Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Фармакологические свойства извлечений из болиголова пятнистого (экспериментальное исследование)

На правах рукописи

ПОПОВА Елена Владиславовна

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ИЗВЛЕЧЕНИЙ ИЗ БОЛИГОЛОВА ПЯТНИСТОГО (экспериментальное исследование)

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

□0345Э307

Томск - 2008

003459307

Работа выполнена в ГУ НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

Поветьева Татьяна Николаевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Зуева Елена Петровна

доктор биологических наук

Новожеева Татьяна Петровна

Ведущая организация:

ГОУ ВПО «Кемеровская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

диссертационного совета Д 001. 031. 01 при ГУ НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН (634028, г. Томск, пр. Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН

Автореферат разослан «хг» 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

Защита состоится «_»

2009 года в_часов на заседании

доктор биологических наук

Амосова Е. Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Воспаление как патологический процесс, лежащий в основе большинства заболеваний человека, является центральной проблемой медицины [Чернух А.М., 1979; Каратеев А.Е., 2007]. Рост ревматических заболеваний и других болезней, протекающих с выраженной воспалительной реакцией и болевым синдромом, хроническое их течение, частое развитие осложнений, длительная потеря трудоспособности определяют социально-медицинское значение и актуальность поиска средств лекарственной регуляции этого процесса [Сиги-динЯ.А., 1990]. С целью коррекции воспаления в настоящее время широко применяются нестероидные противовоспалительные средства (НПВП). По данным ВОЗ, препараты этой группы занимают второе место после антибиотиков по массовости их применения. Ежедневно в мире НПВП используют около 30 миллионов пациентов и эта цифра постоянно возрастает. Специфическая способность этих препаратов влиять на важнейшие патологические процессы (возникновение и проведение болевого импульса, воспаление, агрегацию тромбоцитов, неоангиогенез, апоптоз и др.) определила широкий круг заболеваний и патологических состояний, при которых они с успехом используются. К сожалению, приём НПВП приводит к серьёзным осложнениям, прежде всего связанным с развитием патологии желудочно-кишечного тракта [Каратеев А.Е., Насонов Е.Л., 2006]. Это обосновывает актуальность поиска новых эффективных нетоксичных антифлогистиков, способных корректировать воспалительный процесс с выраженным терапевтическим эффектом без нежелательных побочных явлений и осложнений.

В настоящее время лекарственные растения продолжают оставаться одними из перспективных источников получения новых препаратов. Преимущества применения фитопрепаратов перед синтетическими лекарственными средствами очевидны и состоят в том, что они обладают широким диапазоном терапевтических доз, многими фармакотерапевтическими эффектами, обусловленными наличием в растениях комплекса биологически активных веществ, мягкостью действия, возможностью длительного их использования без опасности возникновения побочных эффектов [Ловкова М.Я. и др., 1989; Пашинский В.Г., 2007].

В связи с этим наше внимание привлекло достаточно часто применяемое в народной медицине, но до настоящего времени малоизученное растение из семейства зонтичных - болиголов пятнистый (Conium maculatum L.). Проведённый анализ литературных данных о применении болиголова в народной медицине позволил выявить основной спектр фармакотерапевтического действия этого растения: противовоспалительное, болеутоляющее, седативное, противо-астматическое, противосудорожное, противораковое и другие [Дадобаева О.,

1972; Завражнов В.И. и др., 1977; Еремина Н.К., 1983; Путырский И., Прохоров В., 2005; French D.H., 1971].

Содержание в болиголове пятнистом комплекса биологически активных веществ с различной химической структурой (алкалоиды, фенольные соединения и др.), предполагает широту фармакотерапевтических эффектов. Известно, что соединения фенолъной группы обладают противовоспалительным, антиок-сидантным, спазмолитическим, адаптогенным, седативным, кровоостанавливающим, антимикробным и другими действиями [Барабой В.А., 1984; Турищев С.Н., 1999; Путырский И., Прохоров В., 2005]. Флавоноиды ингибируют перекисное окисление липидов [Лукьянчук В.Д., Савченкова JI.B., 1998; Torel J. et al., 1986], уменьшают проницаемость капилляров, что приводит к торможению экссудативной фазы воспаления, угнетают активность НАДФ-оксидазы и изменяют секрецию лизосомальных ферментов [СарафА.С., Оганесян Э.Т., 1991; Окуневич Н.В. и др., 1992]. Под их воздействием предотвращается патологически повышенный синтез свободных радикалов, цитотоксических окислительных агентов, медиаторов воспаления. Одним из важных механизмов противовоспалительного действия флавоноидов является их способность к ингибиро-ванию каскада метаболизма арахидоновой кислоты, из которой образуются медиаторы воспаления [Чернов Ю.Н. и др., 2004]. Другими биологически активными веществами болиголова пятнистого являются алкалоиды пиперидинового ряда - кониин и его производные [Зориков П.С., 2005]. Известно, что кониин обладает никотиноподобным действием [Орлов Б.Н. и др., 1990], блокирует де-прессорную реакцию при раздражении блуждающего нерва; вызывает сокращение изолированного отрезка кишечника и матки морской свинки [Bowman W.C., Sanghvi I.S., 1963], уменьшает чувствительность мышц к ацетилхолину [Налегатская А.В., 1953].

Учитывая содержание высокоактивных веществ, сведения народной медицины, немногочисленные экспериментальные данные, большую сырьевую базу, доступность сырья, широкую возможность культивирования, представлялось актуальным комплексное исследование, направленное на изучение противовоспалительных свойств извлечений из болиголова пятнистого.

Цель исследования

Целью настоящей работы явилась оценка противовоспалительной, аналь-гетической и жаропонижающей активности извлечений из болиголова пятнистого.

Задачи исследования:

1. Провести сравнительное изучение противовоспалительной активности извлечений из болиголова пятнистого и нестероидных противовоспалительных препаратов, определить их действие на показатели системы крови на моделях воспаления.

2. Исследовать анальгетическую активность извлечений из болиголова пятнистого.

3. Оценить жаропонижающее действие извлечений из болиголова пятнистого.

4. Изучить влияние извлечений из болиголова пятнистого на процесс ре-паративной регенерации.

5. Оценить антигипоксические свойства извлечений из болиголова пятнистого.

6. Исследовать стресспротективное действие извлечений из болиголова пятнистого при различных патологических состояниях.

Научная новизна

Впервые выполнено широкое сравнительное экспериментальное исследование фармакологических свойств 14 извлечений, полученных из надземной части болиголова пятнистого первого (трава) и второго (соцветия, плоды) года вегетации. Выявлена способность настоек из травы, соцветий, плодов из сухого и свсжесобранного сырья, а также фракций фенольных соединений оказывать выраженное антиэкссудативное и обезболивающее действие, сопоставимое с эффектами синтетических препаратов (метамизол натрия, диклофенак натрия, нимесулид). Показано, что настойки из травы, соцветий и плодов болиголова пятнистого из сухого и свежесобранного сырья проявляют антипролифератив-нуга и жаропонижающую активность, сдерживают развитие иммунного воспаления, нормализуют гематологические и биохимические показатели крови. Установлено, что настойка из сухих соцветий болиголова пятнистого ускоряет заживление кожной лоскутной раны. Впервые обнаружено, что настойки из травы, соцветий сухого и свежесобранного сырья, этилацетатные фракции из болиголова пятнистого обладают антигипоксическим действием. Все исследуемые извлечения проявляют антистрессорные свойства на фоне воспаления, тканевой гипоксии.

Практическая значимость работы

Результаты экспериментальных исследований могут служить основой для создания новых лекарственных препаратов из болиголова пятнистого для лечения воспалительных заболеваний, сопровождающихся болевым синдромом. Наиболее перспективной является настойка соцветий, полученная из сухого сырья.

Апробация работы

Основные положения и результаты работы представлены на: научно-практической конференции «Достижения современной гастроэнтерологии» (Томск, 2005), 7-м конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2006), Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора Л.Н. Березнеговской (Томск, 2006), научно-практической конференции «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2005, 2007), 1-м международном съезде фитотерапевтов (Москва, 2006), 2-й международной (XI Всероссий-

ской) Пироговской студенческой научной медицинской конференции (Москва, 2007), 3-й интернациональной научной конференции «Традиции медицины: текущая ситуация и перспективы развития» (Улан-Уде, 2008).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе 1 - в центральном журнале, рекомендованном перечнем ВАК.

Объём и структура диссертации

Работа изложена на 150 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 291 источник, из них 222 - на русском, 69 -на иностранном языках. Диссертация иллюстрирована 40 таблицами и 5 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проведены на 518 беспородных мышах, 99 мышах линии СВА обоего пола с исходной массой 18-25 граммов, 275 беспородных крысах обоего пола с исходной массой 180-250 граммов. Животные первой категории, полученные из коллекционного фонда НИЛ экспериментального биомоделирования ГУ НИИФ ТНЦ СО РАМН (сертификат имеется). Содержание животных осуществлялось в соответствии с правилами, принятыми Европейской Конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (г. Страсбург, 1986). Эвтаназию проводили, соблюдая «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных», утверждённых Министерством здравоохранения Российской Федерации, путём дислокации шейного позвонка.

Объектами исследования являлись настойки болиголова пятнистого (первого года вегетации - травы; второго года - соцветий, плодов), а также фракции фенольных соединений. Настойки из сухого сырья готовили в соотношении 1:10, из свежего - 1:50, методом мацерации (настаивания), используя в качестве экстрагента 40 %-ный этанол (ГОСТ 5962-67). Сырьё было собрано в окрестностях г. Томска вдали от автомобильных, железнодорожных магистралей и промышленных предприятий: трава - в конце августа 2004 г., соцветия - в середине июня 2005 г., плоды - в начале сентября 2005 г. Собранное сырьё подвергали сушке в хорошо проветриваемом помещении, влажность высушенного сырья определяли по методике, описанной в Государственной фармакопее XI гадания (1989).

Сухой остаток составил в настойке из сухой травы - 3,4 %, свежей травы - 0,3 %, сухих соцветий - 3,7 %, свежих соцветий - 0,5 %, сухих плодов - 3,6 %, свежих плодов - 0,7 %. Общепринятыми химическими методами исследован качественный состав надземной части болиголова пятнистого, установлено на-

личие алкалоидов (кониин и его производные), кумаринов, флавоноидоа, фе-нолкарбоновых кислот, дубильных веществ, полисахаридов.

На кафедре органической химии Томского государственного университета под руководством к.х.н. С.С. Кравцовой в надземной части болиголова пятнистого установлено содержание флавонолов (в пересчете на кверцетин), которое составило 2,36 %.

Для сравнительной оценки фармакологической активности были выделены фракции фенольных соединений болиголова пятнистого по следующей методике: 30,0 г высушенного сырья (трава, соцветия) пятикратно экстрагировали 70 % этанолом при нагревании на водяной бане при температуре 40°С в течение 30 минут. Этанольные экстракты объединяли и растворитель удаляли под вакуумом на роторном испарителе. Полученные сухие экстракты представляли собой маслянистую массу тёмно-зеленого цвета - из травы; светло-коричневого - из соцветий. Далее экстракты были разделены на ряд фракций путём последовательной экстракции хлороформом, водой, этилацетатом, бутанолом, выход которых составлял соответственно 28; 33,4; 32 и 5,6 % - из соцветий; 21,3; 43,8; 27,7 и 7,7 % — из травы. Для химической идентификации этилацетатных фракций использовали современные методы хроматографического анализа на тонком слое адсорбента. Хроматографированне проводили на пластинках «Silu-fol-UV 250» в разных системах органических растворителей: ацетон - этанол; бутанол - этанол - вода; хлороформ — этанол, с целью поиска оптимальной системы, позволяющей наиболее эффективно разделить и идентифицировать действующие вещества, содержащиеся во фракциях. Оптимальной оказалась система растворителей - хлороформ : этанол в соотношении 95 : 5. По величине пробега пятен (Rf=0,58 и 0,63) было определено, что это флавоноиды: гликозид рутин с двумя сахарными остатками и агликон кверцетин.

Получение фракций фенольных соединений болиголова пятнистого и проведение фотохимического анализа осуществляли совместно с доцентом кафедры фармации ГОУ ВПО «Томского военно-медицинского института Росзд-рава», к.ф.н. Т.И. Андреевой.

Извлечения из болиголова пятнистого вводили внутрижелудочно через зонд профилактическим и/или лечебным курсом. Контрольные группы животных получали эквивалентный объём растворителя в аналогичном режиме.

При изучении фармакологической активности извлечений из болиголова пятнистого использовали препараты сравнения: анальгин (метамизол натрия) (Analginum) (фирма изготовитель ОАО «ICN»), вводили внутрижелудочно в дозе 250 мг/кг; ацетилсалициловую кислоту (Acidum acetylsalicylicum) (фирма изготовитель ОАО «ICN»), вводили внутрижелудочно через зонд крысам в дозе 125 мг/кг; диклонат П (диклофенак натрия) (Diclofenac sodium) (фирма изготовитель АО «Плива»), вводили внутрижелудочно через зонд мышам в дозе 17 мг/кг, крысам - 6 мг/кг; индометацин (Indomcthacin pharmachim) (фирма изготовитель ХФК ОАО «Акрихин»), вводили внутрижелудочно через зонд мы-

шам в дозе 10мг/кг, крысам - 6 мг/кг; найз (нимесулид) (Nimesulide) (фирма изготовитель «Dr. Reddy's Laboratories Ltd»), вводили внутрижелудочно через зонд мышам в дозе 20 мг/кг, крысам - 10 мг/кг; сок алоэ (Succus aloes) (фирма изготовитель «Вифитекс»), вводили внутрижелудочно в дозе 10 мл/кг; а-токоферола ацетат (a-Tocopheroli acetas) (фирма изготовитель ЗАО «Фарма-ген»), вводили внутрижелудочно в дозе 100 мг/кг.

Противовоспалительные свойства извлечений из болиголова пятнистого исследовали согласно «Руководству по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2005). Острую воспалительную реакцию у животных вызывали субплантарным введением в заднюю левую лапу мышей 1 %-ного раствора каррагенина - 0,05 мл/кг, 0,01 %-ного раствора серотонина, 0,1 %-ного раствора гистамина, острую экссудативную реакцию (перитонит) вызывали внутрибрюшинным введением 1 %-ного раствора уксусной кислоты (0,1 мл на 10 г массы животного). Иммунное воспаление вызывали полным адъювантом Фрейнда (фирма изготовитель ОАО «ICN»). Флогоген вводили крысам под плантарный апоневроз задней левой лапы однократно в дозе 0,1 мл/кг. Влияние растительных средств из болиголова пятнистого на пролиферативную фазу воспаления изучали на модели «ватной гранулёмы» и «фетровой гранулёмы».

Ранозаживляющую активность фитопрепаратов оценивали на модели «кожного лоскута». На депилированном участке спины у мышей под лёгким эфирным наркозом вырезали лоскут кожи размером 10x10 мм. Для моделирования более длительного заживления струп с экспериментальной раны регулярно (через сутки) снимали [Горбачева А.В. и др., 2003].

Жаропонижающие свойства извлечений из болиголова пятнистого оценивали по их способности оказывать гипотермический эффект у крыс на фоне лихорадки, вызванной подкожным введением суспензии пекарских дрожжей. Изучаемые препараты применяли внутрижелудочно, однократно через 17 часов после инъекции пирогена. Жаропонижающий эффект оценивали по уменьшению гипертермии в течение 6 часов каждый час после введения препаратов по сравнению с контрольными животными, которые получали растворитель.

Для изучения обезболивающего действия индуцировали специфическую болевую реакцию - «корчи» путём внутрибрюшинного введения мышам 1 %-ного раствора уксусной кислоты (ГОСТ 61-75). Анальгетический эффект оценивали по уменьшению количества «корчей». Термическое болевое раздражение [Машковский М.Д., 1990] вызывали, помещая мышей на горячую (64°С) пластину, анальгетическое действие оценивали по длительности спокойного пребывания на ней животных (до начала облизывания лап). О выраженности болевой реакции при механическом болевом раздражении на модели иммунного воспаления судили по числу вокализаций при пассивном пятикратном сгибании пораженного артритом голеностопного сустава крыс и индексу вокализации [Давыдов Т.В. и др., 1997].

Острую тканевую гипоксию у мышей моделировали путём внутрибрю-шинного введения нитропруссида натрия в дозе 25 мг/кг [Караев АЛ. и др.,

1991]. Исследуемые препараты применяли внутрижелудочно через зонд в течение 5 дней, последний раз - за 1 час до инъекции гипоксанта. Фиксировали продолжительность жизни животных, показатели массы селезёнки, тимуса и надпочечников, количество геморрагий на слизистой оболочке желудка.

Антистрессорные свойства фитопрепаратов болиголова пятнистого исследовали на различных моделях воспаления, тканевой гипоксии. Выраженность стресса рассчитывали в баллах по методу Ю.И. Добрякова (1978).

Изучение показателей периферической крови осуществляли стандартными гематологическими методами [Меньшикова В.В., 1987; Гольдберг Е.Д. и др.,

1992].

В сыворотке крови определяли содержание общего белка - биуретовым, серомукоидов - турбидиметрическим методами, активность аланин-аминотрансферазы (АлАТ) по методу Райтмана-Френкеля [Колб В.Г., Камышников В.С., 1976]. Данное исследование осуществляли совместно со старшим научным сотрудником лаборатории токсикологии ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН, к.б.н. Т.В. Ветошкиной.

Морфологические исследования проводили стандартными гистологическими методами [Саркисов Д.С., 1996] совместно с врачом-цитологом ГОУ ВПО Томского военно-медицинского института, к.м.н. Е.П. Росляковой.

Статистическую обработку полученных результатов проводили путём расчёта средней (X) и средней квадратичной ошибки (т). О достоверности различий судили, используя параметрический (критерий Стьюдента) и непараметрический (критерий Вилкоксона-Манна-Уитни) методы. Для сравнения результатов экспериментов, где показатели выражались в долях, достоверность определяли с помощью метода углового преобразования Фишера. Значимость различий считали достоверной при Р^ Ри, Рср < 0,05 [Гублер Е.В., 1978].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение острой токсичности настоек болиголова пятнистого показало, что 1Л)5о для мышей составило: для настойки из сухой травы - 37,0 мл/кг, сухих соцветий - 22,5 мл/кг, свежих соцветий - 26,0 мл/кг, сухих плодов - 20,0 мл/кг, свежих плодов — 24,5 мл/кг, 40 %-ного этилового спирта - 24,5 мл/кг. Острую токсичность настойки из свежей травы определить не удалось, так как в максимально вводимом объёме (1 мл) она не вызывала гибели животных.

Для оценки антиэкссудативной активности фитопрепаратов была выбрана модель острого каррагенинового отёка, возникновение которого связано с индукцией биосинтеза просгагландкнов и последующей выработкой других медиаторов воспаленил. Растительные средства существенно ослабляли флого-генное действие каррагенина, снижая отёк конечности в 1,4-1,9 раза по сравне-

нию с группой контроля (табл. 1). Наибольшее угнетение экссудации (в 1,9 раза) наблюдалось у мышей, получавших настойку из соцветий свежего сырья в дозе 2 мл/кг и этилацетатную фракцию, выделенную из соцветий. Ме-тамизол натрия и индометацин угнетали отёк на пике воспаления в 1,5 и 1,8 раза соответственно.

Таблица 1

Влияние извлечений из болиголова пятнистого на развитие каррагенинового воспаления у беспородных мышей-самцов

Группа животных Доза, Число Средний прирост Угнетение отёка

мл/кг, живот- массы конечности на пике

мг/кт ных (Х+ш), % воспаления, %

Контроль — 10 36,4+4,3 —

Метамизол натрия 250 5 24,7+4,3* 32

Индометацин 12 5 20,7+4,3* 43

Настойка сухой травы 1 5 24,2+3,2* 34

Настойка свежей травы 2 5 25,2+1,2* 31

Контроль — 10 50,1+2,9 —

Настойка сухих 0,5 5 35,5+1,9* 30

соцветий 1 5 28,7+3,1* 43

Настойка свежих 1 5 32,0+3,7* 36

соцветий 2 5 27,0+1,1* 46

Настойка сухих плодов 1 5 36,1+5,1* 28

Настойка свежих 2 5 33,8+2,1* 33

плодов

ХФФС 25 5 27,5+2,2* 45

ХФФТ 25 5 29,0+2,4* 42

ВФС 25 5 30,8+1,6* 39

ВФТ 25 5 28,6+2,5* 43

ЭАФС 25 5 27,1+2,7* 46

ЭАФТ 25 5 28,3±2,3* 44

БФС 25 5 33,4+4,0* 33

БФТ 25 5 31,8+2,8* 37

Примечание. * - Различия достоверны в сравнении с контролем при Рг, Ри<0,05.

На моделях гистаминового и серотонинового воспалений выявлено, что назначение вытяжки из сухих соцветий (1 мл/кг) способствовало уменьшению отёка инъецированной конечности в 1,5 раза (табл. 2). При введении настойки из свежих соцветий (2 мл/кг) наблюдалась тенденция к снижению отёчности лапы. Применение диклофенак натрия снижало экссудацию, вызванную гиста-мином, в 1,9 раза.

Таблица 2

Влияние извлечений из болиголова пятнистого на развитие серотонинового и гистаминового воспалений у мышей-самцов линии СВА

Группа животных Доза, Число Средний прирост Угнетение отёка

мл/кг, животных массы конечности на пике

мг/кг (Х+т), % воспаления, %

Серотониновое воспаление

Контроль — 6 20,7+2,0 —

Настойка сухих соцветий 1 5 13,5+2,3* 35

Настойка свежих 2 5 15,5+3,4 25

соцветий

Гистаминовое воспаление

Контроль — 10 16,8+0,7 —

Диклофенак натрия 17 8 8,9+2,0* 47

Настойка сухих соцветий 1 5 11,2+1,3* 33

Настойка свежих соцветий 2 5 15,7+2,6 7

Примечание. * - Различия достоверны в сравнении с контролем при Pt, Pu<0,05.

Настойки из свежей травы (2 мл/кг) и сухих соцветий (0,5 мл/кг) болиголова пятнистого уменьшали накопление экссудата в условиях модели перитонита у мышей в 5,9 и 1,4 раза соответственно.

Механизм противовоспалительного действия извлечений из болиголова пятнистого является поливалентным и обусловлен наличием комплекса биологически активных веществ, в частности, фенольными соединениями (флаво-ноиды, кумарины, производные фенолкарбоновых кислот), алкалоидами, оказывающими действие на различные звенья патогенеза воспалительного процесса. Противоотёчное действие вытяжек, по-видимому, связано с их влиянием на процессы синтеза, депонирования, высвобождения и превращения медиаторов воспаления (гистамина, серотошша, кининов и т. д.), а также способностью флавоноидов оказывать капилляропротективное действие.

Наиболее адекватной для изучения противовоспалительных средств является модель «адъювантного артрита» [Саратиков A.C. и др., 1983]. Сравнительное изучение влияния извлечений из болиголова пятнистого на течение иммунного воспаления выявило их выраженный антиэкссудативный эффект (рис. 1). Изучаемые фитопрепараты в 1,5-13,2 раза угнетали прирост объёма воспалённой конечности у крыс, гиперемия была выражена слабее в сравнении с контролем во все сроки наблюдения. Максимальный противовоспалительный эффект на данной модели зафиксирован при назначении настойки из свежей травы (1 мл/кг). Использование диклофенак натрия приводило к угнетению отёка

а)

40 1

30

20 -I

Ю -!

- контроль

' диклофенак натрия (6 мг/кг)

- настойка сухой травы (1 мл/кг)

- настойка сухой травы (2 мл/кг)

- настойка свежей травы (2 мл/кг)

3 часа I 2 5 7 9 12 14

б)

50 -

40 н

зо -;

20 -I

10 -

— контроль

1 - нимесулид (10 мг/кг)

- настойка сухих соцветий (0,5 мл/кг)

- настойка свежих соцветий (1 мл/кг)

- настойка сухих плодов (0,5 мл/кг)

- настойка свежих плодов (1 мл/кг)

3 часа 12 3 6

10 13 15

Рис. 1. Влияние извлечений из болиголова пятнистого на динамику развития отёка

конечности у крыс после введения адъюванта Фрейнда.

По оси абсцисс - сроки наблюдения, сут. По оси ординат - прирост стека конечности, %; (а) - эксперимент 1; (б) - эксперимент 2.

Примечание. * — Различия достоверны в сравнении с контролем при Р1, Ри<0,05.

воспалённой конечности, начиная с 9-го дня, отсутствие гиперемии отмечалось на 14-е сутки эксперимента. Введение нимесулида способствовало снижению отёка на 1-3-е сутки. По-видимому, алкалоиды и флавоноиды, содержащиеся в болиголове пятнистом, угнетая синтез простагландинов, способны увеличивать клеточный иммунный ответ, активируя Т-супрессорные клетки, что ведёт к уменьшению образования ревматоидного фактора и, следовательно, к угнетению воспалительного процесса в суставах и внутренних органах больных крыс [Тринус Ф.П. и др., 1987; Клебанов Б.М., 1992].

Развитие адъювантной болезни приводило к формированию изменений в лейкоцитарной формуле периферической крови. На 14-е сутки после введения адъюванта Фрейнда у нелеченых крыс достоверно увеличивалось общее количество лейкоцитов в 1,3 раза по сравнению с фоном за счёт повышения содержания числа сегментоядерных форм лейкоцитов и моноцитов. Их снижение было зафиксировано у животных, получавших настойку из сухой (1; 2 мл/кг) и свежей (2 мл/кг) травы болиголова пятнистого, практически до фоновых показателей. При введении исследуемых растительных средств отмечалось уменьшение общего количества лейкоцитов. Использование диклофенак натрия не приводило к нормализации гематологических показателей.

Известно, что сопутствующим синдромом адъювантной болезни является паренхиматозный гепатит [Саратиков A.C., 1983]. Анализ результатов биохимических исследований показал, что в сыворотке крови контрольных животных происходило увеличение серомукоидов, повышалась активность АлАТ по сравнению с фоновыми показателями. Назначение фитопрепаратов препятствовало развитию у животных некоторых метаболических нарушений, возникающих при адъювантном синдроме: нормализовалась концентрация серомукоидов в крови крыс, активность аланин-аминотрансферазы снизилась до нормы.

Изучение антипролиферативного действия извлечений из болиголова пятнистого на модели «ватной гранулёмы» показало, что введение настоек из сухих соцветий (0,5 мл/кг), свежих соцветий (1 мл/кг), сухих плодов (0,5 мл/кг) и свежих плодов (1 мл/кг) способствовало снижению воспалительного разрастания гранулематозно-фиброзной ткани у животных в 1,5-1,8 раза по сравнению с крысами, получавшими только растворитель (табл. 3). Кроме того, вытяжки болиголова пятнистого снижали массу экссудата в очаге хронического воспаления в 1,5-2,1 раза. Введение нимесулида приводило к угнетению пролиферации и экссудации в 1,4 раза.

На фоне развития «ватной гранулёмы» в контрольной ipynne животных по сравнению с интактными наблюдалась инволюция тимуса, гипертрофия надпочечников, происходило появление геморрагических деструкций на слизистой желудка. При этом глубина стресса составила 7-8 баллов. Назначение фитопрепаратов нивелировало основные проявления, вызванные стрессом, в основном за счёт сохранения массы тимуса на уровне интактных показателей.

Введение нимесулида также оказывало антистрессорный эффект, сохраняя массу тимуса и надпочечников на уровне фоновых значений.

Таблица 3

Влияние извлечений из болиголова пятнистого на развитие «ватной гранулёмы» у беспородных крыс-самцов (Х±ш)

Группа животных Доза, мл/кг, лиг/кг Число животных Масса сырой гранулёмы, мг Масса сухой гранулематозно-фиброзной ткани, мг Масса экссудата, мг Угнетение пролиферации, %

Контроль — 10 266,9±33,5 78,8±7,9 188,1±26,2 —

Нимесулид 10 5 193,8±27,9* 54,8±4,6* 139,0±23,6* 31

Настойка сухих соцветий 0,5 5 148,6±10,4* 54,2±3,8* 94,4±7,5* 31

Настойка свежих соцветий 1 5 134,4±5,1* 45,0±1,3* 89,4±4,1* 43

Настойка сухих плодов 0,5 5 152,0±20,3* 46,8±3,0* 105,2±17,5* 41

Настойка свежих плодов 1 5 156,6±23,8* 47,0±3,2* 109,6±20,7* 40

Примечание. * - Различия достоверны в сравнении с контролем при Ри<0,05.

При моделировании хронического пролиферативного воспаления («фетровой гранулёмы») выявлено, что извлечения из сухой (1 мл/кг) и свежей (1 мл/кг) травы, сухих (0,5 мл/кг) и свежих (1 мл/кг) соцветий, этилацетатные фракции (12,5 мг/кг) в 1,2-1,4 раза угнетали разрастание гранулематозно-фиброзной ткани у животных (табл. 4). Кроме того, при их назначении наблюдалось уменьшение массы экссудата в 1,2-1,3 раза. Применение нимесулида способствовало снижению массы сухой гранулёмы в 1,4 раза, массы экссудата в очаге хронического воспаления - в 1,3 раза.

На модели «фетровой гранулёмы» извлечения из сухой (1 мл/кг) и свежей (1 мл/кг) травы, сухих (0,5 мл/кг) и свежих (1 мл/кг) соцветий, этилацетатные фракции (12,5 мг/кг) проявляли стресспротективный эффект, который осуществлялся, преимущественно, за счёт сокращения количества геморрагий на слизистой оболочке желудка. Под действием нимесулида было зафиксировано увеличение массы надпочечников, однако при этом глубина стресса была на 2 балла ниже по сравнению с контрольными животными.

Не исключено, что антипролиферативные свойства фитопрепаратов связаны с ингибированием алкалоидами и флавоноидами, входящими в состав болиголова пятнистого, синтеза структурных компонентов гранулематозно-фиброзной ткани - коллагена и неколлагеновых белков в очаге воспаления в результате изменения функциональной активности фибробластов.

Таблица 4

Влияние извлечений из болиголова пятнистого на развитие «фетровой гранулёмы» у беспородных крыс-самок (Х+т)

Группа животных Доза, мг/кг, мл/кг Число животных Масса сырой гранулёмы, мг Масса сухой гранулематозно-фиброзиой ткани, мг Масса экссудата, мг Угнетение пролиферации, %

Контроль — 10 707,6± 17,8 208,9+9,3 498,7±16,3 —

Нимесулид 10 5 532,6±18,4* 149,0±5,3* 383,6±14,0* 29

Настойка сухой травы 1 5 584,4±23,0* 168,0±8,3* 416,4±16,7* 20

Настойка свежей травы 1 5 571,2±12,0* 161,0+12,1* 410,2±23,1* 23

Настойка сухих соцветий 0,5 5 525,1±10,0* 146,4±3,4* 378,6±9,0* 30

Настойка свежих соцветий 1 5 521,0+7,2* 144,8+3,4* 376,2±4,6* 31

ЭАФС 12,5 5 539,0±7,9* 150,2±5,7* 388,8±9,5* 28

ЭАФТ 12,5 5 540,8+13,0* 158,2+7,0* 382,6+7,0* 24

Примечание. * - Различия достоверны в сравнении с контролем при Р1, Ри<0,05.

Исследование репаративной активности показало, что изучаемые растительные препараты способствовали ускорению процесса регенерации, уменьшая сроки заживления ран, увеличивая количество животных с полной эпите-лизацией раневого дефекта и вызывая формирование более полноценных регенератов кожи. При назначении настойки из сухих соцветий болиголова в дозе 1 мл/кг средний диаметр ран был достоверно меньше по сравнению с контрольной группой на 10-е сутки на 23 % и продолжал снижаться вплоть до 21-х суток эксперимента. При этом у 60 % исследуемых животных к концу эксперимента наблюдалось полное заживление раневого повреждения. При введении настойки из свежих соцветий болиголова в дозе 2 мл/кг прослеживалась тенденция к снижению диаметра ран, полное заживление ран под действием данного препарата регистрировалось на 21-е сутки эксперимента у 20 % животных. В группе животных, получавших этилацетатную фракцию соцветий болиголова в дозе 25 мг/кг, отмечалась отчётливая тенденция к снижению диаметра ран. Препарат сравнения (сок алоэ) оказывал более выраженное действие на регенерацию: на 21-е сутки было зарегистрировано 80 % мышей с полным заживлением ран.

Результаты гистологического анализа раневого дефекта свидетельствуют о том, что под влиянием настойки из сухих соцветий в дозе 1 мл/кг происходило уменьшение воспалительной реакции дермы, более раннее созревание грануляционной ткани, упорядочение её структуры по сравнению с контролем. Кроме того, выраженность патоморфологических изменений эпителия в виде акантоза, гипер- и дискератоза в группах животных, получавших данную настойку, была значительно ниже, чем в контроле.

Одним из основных компонентов воспалительной реакции является боль. Большинство флоголитиков сочетают антиэкссудативную активность с болеутоляющим эффектом [Тринус Ф.П. и др., 1987]. Фитопрепараты болиголова пятнистого проявили выраженное анальгетическое действие на модели химического болевого раздражения, индуцированного введением уксусной кислоты, которое проявлялось в уменьшении количества «уксусных корчей» на 22-98 % по сравнению с контрольной группой (табл. 5, 6). Латентное время болевой реакции при назначении исследуемых извлечений увеличивалось в 1,6-5,3 раза. Максимальный эффект наблюдался у животных, получавших настойку из свежей травы (4 мл/кг). Следует отметить, что назначение фракций фенольных соединений, выделенных из болиголова пятнистого, оказывало умеренное обезболивающее действие ло сравнению с комплексными препаратами (сокращение количества «корчей» на 22-40 %). Препарат сравнения метамизол натрий достоверно уменьшал количество «корчей» на 61-63 % по сравнению с контролем. При его назначении фиксировалось увеличение латентного периода болевой реакции в 2,3-3,5 раза.

По литературным данным, болеутоляющее действие ненаркотических анальгетиков характеризуется небольшим изменением порога боли при исследовании на здоровой ткани, в то время как при болях воспалительного характера эти препараты проявляют высокую анальгетическую активность [Комендан-това М.В., Шумилина З.И. 1970; Тринус Ф.П. и др., 1987]. На фоне развития каррагенинового воспаления время пребывания на горячей пластине здоровой лапы мыши возрастало при назначении настоек из свежей травы (2 мл/кг), сухих (1 мл/кг) и свежих (2 мл/кг) соцветий в 1,3-3 раза относительно контрольных животных. Под действием водной фракции из травы (ВФТ), этилацетатной фракции из соцветий (ЭАФС) и травы (ЭАФТ) болиголова пятнистого в дозе 25мг/кг достоверно увеличивался латентный период в 1,4-1,6 раза. Введение мышам ЭАФС повышало данный показатель в 1,4 раза.

Кроме того, в ходе развития адъювантной болезни периодически регистрировали индекс вокализации при пассивном пятикратном сгибании пораженного артритом голеностопного сустава. На 8-9-е сутки при назначении изучаемых извлечений отмечалось уменьшение данного показателя относительно нелеченых животных в 2,2-4,4 раза. К 14-м суткам при введении настойки из свежесобранной травы (1 мл/кг) болевая реакция при пассивном сгибании полностью отсутствовала. Применение диклофенак натрия и нимесулида также

приводило к уменьшению индекса вокализации в 1,7-5,0 раза. На 13-е сутки наблюдения при назначении нимесулида отмечалось отсутствие болевой реакции, однако на 15-е сутки было зафиксировано её возобновление.

Таблица 5

Анальгетическая активность извлечений из болиголова пятнистого на модели «уксусных корчей» у беспородных мышей-самок (Х+ш)

Группа Доза Число Количество Латентный период

животных мг/кг, мл/кг животных корчей болевой реакции (мин.)

Контроль — 7 50,8+10,8 1,3+0,4

Метамизол натрия 250 5 20,0+1,1* 4,6+0,0*

Настойка сухой 2 5 21,0+4,6* 3,5+0,8*

травы 4 5 18,0+2,5* 2,9+0,6*

8 5 17,0+3,1* 3,4+0,8*

Контроль — 10 41,1+4,2 2,4+0,3

Настойка свежей 0,5 5 14,4+5,2* 2,9+0,8

травы 1 5 19,6+4,7* 3,1 ±0,3

2 5 8,8+4,7* 8,5+2,5*

4 5 0,8+0,8* 12,6+2,3*

8 5 8,0+4,9* 11,0+2,4*

Контроль — 10 46,4+2,8 2,4+0,4

Метамизол натрия 250 5 20,0+4,0* 6,5+2,2

Настойка сухих 0,5 5 22,6+3,0* 4,5+0,9

соцветий 1 5 17,2+1,3* 5,9+0,8*

2 5 13,6+1,9* 5,7+0,8*

Настойка свежих 1 5 13,4+2,1* 5,6+0,6*

соцветий 2 5 12,8+2,2* 5,9+0,5*

4 5 16,2+3,2* 5,1+0,4*

Контроль — 10 44,8+4,2 1,8+0,1

Метамизол натрия 250 5 16,8+3,7* 4,2+0,6*

Настойка 0,5 5 14,2+3,2* 6,6+1,5*

сухих плодов 1 5 17,0+2,0* 5,5+0,8*

2 5 15,4+3,4* 4,0+1,5

Настойка 1 5 17,0+3,1* 5,2+0,3*

свежих плодов 2 5 17,2+1,9* 5,2+0,2*

4 5 13,0+4,0* 5,2+1,7*

Примечание. * - Различия достоверны в сравнении с контролем при Р^ Ри<0,05.

Таблица 6

Анальгетическая активность фракций фенольных соединений из болиголова пятнистого на модели «уксусных корчей» у мышей-самок линии СВА (Х+ш)

Группа Доза Количество Количество Латентный период

животных мл/кг, животных корчей болевой реакции

мг/кг (мин.)

Контроль — 10 39,6+1,5 1,9+0,3

ХФФС 25 5 29,3+1,9* 3,1+0,2*

ХФФТ 25 5 31,0+2,9* 3,0+0,1*

ВФС 25 5 28,0+4,6* 5,6+1,4*

ВФТ 25 5 26,0+2,7* 3,6±0,3*

-ЭАФС 25 5 23,8+3,5* 4,8+0,2*

ЭАФТ 25 5 24,6+3,5* 4,2+0,3*

БФС 25 5 26,4+1,5* 3,6+0,2*

БФТ 25 5 29,8+2,5* 3,3+0,4*

Примечание. * - Различия достоверны в сравнении с контролем при Р^ Ри<0,05.

Полученные результаты позволяют предположить, что, наряду со способностью влиять на центральные звенья передачи болевых импульсов, в механизме реализации анальгетического действия извлечений из болиголова пятнистого значительную роль играет действие на периферические механизмы болевой чувствительности (противоотёчный эффект, ингибирование эндогенных медиаторов боли, снижение местного ацидоза) [Тринус Ф.П. и др., 1987; Леми-наЕ.Ю., Чурюканов В.В., 1995]. Уменьшение чувствительности болевых рецепторов, по-видимому, также связано с угнетением алкалоидами и флавоноидами болиголова пятнистого продукции простагландинов группы Е как в очаге воспаления, так и в центральной нервной системе, что способствует усилению активности антиноцицептивной системы.

Среди общих реакций на воспаление клиническое значение, помимо боли, имеет лихорадочная реакция [Тринус Ф.П. и др., 1987]. Наблюдение за изменением температуры тела крыс на фоне экспериментальной гипертермии, вызванной введением суспензии пекарских дрожжей, показало, что исследуемые фитопрепараты уже через 1 час после введения снижали повышенную температуру в среднем на 0,20-0,96°С, через 4 часа - на 0,40-0,84°С, через 5 часов - на 0,56-1,20°С. При этом, назначение настойки из сухих плодов (0,5 мл/кг) приводило к достоверному уменьшению гипертермии на всём протяжении эксперимента. Препараты сравнения (ацетилсалициловая кислота и нимесулид) уменьшали гипертермию на 0,32-0,80°С и 0,40-1,10°С соответственно.

Моделирование острой тканевой гипоксии показало, что после введения гипоксанта нитропруссида натрия под влиянием настоек из сухой и свежей тра-

вы (2 мл/кг) продолжительность жизни увеличивалась - на 40 и 31 % соответственно; из сухих (1 мл/кг) и свежих (2 мл/кг) плодов - на 15 и 24 % соответственно (табл. 7).

Таблица 7

Влияние извлечений из болиголова пятнистого на продолжительность жизни беспородных мышей-самцов^ условиях острой тканевой гипоксии __(Х+т)__

Группа Доза Число Продолжительность жизни,

животных мл/кг, мг/кг животных мин.

Контроль — 6 11,0±1,3

а-Токофсрола ацетат 100 5 15,2±0,4*

Настойка сухой травы 2 5 15,4±1,3*

Настойка свежей травы 2 5 14,4+0,2*

Настойка сухих соцветий 1 5 17,0±0,6*

Настойка свежих соцветий 2 5 17,6±0,8*

Настойка сухих плодов 1 5 12,6+0,2

Настойка свежих плодов 2 5 13,6+0,4

ЭАФС 25 5 16,4±0,51*

ЭАФТ 25 5 16,0±1,14*

Примечание. * - Различия достоверны в сравнении с контролем при Рк0,05, Ри<0,05.

Наиболее выраженный антигипоксический эффект проявлялся при применении настоек из сухих (1 мл/кг) и свежих (2 мл/кг) соцветий - на 55 % и 60 % соответственно. Введение этилацетатных фракций также повышало данный показатель: фракция, выделенная из соцветий - на 49 %, из травы - на 46 %. Под действием препарата сравнения (а-токоферола ацетата) время жизни животных увеличивалось на 38 % по сравнению с контролем. Кроме того, исследуемые вытяжки из болиголова пятнистого защищали организм животных от повреждающего действия гипоксии, снижая глубину стресса на 2-4 балла по сравнению с контролем. Применение а-токоферола ацетата также оказывало антистрессорный эффект (разница с контрольной группой составляла 3 балла). Известно, что нит-ропруссид натрия является донатором оксида азота (N0) и в высоких концентрациях способен индуцировать тканевую гипоксию [Лукьянова Л.Д., 1989]. Эндогенный оксид азота вовлечён во многие физиологические и клеточные ответы в норме и в условиях патологии и обусловливает: вазодилатацию, нейротрансмис-сию, эксайтотоксичность, снижение агрегации тромбоцитов, угнетение адгезии тромбоцитов и лейкоцитов к стенкам сосудов, стабилизацию тучных клеток, обеспечение циготоксического и цитостатического эффекта макрофагов и ней-трофилов к патогенным микроорганизмам и опухолевым клеткам посредствам активации Т-лимфоцитов и ^Е [Шехтер А.Б. и др„ 1998; Попков В.Л. и др.,

2005]. Полученные данные свидетельствуют о том, что извлечения из болиголова пятнистого обладают антигипоксическими свойствами, поскольку они увеличивали продолжительность жизни животных и снижали токсические проявления тканевой гипоксии, вызванной нитропруссидом натрия. Не исключено, что это обусловлено влиянием фитопрепаратов на метаболизм оксида азота.

Основываясь на большом числе вышеприведённых экспериментальных исследований, можно заключить, что настойки из травы, соцветий и плодов болиголова пятнистого из сухого и свежесобранного сырья, а также фракции фе-нольных соединений, выделенные из исследуемого растения, способны влиять на основные проявления патологического процесса: воспаление, боль, лихорадку, регенерацию, зачастую не уступая по своему действию препаратам сравнения. Кроме того, фитопрепараты из болиголова пятнистого оказывают защитное действие на внутренние органы, проявляют умеренный гастрозащитный эффект. При различных экспериментальных патологических состояниях было показано, что выраженность эффектов действующих веществ растения (фракции фенольных соединений) часто не достигает уровня такового у комплексных препаратов (настоек), что, вероятно, обусловлено действием всего комплекса биологически активных соединений.

Таким образом, фитопрепараты болиголова пятнистого могут быть полезны в лечении воспалительных заболеваний, сопровождающихся болевым синдромом. При этом широта и эффективность фармакологического действия настойки из сухих соцветий болиголова пятнистого позволяет считать её наиболее перспективной для дальнейшего экспериментального изучения и рекомендовать для клинического испытания.

ВЫВОДЫ

1. Извлечения из болиголова пятнистого проявляют выраженную противовоспалительную активность на моделях острого экссудативного воспаления: препятствуют развитию отёка, вызванного каррагенином (настойки из травы, соцветий, плодов из сухого и свежесобранного сырья, а также фракции фенольных соединений), серотонином и гистамином (настойка сухих соцветий); снижают развитие перитонита (настойки из свежей травы и сухих соцветий). Анти-экссудативное действие извлечений сопоставимо с эффективностью синтетических препаратов (индометацин, диклофенак натрия, нимесулид).

2. При индуцировании хронического пролиферативного воспаления извлечения из болиголова пятнистого угнетают разрастание гранулематозно-фиброзной ткани на модели «ватной гранулёмы» (настойки из сухих и свежих соцветий, сухих и свежих плодов), на модели «фетровой гранулёмы» (настойки из сухой и свежей травы, сухих и свежих соцветий, этилацетатные фракции).

3. При моделировании иммунного воспаления настойки из сухой и свежей травы, сухих и свежих соцветий, сухих и свежих плодов сдерживают раз-

витие артрита, вызванного адъювантом Фрейнда, не уступая по эффективности диклофенак натрию и нимесулиду. Настойки из сухой и свежей травы оказывают нормализующее влияние на показатели периферической крови (общее количество лейкоцитов, сегментоядерные лейкоциты, моноциты) и некоторые биохимические параметры (АлАТ, серомукоиды) на данной модели.

4. Извлечения из болиголова пятнистого обладают анальгетическим действием: уменьшают восприятие болевых раздражений на моделях «уксусных корчей» (настойки из травы, соцветий, плодов из сухого и свежесобранного сырья, а также фракции фенольных соединений), «горячей пластины» (настойки из свежей травы, сухих и свежих соцветий, сухих плодов, водные фрации фенольных соединений из травы и соцветий, этилацетатные фракции), при адъю-вантном артрите (настойки из сухой и свежей травы, сухих и свежих соцветий, свежих плодов).

5. Настойки из травы, соцветий и плодов болиголова пятнистого из сухого и свежесобранного сырья проявляют жаропонижающее действие (снижают гипертермическую реакцию на фоне дрожжевой лихорадки), не уступая по активности ацетилсалициловой кислоте и нимесулиду.

6. Настойка из сухих соцветий болиголова пятнистого оказывает стимулирующее влияние на процесс репаративной регенерации (ускоряет заживление кожной лоскутной раны, способствуют созреванию грануляционной ткани), уступая препарату сравнения - соку алоэ.

7. Настойки из травы, соцветий сухого и свежесобраняого сырья, этил-ацетатные фракции обладают антигипоксической активностью (увеличивают продолжительность жизни животных в условиях острой тканевой гипоксии, вызванной натрия китропруссидом), не уступая препарату сравнения -а-токоферола ацетату.

8. Настойки из травы, соцветий, плодов из сухого и свежесобранного сырья, а также фракции фенольных соединений проявляют стресспротективное действие (нормализуют весовые показатели органов триады Селье) на фоне воспаления, тканевой гипоксии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации

1. Влияние вытяжек Conium maculatum L. на слизистую оболочку желудка на фоне острого экссудативного воспаления // Сибирский журнал гастроэнтерологии и гепатолопш. - 2005. - № 19. - С. 100-101. (соавт. Поветьева Т.Н., Нестерова Ю.В., Нагорняк Ю.Г., Пашинский В.Г.)

2. Исследование фармакологической активности водно-спиртовой вытяжки из надземной части Conium maculatum L // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии: итоговая научная конференция НИИ

фармакологии ТНЦ СО РАМН. - Томск: Изд-во Томского ун-та, 2005. - С. 4344. (соавт. Нестерова Ю.В., Нагорняк Ю.Г.)

3. Влияние настоек Conium maculatum L. на развитие острого воспаления // Науки о человеке: сборник статей по материалам 7 конгресса молодых ученых и специалистов. - Томск, 2006. - С. 109-110. (соавт. Криворотько Ф.П., Нестерова Ю.В.).

4. Conium maculatum L. в фитотерапии адьювантной болезни // Науки о человеке: сборник статей по материалам 7 конгресса молодых ученых и специалистов. - Томск, 2006, - С. 118-119. (соавт. Нестерова Ю.В., Криворотько Ф.П.).

5. Антигипоксическая активность алкалоидоносных растений // Новые достижения в создании лекарственных средств растительного происхождения: материалы Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора Л.Н. Березнеговской. - Томск, 2006. -С. 266-269. (соавт. Поветьева Т.Н., Нестерова Ю.В., Нагорняк Ю.Г. и др.).

6. Углекислотные экстракты пихты и спиртовые экстракты дельфиниума и болиголова в комплексном лечении и профилактике воспалительных заболеваний верхних дыхательных путей // Современные проблемы фитотерапии: материалы I Международного съезда фитотерапевтов. -М., 2006. - С. 84-88. (соавт. Зеленская К.Л., Поветьева Т.Н., Нестерова Ю.В. и др.).

7. Противовоспалительное действие Conium maculatum L. // Здоровье и Образование в XXI веке: тезисы докладов VII международной научно-практической конференции. - М., 2006. - С. 411. (соавт. Нестерова Ю.В., Поветьева Т.Н.).

8. Тканевая гипоксия, вызванная нитропруссидом натрия, и ее коррекция растительными средствами // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2007. - Прил. 1. - С. 49-53. (соавт. Аксиненко С.Г., Поветьева Т.Н., Провалова Н.В. и др.).

9. Изучение флоголитической активности препаратов болиголова пятнистого // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии: итоговая научная конференция НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН. - Томск, 2007. - С. 66-69. (соавт. Нестерова Ю.В.).

10. Анальгетические свойства комплексных извлечений из болиголова пятнистого // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии: итоговая научная конференция НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН. -Томск, 2007. - С. 69-71. (соавт. Нестерова Ю.В.)

11. Действие настоек из плодов Conium maculatum L. на развитие хронического воспаления // Вестник РГМУ. - 2007. - Т. 55, № 2. - С. 306-307. (соавт. Нестерова Ю.В.).

12. Antihypoxic activity of vegetative extracts // Materials of the III International scientific conference «Traditional medicine a current situation and perspectives of

development». - Ulan-Ude, 2008. - p. 78 (with Nesterova Y.V., Pashinskyi V.G., Povetieva T.N. et al.)

13. Создание новых лекарственных препаратов на основе алкалоидов и фла-воноидов из растений Сибири // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2008. - Прил. 2. - С. 30-36. (соавт. Нестерова Ю.В., Поветьева Т.Н., Суслов Н.И. и др.).

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АлАТ

БФС

БФТ

ВФС

ВФТ

ХФФС

ХФФТ

ЭАФС

ЭАФТ

LD

- аланин-аминотрансфераза

- бутанольная фракция соцветий

- бутанольная фракция травы

- водная фракция соцветий

- водная фракция травы

- хлороформная фракция соцветий

- хлороформная фракция травы

- этилацетатная фракция соцветий

- этилацетатная фракция травы

- летальная доза

<1

Подписано в печать 12.12.2008 г. Формат 60x84/16. Гарнитура Times. Бумага офсетная. Печать трафаретная. Усл. печ. л. 1,40. Тираж 100 экз. Заказ № 155.

Отпечатано в типографии ООО «Аграф-Пресс» 634055, г. Томск, пр. Академический, 10/3, стр. 4, к. 104 тел. 252 484, 8 901 610 7013, e-mail: agraf@rambler.ni

Актуальность проблемы

Воспаление как патологический процесс, лежащий в основе большинства заболеваний человека, является центральной проблемой медицины [Альперн Д. Е., 1959; Чернух А. М., 1979; Каратеев А. Е., 2007]. Рост ревматических заболеваний и других болезней, протекающих с выраженной воспалительной реакцией и болевым синдромом, хроническое их течение, частое развитие осложнений, длительная потеря трудоспособности определяют социально-медицинское значение и актуальность поиска средств лекарственной регуляции этого процесса [Насыров X. М., Фархутдинов Р. Р., 1985; Си-гидин Я. А., 1990]. С целью коррекции воспаления в настоящее время широко применяются нестероидные противовоспалительные средства (НПВП). По данным ВОЗ, препараты этой группы занимают второе место после антибиотиков по массовости их применения. Ежедневно в мире НПВП используют около 30 миллионов пациентов и эта цифра постоянно возрастает. Специфическая способность этих препаратов влиять на важнейшие патологические процессы (возникновение и проведение болевого импульса, воспаление, агрегацию тромбоцитов, неоангиогенез, апоптоз и др.) определила широкий круг заболеваний и патологических состояний, при которых они с успехом используются. К сожалению, приём НПВП приводит к серьёзным осложнениям, прежде всего связанным с развитием патологии желудочно-кишечного тракта [Каратеев А. Е., Насонов Е. Л., 2006]. Это обосновывает актуальность поиска новых эффективных нетоксичных антифлогистиков, способных корректировать воспалительный процесс с выраженным терапевтическим эффектом без нежелательных побочных явлений и осложнений.

В настоящее время лекарственные растения продолжают оставаться одними из перспективных источников получения новых препаратов. Преимущества применения фитопрепаратов перед синтетическими лекарственными средствами очевидны и состоят в том, что они обладают широким диапазоном терапевтических доз, многими фармакотерапевтическими эффектами, обусловленными наличием в растениях комплекса биологически активных веществ, мягкостью действия, возможностью длительного их использования без опасности возникновения побочных эффектов [Почему., 1989; Лекарственные., 1990; Пашинский В. Г., 2007].

В связи с этим наше внимание привлекло достаточно часто применяемое в народной медицине, но до настоящего времени малоизученное растение из семейства зонтичных - болиголов пятнистый (Conium maculatum L.). Проведённый анализ литературных данных о применении болиголова в народной медицине позволил выявить основной спектр фармакотерапевтиче-ского действия этого растения: противовоспалительное, болеутоляющее, се-дативное, противоастматическое, противосудорожное, противораковое и другие [Дадобаева О., 1972; Еремина Н. К., 1983; Завражнов В. И. и др., 1993; Лекарственные., 2005; French D.H., 1971].

Содержание в болиголове пятнистом комплекса биологически активных веществ с различной химической структурой (алкалоиды, фенольные соединения и др.), предполагает широту фармакотерапевтических эффектов. Известно, что соединения фенольной группы обладают противовоспалительным, антиоксидантным, спазмолитическим, адаптогенным, седативным, кровоостанавливающим, антимикробным и другими действиями [Барабой В. А., 1984; Турищев С. Н., 1999; Лекарственные., 2005]. Флавоноиды ингибиру-ют перекисное окисление липидов [Лукьянчук В. Д., Савченкова Л. В., 1998; Torel J. et al., 1986], уменьшают проницаемость капилляров, что приводит к торможению экссудативной фазы воспаления, угнетают активность НАДФ-оксидазы и изменяют секрецию лизосомальных ферментов [Са-раф А. С., Оганесян Э. Т., 1991; Окуневич Н. В. и др., 1992]. Под их воздействием предотвращается патологически повышенный синтез свободных радикалов, цитотоксических окислительных агентов, медиаторов воспаления. Одним из важных механизмов противовоспалительного действия флавоноидов является их способность к ингибированию каскада метаболизма арахи-доновой кислоты, из которой образуются медиаторы воспаления [Чернов Ю. Н. и др., 2004]. Другими биологически активными веществами болиголова пятнистого являются алкалоиды пиперидинового ряда — кониин и его производные [Зориков П. С., 2005]. Известно, что кониин обладает никоти-ноподобным действием [Орлов Б. Н. и др., 1990], блокирует депрессорную реакцию при раздражении блуждающего нерва; вызывает сокращение изолированного отрезка кишечника и матки морской свинки [Bowman W. С., Sanghvi I. S., 1963], уменьшает чувствительность мышц к ацетилхолину [На-легатская А. В., 1953].

Учитывая содержание высокоактивных веществ, сведения народной медицины, немногочисленные экспериментальные данные, большую сырьевую базу, доступность сырья, широкую возможность культивирования, представлялось актуальным комплексное исследование, направленное на изучение противовоспалительных свойств извлечений из болиголова пятнистого.

Цель исследования

Целью настоящей работы явилась оценка противовоспалительной, анальгетической и жаропонижающей активности извлечений из болиголова пятнистого.

Задачи исследования:

1. Провести сравнительное изучение противовоспалительной активности извлечений из болиголова пятнистого и нестероидных противовоспалительных препаратов, определить их действие на показатели системы крови на моделях воспаления.

2. Исследовать анальгетическую активность извлечений из болиголова пятнистого.

3. Оценить жаропонижающее действие извлечений из болиголова пятнистого.

4. Изучить влияние извлечений из болиголова пятнистого на процесс репаративной регенерации.

5. Оценить антигипоксические свойства извлечений из болиголова пятнистого.

6. Исследовать стресспротективное действие извлечений из болиголова пятнистого при различных патологических состояниях.

Научная новизна

Впервые выполнено широкое сравнительное экспериментальное исследование фармакологических свойств 14 извлечений, полученных из надземной части болиголова пятнистого первого (трава) и второго (соцветия, плоды) года вегетации. Выявлена способность настоек из травы, соцветий, плодов из сухого и свежесобранного сырья, а также фракций фенольных соединений оказывать выраженное антиэкссудативное и обезболивающее действие, сопоставимое с эффектами синтетических препаратов (метамизол натрия, диклофенак натрия, нимесулид). Показано, что настойки из травы, соцветий и плодов болиголова пятнистого из сухого и свежесобранного сырья проявляют антипролиферативную и жаропонижающую активность, сдерживают развитие иммунного воспаления, нормализуют гематологические и биохимические показатели крови. Установлено, что настойка из сухих соцветий болиголова пятнистого ускоряет заживление кожной лоскутной раны. Впервые обнаружено, что настойки из травы, соцветий сухого и свежесобранного сырья, этилацетатные фракции из болиголова пятнистого обладают антигипоксическим действием. Все исследуемые извлечения проявляют ан-тистрессорные свойства на фоне воспаления, тканевой гипоксии.

Практическая значимость работы

Результаты экспериментальных исследований могут служить основой для создания новых лекарственных препаратов из болиголова пятнистого для лечения воспалительных заболеваний, сопровождающихся болевым синдромом. Наиболее перспективной является настойка соцветий, полученная из сухого сырья.

Апробация работы

Основные положения и результаты работы представлены на: научно-практической конференции «Достижения современной гастроэнтерологии» (Томск, 2005), 7-м конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2006), Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора JI.H. Березнеговской (Томск, 2006), научно-практической конференции «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2005, 2007), 1-м международном съезде фитотерапевтов (Москва, 2006), 2-й международной (XI Всероссийской) Пироговской студенческой научной медицинской конференции (Москва, 2007), 3-й интернациональной научной конференции «Традиции медицины: текущая ситуация и перспективы развития» (Улан-Уде, 2008).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе 1 — в центральном журнале, рекомендованном перечнем ВАК.

Объём и структура диссертации.

Работа изложена на 150 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 291 источник, из них 222 - на русском, 69 - на иностранном языках. Диссертация иллюстрирована 40 таблицами и 5 рисунками.

ВЫВОДЫ

1. Извлечения из болиголова пятнистого проявляют выраженную противовоспалительную активность на моделях острого экссудативного воспаления: препятствуют развитию отёка, вызванного каррагенином (настойки из травы, соцветий, плодов из сухого и свежесобранного сырья, а также фракции фенольных соединений), серотонином и гистамином (настойка сухих соцветий); снижают развитие перитонита (настойки из свежей травы и сухих соцветий). Антиэкссудативное действие извлечений сопоставимо с эффективностью синтетических препаратов (индометацин, диклофенак натрия, ни-месулид).

2. При индуцировании хронического пролиферативного воспаления извлечения из болиголова пятнистого угнетают разрастание гранулематозно-фиброзной ткани на модели «ватной гранулёмы» (настойки из сухих и свежих соцветий, сухих и свежих плодов), на модели «фетровой гранулёмы» (настойки из сухой и свежей травы, сухих и свежих соцветий, этилацетатные фракции).

3. При моделировании иммунного воспаления настойки из сухой и свежей травы, сухих и свежих соцветий, сухих и свежих плодов сдерживают развитие артрита, вызванного адъювантом Фрейнда, не уступая по эффективности диклофенак натрию и нимесулиду. Настойки из сухой и свежей травы оказывают нормализующее влияние на показатели периферической крови (общее количество лейкоцитов, сегментоядерные лейкоциты, моноциты) и некоторые биохимические параметры (АлАТ, серомукоиды) на данной модели.

4. Извлечения из болиголова пятнистого обладают анальгетическим действием: уменьшают восприятие болевых раздражений на моделях «уксусных корчей» (настойки из травы, соцветий, плодов из сухого и свежесобранного сырья, а также фракции фенольных соединений), «горячей пластины» (настойки из свежей травы, сухих и свежих соцветий, сухих плодов, водные фрации фенольных соединений из травы и соцветий, этилацетатные фракции), при адъювантном артрите (настойки из сухой и свежей травы, сухих и свежих соцветий, свежих плодов).

5. Настойки из травы, соцветий и плодов болиголова пятнистого из сухого и свежесобранного сырья проявляют жаропонижающее действие (снижают гипертермическую реакцию на фоне дрожжевой лихорадки), не уступая по активности ацетилсалициловой кислоте и нимесулиду.

6. Настойка из сухих соцветий болиголова пятнистого оказывает стимулирующее влияние на процесс репаративной регенерации (ускоряет заживление кожной лоскутной раны, способствуют созреванию грануляционной ткани), уступая препарату сравнения - соку алоэ.

7. Настойки из травы, соцветий сухого и свежесобранного сырья, этил-ацетатные фракции обладают антигипоксической активностью (увеличивают продолжительность жизни животных в условиях острой тканевой гипоксии, вызванной натрия нитропруссидом), не уступая препарату сравнения -а-токоферола ацетату.

8. Настойки из травы, соцветий, плодов из сухого и свежесобранного сырья, а также фракции фенольных соединений проявляют стресспротектив-ное действие (нормализуют весовые показатели органов триады Селье) на фоне воспаления, тканевой гипоксии.