Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Фармакопрофилактика производными бетулина токсического и ишемического повреждения печени

004ЫЭ7 (О

На правах рукописи

ШИНКАРЁВА Наталья Витальевна

ФАРМАКОПРОФИЛАКТИКА ПРОИЗВОДНЫМИ БЕТУЛИНА ТОКСИЧЕСКОГО И ИШЕМИЧЕСКОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ ПЕЧЕНИ

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология 14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2010

Томск - 2010

004615978

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Новосибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук

доктор медицинских наук

Грек Олег Рувимович Шарапов Виктор Иванович

Алиев Олег Ибрагимович Ваизова Ольга Евгеньевна

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Алтайский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита диссертации состоится «_»_2010г. в_час на

заседании диссертационного совета Д 001.031.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН (634028, г. Томск, пр. Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН

Автореферат разослан «_»_2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

Амосова Е.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. В настоящее время цитостатическая терапия широко применяется для лечения злокачественных новообразований, аутоиммунных заболеваний и в трансплантологии (Dreher M.R., Raucher D., Balu N. et al., 2003), однако она сопряжена с развитием осложнений, связанных с повреждающим действием цитостатиков на различные ткани и органы, в частности, на печень (Jaeschke Н., 2003).

Развивающаяся при применении цитостатиков токсичность является фактически продолжением их терапевтической активности. В этой связи, побочное действие цитостатиков, подобно токсическому поражению, реализуется через различные механизмы повреждения клетки: повреждение генетического аппарата клетки, активация процессов свободнорадикального окисления, повреждение клеточных мембран, нарушение процессов синтеза белка и клеточного деления, повреждающее действие избытка ионов Са+2 в клетке, нарушение энергетического обмена (Барабой В.А., Сутковой Д.А., 1997; Глушков С.И., 2006; Меньшикова Е.Б., Ланкин В.З., Зенков Н.К. и др., 2006).

Известно, что в основе осложнений цитостатической терапии лежит мембранотоксическое действие противоопухолевых препаратов, вследствие большого сродства к липидам, в частности, к кардиолипину, входящему в состав внутренней мембраны митохондрий (Непомнящих JIM., Лушникова Е.Л., Семенов Д.Е., 2000).

Нарушение обмена кислорода в разных органах и тканях организма опухоленосителя проявляется в ослаблении дыхания и усилении гликолиза, снижении процессов энергетического обмена, нарушении доставки кислорода и структурно-функциональными изменениями гемоглобина, уменьшением артеривенозной разницы по кислороду и коэффициента использования кислорода тканями (Горчакова H.A., 1990; Колчинская А.З., Цыганова Т.Н., Остапенко Л.А., 2003; Коршунов Д.А., 2010).

Вовлечение мембран эндоплазматического ретикулума в патологический процесс при гипоксии, ишемии проявляется нарушением функции мембраносвязанных монооксигеназных комплексов (Воронов Г.Г., Лукиенко П.И., Бушма М.И., 1982; Грек О.Р., Шарапов В.И., Литвинов B.C., Долгов A.B., 1984; Ferrero М.Е., Orsi R., Berneiii - Zazzera А., 1978), которым отводится ведущая роль в биотрансформации лекарственных веществ (Лакин K.M., Крылов Ю.Ф., 1981).

В связи с этим остается актуальной проблема разработки новых лекарственных средств-корректоров побочных эффектов цитостатиков, не снижающих их терапевтической активности, а также нарушений, вызванных ишемическим повреждением. Препараты растительного происхождения фенольной природы в качестве гепатопротекторов оказываются недостаточно эффективными при цитостатической терапии (Гольдберг Е.Д., Зуева Е.П., 2000). Поэтому особый интерес представляет класс

тритерпеноидов лупанового ряда, сочетающий высокую биологическую активность и доступность (Карачурина JI.T., Сапожников Т. А., Зарудий Ф. С. и др., 2003). В Новосибирском институте органической химии им. H.H. Ворожцова СО РАН синтезированы новые производные бетулоновой кислоты, содержащие у С-28 различные фрагменты аминокислот или их метиловых эфиров (Петренко Н.И. и др., 2002; Толстиков Г.А., Флехтер О.Б., Шульц Э.Э. и др., 2005; Кузнецова С.А., Васильева Н.Ю.,1Калачева Г.С. и др., 2008). Они наделены рядом свойств: антиоксидантными,

противовоспалительным, иммуномодулирующим, гепатопротекторным и обладают цитостатическим действием в отношении ряда опухолей нейроэктодермального происхождения (Е. Pisha, H.Chai, I.-S. Lee et al., 1995; К. Hata, К. Hori, S. Takahashi, 2002; Позднякова C.B., 2007; Шарапов И.В., 2009; Пономарева И.А., 2009; Агаева Т.Х., 2010).

Поэтому актуальной задачей фармакологии является изучение гепатопротективных свойств данного класса соединений, влияющих на общие звенья патогенеза токсического и ишемического повреждений.

Научная работа проводилась по плану НИР НГМУ: «Системные механизмы действия ксенобиотиков на организм и разработка новых фармакологических препаратов» № гос.регистрации 01.2.007 09495 код ВНТИЦ 0203042450323.

Цель исследования: Изучить влияние профилактического введения бетулоновой кислоты и ее альфа-аланинамидных производных на активность пероксидативных процессов и состояние плазматических, лизосомальных и микросомальных мембран гепатоцитов при токсическом, ишемическом и сочетанном повреждениях печени.

Задачи исследования:

1. Изучить антиокислительную активность, интенсивность процессов перекисного окисления липидов в ткани печени и сыворотке крови при различных видах повреждения печени (при ишемическом, токсическом и сочетанном воздействиях).

2. Изучить активность цитозольных ферментов (трансаминаз, глутамилтрансферазы, щелочной фосфатазы) в сыворотке крови, свободную активность лизосомальных гидролаз и скорость метаболизма амидопирина, эритромицина, анилина в ткани печени и оценить состояние плазматических, лизосомальных и микросомальных мембран при различных видах повреждения печени (токсическом, ишемическом, сочетанном).

3. Изучить влияние профилактического введения бетулоновой кислоты и ее альфа-аланинамидных производных на активность процессов перекисного окисления липидов и антиокислительную активность в сыворотке крови и ткани печени при различных видах повреждения.

4. Изучить протективный эффект бетулоновой кислоты и ее альфа-аланинамидных производных при профилактическом введении на

плазматические, лизосомальные, микросомальные мембраны гепатоцитов при токсическом, ишемическом и сочетанном повреждении. 5. Сравнить мембранопротективный эффект бетулоновой кислоты и ее альфа-аланинамидных производных при токсическом, ишемическом и сочетанном повреждениях печени.

Научная новизна

Впервые показано, что при токсическом, ишемическом и сочетанном воздействии общим звеном повреждения печени является дестабилизация плазматических, лизосомальных и микросомальных мембран гепатоцитов в результате снижения антиокислительной активности ткани и активации процессов перекисного окисления липидов.

Впервые установлено, что однократное профилактическое введение бетулоновой кислоты и ее альфа-аланинамидных производных при различных видах повреждения гепатоцитов оказывает выраженное мембранопротективное действие в отношении плазматических, лизосомальных и микросомальных мембран гепатоцитов.

Впервые показано, что мембранопротективный эффект бетулоновой кислоты и ее альфа-аланинамидных производных при токсическом, ишемическом и сочетанном повреждениях обусловлен их способностью ингибировать процессы перекисного окисления липидов и повышать антиоксидантный потенциал ткани печени.

Впервые дана сравнительная оценка мембранопротективного эффекта производных бетулина и выявлен более выраженный эффект у метилового эфира 2а-аланин-бетулоновой кислоты при различных видах повреждения печени.

Теоретическая и практическая значимость

Полученные данные расширяют представление об общих механизмах повреждения мембран клеток печени при различных видах повреждения (токсическом, ишемическом и сочетанном воздействиях).

Дано обоснование целесообразности дальнейшего изучения бетулоновой кислоты, 2а-аланин-бетулоновой кислоты, метилового эфира 2а-аланин-бетулоновой кислоты в качестве мембраностабилизирующих средств, уменьшающих последствия цитостатической терапии и ишемического повреждения.

Наиболее выраженный мембранопротективный эффект у метилового эфира 2а-аланин-бетулоновой кислоты позволяет рекомендовать данное соединение для углубленного доклинического изучения.

Положения, выносимые на защиту: 1. Общим звеном в патогенезе токсического, ишемического и сочетанного воздействий на печень является дестабилизация

з

плазматических, лизосомальных и эндоплазматических мембран клеток печени в результате активации пероксидативных процессов.

2. Профилактическое введение бетулоновой кислоты и ее альфа-аланинамидных производных оказывает мембранопротективное действие при моделировании различных видов повреждения гепатоцитов (при токсическом, ишемическом и сочетанном воздействиях).

3. Протективный эффект бетулоновой кислоты и ее альфа-аланинамидных производных при токсическом, ишемическом и сочетанном повреждениях связан с предупреждением деструкции клеточных и субклеточных мембран гепатоцитов в результате ингибирования процессов перекисного окисления липидов и повышения антиоксидантного потенциала ткани печени.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на ежегодных конкурс-конференциях студентов и молодых ученых НГМУ «АВИЦЕННА» (Новосибирск, 2007-2009), на Ш-м съезде фармакологов России «Фармакология - практическому здравоохранению» (Санкт-Петербург, 2007), на региональной конференции «Создание новых лекарственных препаратов» (Томск, 2007), на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» (Новосибирск, 2009), на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молодые ученые» (Казань, 2009).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 12 работ, из них 2 в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 113 страницах машинописного текста, иллюстрирована 23 таблицами, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований, выводов и списка литературы. Библиографический указатель включает 229 источников, из них 137 отечественных и 92 зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Лабораторные животные

Эксперименты проведены на 300 крысах самцах линии Вистар массой 180-200 гр. в соответствии с требованиями «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. № 755). Животных получали из вивария ЦНИЛ НГМУ (зав. - д.м.н., проф. Пустоветова М.Г.).

Животных содержали на стандартном рационе, со свободным доступом к воде и пище. Перед декапитацией животных лишали корма на 12 часов, забой проводили в утренние часы. Декапитировали животных под легким эфирным наркозом, соблюдая общепринятые нормы гуманного обращения с ними.

Условия проведения эксперимента

Работа была выполнена совместно с НИИ органической химии СО РАН им. Н.Н.Ворожцова (лаборатория фармакологических исследований - зав.лаб. - д.б.н. Толстикова Т.Г., лаборатория медицинской химии - зав. лаб., д.х.н., проф. Шульц Э.Э.) и ЦНИЛ НГМУ (зав.- д.м.н., проф. Пустоветова М.Г.). Синтез изучаемых соединений проводился из бетулина (3-оксо-20(29)-лупен-28-ол): бетулоновая кислота (БК) - (3-оксо-20(29)-лупен-28-овая кислота) и ее пептидные производные, содержащие у атома С-28: а-аланин - 3-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оил]-аминопропионовая кислота (2а-БК), метиловый эфир 3-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оил]-аминопропионовой кислоты (2а-ЭБК) (Петренко Н.И., Еланцева Н.В., Петухова В.З., 2002). В качестве препарата сравнения использовали дигидрокверцетин (ДКВ), полученный в той же лаборатории.

Исследуемые БК-соединения вводились в виде водно-твиновой взвеси (твин 80) внутрижелудочно в дозе 50 мг/кг (Сорокина И.В. Бубнова Е.Б., Толстикова Т.Г., и др., 2004) за 6 часов до забора материала - сыворотка крови, ткань печени.

В группах животных, получавших цитостатическую терапию, исследуемые БК-соединения вводились внутрижелудочно в дозах 50 мг/кг за 6 часов до введения ПХК.

Экспериментальные животные были разделены на несколько групп методом случайной выборки по 6 животных, в зависимости от сроков и схемы экспериментов:

1 группа - интактные животные.

2 группа - животные, которые получали бетулоновую кислоту и ее аланинамидные производные (2а-аланин-бетулоновая кислоты, метиловый эфир 2а-аланин-бетулоновой кислоты).

3 группа - животные, которым были введены комплекс цитостатических препаратов, в динамике наблюдения.

4 группа - животные, которым до получения комплекса цитостатических препаратов, были введены бетулоновая кислота и ее аланинамидные производные, также в динамике наблюдения.

5 группа - животные, которым был введен дигидроквирцетин (в качестве препарата сравнения).

Экспериментальные модели Моделирование токсического повреждения

В качестве экспериментальной модели использовали цитотоксическое действие комплекса антибластомных препаратов с различным механизмом

действия, выбрав классическую химиотерапевтическую программу CHOP (Зарицкий А.Ю., Алексеева Ю.А., 2001): циклофосфан, доксорубицин (гидроксидауномицин), винкристин (онковин), преднизолон. Цитотоксическую модель включает в себя однократное введение животным комплекса противоопухолевых препаратов: циклофосфан («Биохимик», Саранск), доксорубицин ("ЛЭНС-Фарм", Россия), винкристин ("Гедеон Рихтер", Венгрия), преднизолон ("Гедеон Рихтер", Венгрия). Доза вводимого полихимиотерапевтического комплекса составляла 1/5 LD5o, рассчитанной по методу Беренса по количеству погибших и выживших животных (Беленький Л.М., 1963, Мишенина СВ., 2002). 1/5 дозы LD50 комплекса цитостатических препаратов для крыс составила: циклофасфан -21мг/кг; доксорубицин -2,1мг/кг; винкристин - 0,04мг/кг; преднизолон - 2,1 мг/кг массы при однократном внутрибрюшинном введении (Мишенина C.B., 2002). Циклофосфан и доксорубицин разводили ex tempore 0,9% раствором хлорида натрия, преднизолон и винкристин использовали в виде готовых растворов. Группа контрольных животных получала внутрибрюшинно стерильный изотонический раствор натрия хлорида в том же объеме.

Моделирование ишемического повреждения in vitro

Для оценки активности мембраноповреждающих процессов использовали модель ишемического повреждения in vitro (Шарапов В.И., Грек O.P., Долгов A.B., 1986; 1987). Гомогенат, полученный нижеуказанным методом, подвергали инкубации при температуре 37°С на протяжении 120 минут. Заборы образцов проводились до начала инкубации (нулевое время), через 60 минут и 120 минут инкубации.

Моделирование сочетанного повреждения

Для оценки патологических процессов, возникающих при токсическом и ишемическом повреждении, использовали гомогенат печени экспериментальных животных, получавших однократно комплекс цитостатических препаратов, который затем подвергали инкубации в течение 120 мин по вышеописанным методам.

Материал исследования

Сыворотка крови

После декапитации животных под эфирным наркозом кровь собирали в центрифужные пробирки и оставляли на 30 минут при комнатной температуре, затем пробирки центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин. Сыворотку отбирали пипеткой и замораживали, либо использовали сразу. АОА сыворотки оценивали с применением желточных липопротеинов по методу Г.И. Клебанова и др. (1988). Скорость реакций перекисного окисления липидов оценивали по концентрации малонового диальдегида (МДА) в реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) (Steinbrecher U.P., 1990, Арутюнян A.B., Дубинина Е.Е., Зыбина H.H., 2000).

Гомогенат печени

После декапитации животных печень отмывали через нижнюю полую вену буферным раствором 0,9% раствором NaCl и гомогенизировали в среде, содержащей 0,25 М сахарозу и 40 мМ трис-НС1-буфер, рН=7,4 (Т +1, +4°С), по окончании перфузии печень приобретала светло-бежевую окраску. Исследуемые образцы измельчали путем продавливания через перфорированный пресс из нержавеющей стали (диаметр отверстий 1 мм). Ткань гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе Поттера-Эльвейна с тефлоновым пестиком в течение 45 секунд при 1200 об/мин при +4°С. Приготовленный 20% (масса/объем) гомогенат фильтровали через капроновую ткань и использовали в дальнейших процедурах.

Определение активности лизосомальных ферментов в гомогенате печени и в сыворотке крови

20% гомогенат печени готовили на растворе 0,25 М сахарозы, содержащем 1 мМ ЭДТА, pH 7,4, при предварительной перфузии органа. Общую активность лизосомальных ферментов определяли после разрушения органел в присутствие 0,15% Тритона Х-100. Свободную активность определяли в присутствие в инкубационной смеси 0,25 М сахарозы, время инкубации 10 минут. Активность кислой фосфатазы определяли с использованием субстрата - 2-глицерофосфата, ß-галактозидазы - с субстратом 4-нитрофенил-Р-0-галактопиранозидом (Barret A. J., 1972). Свободную активность лизосомальных ферментов в гомогенате печени выражали в процентах от общей.

Содержание белка в гомогенате печени определяли по методу Лоури (Lowry О.Н., 1951).

В сыворотке крови определяли активность аланинаминотрансферазы (АлАТ) в мккат/л, аспартатаминотрансферазы (АсАТ) в мккат/л, щелочной фосфатазы (ЩФ) в ммоль/л, у-глутамилтрансферазы (у-ГГТ) в мккат/л, тимоловую пробу в единицах помутнения с помощью диагностических наборов реактивов фирмы PLIVA-Lachema Diagnostika s.r.o.

Оценка активности процессов ПОЛ и АОА в гомогенате печени

Активность реакций перекисного окисления липидов (ПОЛ) изучалась в гомогенате печени в динамике спонтанной индукции.

Для оценки активности процессов пероксидации в ткани печени определяли спонтанное (СПОЛ), аскорбат-зависимое (АЗПОЛ) и НАДФН-зависимое (НЗПОЛ) ПОЛ по концентрации малонового диальдегида (МДА) в реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) (Steinbrecher U.P., 1990, Арутюнян A.B., Дубинина Е.Е., Зыбина H.H. 2000). Расчеты проводили с использованием коэффициента молярной экстинкции (156 мМ"1). Результаты выражали для спонтанного ПОЛ в нмоль/мг белка, для индуцированного ПОЛ - в нмоль/мин/мг белка. АОА гомогената печени оценивали с применением желточных липопротеинов по методу Г.И. Клебанова и др. (1988).

Оценка состояния микросомальных мембран печени

В гомогенате печени оценивали скорость метаболизма амидопирина, эритромицина, анилина (Щербаков В.М., Тихонов А.В., 1995). Скорость метаболизма амидопирина и эритромицина оценивали по скорости образования формальдегида в реакции М-деметилирования. Количество формальдегида определяли в реакции Nash Т. (1953). Показатели выражали в нмоль НСНО/мин/г белка гомогената. Скорость метаболизма анилина определялась по скорости р-гидроксшшрования (Щербаков В.М., Тихонов А.В., 1995), которую оценивали по количеству образовавшегося р-аминофенола (Imai Y., 1966). Показатели выражали в нмоль р-аминофенола/мин/г белка гомогената. Содержание белка в гомогенате печени определяли по методу Лоури (Lowry О.Н., 1951).

Статистическая обработка результатов

Полученные данные подвергали статистической обработке с вычислением среднего арифметического (М), ошибки среднего (м). Достоверность различий рассчитывали с использованием t-критерия Стьюдента с уровнем вероятности р<0,05. Обработку результатов проводили с использованием компьютерных программ Statgraf, Microsoft Excel (Гублер Е.В., 1978).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Фармакокоррекция производными бетулина мембраноповреждающих процессов при токсическом повреждении печени

Для оценки характера повреждения клеток печени изучали показатели цитолитического, холестатического и мезенхимально-воспалительного поражения гепатоцитов. Основным механизмом повреждения клеточных мембран являются инициация процессов ПОЛ и активация фосфолипаз А1, А2, С (Mukherjee А.К., Ghosal S.K., Maity C.R., 1997; Nilsson E„ Ghassemifar R., Brunk U.T., 1997).

Однократное введение ПХК приводит к изменению биохимических показателей целостности клеточных мембран: на 7-е и 14-е сутки в сыворотке крови повышалась активность АлАТ в 1,5 и 1,7 раза, АсАТ в 2 и 2,3 раза, уГГТ в 4,7 раза, ЩФ в 1,6 и 1,4 раза, тимоловой пробы в 1,6 и 2,2 раза, а также кислой фосфатазы в 1,3 и 1,2 раза соответственно по сравнению с интактным контролем.

Степень подъема активности цитозольных ферментов в сыворотке крови животных указывает на повреждение не только клеточных, но и субклеточных мембран гепатоцитов.

При введении БК-соединений на фоне токсического повреждения уже на 7-е сутки регистрировалось восстановление активности АлАТ, уГГТ и ЩФ до показателей интактной группы и ниже в группе 2а-ЭБК. Уровень АсАТ на 7-е сутки в пределах интактного контроля отмечался только в группе БК, в

других группах активность была выше показателей контроля в 2 раза (2а-БК) и 3,8 раза (2а-ЭБК). Показатель тимоловой пробы восстанавливался медленнее и был выше контроля на 7-е и 14-е сутки, но достоверно ниже контроля ПХК: в группе БК на 18% и 32%, в группе 2а-БК на 23% и 31,4%, в группе 2а-ЭБК до 33% соответственно срокам (табл. 1).

Таблица 1.

Влияние бетулоновой кислоты и ее альфа-производных (в дозе 50 мг/кг) на изменение биохимических показателей в сыворотке крови на фоне токсического повреждения (М±т, п=6).___

Условия эксперимента АлАТ, мккат/л АсАТ, мккат/л уГГТ, мккат/л ЩФ, моль/л Тимолов ая проба, ед. S-H

Контроль 0,24±0,05 0,04±0,01 1,86±0,23 1,7±0,23 28,0+2,0

ПХК-7 сут. а 0,35+0,02 0,04±0,01 а 8,81+0,45 а 2,7+0,04 а 45,1+2,8

ПХК-14сут. а 0,4±0,03 а 0,09+0,01 1,63±0,06 а 2,4±0,08 а 60,5+2,5

и ^ 6« БК * 0,26±0,04 0,05±0,01 * 1,62+0,14 * 1,4+0,3 а* 36,8+2,0

2а-БК * 0,28±0,02 а* 0,08±0,004 * 1,62+0,14 * 1,8+0,1 а* 34,9+2,6

С 2а-ЭБК а* 0,16±0,02 а* 0,15±0,01 * 1,86±0,08 а* 0,9±0,05 а 42,7+3,3

Б * у- а БК а 0,33±0,02 а 0,09+0,01 1,54+0,04 а* 1,1±0,1 а* 41,3+1,5

2а-БК * 0,21+0,08 а>£ 0,07±0,002 1,59+0,11 а* 0,8±0,09 а* 41,5+4,5

2а-ЭБК а* 0,18±0,02 а 0,1±0,01 1,64±0,04 * 1,3±0,1 а* 40,7+1,9

Примечание: в качестве контроля выступала группа животных с введением

водно-твиновой взвеси без БК-соединений.

ра - достоверность различий с контрольной группой (р<0,05),

р*- достоверность различий с ПХК-7, ПХК-14 сут. соответственно (р<0,05).

Однократное введение ПХК приводит к увеличению концентрации МДА в сыворотке крови на 7-е сутки на 66% и на 14 -е, хотя и наблюдается тенденция к снижению, уровень МДА остается высоким на 47% по сравнению с интактным контролем. Этому соответствует и невысокая АОА 46% и 75% от контроля. Из введенных соединений значительно снизилась скорость реакций ПОЛ в группе БК, при этом уровень МДА на 7 -е и 14 -е сутки достоверно соответствовал интактному контролю. При введении 2а-БК и 2а-ЭБК наметилась лишь тенденция к снижению накопления МДА. АОА

при введении 2а-БК на 7 -е сутки была почти в 2 раза выше интактного контроля и снижалась до его значений на 14 -е сутки. В группе 2а-ЭБК, наоборот, АОА на 7 -е сутки достоверно не отличалась от интактного контроля, а затем возрастала на 14 -е сутки в 1,5 раза (табл. 2).

Таблица 2.

Влияние бетулоновой кислоты и ее альфа-производных (в дозе 50 мг/кг) на активность процессов ПОЛ и АОА сыворотки крови при токсическом повреждении (М±т, п-6.)__

Условия МДА, АОА,

эксперимента нмоль/мг отн. ед.

Контроль 3,2±0,1 36,6+1,02

ПХК-7 сут. 5,3±0,6а 17,0±1,7а

ПХК-14 сут. 4,7±0,5а 27,5±1,5а

3 ^ ¡2 и БК 3,3±0,2* 37,5+1,4*

2а-БК 4,1±0,4а 68,4±2,34а*

В 2а-ЭБК 5,4±0,4а* 41,4±3,5*

& £> БК 3,2±0,6* 37,5±1,4*

2а-БК 4,0±0,2а 37,3±4,3*

В 3 2а-ЭБК 4,2±0,1а 55,3±1,6а*

Примечание: в качестве контроля выступала группа животных с введением

водно-твиновой взвеси без БК-соединений.

ра - достоверность различий с контрольной группой (р<0,05),

р*- достоверность различий с ПХК-7, ПХК-14 сут. соответственно (р<0,05).

Таблица 3.

Влияние бетулоновой кислоты и ее альфа-производных (в дозе 50 мг/кг) на изменение свободной активности кислой фосфатазы (в % от общей) в гомогенате печени при токсическом повреждении (М±т, п-6)._

Условия эксперимента Кислая фосфатаза

Контроль 7,19±0,22

ПХК-7 сут. 21Д9±0Д6а

ПХК-14 сут. 23,99±0,14а

ПХК-7 сут БК 15,7±0,1а*

2а-БК 14,15±0,18а*

2а-ЭБК 15,2±0Д1а*

пхк- 14сут БК 18,89±0Д2а*

2а-БК 17,34±0,14а*

2а-ЭБК 18,39±0,16а*

Примечание: в качестве контроля выступала группа животных с введением водно-твиновой взвеси без БК-соединений. ра - достоверность различий с контрольной группой (р<0,05), р*- достоверность различий с ПХК-7, ПХК-14 сут. соответственно (р<0,05).

10

Введение ПХК также нарушало стабильность мембран лизосом печени крыс, это отразилось в выраженном повышении свободной активности лизосомальных ферментов в гомогенате печени, на 7-е и 14-е сутки активность кислой фосфатазы повысилась в 2,9 и 3,3 раза. На фоне профилактического введения БК, 2а-БК, 2а-ЭБК свободная активность кислой фосфатазы снижалась на 7-е сутки в диапазоне 2-2,1 раза и на 14-е сутки в диапазане 2,4-2,6 раза, соответственно, по сравнению с контролем. Наиболее выраженный мембраностабилизирующий эффект отмечен в группе 2а-БК (табл. 3).

Однократное введение ПХК приводило к повышению концентрации МДА в гомогенате на 7-е сутки в 1,5 раза и на 14-е сутки в 1,9 раза. Повышение активности процессов липидной пероксидации при моделировании токсического повреждения соответствует данным литературы о прооксидантном действии циклофосфана и доксорубицина (Lear L., Nation R.L., Stupans I., 1992; Kaya H., Oral В., Ozguner F. et al„ 1999; Xu M.F., Tang P.L., Qian Z.M., Ashraf M., 2001). По сравнению с процессами ПОЛ, повреждение лизосомальных мембран было более выраженным, что может быть связано с вовлечением каких-либо других механизмов лабилизации мембран лизосом (активация фосфолипаз, осмотические эффекты и др.). Процессы ПОЛ, возникающие на фоне токсического повреждения, зависят от состояния антиоксидантной системы, функцией которой является удаление активных форм кислорода и снижение антиокислительного потенциала. При токсическом воздействии отмечалось ослабление АОА в гомогенате на 7-е сутки в 1,6 раза и на 14-е сутки в 1,9 ра-

Таблица 4.

Влияние бетулоновой кислоты и ее альфа-производных (в дозе 50 мг/кг) на изменение активности ПОЛ в гомогенате печени крыс при токсическом повреждении (М±т, п=6).__

Условия МДА, АОА,

эксперимента нмоль/мг белка отн. ед.

Контроль 0,13+0,01 71,9+1,11

ПХК-7 сут. 0,20±0,01а 44,1±1,8а

ПХК-14сут. 0,25±0,02а 38,1±2,6а

й £ БК 0,11±0,01а* 68,9±2,2*

2а-БК 0,15+0,01* 60,9±3,5а*

с 2а-ЭБК 0,1+0,0Г* 69,6+1,1*

ä £ И БК 0,14+0,01* 60,2±3,4°*

2а-БК 0,16±0,01а* 58,7±2,8а*

a S 2а-ЭБК 0,07+0,00 Г* 74,01+1,6*

Примечание: в качестве контроля выступала группа животных с введением

водно-твиновой взвеси без БК-соединений.

ра - достоверность различий с контрольной группой (р<0,05),

р*- достоверность различий с ПХК-7, ПХК-14-сут. соответственно (р<0,05).

за вследствии инициации ПОЛ. Профилактическое введение БК, 2а-БК, 2а-ЭБК способствовало снижению активности ПОЛ и повышению АОА в гомогенате печени. Более выраженный антиоксидантный эффект отмечался в группе БК и 2а-ЭБК (табл. 4).

Таким образом, используемые с профилактической целью БК-соединения при токсическом повреждении оказывали в разной степени выраженности протективный эффект.

Корреция производными бетулина мембраноповреждаюших процессов при моделировании ишемнческого повреждения печени

Одним из ранних проявлений реакции гепатоцитов на ишемическое повреждение является изменение функционального состояния лизосомального аппарата. Прирост свободной активности кислой фосфатазы в интактной группе составил в 5,5 и 7,1 раза (60' и 120') соответственно по сравнению с нулевой точкой. В группах БК, 2а-БК, 2а-ЭБК свободная активность кислой фосфатазы повысилась в 3,2; в 3,9; в 3,5 раза на 60 мин, а через 120 мин в 3,4; в 4,7; в 4 раза и в группе ДКВ в 4,1 и 4,4 раза (60' и 1200 соответственно по сравнению с начальной точкой.

При профилактическом введении БК-соединений на фоне ишемического воздействия свободная активность кислых гидролаз в начальной точке была ниже или в пределах интактного контроля, но при дальнейшем ишемическом повреждении отмечалось достоверное снижение их активности. Так, через 60 мин свободная активность кислой фосфатазы уменьшилась в 1,7 раза соответственно во всех группах, а через 120 мин ишемического повреждения снизилась в 1,9 и в 1,5 раза соответственно во всех группах по сравнению с интактным контролем (табл. 5).

Таблица 5.

Влияние бетулоновой кислоты и ее альфа-производных (в дозе 50 мг/кг) на изменение свободной активности кислой фосфатазы (в % от общей) печени при моделировании ишемического повреждения (М±т, п=б).

Условия эксперимента Время ишемического повреждения, мин

0' 60' 120'

Контроль 7,19±0,22 39,66±0,13 51,2+0,18

БК 7,36±0,18 23,39±0,1а 24,79±0,18а

2а- БК 5,81±0,11а 22,55±0,12а 27,02±0,6а

2а- ЭБК 6,87±0,08 23,77±0,1а 27,67±0,11а

ДКВ 5,63±0,84а 23,3±0,68а 24,6±1,12а

Примечание: в качестве контроля выступала группа животных с введением

водно-твиновой взвеси без БК-соединений.

ра - достоверность различий с контрольной группой (р<0,05),

Известно, что ткань печени высоко чувствительна к гипоксическому воздействию, в результате которого изменяется функциональная активность монооксигеназных систем ЭПР гепатоцитов (Шарапов В.И., Грек О.Р., Долгов A.B., 1987). Так, активность микросомальных ферментов по способности ДГ-деметилирования амидопирина имела достоверные отличия от интактного контроля и увеличилась в начальной точке в группе 2а-ЭБК в

1.4 раза, в группе 2а-БК в 1,8 раз и при введении препарата сравнения ДКВ в

1.5 раза. Исключение составила группа БК - показатели были в пределах интактного контроля.Через 60 мин активность микросомальных ферментов увеличилась в 2 раза и через 120 мин активность составила в группе БК в 2,1 раза, 2а-ЭБК в 3,1 раза, 2а-БК в 4,7 раза и при введении ДКВ в 4,4 раза по сравнению с исходными значениями. Также отмечалось достоверное снижение микросомальных изоформ, осуществляющих АГ-деметилирование эритромицина в 2,2 раза (60 мин) и 7,6 раза (120мин). Результаты анилин-р-гидроксилирующей активности указывали на снижение в 2,3 раза (60 мин) и в 46,4 раза (120 мин) по сравнению с нулевой точкой, т.е. свидетельствовали о почти полном ингибировании процесса (табл. 6).

Таблица 6.

Изменение скорости метаболизма амидопирина в ткани печени у интактных животных после введения бетулоновой кислоты и ее альфа-производных (в дозе 50мг/кг) при моделировании ишемического

Условия эксперимента Амидопирин

Время ишемического повреждения, мин

0' 60' 120'

Контроль 18,3±0,47 7,4±0,74 4,4±0,13

БК 19,2±0,65 14,4+0,3 Ia 9,45+0,25a

2а-БК 32,8±0,31a 26,9±0,55a 20,5±0,34a

2а-ЭБК 26,l±0,42a 21,2±0,13a 13,6±0,42a

ДКВ 28,l±0,35a 21,48±0,1a 19,3+0,14 a

Примечание: в качестве контроля выступала группа животных с введением водно-твиновой взвеси без БК-соединений. Скорость М-деметилирования амидопирина в нмоль НСНО/мин/мг белка. ра - достоверность различий с контрольной группой (р<0,05).

При индукции ПОЛ наблюдалась избирательная активация пероксидации, которая зависела как от вида индуктора, от химического строения молекул БК-соединений, так и от времени ишемического повреждения. Так, АЗПОЛ снижалось в начальной точке в группе БК на 47%, с 2а-БК - на 78,8%, с 2а-ЭБК - на 81,8% и с ДКВ - на 63,6% по сравнению с интактным контролем. Через 60 мин в группе БК не отличалось от исходного значения, однако в группе 2а-БК, 2а-ЭБК и ДКВ оно снижалось на 53%, 46,9% и 45,5% соответственно. На 120 мин в группах 2а-БК и ДКВ

показатели приближались или были равны интактному контролю, а в группе БК были выше на 50%, с 2а-ЭБК ниже на 20% от исходных значений. Вероятно, это можно объяснить различной способностью включаться в биологические мембраны исследуемых соединений. Включение в биомембраны в зависимости от химического строения молекулы является причиной различных изменений физико-химических свойств мембраны (табл. 7).

Таблица 7.

Влияние бетулоновой кислоты и ее альфа-производных (в дозе 50 мг/кг) на изменение активности АЗПОЛ в ткани печени интактных животных при моделировании ишемического повреждения (М+т, п-6)._

Условия эксперимента Время ишемического повреждения, мин

0' 60' 120'

Контроль 0,66±0,02 0,66±0,02 0,5±0,03

БК 0,35±0,02а 0,67±0,05 0,75±0,08а

2а- БК 0Д4±0,01а 0,31±0,01а 0,5±0,02

2а- ЭБК 0,12+0,002* 0,35±0,04а 0,4±0,01а

ДКВ 0,24±0,02а 0,36±0,03а 0,46+0,01

Примечание: в качестве контроля выступала группа животных с введением

водно-твиновой взвеси без БК-соединений.

Содержание МДА в нмоль/мин/мг белка.

ра - достоверность различий с контрольной группой (р<0,05).

Таблица 8.

Влияние бетулоновой кислоты и ее альфа-производных (в дозе 50 мг/кг) на изменение активности НАДФНЗПОЛ в ткани печени интактных животных при моделировании ишемического повреждения (М±т, п=6).

Условия эксперимента Время ишемического повреждения, мин

0' 60' 120'

Контроль 0,47±0,01 0,43±0,01 0,33±0,03

БК 0,59+0,03" 0,65+0,02а 0,73±0,02а

2а-БК 0,29±0,01а 0,44±0,03 0,52+0,01"

2а- ЭБК 0,32±0,01а 0,42±0,03 0,43±0,03а

ДКВ 0,39+0,01" 0,49±0,01а 0,47±0,01"

Примечание: в качестве контроля выступала группа животных с введением

водно-твиновой взвеси без БК соединений.

Содержание МДА в нмоль/мин/мг белка.

р" - достоверность различий с контрольной группой (р<0,05).

НАДФНЗПОЛ отражает состояние электронтранспортной цепи, ее целостность и проводящую способность, т.е. функционирование «активирующих» изоформ микросомальных ферментов, таких как Р450ПЕ1

(Johansson I., Ingelman-Sundberg M., 1983; Щербаков B.M., Тихонов A.B., 1995). Активность данной изоформы снижается при применении антиоксидантов (Ланкин В.З., 1981). При введении 2а-БК и 2а-ЭБК в начальной точке наблюдалось понижение в 1,6 и 1,5 раза соответственно к контролю, через 60 мин показатели были в пределах интактного контроля, а на 120 мин увеличились в 1,6 и 1,3 раза по сравнению с контролем. Но при использовании БК-соединений активность НАДФНЗПОЛ достоверно повышалась в группе БК в 1,3 раза (00, в 1,5 раза (60') и в 2,2 раза (120') по сравнению с контролем. Бетулоновая кислота, в отличие от ее производных, оказывает активирующее влияние на скорость индуцированного ПОЛ, особенно выраженное в НАДФ-зависимой системе, что полностью согласуется с литературными данными (Жоголь P.A., Мотолова Т.И., Толстикова Т.Г. и др., 2004). Это может быть связано с ее преобладающим воздействие по отношению к «активирующим» изоформам цитохромов по сравнению с ее антиоксидантными свойствами (табл. 8).

Увеличение активности микросомальных ферментов при использовании БК-соединений может быть связано с улучшение реологических свойств мембраны и изменением ее проницаемости дня различных ионов, субстратов и продуктов реакций. Известно, что в функционировании микросомальных редокс-цепей важную роль играет фосфолипидный компонент мембраны ЭПР (Арчаков А.И„ 1975; 1983; Абрамова Ж.И., Оксенгендлер Г.И., 1985). Изменения в мембранах могут распространяться и на митохондриальные, что ведет к увеличению эффективности дыхательной цепи и стимуляции тканевого дыхания, повышению эффективности АТФ-аз и других энергопотребляющих процессов, все это способствует повышению энергетического потенциала клетки. Данные энергоповышающие процессы могут быть причиной органопротективных свойств, наблюдаемых при использовании БК-соединений (Позднякова C.B., Грек O.P., Сорокина И.В. и др., 2004).

Профилактическое однократное введение животным БК-соединений не влияло на исходную активность ПОЛ. При введении ДКВ отмечалось снижение концентрации МДА во всех точках на 15,4%, 29,2% и 64,6% соответственно. Через 60 мин ишемического повреждения все соединения ингибировали накопление МДА в диапазоне на 12,5-50% по сравнению с контролем, но наиболее выраженный антиоксидантный эффект отмечался в группе 2а-ЭБК - на 50%. При дальнейшем ишемическом повреждении снижают уровень МДА БК на 27%, 2а-БК на 45,8%, 2а-ЭБК на 62,5% по сравнению с контролем.

При сравнительной оценке уровня прироста МДА на фоне ишемического повреждения в контроле наблюдалось повышение в 1,8 и 3,7 раза по сравнению с нулевой точкой. Профилактическое введение БК повышало концентрацию МДА в 1,6 и 2,7 раза; 2а-БК 1,3 и 2 раза; 2а-ЭБК в 1,2 и 1,8 раза и при введении ДКВ в 1,5 раза на 60 и 120 мин соответственно по сравнению с начальной точкой (таблица 9).

Таблица 9.

Влияние бетулоновой кислоты и ее альфа-производных (в дозе 50 мг/кг) на изменение активности ПОЛ в ткани печени крыс при моделировании ишемического повреждения (М±т, п-6).

Условия эксперимента МДА, нмоль/мг белка

Время ишемического повреждения, мин

0' 60' 120'

Контроль 0,13+0,01 0,24+0,02 0,48±0,09

БК 0,13+0,01 0,21+0,02" 0,35±0,03а

2а-БК 0,13+0,05 0,17+0,01" 0,26±0,03а

2а-ЭБК 0,1 ±0,02" 0,12±0,02" 0,18±0,01а

ДКВ 0,11±0,002а 0,17+0,01" 0,17+0,005"

Примечание: в качестве контроля выступала группа животных с введением

водно-твиновой взвеси без БК-соединений.

р" - достоверность различий с контрольной группой (р<0,05).

Показатели изменения уровня АОА на фоне ишемического повреждения показала, что при введении БК-соединений антиокислительный потенциал возрастал. Наиболее выраженный антиоксидантный эффект был выявлен в группах 2<х-БК (32,1%, 29,9%, 61,5%) и 2а-ЭБК(32,5%, 37,4%, 58%) по всем точкам соответственно (таблица 10).

Таблица 10.

Влияние бетулоновой кислоты и ее альфа-производных (в дозе 50мг/кг) на изменение АОА в ткани печени крыс при моделировании сочетанного

повреждения (М±т, п=6

Условия АОА, отн. ед.

эксперимента Время ишемического повреждения, мин

0' 60' 120'

Контроль 71,9+1,11 56,2±1,73 40,0±4,98

БК 88,4+1,2а 69,6±3,3а 55,4±1,8а

2а-БК 95,0+1,8" 73,0±7,6а 64,6±5,0а

2а-ЭБК 95,3+1,6а 77,2+1,2а 63,2±1,8а

ДКВ 86,9+3,6а 72,9±1,7а 67,7±2,5а

Примечание: в качестве контроля выступала группа животных с введением

водно-твиновой взвеси без БК-соединений.

ра - достоверность различий с контрольной группой (р<0,05).

Таким образом, профилактическое введение БК-соединений способствовало коррекции ишемического повреждения.

Фармакокоррекция производными бетулина мембраноповрезвдающих процессов при сочетанном повреждении

печени

Свободная активность лизосомальных ферментов в гомогенате достоверно увеличивались в зависимости от времени ишемического воздействиия на 7-е сутки свободная активность кислой фосфотазы в 2,9 раза (О') и в 1,3 раза при дальнейшей инкубации (60' и 120'), достигая максимальных результатов на 14-е сутки (в 0', 60'и 120') в 3,3 раза, в 1,4 и 1,3 раза соответственно по сравнению с интактным контролем. Таким образом, значительное изменение проницаемости лизосомальных структур клетки объясняется выраженной активацией ПОЛ мембран клеток и определяет повреждающие механизмы ишемического и токсического воздействия.

Таблица 11.

Влияние бетулоновой кислоты и ее альфа-производных (в дозе 50 мг/кг) на изменение свободной активности кислой фосфатазы (в% от общей) в гомогенате печени при сочетанном повреждении (М±т, п-6)._

Условия эксперимента Время ишемического повреждения, мин

0' 60' 120'

Контроль 7,19+0,22 39,66±0,13 51,2+0,18

БК 7,36+0,18 23,39±0Да 24,79+0,18а

2а-БК 5,81±0,1Г 22,55+0,12а 27,02±0,6а

2а- ЭБК 6,87+0,08 23,77±0,Г 27,67+0,11а

ДКВ 5,63+0,84я 23,3±0,68а 24,6+1,12а

ПХК-7 сут 21,19+0,16" 53,21+0,63а 64,78±0Д5а

ПХК-14суг 23,99±0Д4а 56,32±0Д4а 67,88±0Д2а

ПХК-7 сут БК 15,7±0,1а*в 47,71 ±0,19а*в 59,26±0Д5а*в

2а-БК 14Д5±0Д8а*в 46,17±0,14а*° 57,72±0,46а*в

2а-ЭБК 15,2±0,1Г*В 47,22±0Д7а*в 58,77±0,07а*в

ПХК-14 сут БК 18,89±0,12а*в 50,91 ±0,33а*в 62,45±0,68а*в

2а-БК 17,34±0,14а*в 49,37±0,13а*в 60,92±0,19а*в

2а-ЭБК 18,39±0Д6а*в 50,43±0Д6а*в 61,96±0,59а*в

Примечание: в качестве контроля выступала группа животных с введением

водно-твиновой взвеси без БК-соединений.

ра - достоверность различий с контрольной группой (р<0,05),

р*- достоверность различий с ПХК-7, ПХК-14 сут. соответственно (р<0,05),

рв- достоверность различий с БК- соединениями (р<0,05).

При профилактическом введении БК, 2а-БК, 2а-ЭБК на фоне сочетанного повреждения печени отмечалось уменьшение активности и несмотря на то, что показатели были выше интактного контроля, их активность была достоверно ниже контроля ПХК на 7-е и 14-е сутки. По сравнению с БК, группы 2а-БК и 2а-ЭБК оказывали более выраженный

17

мембраностабилизирующий эффект, который сохранялся на 14-е сутки (табл. 11).

Таким образом, выявленные изменения отражают мембраностабилизирующее действие БК-соединений, препятствующих выходу лизосомальных ферментов клеток печени в кровь.

Таблица 12.

Влияние бетулоновой кислоты и ее альфа-производных (в дозе 50 мг/кг) на изменение активности ПОЛ в ткани печени крыс при сочетанном повреждении (Mim, п-6).

Условия эксперимента МДА, нмоль/мг белка

Время ишемического повреждения, мин

0' 60' 120'

Контроль 0,13+0,01 0,24+0,02 0,48+0,09

БК 0,13+0,01 0,21+0,02" 0,35±0,03"

2а-БК 0,13+0,05 0,17+0,01" 0,26+0,03"

2а-ЭБК 0,1±0,02а 0,12+0,02" 0,18±0,01"

ДКВ 0,11±0,002а 0,17+0,01" 0,17+0,005"

ПХК-7 сут. 0,2±0,01а 0,29+0,01" 0,39+0,05"

ПХК-14 сут. 0,25±0,02а 0,32+0,01" 0,45±0,01а

ПХК-7сут БК 0,11+0,01°*" 0,12±0,01"*в 0,2±0,02"*в

2а-БК 0,15±0,01* 0,17+0,01"* 0,19+0,01"*"

2а-ЭБК 0,1±0,01а* 0,18±0,01а*в 0,29+0,02"*°

ПХК-14 су г БК 0,14±0,01* 0,16+0,01"*" 0,21±0,01"*8

2а-БК 0,16±0,01а* 0,13±0,001"*в 0,24±0,004"*

2а-ЭБК 0,07±0,00Г* 0,12±0,01а* 0,17±0,02а*

Примечание: в качестве контроля выступала группа животных с введением

водно-твиновой взвеси без БК-соединений.

ра - достоверность различий с контрольной группой (р<0,05),

р*- достоверность различий с ПХК-7, ПХК-14 сут. соответственно (р<0,05),

рв- достоверность различий с БК- соединениями (р<0,05).

Сочетанное повреждение ткани печени приводило к более выраженной активации процессов ПОЛ. Так, на 7-е сутки концентрация МДА в гомогенате увеличилась на 54% и 21% (0'и 60') соответственно, а на 120 мин содержание МДА достоверно не отличалось от контроля. НА 14-е сутки уровень МДА повысился на 92,3% и 33% (0'и 60') соответственно по сравнению с интактным контролем и на 120 мин не отличался от исходного. Профилактическое введение БК, 2а-БК, 2а-ЭБК значительно ингибировало накопление МДА во всех точках, показатели были достоверно ниже интактного контроля.

При использовании БК-соединений на фоне сочетанного повреждения прирост МДА на 60 мин не отличался от начальной точки, кроме группы 2а-ЭБК - повышение в 1,8 раза и через 120 мин концентрация МДА повысилась в группах БК, 2а-БК, 2а-ЭБК в 1,8; в 1,3; в 2,9 раза соответственно по сравнению с нулевой точкой. На 14-е сутки в группах 2а-БК, 2а-ЭБК прирост МДА составил на 60 мин в 1,2 и 1,7 раза соответственно, при этом в группе БК показатели не изменялись и к 120 мин возросли в группе БК и 2а-БК в 1,5 раза, в группе 2а-ЭБК в 2,4 раза по сравнению с начальной точкой. Из введенных БК-соединений значительно снизили скорость реакций ПОЛ на 7-е сутки БК, а на 14-е сутки 2а-ЭБК (табл. 12).

Таблица 13.

Влияние бетулоновой кислоты и ее альфа-производных (в дозе 50мг/кг) на изменение АОА в ткани печени крыс при сочетанном повреждении (М+т, п=6).__

Условия эксперимента АОА, отн. ед.

Время ишемического повреждения, мин

0' 60' 120'

Контроль 71,9+1,11 56,2±1,73 40,0±4,98

БК 88,4±1,2а 69,6+3,3" 55,4+1,8а

2а-БК 95,0±1,8а 73,0±7,6а 64,6±5,0а

2а-ЭБК 95,3+1,6а 77,2+1,2" 63,2+1,8а

ДКВ 86,9+3,6а 72,9±1,7а 67,7±2,5а

ПХК- 7 сут. 44,1+1,8а 35,5±1,8а 30,3+2,1а

ПХК-14 сут. 38,1±2,6а 28,1±1,6а 26,2+1,7а

пхк- 7 сут БК 68,9±2,2*в 55,0±2,3*в 50,5±1,5а*в

2а-БК 60,9+3,5а*в 51,2+1,2а*в 49,1+1,За*в

2а-ЭБК 69,6+1,1*" 50,9+1,2"*в 44,6±1,6*в

пхк- 14сут БК 60,2±3,4а*в 49,3±1,5а*в 50,4±2,2а*в

2а-БК 58,7+2,8а*в 51,1±2,1а*° 46,9±2,0*в

2а-ЭБК 74,01±1,6*в 59,1±1,5*в 52,6±2,2а*в

Примечание: в качестве контроля выступала группа животных с введением

водно-твиновой взвеси без БК-соединений.

ра - достоверность различий с контрольной группой (р<0,05),

р*- достоверность различий с ПХК-7, ПХК-14 сут. соответственно (р<0,05),

р°- достоверность различий с БК-соединениями (р<0,05).

Значительная инициация процессов ПОЛ на фоне сочетанного повреждения объясняет ослабление АОА на 7-е сутки уровень АОА в начальной точке и через 60 мин в группе БК оставался в пределах интактного котроля и к 120 мин выше в 1,3 раза. В группе 2а-БК был меньше в 1,2 и 1,1 раза (0 и 60 мин), а затем возростал в 1,2 раза (120 мин) соответственно по сравнению с интактным контролем. 2а-ЭБК в начальной точке был в

пределах контроля, к 60 мин меньше в 1,1 раза и к 120 мин выше в 1,1 раза по сравнению с интактным контролем. На 14—е сутки сочетанного повреждения при введении БК и 2а-БК антиокислительный потенциал был ниже интактного контроля на начальной и 60 мин, а к 120 мин увеличивался в 1,3 и 1,2 раза соответственно по сравнению с интактным контролем. В группе 2а-ЭБК уровень АОА увеличился к 60 мин в 1,1 раза и 120 мин в 1,3 раза по сравнению с контролем.

Сочетанное повреждение печени вызывало снижение АОА на 7-е, 14-е сутки на 60-й мин в 1,3 и 1,4 раза соответственно и на 120-й мин в 1,5 раза по сравнению с начальной точкой. При введении БК, 2а-БК и 2а-ЭБК на 7-е сутки уровень АОА снизился на 60-й мин в 1,3; в 1,2 и 1,4 раза соответственно, а через 120 мин в 1,4; в 1,3 и 1,6 раза соответственно по сравнению с начальной точкой. На 14-е сутки АОА на 60-й и 120-й мин в группе БК уменьшилась в 1,2 раза; в группе 2а-БК в 1,1 и 1,3 раза; в группе 2а-ЭБК в 1,3 и 1,4 раза соответственно по сравнению с начальной точкой.

Исходя из выше перечисленного, можно сделать вывод, что лидирующее место по выраженности антиоксидантного эффекта и его удержанию отмечаются в группе БК на 7-е сутки и на 14-е сутки у 2а-ЭБК (табл. 13).

Таким образом, исходя из экспериментальных данных, можно предположить, что механизм повреждения гепатоцитов на фоне однократного введения цитостатиков связан с лабилизацией мембран, что проявляется активацией перекисного окисления липидов, снижением активности микросомальных ферментов и лабилизацией лизосомальных мембран. В дальнейшем функциональное состояние печени усугубляется нарастающей гипоксией в процессе ишемического повреждения. В условиях ишемического воздействия, при котором наблюдается кислородная и субстратная. недостаточность и идет накопление продуктов тканевого метаболизма, возрастает активность ПОЛ, угнетается работа микросомапьной монооксигеназной системы, нарушается проницаемость мембран клеток. Это приводит к более выраженным нарушениям по сравнению с раздельным повреждающим воздействием. На представленной схеме обозначены вероятные механизмы реализации эффектов БК-соединений через основные звенья сочетанного повреждения: предупреждение выхода в плазму крови цитозольных ферментов и инактивации микросомальных монооксигеназных ферментов, торможение выхода в цитоплазму лизосомальных ферментов, что является, следствием стабилизации мембран (плазматических, микросомальных, лизосомальных) за счет, по-видимому, изменения реологических свойств мембран в результате ингибирования процессов перекисного окисления мембранных липидов (схема).

Схема сочетанного механизма повреждения гепатоцитов и точки приложения БК-соединений

Совокупность полученных результатов свидетельствует о том, что БК-соединения имеют выраженный защитный эффект в отношении клеточных и субклеточных мембранных структур гепатоцитов благодаря их выраженному антиоксидантному эффекту, а наличие у данных соединений противоопухолевых свойств (Цымбал И.Н., Сторожок Н.М., 2002; Сорокина И.В., Толстикова Т.Г., Бубнова Е.Б. и др., 2003, 2004), позволяет заключить, о возможности клинического использования изученных производных бетулина в фармакопрофилактике последствий токсического, ишемического и сочетанного повреждений печени при проведении цитостатической терапии.

ВЫВОДЫ:

1. При токсическом, ишемическом и сочетанном повреждении печени отмечается дестабилизация плазматических, лизосомальных и микросомальных мембран гепатоцитов, что проявляется выходом в кровоток цитозольных ферментов (трансаминаз, глутамилтрансферазы, щелочной фосфатазы), повышением свободной активности лизосомальных гидролаз, ингибированием скорости метаболизма амидопирина, анилина, эритромицина в ткани печени.

2. Различные виды повреждения печени сопровождаются активацией процессов перекисного окисления липидов, снижением антиокислительной активности в плазме и ткани печени, что свидетельствует об общем механизме деструкции клеточных и субклеточных мембран гепатоцитов, наиболее выраженной при сочетанном повреждении.

3. Профилактическое однократное введение бетулоновой кислоты, 2а-аланин-бетулоновой кислоты, метилового эфира 2а-аланин-бетулоновой кислоты при токсическом, ишемическом и сочетанном повреждении ингибирует процессы перекисного окисления липидов и повышает антиокислительную активность ткани печени и плазмы крови. Наиболее выраженный эффект отмечался у метилового эфира 2а-аланин-бетулоновой кислоты.

4. При профилактическом однократном введении бетулоновая кислота и ее альфа-аланинамидные производные, воздействуя на общее звено патогенеза токсического, ишемического и сочетанного повреждений, оказывает мембранопротективный эффект в отношении плазматических, лизосомальных и микросомальных мембран гепатоцитов, что проявлялось снижением свободной активности лизосомальных ферментов и сохранением активности микросомального метаболизма ксенобиотиков в гомогенате печени, уменьшением активности цитозольных ферментов в плазме крови.

5. При токсическом и ишемическом повреждении печени мембранопротективное действие наиболее выражено у соединений 2а-аланин-бетулоновой кислоты и метилового эфира 2а-аланин-бетулоновой кислоты, при сочетанном повреждении наиболее выраженное мембранопротективное действие оказывали бетулоновая кислота и метиловый эфир 2а-аланин-бетулоновой кислоты при их однократном профилактическом введении.

СПИСОК

работ, опубликованных по теме диссертации 1. Шнипов М.М., Позднякова C.B., Жоголь P.A., Шинкарёва Н.В. Влияние пикнолара на перекисное окисление липидов при тепловой ишемии ткани печени// Психофармакология и биологическая наркология: Мат. III-съезда фармакологов России, 23-27 сентября 2007.-Санкт-Петербург Том 7, часть 2,- С. 2-2018 - 2-2019.

2. Шарапов И.В., Шинкарёва Н.В., Ким Т.В. Антиоксидантный потенциал плазмы крови при экспериментальной полихимиотерапии на фоне профилактического введения производных бетулина// АВИЦЕНА-2007. Мат. ежегод. конкурс-конф. студ. и молодых ученых: Тез. докл.- Новосибирск,

2007,- С. 466-467.

3. Шинкарёва Н.В., Ким Т.В., Шарапов И.В. Сравнительная противоишемическая активность аланинамидных производных бетулоновой кислоты // АВИЦЕНА-2007. Мат ежегод. конкурс-конф. студ. и молодых ученых: Тез. докл.- Новосибирск, 2007,- С. 470-471.

4. Грек O.P., Шарапов В.И., Толстикова Т.Г., Сорокина И.В., Жоголь P.A., Шарапов И.В., Ким Т.В., Шинкарёва Н.В. Гепатопротекторные свойства производных бетулина // Создание новых лекарственных препаратов: Мат. С 43 конф. / Под ред. Е.Д. Гольдберга. -Томск: Изд-во Томск. Ун-та,2007.- С. 84-86.

5. Шинкарёва Н.В., Ким Т.В., Шарапов И.В. Влияние бетулоновой кислоты и ее производных на активность процессов перекисного окисления липидов в печени при экспериментальной полихимиотерапии // АВИЦЕНА-

2008. Мат. ежегод. конкурс-конф. студ. и молодых ученых: Тез. докл.-Новосибирск, 2008.- С. 411-412.

6. Ким Т.В., Грек O.P., Начаров Ю.В.,Толстикова Т.Г.,Шарапов И.В., Шарапов В.И., Шинкарёва Н.В. Влияние профилактического введения производных бетулоновой кислоты на активность процессов липопероксидации гомогената печени при экспериментальной полихимиотерапии // Вестник новых медицинских технологий,- 2008.-T.XV,№3.- С.13-14.

7. Ким Т.В., Шинкарёва Н.В., Шарапов И.В., Грек O.P., Шарапов В.И., Сорокина И.В., Толстикова Т.Г. Влияние бетулоновой кислоты и ее производных на функциональное состояние печени при экспериментальной полихимиотерапии // Вопросы патогенеза типовых патологических процессов: Труды Всероссийской научно-практической конференции с международным участием - Новосибирск, 2009.- С.192-195.

8. Ким Т.В., Шинкарёва Н.В., Шарапов КВ., Грек O.P., Шарапов В.И., Сорокина И.В., Толстикова Т.Г. Оценка антиоксидантной эффективности бетулоновой кислоты и ее производных на фоне применения цитостатических средств // Вопросы патогенеза типовых патологических процессов: Труды Всероссийской научно-практической конференции с международным участием - Новосибирск, 2009.- С.188-191.

9. Шинкарёва Н.В., Ким Т.В., Шарапов И.В., Грек O.P., Шарапов В.И., Сорокина И.В., Толстикова Т.Г. Изучение сравнительной антиоксидантной активности производных бетулина на модели спонтанной индукции перекисного окисления липидов ткани печени // Вопросы патогенеза типовых патологических процессов: Труды Всероссийской научно-практической конференции с международным участием -Новосибирск, 2009,- С.396-398.

10. Ким Т.В., Шинкарёва Н.В., Шарапов И.В. Влияние бетулоновой кислоты и ее производных на перекисное окисление липидов при тепловой ишемии ткани печени на фоне экспериментальной полихимиотерапии // Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Молодые ученые» 29-30 апреля 2009 г.- Казань, 2009.- С.136-137.

11. Шинкарёва Н.В., Ким Т.В., Шарапов И.В. Изучение антиокислительной активности бетулоновой кислоты и ее производных при тепловой ишемии ткани печени в условиях экспериментальной полихимиотерапии // Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Молодые ученые» 29-30 апреля 2009 г.- Казань, 2009.- С.141-142.

12. Ким Т.В., Грек О.Р., Толстикова Т.Г., Шарапов В.И., Шинкарёва Н.В. Гепатопротекторная активность бетулоновой кислоты и ее производных при экспериментальной полихимиотерапии // Вестник новых медицинских технологий,- 2010.-Т.ХУП, №1.- С.174-175.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АЗПОЛ - аскорбат-зависимое перекисное окисление липидов

АлАТ - аланинаминотрансфераза

АОА - антиоксидантная активность

АсАТ - аспартатаминотрансфераза

БК - бетулоновая кислота

2а-БК- 2а-аланин бетулоновая кислота

2а-ЭБК - 2а-аланин-метиловый эфир бетулоновой кислоты

БК- соединения (БК, БК-2а, ЭБК-2а)

у-ГГТ - гамма-глютамилтрансфераза

ДКВ- дигидрокверцетин

ЛД50 - полулетальная доза

МДА - малоновый диальдегид

МОС - монооксигеназная система

НАДФН - никотинамидадениннуклеотидфосфат восстановленный

НАДФНЗПОЛ - НАДФН -зависимое перекисное окисление

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ПХК - полихимиотерапевтический комплекс

СПОЛ - спонтанное перекисное окисление липидов

ЩФ - щелочная фосфатаза

Актуальность темы: В настоящее время цитостатическая терапия^ широко применяется^ для«, лечения злокачественных новообразований; аутоиммунных заболеваний и в трансплантологии (Dreher M.R., Raucher Di, Balu N. et ah, 2003), однако- она сопряжена с развитием осложнений; связанных с повреждающим действием цитостатиков на,различные ткани и органы, в частности, на печень (Jaeschke Н., 2003).

Развивающаяся при применении цитостатиков токсичность является фактически продолжением их терапевтической активности. В этойг связи, побочное действие цитостатиков, подобно токсическому поражению, реализуется через различные механизмы повреждения клетки: повреждение генетического аппарата клетки, активацию процессов» свободнорадикального окисления, повреждение клеточных мембран, нарушение процессов»синтеза белка и клеточного деления, повреждающее действие избытка ионов Са+2 в I клетке, нарушение энергетического обмена (Барабой В.А., Сутковой Д.А., 1997; Глушков С.И., 2006; Меныцикова Е.Б., Ланкин В.З., Зенков Н.К. и др., 2006).

Известно, что в основе осложнений цитостатической терапии- лежит мембранотоксическое действие противоопухолевых препаратов, вследствие большого сродства к липидам, в частности, к кардиолипину, входящему в состав внутренней мембраны митохондрий (Непомнящих Л.М., Лушникова Е.Л., Семенов Д.Е., 2000).

Нарушение обмена кислорода в разных органах и тканях организма опухоленосителя проявляется в ослаблении дыхания и усилении гликолиза, снижении процессов энергетического обмена, нарушении доставки кислорода и структурно-функциональными изменениями гемоглобина, уменьшением артеривенозной разницы по кислороду и коэффициента использования кислорода тканями (Горчакова H.A., 1990; Колчинская А.З., Цыганова Т.Н., Остапенко Л.А., 2003; Коршунов Д.А., 2010).

Вовлечение мембран эндоплазматического ретикулума в патологический процесс при гипоксии, ишемии проявляется нарушением функции мембраносвязанных монооксигеназных комплексов (Воронов Г.Г., Лукиенко П.И., Бушма М.И., 1982; Грек O.P., Шарапов В.И., ЛитвиновВ.С., Долгов A.B., 1984; Ferrero М.Е., Orsi R., Berneiii - Zazzera A., 1978), которым отводится ведущая роль в биотрансформации лекарственных веществ (Лакин K.M., Крылов Ю.Ф., 1981).

В связи с этим остается актуальной проблема разработки новых лекарственных средств-корректоров побочных эффектов цитостатиков, не снижающих их терапевтической активности, а также нарушений, вызванных ишемическим повреждением. Препараты растительного происхождения фенольной природы в качестве гепатопротекторов оказываются недостаточно эффективными при цитостатической терапии (Гольдберг Е.Д., Зуева Е.П., 2000). Поэтому особый интерес представляет класс тритерпеноидов лупанового ряда, сочетающий высокую- биологическую активность и доступность (Карачурина Л.Т., Сапожников Т. А., Зарудий ф. С. и др., 2003). В Новосибирском институте-органической химии им. H.H. Ворожцова GO РАН синтезированы новые производные бетулоновой кислоты, содержащие у С-28 различные фрагменты аминокислот или их метиловых эфиров (Петренко Н.И. и др., 2002; Толстиков Г.А., Флехтер О.Б., Шульц Э.Э. и др., 2005; Кузнецова С.А., Васильева Н.Ю., Калачева Г.С. и др., 2008). Они обладают рядом свойств: антиоксидантными, противовоспалительным, иммуномодулирующим, гепатопротекторным и обладают цитостатическим действием в отношении ряда опухолей нейроэктодермального происхождения (Е. Pisha, H.Chai, I.-S. Lee et al., 1995; К. Hata, К. Hori, S. Takahashi, 2002; Позднякова C.B., 2007; Шарапов И.В., 2009; Пономарева И.А., 2009; Агаева Т.Х., 2010).

Поэтому актуальной задачей фармакологии является изучение гепатопротективных свойств данного класса соединений, влияющих на общие звенья патогенеза токсического и ишемического повреждений.

Научная работа проводилась по плану НИР НГМУ: «Системные механизмы действия ксенобиотиков на организм и разработка новых фармакологических препаратов» № гос.регистрации 01.2.007 09495 код ВНТИЦ' 0203042450323.

Цель исследования - Изучить влияние профилактического введения бетулоновой кислоты и ее альфа-аланинамидных производных на активность пероксидативных процессов и состояние плазматических, лизосомальных и микросомальных мембран гепатоцитов при токсическом, ишемическом и сочетанном повреждениях печени.

Задачи исследования:

1. Изучить антиокислительную активность, интенсивность процессов перекисного окисления липидов- в ткани печени* № сыворотке крови- при различных видах повреждения, печени5 (при ишемическом, токсическом^ и сочетанном воздействиях).

2. Изучить активность цитозольных ферментов- (трансаминаз, глутамилтрансферазы, щелочной фосфатазы) в сыворотке крови, свободную активность лизосомальных гидролаз и-скорость метаболизма амидопирина, эритромицина, анилина в ткани печени и оценить состояние плазматических, лизосомальных и микросомальных мембран при различных видах повреждения печени* (токсическом, ишемическом, сочетанном).

3. Изучить, влияние профилактического введения» бетулоновой кислоты и ее альфа-аланинамидных производных на активность процессов перекисного окисления липидов и антиокислительную активность в сыворотке крови и ткани печени при различных видах повреждения.

4. Изучить протективный эффект бетулоновой кислоты и ее альфа-аланинамидных производных при профилактическом введении на плазматические, лизосомальные, микросомальные мембраны гепатоцитов при токсическом, ишемическом и сочетанном повреждении.

5. Сравнить мембранопротективный эффект бетулоновой кислоты, и ее альфа-аланинамидных производных при токсическом, ишемическом и сочетанном повреждениях печени.

Научная- новизна: Впервые* показано,- что при- токсическом; ишемическом. и сочетанном воздействии общим звеном повреждения печени является дестабилизация плазматических, лизосомальных и микросомальных мембран гепатоцитов в результате снижения антиокислительной активности ткани и активации процессов перекисного окисления липидов.

Впервые установлено, что однократное профилактическое введение бетулоновой кислоты и ее альфа-аланинамидных производных при* различных видах повреждения гепатоцитов оказывает выраженное мембранопротективное действие в отношении плазматических, лизосомальных и микросомальных мембран гепатоцитов.

Впервые показано, что мембранопротективный эффект бетулоновой кислоты и ее альфа-аланинамидных производных при токсическом; ишемическом и сочетанном повреждениях обусловлен их способностью ингибировать процессы перекисного окисления липидов и повышать антиоксидантный потенциал ткани печени.

Впервые дана сравнительная оценка мембранопротективного эффекта производных бетулина и выявлен более выраженный эффект у метилового эфира» 2а-аланин-бетулоновой кислоты при различных видах повреждения печени.

Практическая значимость: Полученные данные расширяют представление об общих механизмах повреждения мембран клеток печени при различных видах повреждения (токсическом, ишемическом и сочетанном воздействиях).

Дано обоснование целесообразности дальнейшего изучения бетулоновой кислоты, 2а-аланин-бетулоновой кислоты, метилового эфира 2а-аланин-бетулоновой кислоты в качестве мембраностабилизирующих средств, уменьшающих последствия цитостатической терапии и ишемического повреждения.

Наиболее выраженный мембранопротективный эффект метилового эфира' 2а-аланин-бетулоновой кислоты- позволяет рекомендовать^ данное соединение для.углубленногодоклиническош-изучения.

Положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Общим звеном; в патогенезе токсического, ишемического и сочетанного воздействий на печень является дестабилизация плазматических, лизосомальных и эндоплазматических мембран клеток печени в результате активации пероксидативных процессов.

2. Профилактическое введение бетулоновой кислоты, и ее альфа-аланинамидных производных . оказывает мембранопротективное; действие при- моделировании различных видов повреждения гепатоцитов (при токсическом, ишемическом и сочетанном воздействии).

3; Протективный эффект бетулоновой кислоты и ее альфа-аланинамидных. производных при токсическом, ишемическом и сочетанном; повреждении связан? с предупреждением деструкции клеточных и субклеточных мембран гепатоцитов в;; результате ингибирования процессов: перекисного окисления липидов и повышения антиоксидантного потенциала ткани печени;

Апробация работы:- Материалы; диссертации были представлены на ежегодных конкурс-конференциях студентов и молодых ученых НРМУ «АВИЦЕННА» (Новосибирск 2007-2009), на Ш-съезде фармакологов России «Фармакология - практическому здравоохранению» (Санкт-Петербург,. 2007),, на региональной конференции «Создание новых лекарственных препаратов» (Томску 2007), на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза; типовых патологических процессов» (Новосибирск, 2009), на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молодые ученые» (Казань, 2009).

ВЫВОДЫ:

1. При токсическом, ишемическом и сочетанном повреждении печени отмечается- дестабилизация плазматических, лизосомальных и микросомальных мембран-гепатоцитов; что проявляется выходом в,кровоток цитозольных ферментов, (трансаминаз, глутамилтрансферазы, щелочной фосфатазы), повышением свободной активности лизосомальных гидролаз, ингибированием скорости метаболизма амидопирина, анилина, эритромицина в ткани печени.

2. Различные виды повреждения печени сопровождаются активацией процессов перекисного окисления липидов, снижением антиокислительной активности в сыворотке крови и ткани печени, что свидетельствует об общем механизме деструкции клеточных- и субклеточных мембран гепатоцитов, наиболее выраженной при сочетанном повреждении.

3. Профилактическое однократное введение бетулоновой кислоты, 2а-аланин-бетулоновой кислоты, метилового эфира 2а-аланин-бетулоновой кислоты, при токсическом, ишемическом и сочетанном повреждении ингибирует процессы перекисного окисления липидов и повышает активность ткани печени и сыворотки крови. Наиболее выражен эффект отмечался у метилового эфира 2а-аланин-бетулоновой кислоты.

4. При профилактическом однократном введении бетулоновая. кислота и ее альфа-аланинамидные производные, воздействуя на общее звено-патогенеза токсического, ишемического и сочетанного повреждений; оказывают мембранопротективный эффект в отношении плазматических, лизосомальных и микросомальных мембран гепатоцитов, что проявлялось снижением свободной активности лизосомальных ферментов и сохранением активности микросомального метаболизма ксенобиотиков в гомогенате печени, уменьшением активности цитозольных ферментов в сыворотке крови.

5. При токсическом4 и ишемическом повреждении печени мембранопротективное действие наиболее выражено у соединений 2а-аланин-бетулоновой кислоты и метилового эфира 2а-аланин-бетулоновой кислоты, при сочетанном повреждении наиболее выраженное мембранопротективное действие оказывали бетулоновая кислота и метиловый эфир 2а-аланин-бетулоновой кислоты при их однократном профилактическом введении.