только отдельные десмин-положительные ГМК, в то время как остальные ГМК десмин не содержат. В разветвлениях дистальных отделов артерий мышечного типа и в органных артериях, которые тоже относятся к артериям мышечного типа, отсутствуют десмин-положительные ГМК или содержатся только единичные десмин-положительные ГМК. В артериях vasa vasorum также отсутствуют десмин-положительные ГМК, за исключением артерий крупного калибра, которые могут содержать отдельные десмин-положительные ГМК.

В эмбриональных венах присутствуют только десмин-положительные ГМК. При этом фенотип ГМК вен по содержанию десмина идентичен фенотипу несосудистых ГМК, которые находятся в стенке мочеточника и пищевода эмбриона человека.

Таким образом, в эмбриональных сосудах установлены два фенотипа гладкомышечных клеток: десмин-негативные и десмин-позитивные ГМК. В артериях эластического и мышечного типов у эмбриона человека были обнаружены десмин-негативные ГМК, в то время как в венозных сосудах - десмин-позитивные ГМК. В артерии пупочного канатика человека на всем ее протяжении вплоть до разветвлений в крупных стволовых ворсинах плаценты десмин-негативные ГМК были

Таблица 2. Распределение миозина, десмнна и виментина в сосудистых и несосудистых ГМК збриональной ткани человека (18-20 недель беременности).

* - в крупной артерии vasa vasorum могут быть отдельные десмин-положительные ГМК

Органы Миозин Виментин Десмин

Аорта (дуга, грудной и брюшной + + -

отделы)

Бедренная и плечевая артерии и + + отдельные

их разветвления клетки

Бедренная и плечевая вены + + +

Пищевод, мочеточник + + +

артерия в vasa vasorum + +

вена в vasa vasorum + + +

Артерия пупочного канатика:

наружный слой медии + + +

внутренний слой медии + + -

Вена пупочного канатика + + +

Разветвления артерии пуповины в

хориальной пластине вплоть до

стволовой ворсины крупного

калибра:

наружный слой медии + + +

внутренний слой медни + 4 -

Разветвления вены пуповины в + + +

хориальной пластине

Артерия стволовой ворсины + + -

среднего и малого калибра

артериола промежуточной + + -

ворсины

венула промежуточной ворсины + + +

расположены лишь во внутреннем слое медии, тогда как наружный слой медии бьи представлен десмин-положительными ГМК. Артерии стволовых ворсин среднего и малого калибров, а также промежуточных ворсин плаценты не содержали десмин-положительных ГМК.

Вена пупочного канатика человека на всем своем протяжении вплоть до разветвлений в промежуточных ворсинах плаценты всегда содержала большое количество десмин-положительных ГМК. На основании содержания десмина в ГМК можно провести дифференциальную диагностику между артериями и венами в средних и малых стволовых ворсинах, а также в промежуточных ворсинах.

Сравнительное исследование популяции разных фенотипов ГМК мы проводили не только в эмбриональной ткани, но. и в постнатальном периоде, в частности, в аорте человека.

Результаты исследования аорты человека (14 лет) также показали наличие десмин-отрицательных ГМК в ее интиме. В медии крупной артерии, относящейся к vasa vasorum аорты, отмечены единичные десмин-положительные ГМК. В расположенных там же венах, напротив, отмечено большое количество десмин-положительных ГМК.

Таким образом, описанная картина совпадает с тем, что наблюдали в эмбриональных сосудах человека.

Полученные нами данные о фенотипических особенностях ГМК сосудов в эмбриональном и постнатальном периодах у человека были сопоставлены с результатами иммуногистохимического анализа ГМК сосудов животных, а именно, морской свинки.

У морской свинки, начиная с 30 дня беременности, отмечено выраженное расширение маточно-плацентарных артерий в дистальном, периметриальном и мезометриальном (примерно до середины расстояния между дугообразной артерией и маткой) сегментах. Расширение просвета маточно-плацентарных артерий, которое сохраняется до конца беременности, сопровождается одновременным утолщением стенки сосудов. Утолщенная часть стенки артерии представлена клетками, которые одновременно экспрессируют десмин и виментин, что позволяет считать их, скорее всего, миофибробластами. Кроме того, в медии артерии обнаружены клетки, которые по ультраструктурным и иммуногистохимическим характеристикам можно отнести к малодифференцированным ГМК. Маточно-плацентарные вены морской свинки резко отличаются от артерий наличием большого количества десмин-положительных ГМК. Это значит, что маточно-плацентарные вены морской свинки по содержанию десмин-положительных ГМК имеют большое сходство с эмбриональными венами человека.

Таким образом, различие в экспрессии десмина сосудистыми ГМК существует уже на ранних стадиях онтогенеза. Кроме того, указанная гетерогенность ГМК зависит от типа сосудов. В эмбриональной артерии эластического и мышечного типов преобладают десмин-негативные ГМК, в эмбриональной вене - десмин-положительные ГМК. Надо заметить, что последние имеют сходный фенотип с несосудистыми ГМК пищевода и мочеточника эмбриона человека.

В ранние сроки эмбрионального развития отмечено образование компонентов ЭЦМ в стенке эмбриональных сосудов. Компоненты ЭЦМ в крупных эмбриональных сосудах экспрессируются ГМК, эндотелиальными и стромальными клетками. В мелких сосудах, где медия представлена всего лишь одним или двумя слоями ГМК, экспрессия компонентов ЭЦМ осуществляется исключительно ГМК. Глава 4. Экстрацеллюлярный матрикс в плаценте человека

Для исследования распределения компонентов ЭЦМ (коллаген различных типов, фибронектин, ламинин, гепаран сульфат протеогликан) в ворсинах ранней и зрелой плаценты человека были использованы непрямой иммунофлюоресцентный метод и иммуноцитохимический метод, включающий конъюгацию антител с коллоидным золотом и заливку тканей водорастворимой смолой. Иммунофлюоресцентное исследование выявило, что коллагены интерстициальных типов (I, III, V) более широко представлены в строме ворсин зрелой плаценты по сравнению с незрелой плацентой. Эти данные получили подтверждение при использовании иммуноцитохимического

метода исследования. На ультраструктурном уровне выявлен как низкий, так и высокий уровень экспрессии интерстициального коллагена I и III типов в строме ворсин, что отражает раннюю и позднюю стадии развития плаценты.

Иммунофлюоресцентное исследование выявило, что коллаген IV типа, энтактин и гепаран сульфат протеогликан были локализованы в эндотелиальных, гладкомышечных и эпителиальных базальных мембранах. Следует отметить, что при этом коллаген IV типа и энтактин обнаружены вне базальных мембран в строме ворсин. При иммуноцитохимическом исследовании коллаген IV типа также идентифицирован вне базальных мембран в строме ворсин зрелой плаценты в виде гомогенного электроиноплотного базалькоподобного материала, содержащего специфическую метку - частицы коллоидного золота. Указанный материал имел форму извилистых лент и напоминал фрагменты базальных мембран. Не исключено, что возникновение подобных фрагментов базальных мембран в строме ворсин связано с постоянным ростом и перестройкой тканевых структур на этапах гистогенеза плаценты. Учитывая протяженность фрагментов базальных мембран и их топографическое расположение рядом с истинными базальными мембранами, можно предполагать их определенное участие в плацентарном барьере. Кроме того, коллаген IV типа, обнаруженный вне базальной мембраны, явно находится в тесной связи с интерстициальным коллагеном I и III типов в строме ворсин зрелой плаценты. Глава 5. Диффереицировка миофибробластов в строме ворсин плаценты человека

В соответствии с иммуногистохимической картиной экспрессии цитоскелетных и сократительных белков и ультраструктурными особенностями можно установить пять подтипов внесосудистых сгромальных клеток ворсин плаценты человека (Рис. 2):

- недифференцированные мезенхимальные клетки, которые экспрессируют виментин (В-тип). Подобный тип клеток обычно находили в мезенхимальных ворсинах -предшественниках всех типов ворсин плаценты.

- клетки, одновременно экспрессирующие виментин и десмин (ВД-тип), имеют сходство с фибробластами по месту расположения и ультраструктуре, представляют наиболее общий тип внесосудистых стромальных клеток и находятся во всех типах ворсин. Ультраструктурные особенности этих клеток, такие как фрагментарная базальная пластинка, пучки микрофиламентов (stress fibres) и плотные тельца (dense plaques) позволяют предположить о начале миофибробластической дифференцировки.

- миофибробласты, одновременно экспрессирующие виментин, десмин и а-гм актин (ВДА-тип). Эти клетки соответствуют сформировавшимся миофибробластам и находятся в незрелых промежуточных и стволовых ворсинах.

- миофибробласты, дополнительно экспрессирующие у-гм актин (ВДАГ-тип).

- клетки, относящиеся к гладкомышечным клеткам, которые дополнительно экспрессируют гм миозин (ВДАГМ-тип).

Последние два клеточных типа найдены только на завершающихся стадиях

Л'^Х-'Д-ЛЛ: »дамГЛ-Л-ИХЛ!

40 недель | вдагм вдаг вда вд*в берем.

Рио. 2. Схема поперечного среза стволовой ворсины зрелой плаценты. Зоны стромы ворсины между фетальным сосудом и поверхностным трофобластом представляют стадии дифференцировки от мезенхимальных и фиброблаотических клеток до высоко дифференцированных миофиброблаотов. Внизу показано изменение состава цитоскелетных белков в слоях ворсины в разные сроки беременности. В зависимости от стадии зрелости поверхностно расположенные В-ВД-типы клеток могут исчезать в том случае, когда трофобласт замещается периворсинчатым фибриноидом. В - виментин, Д - десмин, А - а-гм актин, Г - у-гм 'актин, М - гм миозин.

дифференцировки, т. е. в центре незрелых промежуточных и стволовых ворсин, где они окружают стенки фетальных сосудов. Следует отметить иммуногистохимическое и ультраструктурное сходство этих типов клеток с ГМК, в особенности, ВДАГМ-типа клеток. Это позволяет предположить, что ВДАГ- и ВДАГМ-тип клеток являются потенциальными внесосудистыми ГМК. Кроме того, их можно четко выделить и отличить от ГМК медии сосудов по месту локализации и пространственной ориентации.

Результаты исследования показали, что на ранних стадиях беременности превалировали стромальные клетки с низким содержанием цитоскелетных белков. С увеличением срока беременности отмечался сдвиг клеток в сторону с высокой экспрессией цитоскелетных белков. При этом было замечено, что в плацентарных ворсинах на разных стадиях дифференцировки стромальные клетки всегда располагались таким образом, что пролиферирующие менее дифференцированные клетки занимали субтрофобластическую область, в то время как клетки с увеличенным содержанием цитоскелетных белков локализовались более центрально. Обнаруженные нами подтипы внесосудистых стромальных клеток ворсин отражают разную степень зрелости в процессе дифференцировки и их можно рассматривать как различные стадии дифференцировки от мезенхимальных клеток через фибробласты к миофибробластам и к ГМК. Таким образом, В-тип клеток (мезенхимальные клетки) являются наименее дифференцированным типом клеток, которые созревают через стадию фибробластов (ВД-тип) и далее через различные стадии миофибробластов от ВДА-типа до ВДАГ- и ВДАГМ-типа клеток. В зависимости от локализации клеток внутри стромы ворсин и от степени зрелости ворсин внесосудистые стромальные клетки демонстрируют ясно выявляемый определенный пространственный градиент дифференцировки с увеличением цитоскелетного комплекса в плацентарных стромальных клетках от трофобласта, покрывающего поверхность ворсин, в направлении кровеносных сосудов, расположенных в центре стволовой ворсины.

Пространственное распределение различных стадий дифференцировки стромальных клеток позволяет предположить, что ворсины плаценты человека могут быть подходящей моделью для изучения дифференцировки миофибробластов. Глава 6. Экстрацеллюлярный матрикс в фибриноиде зрелой плаценты человека

Все исследованные нами компоненты ЭЦМ были сгруппированы соответственно их содержанию в фибриноиде как "большое количество", "отсутствуют" и "вариабельный" (Таблица 3).

Для всех исследованных нами типов фибриноида: периворсинчатого, клеточного островка и базальной пластины, характерным было содержание в большом количестве фибрина, фибронектина всех типов, гепаран сульфат протеогликана, коллагена IV и V типов. Мы полагаем, что основную роль в экспрессии указанных компонентов ЭЦМ выполняют вневорсинчатые трофобластические клетки. Наряду с

Таблица 3. Распределение компонентов ЭЦМ, промежуточных филаментов и гм миозина в периворсинчатом фибриноиде, клеточном островке и базальной пластине. (Оценка флюоресценции: + + + +, большое количество; + н— и + —, вариабельное; - - - -, отсутствует)

Антигены Периворсинчатый Клеточный Базальная

фибриноид островок пластина

Фибрин + + + + + + + + + + + +

Фибронектин:

онко-фетальный + + + + + + + + + + + +

и клеточный

тканевой и + + + + + + + + + + + +

плазменный

Гепаран сульфат + + + + + + + + + + +

протеогликан

Коллаген:

V типа + + + + + + + + + + + +

IV типа + + + + + + + + + + + +

III типа + + - - ---- + + + +

1типа +--- ---- + + + +

Энтактин + + - - ---- + + +

Ламинин ---- + + -- + + + +

Виментин ---- ---- + + + +

Десмин ---- ---- + + + +

Миозин ---- + + + +

Фактор VIII ---- ---- + + + +

этим, мы не исключаем участия в экспрессии ЭЦМ и других клеток, особенно по отношению к базальной пластине, которая содержит разнообразные типы клеток.

Таким образом, сравнительное иммуногистохимическое исследование периворсинчатого фибриноида, фибриноида клеточных островков и базальной пластины показало, что все они содержат фибрин. Поэтому можно полагать, что все таки основным критерием фибриноида вообще, независимо от места его локализации, является наличие фибрина, а также выше указанных компонентов ЭЦМ.

Если в периворсинчатом фибриноиде к "вариабельным" антигенам можно отнести коллаген I, III типов и энтактин, то в клеточном островке - лишь ламинин. И наоборот, в фибриноиде клеточного островка коллаген I, III типов и энтактин можно расценивать как "отсутствуют", а ламинин - как "вариабельный". В фибриноиде базальной пластины все указанные антигены (коллаген I и III типов, энтактин, ламинин) присутствуют постоянно и в большом количестве. Подобное различие, по-видимому, объясняется тем, что клеточный состав периворсинчатого фибриноида и клеточного островка представлен преимущественно вневорсинчатыми трофобластическими клетками, количество которых зависит от сроков формирования и развития фибриноидов, что в конечном итоге обусловливает разную степень экспрессии ЭЦМ. В базальной пластине, в отличие от периворсинчатого фибриноида и клеточного островка, помимо

вневорсинчатых трофобластичесхих клеток содержатся стромальные клетки, ГМК, миофибробласты, децидуальные клетки. Все эти клетки в той или иной степени могут участвовать в экспрессии ЭЦМ. Возможно, этим объясняется, что все исследованные нами компоненты ЭЦМ экспрессируются в базальной пластине в большем количестве, по сравнению с периворсинчатым фибриноидом и клеточным островком.

Промежуточные филаменты, такие как виментин и десмин, а также гладкомышечный миозин отсутствуют в клетках в периворсинчатом фибриноиде и фибриноиде клеточного островка. В базальной пластине указанные цитоскелетные и сократительные белки можно обнаружить в ГМК и миофибробластах, которые могут быть представлены отдельными клетками или формируют пучок ГМК.

Только в базальной пластине плаценты антитела против фактора VIII выявляют эндотелиальные клетки, выстилающие ее внутреннюю поверхность со стороны межворсинчатого пространства. Данный эндотелиальный слой имеет собственную базальную мембрану, которую можно наблюдать при использовании антител к компонентам базальной мембраны.

Полученные результаты показывают, что во всех исследованных нами фибриноидах содержится, как правило, фибрин и большое количество различных компонентов ЭЦМ. Поэтому мы считаем, что наиболее подходящим термином, по-видимому, является все таки фибриноид, а не "отложения фибрина". Данный термин более полно характеризует этот интересный феномен, который до настоящего времени является предметом дискуссий. Считаем целесообразным еще раз упомянуть, что по нашим данным решающим критерием для определения фибриноида является наличие в нем фибрина и компонентов ЭЦМ. Глава 7. Краевой синус зрелой плаценты человека

Несмотря на то, что плацента человека относится к типу гемохориальных плацент, межворсинчатое пространство периферической зоны плаценты покрыто эндотелиальными клетками. Этот. слой эндотелиальных клеток в краевом синусе выстилает на значительном протяжении хориальную и базальную пластину, а также проксимальные отделы периферических стволовых ворсин. При иммуногистохимическом исследовании данные эндотелиальные клетки демонстрируют положительную реакцию с антителами к виментину, фактору VIII и QB-end 40. При электронномикроскопическом исследовании этих клеток обнаружены характерные ультраструктурные свойства, присущие эндотелиальным клеткам: базальная мембрана, десмосомы и полудесмосомы, тельца Weibel-Palade и кавеолы. Можно предполагать, что эндотелиальные клетки краевого синуса относятся к материнским эндотелиальным клеткам и, мигрируя из миометриальных вен, покрывают межворсинчатое пространство краевого синуса.

В периферической зоне плаценты человека, а именно в стенке краевого синуса, мы обнаружили компактный слой гладкомышечных клеток ("m. constrictor placentae").

При иммуногнстохимическом исследовании эти клетки всегда проявляют положительную реакцию с антителами к виментину, десмину, а-гм актину и гм миозину. При ультраструктурном исследовании указанных клеток обнаруживаем типичное строение присущее ГМК. Часть этих клеток имели строение присущее миофибробластам.

Выше описанные ГМК кольцеобразно окружают плаценту по периферии. Мышечное кольцо краевого синуса при переходе в хориальную пластину становится тоньше. В базальной пластине мышечное кольцо краевого синуса значительно утолщается и может достигать центральной зоны плаценты. ГМК краевого синуса окружены ЭЦМ, который содержит ламинин, гепаран сульфат протеогликан, коллаген III, IV и VI типов. Гладкомышечное кольцо краевого синуса может участвовать в регуляции просвета межворсинчатого пространства, таким образом обеспечивая материнский контроль циркуляции крови в межворсинчатом пространстве ("т. constrictor placentae"). ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Итак, результаты настоящего исследования показали, что в кровеносных сосудах эмбриона человека на всех этапах эмбрионального развития существуют гетерогенные ГМК, а именно, установлены два фенотипа : десмин-негативные и десмин-позитивные ГМК. В артериях эластического и мышечного типов у эмбриона человека были обнаружены десмин-негативные ГМК, в то время как в венозных сосудах - десмин-позитивные ГМК. Отмеченные фенотипические особенности ГМК сохраняются и в постнатальном периоде. Кроме того, фенотип ГМК вен идентичен фенотипу внесосудистых ГМК, которые находятся а стенке мочеточника и пищевода эмбриона человека. Это позволяет говорить о програмированной дифференцировке ГМК, обусловливающее выполнение определенной функции в зависимости от типа сосуда или ткани. Полученные результаты дают основание предположить, что фенотип ГМК вен и внесосудистых ГМК призваны осуществлять медленные тонические сокращения, поэтому они отсутствуют в артериях, где требуется более быстрые сокращения, осуществляемые десмин-негативными ГМК.

В артерии пупочного канатика человека на всем ее протяжении вплоть до разветвлений в крупных стволовых ворсинах плаценты десмин-негативные ГМК были расположены лишь во внутреннем слое медии, тогда как наружный слой медии был представлен десмин-положительными ГМК. Наличие двух фенотипов ГМК в четко различимых слоях медии свидетельствует, что артерия пупочного канатика одновременно сочетает структуру артерии и вены, описанную у эмбриона человека. Такое своеобразное строение артерии пупочного канатика требуется для сбалансированной доставки крови по достаточно протяженным сосудам пуповины. Артерии стволовых ворсин среднего и малого калибров, а также промежуточных ворсин плаценты не содержали десмин-положительных ГМК, т. е. по

иммуноморфологической характеристике соответствовали артериям эмбриона человека. По-видимому, в артериях ворсин плаценты, которые постоянно разветвляются на все более мелкие ветви, требуется более активное и быстрое сокращение ГМК.

Исследование стромальных клеток пупочного канатика и ворсин плаценты человека показало, что в соответствии с иммуногистохимической картиной экспрессии цитоскелетных и сократительных белков и ультраструктурными особенностями можно установить определенные подтипы внесосудистых стромальных клеток. Обнаруженные нами подтипы внесосудисты стромальных клеток ворсин отражают разную степень зрелости в процессе дифференцировки, и их можно рассматривать как различные стадии дифференцировки от мезенхимальных клеток через фибробласты к миофибробластам и к ГМК. Однако, мы не можем исключить и другие возможные варианты путей дифференцировки, например, от каких-либо предшественников клеток, к которым у нас пока нет маркеров.

Кроме того, возникает вопрос чем обусловлено пространственное распределение различных стадий дифференцировки стромальных клеток, особенно выраженное в ворсинах плаценты человека. Возможно, это связано с определенной микросредой, окружающей эти клетки, в частности, с влиянием амниотического эпителия пупочного канатика или влиянием трофоболастического слоя ворсины плаценты, представленный цитотрофобластами и синцитиотрофобластом. Не удивительно, что в субамниотической зоне зрелого пупочного канатика мы обнаруживаем усиленное накопление интерстициальных типов коллагена и фибронектина, поскольку в этой зоне расположены высоко-дифференцированные миофибробласты. Под трофобластическим слоем в ворсинах плаценты локализованы мало-дифференцированные миофибробласты и в этой зоне, соответственно, не находим выраженной экспрессии компонентов ЭЦМ. В других случаях пространственное распределение различных стадий дифференцировки стромальных клеток может быть связано с компонентами ЭЦМ, которые продуцируются самими дифференцирующимися стромальными клетками и затем могут оказывать определенное влияние на процесс дифференцировки клеток. И как мы уже отметили, в свою очередь формирование и локализация компонентов ЭЦМ обусловлены степенью дифференцировки сократительных клеток, а также присутствием других внесосудистых клеток и их количественным соотношением.

ВЫВОДЫ

1. В кровеносных сосудах эмбриона человека на всех этапах эмбрионального развития существуют гетерогенные ГМК, в частности, десмин-негативные и десмин-позитивные ГМК. В артериях эластического и мышечного типов у эмбриона человека были обнаружены десмин-негативные ГМК, в то время как в венозных сосудах -десмин-позитивные ГМК.

2. Десмин-положительные ГМК эмбриональной вены имеют сходный фенотип с несосудистыми ГМК пищевода и мочеточника эмбриона человека.

3. В артерии пупочного канатика человека на всем ее протяжении вплоть до разветвлений в крупных стволовых ворсинах плаценты десмин-негативные ГМК расположены лишь во внутреннем слое медии, тогда как наружный слой медии артерии представлен десмин-положительными ГМК. Артерии стволовых ворсин среднего и малого калибров, а также промежуточных ворсин плаценты человека не содержат десмин-положительных ГМК.

4. Вена пупочного канатика человека на всем своем протяжении вплоть до разветвлений в промежуточных ворсинах плаценты всегда содержит большое количество десмин-положительных ГМК. На основании содержания десмина в ГМК можно провести дифференциальную диагностику между артериями и венами в средних и малых стволовых ворсинах, а также в промежуточных ворсинах плаценты.

5. Маточно-плацентарные вены беременной морской свинки по содержанию десмин-положительных ГМК сходны с эмбриональными венами человека.

6. Образование компонентов ЭЦМ в стенке эмбриональных сосудов происходит в ранние сроки эмбрионального развития. Компоненты ЭЦМ в крупных эмбриональных сосудах экспрессируются ГМК, эндотелиальными и стромальными клетками. В мелких сосудах, где медия представлена всего лишь одним или двумя слоями ГМК, экспрессия компонентов ЭЦМ осуществляется исключительно ГМК.

7. Дифференцировка стромальных клеток пупочного канатика зависит от места их локализации в определенных зонах стромы и сроков развития пупочного канатика, т. е. от первого триместра до образования зрелой пуповины. В первом триместре сгромальные клетки в зоне адвентиции и в субамниотической зоне пупочного канатика соответствуют в основном ВДАГМ-типу клеток. Стромальные клетки вартонова студня в большей мере соответствуют ВДА- или ВДАГ-типу клеток (более центральное расположение, поздняя стадия) или даже ВД-типу (более периферическое расположение, ранняя стадия). В зрелом пупочном канатике большинство стромальных клеток принадлежат к полностью дифференцированному ВДАГМ-типу клеток.

8. В вартоновом студне пупочного канатика обнаружена система каналов и щелей, стенки которых содержат базальноподобный материал, т. е. белки базальной мембраны, а именно: коллаген IV типа, ламинин, гепаран сульфат протеогликан. Эти каналы и щели окружены тонкими веретеновидными клетками, которые по яммуногистохимическим и ультраструктурным свойствам относятся к миофибробластам и преимущественно соответствуют ВДАГМ-типу клеток.

9. Коллаген IV типа идентифицирован вне базальных мембран в строме ворсин зрелой плаценты в виде электронноплотного базальноподобного материала, содержащего специфическую метку - частицы коллоидного золота.

10. В строме ворсин плаценты человека установлено пять подтипов внесосудистых стромальных клеток: В-, ВД-, ВДА-, ВДАГ- и ВДАГМ-тип клеток. В-тип клеток (мезенхимальные клетки) являются наиболее недифференцированным типом клеток, которые созревают через стадию фибробластов (ВД-тип) и далее через различные стадии миофибробластов от ВДА-типа до ВДАГ- и ВДАГМ-типа клеток. Последние два клеточных типа имеют иммуногистохимическое и ультраструктурное сходство с ГМК.

11. Градиент дифференцировки в стволовых ворсинах плаценты от пролиферирующего ВД-типа клеток, находящихся непосредственно под поверхностью ворсин, до гладкомышечноподобных клеток (ВДАГМ-тип), расположенных вокруг центральных сосудов, отличается от соответствующего градиента в пупочном канатике присутствием в субамниотической зоне пуповины высокодифференцированных миофибробластов. Это различие более выражено в первом триместре по сравнению со зрелой пуповиной.

12. Решающим критерием для определения фибриноида, независимо от места его локализации, является наличие в нем фибрина и компонентов ЭЦМ.

13. Межворсинчатое пространство краевого синуса плаценты человека выстлано эндотелиальными клетками.

14. В стенке краевого синуса плаценты человека находится компактный слой гладкомышечных клеток. Обнаруженный нами пучок ГМК кольцеобразно окружает плаценту по периферии. Гладкомышечное кольцо краевого синуса может участвовать в регуляции просвета межворсинчатого пространства, таким образом обеспечивая материнский контроль циркуляции крови в межворсинчатом пространстве ("т. constrictor placentae").

Список опубликованных работ по теме диссертации:

1. Нанаев А. К., Ермилова В. Д., Шехонин Б. В., Домогатский С. П., Идельсон Г. Л., Рукосуев В. С. (1986) Особенности распределения экстрацеллюлярного матрикса в фиброаденомах и листовидной опухоли молочной железы человека (иммуноморфологическое исследование). Архив патологии, 48, 47-52.

2. Нанаев А. К., Рукосуев В. С., Ширинский В. П. (1988) 13 Всесоюзная конференция по электронной микроскопии, Тезисы докладов, Москва, стр. 184.

3. Рукосуев В. С., Моисеев В. С., Шелепин А. А., Огурцов П. П., Нанаев А. К., Батыралиев Т. А., Григорян Р. А. (1988) Некоторые иммунологические нарушения при некоронарогенных заболеваниях миокарда. Клиническая медицина, 8, 71-75.

4. Рукосуев В. С., Нанаев А. К., Самко А. Н., Ширинский В. П., Батыралиев Т. А. (1989) Локализация некоторых компонентов внеклеточного матрикса и цитоскелета в миокарде

биоптатов при алкогольной кардиомиопатии. Бюллетень ВКНЦ АМН СССР, 2, 88-94.

5. Нанаев А. К., Рукосуев В. С., Милованов А. П., Фокин Е. И., Ширинский В. П. (1989) Распределение коллагена III и IV типов в ворсинах, плаценты человека. Бюлл. эксперкм. биол. и мед., 2, 247-250.

6. Нанаев А. К., Рукосуев В. С., Ширинский В. П. (1990) Метод иммуноэлектроной микроскопии с использованием водорастворимой смолы и антител, меченных коллоидным золотом. Архив анат. гистол. и эмбриол., 1, 82-85.

7. Нанаев А. К., Ширинский В. П., Бирюков К. Г., Рукосуев В. С. (1990) Распределение миозина, десмина и виментина в гладкомышечных клетках эмбриональных сосудов человека. Бюлл. эксперим. биол. и мед., 8Б 213-215.

8. Rukosuev V. S., Nanaev А. К., Milovanov А .Р. (1990) Participation of collagen types I, HI, IV, V, and flbronectin in the formation of villi fibrosis in human term placenta. Acta Histochem., 89, 11-16.

9. Nanaev A. K., Shvalev V. N., Kozlova M. V., Rukosuev V. S. (1991) Immunohistochemicai investigation of autoantibodies to nerve fibers in cardiomyopathy. Zentralbl. Pathol., 137, 405408.

10. Nanaev A. K., Shirinsky V. P., Birukov K. G. (1991) Immunofluorescent study of heterogeneity in smooth muscle cells of human fetal vessels using antibodies to myosin, desmin, and vimentin. Cell Tissue Res., 266, 535-540.

11. Birukov K. G., Stepanova О. V., Nanaev A. K., Shirinsky V.P. (1991) Expression of calponin in rabbit and human aortic smooth muscle cells. Cell Tissue Res., 266, 579-584.

12. Nanaev A. K., Rukosuev V. S., Shirinsky V. P., Milovanov A. P., Domogatsky S. P., Duance V. C., Bradbury F. M., Yarrow P., Gardiner L., d'Lacey C., Ockleford C.D. (1991) Confocal and conventional immunofluorescent and immunogold electron microscopic localization of collagen types III and IV in human placenta. Placenta, 12, 573-595.

13. Nanaev A. K., Domogatsky S. P., Milovanov A. P. (1992) Immunohistochemicai investigation of the extracellular matrix in cytotrophoblast islets in early and mature human placenta. Placenta, 13, A47.

14. Nanaev A. K., Domogatsky S. P., Milovanov A. P. (1992) Immunohistochemicai study of the extracellular matrix and intermediate filaments in the human umbilical cord. Placenta, 13, A48.

15. Kadyrov M., Milovanov A. P., Voloshchuk I. N., Nanaev A. K. (1993) Epithelial- capillary distance of chorionic villi of normal-developed placenta. Placenta, 14, A34.

16. Nanaev A. K., Milovanov A. P., Domogatsky S. P. (1993) Immunohistochemical localization of extracellular matrix in various types of fibrinoid of the normal human term placenta. Placenta, 14, A55.

17. Nanaev A. K., Milovanov A. P., Kadyrov M., Domogatsky S. P. (1993) Extracellular matrix (ECM) and ECM-producing cells in villous stroma of human term placenta. Placenta, 14, A55.

18. Shlihter N. A., Milovanov A. P., Nanaev A. K. (1993) Extracellular matrix (ECM) and ECM-producing cells in villous stroma of human immature placenta. Placenta, 14, A71.

19. Nanaev A. K., Milovanov A. P., Domogatsky S. P. (1993) Immunohistochemical localization of extracellular matrix in perivillous fibrinoid of normal human term placenta. Histochemistry, 100, 341-346.

20. Nanaev A., Milovanov A. P., Domogatsky S. P., Kohnen G., Kaufmann P. (1994) Immunihistochemical study of cells and extracellular matrix of the term human umbilical cord. 89. Versamlung in Marburg. Verhandlungen der Anatomischen Gesellschaft. Annals of Anatomy. Gustav Fischer Verlag Jena, Stuttgart, New York, 176 (Suppl), 126-127.

21. Kohnen G., Kertschanska S., Nanaev A., Telfer J. F., Cameron I. T., Greer I. A., Kaufmann P. (1995) Differentiation of placental myofibroblasts. 90. Versamlung in Graz. Verhandlungen der Anatomischen Gesellschaft. Annals of Anatomy. Gustav Fischer Verlag Jena, Stuttgart, New York, 177 (Suppl), 26-27.

22. Nanaev A.K., Frank H.-G., Chwalisz K., Kaufmann P. (1995) Die physiologische Dilatation der uteroplacentaren Arterien im Verlaufe der Schwangerschaft ist ein Effekt der NO-Synthase-Aktivität des extravillösen Trophoblasten. 90. Versamlung in Graz. Verhandlungen der Anatomischen Gesellschaft. Annals of Anatomy. Gustav Fischer Verlag Jena, Stuttgart, New York, 177 (Suppl), 104-105.

23. Nanaev A.( Frank H.-G., Chwalisz K., Kaufmann P. (1995) Physiological dilatation of uteroplacental arteries in the guinea pig is related to NOS-activity of invasive trophoblast. Placenta, 16, A51.

24. Nanaev A. K., Chwalisz K., Frank H.-G., Kohnen G., Hegele-Hartung C., Kaufmann P. (1995) Physiological dilation of uteroplacental arteries in the guinea pig depends on nitric oxide synthase activity of extravillous trophoblast. Cell Tissue Res., 282, 407-421.

25. Nanaev A. K., Kosanke G., Kertschanska S., Kaufmann P. (1996) Endothelzellen und glate Muskulatur in der Marginalzone der reifen menschlichen Placenta: Immunhistochemische und ultrastrukturelle Befunde. 91. Versamlung in Würzburg. Verhandlungen der Anatomischen Gesellschaft. Annals of Anatomy. Gustav Fischer Verlag Jena, Stuttgart, New York, 178 (Suppl), 330.

26. Nanaev A. K., Kosanke G., Kertschanska S., Kaufmann P. (1996) Endothelial and smooth muscle cells in the marginal zone of term human placenta: immunohistochemical and ultrastructurai findings. Placenta, 17, A32.

27. Kosanke G., Nanaev A. K., Huppertz B., Kaufmann P. (1996) Fetal and maternal vascularization of the rat placenta. Placenta, 17, A32.

28. Nanaev A. K., Kohnen G., Milovanov A. P., Domogatsky S. P., Kaufmann P. (1997) Stromal differentiation and architecture of the human umbilical cord. Placenta, 18, 53-64.

Соискатель