Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Фитохимическое исследование по созданию гепатопротекторных лекарственных средств на основе плодов расторопши пятнистой

На правах рукописи

ВОЛОЦУЕВА АЛЛА ВАЛЕРИЕВНА

ФОТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПО СОЗДАНИЮ ГЕПАТОПРОТЕКТОРНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ НА ОСНОВЕ ПЛОДОВ РАСТОРОПШИ ПЯТНИСТОЙ

15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат

Диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Пермь - 2004

Работа выполнена в Государственном общеобразовательном учреждении высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения России».

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор фармацевтических наук, профессор Владимир Александрович Куркин ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор фармацевтических наук, профессор Башкирского государственного медицинского университета Татьяна Ивановна Плеханова. кандидат фармацевтических наук, доцент Пермской государственной фармацевтической академии Александр Алексеевич Донцов

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Государственное общеобразовательное учреждение высшего

профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет Минздрава России».

Защита состоится » 2004 г.

В часов на заседании Диссертационного Совета Д 208.068.01

при ГОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия Минздрава России» по адресу: 614600 г. Пермь, ул. Ленина,48.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «ПГФА Минздрава России».

Автореферат разослан 2004 г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета Д 208.068.01, Кандидат фармацевтических наук,

доцент Е. В. МЕТЕЛЕВА

20967

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время плоды расторопши пятнистой [ЗИуЬиш шапапиш Gaeгtn. сем. Ая1егасеае - Астровых] широко применяются в России и за рубежом для производства таких ценных гепатопротекторных препаратов, как Силимар, Карсил, Легален, Силибор, Гепабене и др. Уникальность данных препаратов заключается в том, что их гепатозащитные свойства обусловлены новой группой биологически активных соединений (БАС) - флаволигнанами, в частности, силибином, силидианином и силикристином. Механизм действия указанных БАС включает в себя снижение перекисного окисления фосфолипидов в ткани печени и повышение активности таких антиоксидантных ферментов, как каталаза и супероксиддисмутаза, а также стимуляцию регенерации клеток печени.

При этом важно подчеркнуть, что гепатопротекторы на основе плодов расторопши пятнистой используются не только для лечения патологии печени, но и в качестве вспомогательной терапии многих инфекционных поражений (хронический бронхит, хламидиоз, токсоплазмоз и.т.д.), а также для профилактики различных заболеваний, возникших в результате воздействия на организм неблагоприятных факторов окружающей среды. Однако отсутствие на сегодняшний день достаточного ассортимента отечественных аналогов и дороговизна импортных препаратов не позволяют удовлетворить острую потребность населения в данной группе лекарственных средств. Огромные возможности для создания современных гепатопротекторов на основе флаволигнанов расторопши пятнистой имеются в Самарской области, где создана крупнейшая в Российской Федерации промышленная сырьевая база.

Таким образом, разработка отечественных, эффективных, безопасных, доступных по цене гепатопротекторных фитопрепаратов, применимых и в педиатрической практике, представляется актуальной и перспективной как в научном, так и в практическом отношении.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение фармакогностических и аналитических аспектов создания

1. Сравнительное изучение химического состава плодов, шрота, жома растропши пятнистой, культивируемой в Самарской области.

2. Обоснование способа получения нового гепатопротекторного лекарственного средства «Холемарин».

3. Разработка методик качественного и количественного анализа нового гепатопротекторного лекарственного средства «Холемарин».

4. Разработка методик качественного и количественного анализа гепатопротекторного лекарственного средства «Расторопши сироп».

5. Разработка числовых показателей новых гепато протекторных лекарственных средств «Холемарин» и «Расторопши сироп».

6. Разработка проектов нормативной документации ФСП «Холемарин» и ФСП «Расторопши сироп».

Научная новизна.

В результате изучения химического состава плодов расторопши пятнистой, культивируемой в Самарской области, выделены и идентифицированы силибин, силидианин, силикристин, а также впервые получено и охарактеризовано индивидуальное вещество флаволигнан (один из основных биологически активных соединений) 2,3-дегидросилибин. Выявлено, что 2,3-дегидросилибин обладает выраженным антиоксидантным действием, что позволяет относить данный флаволигнан к основным биологически активным соединениям плодов расторопши пятнистой. Для установления структуры и определения физико-химических свойств дегидросилибина использованы УФ-спектрометрия, 'Н-ЯМР-спектроскопия и масс-спектрометрия, а также различные химические превращения. На основе принципа унификации разработаны унифицированные методики качественного и количественного анализа препаратов «Холемарин» и «Расторопши сироп» с использованием тонкослойной хроматографии и прямой спектрофотометрии и Государственнного стандартного образца (ГСО) силибина. Научно обоснована целесообразность использования шрота плодов (после экстракции хладоном-12) для получения, гепатопротекторных препаратов. Проведено сравнительное фитохимнческое исследование плодов, шрота и жома плодов, экстракта, холемарина и сиропа расторопши.

Практическая значимость.

1. Обоснованы технология получения экстракта расторопши жидкого и лекарственного средства «Холемарин» (достигается максимальное извлечение основных БАС плодов расторопши пятнистой из нативных плодов и обезжиренного сырья) и методы качественного и количественного анализа, позволяющие определять содержание суммы флаволигнанов в сырье и препаратах.

2. Получен Патент РФ на изобретение № 2209063 «Способ получения вещества, обладающего антиоксидантным действием» по заявке № 2002103533 от 08.02.2002 г.

3. Разработаны методики качественного и количественного анализа препаратов «Холемарин» и «Расторопши сироп» с использованием ТСХ-анализа и прямой спектрофотометрии.

4. Определены числовые показатели препаратов «Холемарин», «Расторопши

•у

сироп»: содержание суммы флаволигнанов, сухой остаток, концентрация спирта, установлен срок годности.

5. Обоснована целесообразность применения разработанных препаратов на основе плодов растропши пятнистой «Холемарин» и «Расторопши сироп» в медицинской практике в качестве гепатопротекторных лекарственных средств.

6. Результаты исследований используются в практическом здравоохранении, научных изысканиях и в учебном процессе на кафедре фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии Самарского государственного медицинского университета (акты внедрения от 10.03.2004 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 научных работ, в том числе 1 патент РФ на изобретение.

Апробация работы. Материалы работы доложены и обсуждены на VII, VIII и IX Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 2000-2002 гг.); на II Международной научной конференции «Биологическое разнообразие. Интродукция растений» (С. Пб, 1999 г.); на Международной научной конференции «Поиск, разработка и внедрение новых лекарственных средств и организационных форм фармацевтической деятельности» (Томск, 2000 г.); на VI и VII Всероссийском конгрессе «Экология и здоровье человека»

(Самара, 2001,2002 гг.); на научной конференции «Достижения, проблемы, перспективы фармацевтической науки и практики», посвященной 35-летию фармацевтического факультета Курского государственного медицинского университета (Курск, 2001 г.); на юбилейной IX научно-практической конференции «Актуальные вопросы диагностик, лечения и реабилитации больных» Пензенского института усовершенствования врачей МЗ РФ с участием регионов России (Пенза, 2002 г.); на XXI международной конференции по полифенолам (Марокко, 2002 г.).

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ Самарского государственного медицинского университета (№ Государственной регистрации 01200112941) и Республиканских программ:

1. «Совершенствование лекарственного обеспечения населения и лечебно-профилактических учреждений в рыночных условиях» по теме: «Создание лекарственных средств природного происхождения антимикробного, адаптогенного и гепатопротекторного действия» (№ Государственной регистрации 01990005277).

2. «Разработка методик качественного и количественного анализа сырья и препаратов лекарственных растений, содержащих фенилпропаноиды и флавоноиды» (№ Государственной регистрации 01990007536). Положения, выдвигаемые на защиту:

1. Результаты сравнительного изучения химического состава плодов и обезжиренного сырья (жома и шрота) расторопши пятнистой.

2. Методики качественного и количественного анализа нового гепатопротекторного лекарственного средства «Холемарин».

3. Методики качественного и количественного анализа лекарственного средства «Расторопши сироп».

4. Результаты определения показателей качества препаратов. Объем и структура работы.

Диссертационная работа изложена на 140 страницах машинописного текста, содержит 16 таблиц, 7 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора

литературы, описания объектов и методик исследования, 3-х глав, отражающих результаты собственных экспериментальных исследований и их обсуждение, общих выводов, приложения и списка литературы, включающего 224 источника, из которых 76 на иностранных языках. Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, отмечена новизна и практическая значимость полученных результатов, а также изложены положения, выносимые на защиту.

Глава 1 содержит аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы по проблеме современного состояния исследований плодов расторопши пятнистой, в котором обобщены и систематизированы сведения по изучению химического состава растения, фармакологической активности, применению в медициской практике.

В главе 2 представлены характеристика объектов и методов исследования. Приведены методики химического и физико-химического изучения лекарственного сырья, индивидуальных веществ и препаратов, а также контроля качества лекарственных форм на основе плодов расторопши пятнистой.

В главах 3-5 экспериментальной части приводятся результаты собственных исследований по изучению химического состава плодов расторопши пятнистой, разработке новых препаратов и оценке их качества. В приложение вынесены материалы по разработке нормативной документации; акты внедрения.

Результаты, полученные при проведении исследований, обработаны статистически и представлены в таблицах, на рисунках, выражены в соответствующих формулах, которые приведены в тексте диссертации.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Исследование химического состава плодов расторопши пятнистой, культивируемой в Самарской области

В фармацевтической технологии известны способы получения лекарственных средств и субстанций на основе суммы БАС (карсил, силибор, силимар, силимарин и др.), а также индивидуальных веществ из плодов расто-

ропши пятнистой, однако недостатком известных способов является сложность технологического процесса и низкий выход целевого продукта. Кроме того, до настоящего времени как в отечественной, так и зарубежной литературе подчеркивалась прежде всего значимость трех основных действующих веществ плодов расторопши пятнистой - силибина, силидианина и силикристина, которые определяют гепатопротекторные, антиоксидантные,

мембраностабилизирующие свойства препаратов на основе сырья данного растения. Однако следует учесть то обстоятельство, что в экстракте расторопши жидком в заметном количестве содержится 2,3-дегидросилибин, впервые выделенный и идентифицированный нами в ходе настоящих исследований из сырья расторопши пятнистой, культивируемой в Российской Федерации. Для целей стандартизации плодов расторопши пятнистой и отечественных препаратов на основе этого сырья ранее предложено использовать силибин в качестве Государственного стандартного образца [Куркин В.А., Запесочная Г.Г.,1991; 1996].

Выделение флаволигнанов осуществляли из 200,0 г измельченных плодов расторопши пятнистой, культивируемой в Самарской обл. (урожай 2001 г.), а также из 200,0 г шрота плодов и 200,0 г жома плодов - отходов производства масла расторопши. Воздушно-сухое сырье расторопши пятнистой заливали 80%-ным этиловым спиртом в соотношении 1:10 и настаивали в течение 24 ч, затем экстракцию сырья осуществляли 80 %-ным этиловым спиртом при нагревании с обратным холодильником (в течение 30 мин в 2 этапа для полного истощения сырья). Объединенное водно-спиртовое извлечение упаривали под вакуумом до водного остатка, который наносили на слой полиамида «Woelm» (20,0 г), высушивали. Полученный сухой порошок (экстракт+полиамид) наносили на слой полиамида, сформированный в воде (высота колонки 20 см, диаметр — 5,5 см), и элюировали водой, а затем смесью растворителей вода—этиловый спирт с возрастанием концентрации последнего. Целевой продукт элюировали 80 %-ным этиловым спиртом. Упаренные фракции, содержащие смесь флаволигнанов, высушивали на силикагеле L 40/100 (20,0 г). Сухой порошок наносили на слой силикагеля (40,0 г), сформированный в виде взвеси в хлороформе (высота колонки 8,0 см, диаметр - 4,0 см). Хроматографическое разделение целевых

веществ осуществляли на силикагеле L 40/100 с использованием градиентной элюентной смеси хлороформ—этиловый спирт в различных соотношениях (100:0, 98:2, 97:3, 95:5, 93:7). Это привело к получению отдельных фракций (15-18, 5% этанол в хлороформе), обогащенных силибином и 2,3-дегидросилибином, из которых были получены целевые вещества в количестве 1,0 и 0,5 г соответственно. Кроме того, в результате рехроматографирования на полиамиде «"Мэе1т» фракций, содержащих другие целевые вещества и последующей перекристаллизации выделены флаволигнаны силидианин и силикристин. Окончательную очистку 2,3-дегидросилибина (4) осуществляли перекристаллизацией из водного спирта, а силибина (1)— из смеси ацетона и спирта. Выход целевого продукта — индивидуального силибина (1) и 2,3-дегидросилибина (4) составил 0,6 г и 0,2 г соответственно. С использованием метода колоночной хроматографии выделены 4 соединения флавоноидной природы (1 - 4) из водно-спиртовых извлечений измельченных плодов, шрота и жома - обезжиренного сырья. Положительный тест с серной кислотой (лимонно-желтое - как и для силибина) свидетельствует о наличии в молекуле (4) бензодиоксанового цикла (в случае силикристина тест отрицательный). В условиях ТСХ дегидросилибин имеет величины К, 0,45 (хлороформ-метанол, 6:1) и 0,85 (хлороформ-метанол-вода, 26:14:3) и при проявлении раствором А1С13 обнаруживается в виде пятна, имеющего ярко-зеленую флуоресценцию (флавонол). Следовательно, соединение (4) представляет собой 2,3-дегидросилибин, ранее синтезированный японскими учеными [Т. Такето11о й а1, 1975]. Флаволигнаны 1, 2, 3 имеют флаваноноловую природу и относятся к группам 1,4-бензодиоксанов (силибин), трициклических кетонов (силидианин) и бензофуранов (силикристин) соответственно. Контроль за ходом хроматографического разделения осуществляли методом тонкослойной хроматографии на пластинках «8ПиЫ иУ 254» (15*15 см) и «Сорбфил ПТСХ-П-А-УФ (10*10 см) в системе растворителей хлороформ : метанол (6:1), хлороформ:метанол:вода (26:14:3) и хлороформ : ацетон : муравьиная кислота (9:2: 1).

Таблица 1

Флаволигнаны расторопши пятнистой

№ п/п Название / Структурная формула Физико-химические константы

1 2 3

1 Силибин ТГт .сс ✓СНгОН Г1 С25Н22О10 Т пл. 164-168 °С [a]D +10,8° (ацетон)

он о чон V\)B ОСН)

2 Силидианин НО, он о Т" \ ГУХУ но' 0 . jacHj . „он \ • у ? у» С25Н22О10 Тпл. 189-191 °С [a]D + 218° (этанол)

"он о

3 Силикристин ОСНз ir С25Н22О]0 (М+ 482) Тпл. 174-177 °С [a]D + 80,5° (пиридин) 289,325 (пл) нм

ОН 0 Xj— N0H СН20Н

4 2,3-Дегидросилибин н I ^/СНгОН С25Н20ОЮ Тпл. 254-255 °С

Vi

он о ""он ОСНз

1.1. Изучение химических параметров выделенных флаволигнанов растропши пятнистой

Для установления структуры выделенных соединений использовали данные УФ-, 'Н-ЯМР- и масс-спектров, а также результаты химических превращений и непосредственное сравнение с достоверными образцами веществ (силибин, силидианин и силикристин). Отсутствие примесей в получаемых соединениях контролировалось методом ТСХ в нескольких системах и с использованием различных способов детекции.

Рис.1. Тонкослойная хроматография водно-спиртового извлечения из сырья расторопши пятнистой по содержанию флаволигнанов 1- 4

ХЛФ-Ме0Н-Н20 26:14:3 УФ 254нм

8 8 8 О О

О о о о

О о о о

1 2 3 4 5 6 7

1. Водно-спиртовое извлечение из плодов расторопши.

2. Извлечение из жома плодов.

3. Извлечение из шрота плодов

4. силибин (Rf 0,8)

5. силидианин (Rf 0,7)

6. силикристин (Rf 0,6)

7. дегидросилибин (Rf 0,85)

Вещества сушили в вакуум-пистолете при температуре 48-60 °С/ 2 мм над пятиокисью фосфора и затем определяли температуру плавления на блоке Кофлера. Уф-спектры снимали на приборе Specord M 40 и Hitachi-EPS-ЗТ в метаноле (этаноле). Применяли реагенты сдвига: 0,1М раствор метилата натрия, свежеплавленный ацетат натрия, безводная борная кислота (или ее насыщенный раствор в метаноле), 5% раствор безводного А1С13, 10% НС1. Спектральные и

физико-химические свойства веществ изучены с использованием следующих методов: 'Н ЯМР-спектры регистрировали на приборе Уапап-0етт1ш-200 (200 МГц), УФ-спектры снимали на приборе 8ресог! М40 в метаноле, масс-спектры электронного удара регистрировали на приборе Уапап-СН-8 при энергии ионизирующих электронов 35 и 70 эВ и варьировании температуры ионного источника от 30 до 250 °С.

В ЯМР-спектре (4) отсутствуют сигналы Н-2 и Н-3 (дублеты с I = 11 Гц в области 4,5-5.1 м.д., характерные для флаволигнанов (1-3), имеющих флаваноноловую природу). Подтверждает структуру флавонол-лигнана и масс-спектр, где отмечен молекулярный ион с массой 480. Положительный тест с серной кислотой (лимонно-желтое - и для силибина) свидетельствует о наличии в молекуле (4) бензодиоксанового цикла (в случае силикристина тест отрицательный).

.....Ц........и................'4.........¿.........i.........<1..............i.........^...............

Рис 2. Ш-ЯМР-спекгр ГСО силибина в дейтероацетоне Силибин (1). Белые кристаллы состава С22Н22О10 (М+ 482). Т. пл. 164 — 166 °С, [а]в +10.0 (ацетон), УФ-спектр: Хщм 289, 325 (пл) нм. 'Н ЯМР-спектр в дейтероацетоне при 50° (200 МГц): 11.70 (с, 5-ОН), 6.8—7.2 (м, 6Н-Аг), 5.96 (д, 2Н, 2 Гц, Н-6.8), 5.10 (д, 12 Гц, Н-2), 5.00 (д, 8 Гц, НА), 4.60 (д, 12 Гц, Н-3), 4.1—4.2 (м, Нв), 3.3—3.8 (м, Нс и Нв), 3.85 (с, ЗН, СН3О) (рис 2.).

Силидианин (2). Белые кристаллы состава С25Н22О10 (М+ 482) с т. пл. 188191 °С. УФ-спектр: Хтаа1,289, 325 (пл) нм. Н-ЯМР-спекгр в дейтероацетоне (200 МГц): 11,76 (с, 5-ОН), 9,78 (уш. с, 7-ОН), 6,7-7,0 (м, ЗН-Аг), 6,30 (м, Н-61), 6,02 (уш, с, 2Я Н-6,8), 4,92 (дд, 12 н 2 Гц, Н-2), 4,65 (дд, 12 и 3 Гц, Н-3), 4,29 (дд, 8 и 3,5 Гц,

'Н-ЯЮВепиечр ГСО 1саанб|— ш жАтерпанетоие

ГСОшмАш

М_I

Нс), 3,78 (д, 8 Гц, Н0), 3,75 (с, ЗН, СН30), 3,66 (од, 4 и 2 Гц, Н-21), 3,42 (м, Ид), 3,28 (ад, 6 и 2,5 Гц, Н-51), 2,9 (м, Нв).

Силикристин (3). Кристаллы светло-желтого цвета состава С25Н22010 (М+482) с т. пл. 173-175 °С, [а]в + 207 (этанол),УФ-спектр: 289, 326 (пл) нм.'Н-ЯМР-спектр в дейтероацетоне (200 МГц): 11,86 (с, 5-ОН), 6,8-7,18 (м, 6Н-Аг), 6,0 (д, Н, 2 Гц, Н-8), 5,96 (д, Н, 2 Гц, Н-6), 5,60 (ц, 6,4 Гц, Ид), (5,05, д, 11,5 Гц, Н-2), 4,65 (д, 11,5 Гц, Н-3), 4,1-4,3 (м, Нв), 3,5-3,8 (м. Нси Нс), 3,82 (с, ЗН, СН30).

2,3-Дегидросилибин (4). Кристаллы желтого цвета состава С25Н20010 (М+ 480). Т. пл. 253—255 °С. УФ-спектр: Х,,^ 267, 365 нм. 'Н ЯМР-спектр в дейтероацетоне (200МГц): 12.15 (с, 5-ОН), 9.74 (уш. с, 7-ОН), 7.87 (д, 2.1 Гц, Н-2'), 7.17 (дд, 8.3 и 2.1 Гц, Н-6), 7.8—6.9 (м, 4Н-Аг), 6.60 (д, 2.1 Гц, Н-8), 6.28 (д, 2.1 Гц, Н-6), 5.06 (д, 8.06 Гц, НА), 4.24 (м, Нв), 3.88 (с, ЗН, СН3О), 3.80 (дд, 12.5 и 3.5 Гц, Нс), 3.55 (дд, 12.5 и 4.3 Гц, Н0).

2. Исследования по обоснованию целесообразности создания нового гепатопротекторного лекарственного средства «Холемарин» и сиропа расторопши 2.1. Разработка нового лекарственного препарата на основе плодов расторопши пятнистой «Холемарин» Ранее в СамГМУ [Куркин В.А., 2003] разработан экстракт расторопши жидкий. С целью расширения ассортимента гепатопротекторных лекарственных средств были проведены исследования по созданию лекарственного средства «Холемарин». Состав:

Плодов расторопши пятнистой (ВФС 42-3381-99) - 200,0 г Этилового спирта 80% (ФС 42-3071-94) - достаточное количество до получения 1 л препарата.

2.1.1. Разработка способа получения гепатопротекторного лекарственного средства «Холемарин» Нами разработана оригинальная технологическая схема получения нового отечественного гепатопротекторного лекарственного средства «Холемарин». При отработке технологических параметров схемы мы исследовали влияние на

полноту извлечения биологически активных соединений из сырья следующих факторов:

1. Измельчённость сырья.

Для обсуждаемого объекта следует придерживаться общих рекомендаций по измельченности лекарственного растительного сырья "Плоды" (ГФ«Х1» ст. 49): размеры частиц должны быть не более 0,5 мм.

2. Обезжиренность сырья.

Наряду с плодами расторопши пятнистой нами были исследованы отходы производства жирного масла (шрот и жом) на предмет получения из них нового гепатопротекторного лекарственного средства «Холемарин». Выше приведёнными методами качественного и количественного определения состава готового продукта нами было показано, что препарат полученный из обезжиренного сырья в равных условиях действительно идентичен по количественному содержанию суммы флаволигнанов в пересчете на силибин препарату, полученному в тех же условиях из плодов расторопши пятнистой.

3. Выбор концентрации экстрагента.

Разработанное нами новое гепатопротекторное средство на основе плодов расторопши пятнистой представляет собой водно-спиртовое извлечение, использующееся для приёма внутрь. Для определения оптимальной концентрации этанола были проведены следующие исследования: одинаковые навески измельченных плодов (до размеров не более 0,5 мм), а также аналогичные навески обезжиренного сырья расторопши пятнистой помещали в пять пронумерованных емкостей, и заливали этиловым спиртом различной концентрации в соотношении 1:5 (60%; 70%; 80%; 90%; 96% ) и оставляли на 24 часа. В полученных извлечениях методом УФ - спектрофотометрии определяли сумму флаволигнанов в пересчёте на силибин, максимальная концентрация которого наблюдалась в извлечении, полученном на 80% этаноле, что и явилось основанием для выбора в качестве экстрагента при получении препарата. Содержание суммы флаволигнанов в полученных препаратах определяли методом УФ-спектрофотометрии. ,

4. Соотношение сырья и экстрагента.

Для вымачивания сырья и залива его экстагентом принято условно троекратное количество жидкости по отношению к массе загруженного сырья. 5. Температурный режим экстракции.

Процесс настаивания сырья с экстрагентом включает в себя этапы термической и нетермической экстракции. Параметры режима настаивания определены экспериментально. В ходе проведенных исследований были приготовлены образцы холемарина различными методами. Использовались методы мацерации, перколяции, реперколяции. Полученные образцы анализировались по разработанной методике. Все образцы извлечений соответствовали по содержанию суммы флаволигнанов предложенным выше пределам. Наибольший выход действующих веществ наблюдался при использовании метода модифицированной реперколяции, сочетающего экстракцию при комнатной температуре и при нагревании при температуре 55-60 °С.

22. Исследования по разработке «Расторопши сиропа»

Принимая во внимание ограниченный ассортимент детских гепатопротекторных лекарственных форм, нами проведены исследования по созданию «Расторопши сиропа». В качестве возможной субстанции изучен экстракт расторопши жидкий. Состав:

Экстракта расторопши жидкого (ВФС 42-3382-99) - 100,0

Сахарного сиропа (ГФ X. «Сиропы», стр. 215) - достаточное количество

до получения 1000,0 г сиропа расторопши.

2.2.1. Способ получения сиропа расторопши.

Для получения сиропа расторопши предварительно следует приготовить экстракт расторопши жидкий 1:1 (ВФС 42-3382-99) 100,0 и сахарный сироп согласно ГФ X («Сиропы», стр 215) в соотношении: сахар - вода очищенная, 64:36. В чистый простерилизованный флакон темного стекла отвешивают 900,0 сиропа и частями при перемешивании добавляют 100,0 экстракта. Флакон укупоривают и хранят в течение 1 года. Разовая доза 0,5 г. сиропа соответствует 10 каплям экстракта (терапевтическая доза).

2.3.Обоснование использования разработанных препаратов в медицинской

практике

Исследование антиоксидантного действия флаволигнанов плодов расторопши пятнистой (2,3-дегидросилибин, силибин), экстракта, сиропа и холемарина проведено на крысах, у которых под наркозом удалялась печень, и из нее готовили гомогенат в стеклянном гомогенизаторе при температуре +1°С на 0,05 М фосфатном буфере. Антиоксидантная активность дегидросилибина выявлена впервые и сопоставима с таковой силибина. Исследования экстракта, сиропа и настойки расторопши были проведены в сравнении с лекарственными средствами «Легалон» и «Карсил», аналогичными по происхождению, химическому составу и предполагаемому механизму действия новому препарату. Показателем терапевтической эффективности потенциальных гепатопротекторов является уменьшение

морфогистохимических, биохимических и функциональных нарушений при экспериментальных поражениях печени. Полученные результаты свидетельствуют, что экстракт растропши жидкий, сироп и холемарин статистически достоверно снижали перекисное окисление липидов в 2,9 раза, в то время как легалон снижал его в 1,5 раза. Все препараты — и холемарин, и легалон повышали активность супероксиддисмутазы в 5,0 и 4,0 раза, соответственно. Активность каталазы также повышалась в 4,1 раза при действии изучаемого препарата и в 4,5 раза при действии легалона.

Таким образом, сироп расторопши и холемарин являются препаратами, обладающими более выраженным антиоксидантным действием по сравнению с таковым свойством у «Легалона», особенно в плане влияния на уровень МДА.

3. Исследования по стандартизации холемарина и сиропа расторопши

В ходе предварительных исследований по проблеме комплексного использования сырья растения была показана возможность использования при получении холемарина и расторопши сиропа как необезжиренных, так и обезжиренных (шрот и жом при производстве жирного масла) плодов расторопши. При этом оценивалось содержание флаволигнанов (основных БАС растения) в сырье и в готовой продукции. На основании результатов

исследования водно-спиртовых экстрактов расторопши пятнистой нами предложены методики определения подлинности и оценки количественного содержания флаволигнанов в холемарине и сиропе с использованием ГСО силибина.

3.1. Качественный анализ разработанных препаратов на основе плодов расторопши пятнистой

При изучении показателей качества и разработке методов стандартизации новых гепатопротекторных средств «Холемарин» и «Расторопши сироп» (образцы препаратов, полученные в лабораторных условиях из плодов расторопши пятнистой, собранных в 2002 г. на промышленных плантациях совхоза "Сергиевский", Самарская обл., из шрота и жома - обезжиренного сырья) с целью унификации методов анализа сырья и готовой продукции за основу взяты подходы к стандартизации, реализованные в методиках качественного анализа и количественного определения суммы флаволигнанов в плодах данного растения.

3.1.1. Качественный анализ лекарственного средства «Холемарин»

Для качественной оценки холемарина, как и в случае плодов расторопши, предложен ТСХ-анализ. В ходе разработки методики были проведены исследования по выбору оптимальных условий хроматографирования, позволяющих эффективно разделить и однозначно идентифицировать основные компоненты препарата.

В результате проведенных опытов с различными хроматографическими системами (хлороформ - этанол, хлороформ - метанол в различных соотношениях, хлороформ - ацетон - муравьиная кислота 5:2:2, циклогексан-ацетонитрил 6:4) предпочтение было отдано системе растворителей циклогексан-ацетонитрил в соотношении 6:4, как обеспечивающей наиболее четкое разделение доминирующих БАВ лекарственной формы - флаволигнанов силибина, силидианина, силикристина. Для их идентификации были использованы в качестве свидетелей ГСО силибин и достоверно известные образцы силидианина и силикристина. В предложенных условиях достигается четкое разделение доминирующих флаволигнанов. На хроматограмме обнаружены пятна силибина, силидианина, силикристина, которые при

облучении УФ-светом (254 нм) видны в виде фиолетовых пятен с К, 0,8; 0,7; 0,6 соответственно. При обработке хроматограммы диазореактивом флаволигнаны проявляются в виде пятен желто-оранжевого цвета.

При выборе реагента для проявления хроматограмм проведены опыты со следующими реактивами: 1 % спиртовой раствор хлорида алюминия, 1 % раствор хлорида железа, свежеприготовленный раствор диазотированного сульфаниламида (ГФ СССР, XI изд.), раствор диазобензолсульфокислоты в насыщенном растворе карбоната натрия (ГФ СССР, X изд.). В результате для детекции соединений было предложено проявлять хроматограммы свежеприготовленным раствором диазобензолсульфокислоты в насыщенном растворе карбоната натрия с последующим их нагревом при температуре 110 °С в течение 5 мин в сушильном шкафу, что ускоряет протекание реакции азосочетания. При этом флаволигнаны проявляются в виде хорошо заметных желто-оранжевых пятен с ранее указанными значениями К,. В предлагаемой методике используются готовые пластинки "Силуфол УФ 254", либо пластинки «Сорбфил ПТСХ-ПА-УФ», которые предварительно активируют в сушильном шкафу не менее 1 часа при 110 °С для четкого разделения компонентов. С той же целью хроматографическую камеру насыщают парами системы растворителей не менее 24 часов.

Для качественного анализа предлагается также использовать данные УФ-спектра водно-спиртового извлечения плодов расторопши пятнистой с характерными максимумами при 289 нм.

3.1.2. Качественный анализ сиропа расторопши Для качественной оценки "Расторопши сиропа", как и в случае холемарина, предложен ТСХ-анализ. Для анализа использовали ацетоновый раствор флаволигнанов, полученный путем смешения 5 мл ацетона и 10 мл сиропа в делительной колонке, где осуществлялся переход флаволигнанов из фазы сиропа в фазу ацетона до обесцвечивания фазы сиропа.

На хроматограмме обнаруживаются пятна силибина, силидианина, силикристина и 2,3-дегидросилибина, которые при облучении УФ - светом (254 нм) обнаружены в виде фиолетовых пятен с К, 0,8; 0,7; 0,6; 0,85 соответственно.

При обработке хроматограммы диазореактивом флаволигнаны проявляются в виде пятен желто-оранжевого цвета.

Рис 3. Тонкослойная хроматография холемарина и сиропа расторопши

ХЛФ-Ме0Н-Н20 26:14:3

УФ 254нм

В 8 о

О о

О о

1 2 3

1. Холемарин 2. Сироп расторопши 3. ГС0силибин(К,0,8)

3.5. Количественное определение суммы флаволигнанов в холемарине и

расторопши сиропе 3.5.1. Количественный анализ лекарственного средства «Холемарин»

Для определения суммы флаволигнанов в холемарине использовали спектрофотометрический метод и ВЭЖХ-анализ.

Спиртовой раствор препарата имеет максимум поглощения при длине волны 289 нм, причем характер УФ-спектра (Бресок! М 40, ЕЮЫ) практически совпадает с таковым раствора ГСО силибина и, следовательно, определяется в основном флаволигнанами, имеющими флаваноноловую природу.

В предложенных методиках количественного определения использовали образец ГСО силибина, определяя оптическую плотность при длине волны 289 нм (спектрофотометрия).

УФ-спектр спиртовых растворов 1:2500 и 1:5000 холемарина и силибина

220 230 240 250 260 272 285 281 28Э 300 310 323 3

Длина волны, нм

Рис.4. УФ - спектр спиртового раствора ГСО силибина и холемарина

Результаты исследований свидетельствуют о том, что содержание суммы флаволигнанов в холемарине в пересчете на силибин находится в пределах 0,45 - 0,47% (спектрофотометрия).

Выбор в пользу силибина, как ГСО используемого в химической стандартизации сырья и препаратов расторопши диктуется лишь тем обстоятельством, что в Российской Федерации (ВИЛАР и Самарский госмедуниверситет) уже проведены исследования по созданию нормативной документации на силибин -стандартный образец (ФС 42-0072-01).

Метрологические характеристики спектрофотометрической методики количественного определения суммы флаволигнанов в препарате даны по результатам 11 определений и представлены в таблице 2.

Таблица 2

Метрологические характеристики методики

Б X 8 Р,% дх Е, %

10 0,50 0,0721 95 2,23 ± 0,0234 ±4,67

Результаты статистической обработки проведенных опытов свидетельствуют о том, что ошибка единичного определения с доверительной вероятностью 95 % составляет ± 4,67 %.

Достоверность предложенной методики определения суммы флаволигнанов в настойке расторопши подтверждена опытами с добавками ГСО силибина в препарат и в раствор А (табл. 3).

Таблица 3

Содержание суммы флаволигнанов в "Холемарине " в зависимости от добавляемого ГСО силибина

Исходное содержание суммь флаволигнанов, мг 5 мл препарата Добавлено силибина, мг Содержание суммы флаволигнанов, мг Ошибка

расчетное найденное абсолют., мг относит. %

25,0 5,6 30,6 31,42 + 0,82 + 2,68

(в препарат)

25,0 11,2 36,2 35,94 -0,26 -0,71

(в препарат)

0,62 0,6 1,22 1,17 -0,05 -4,33

(в раствор А)

0,62 0,4 1,02 1,06 + 0,04 + 4,33

(в раствор А)

При этом ошибка определения суммы флаволигнанов в холемарине находится в пределах ошибки единичного определения, что свидетельствует оВ отсутствии систематической ошибки.

Полученные данные по изучению стабильности позволяют рекомендовать нижний предел содержания флаволигнанов в извлечении 0,4%.

Изучение компонентного состава препарата проводили также методом обращенно-фазовой ВЭЖХ на хроматографе "Милихром-4" (колонка 2 х 64 мм, стационарная фаза Сепарон С-18) в изократическом режиме. В качестве подвижной фазы использовали смесь ацетонитрил-вода 3:7 с добавлением уксусной кислоты (1%). Скорость элюирования -100 мкл/мин. Детектирование веществ осуществляли УФ-детектором при пяти длинах волн одновременно (270, 290, 326, 340 и 360 нм). В качестве реперных веществ для идентификации пиков на хроматограммах исследуемых извлечений использовали индивидуальные соединения - силикристин (1), силибин (2) и силидианин (3).

Время удерживания (К1) определяли для каждого вещества в отдельности и в модельных смесях. Кроме того, индивидуальные соединения 1-3 добавляли в исследуемые водно-спиртовые извлечения.

Содержание силибина, силидианина, силикристина и их суммы в препарате (1:500) с использованием ВЭЖХ определяли в соответствии с методикой, предложенной для оценки содержания флаволигнанов в плодах расторопши (В. А. Куркин и др., 1996 г.). По данным ВЭЖХ-анализа, содержание отдельных компонентов - силибина, силидианина и силикристина - в препарате составляет 0,36%, 0,08% и 0,24% соответственно. Результаты исследований с использованием разработанных методик свидетельствуют о том, что содержание суммы флаволигнанов в холемарине в пересчете на силибин составляет в среднем 0,5 % (спектрофотометрия) и 0,4 % (ВЭЖХ).

3.5.2. Количественный анализ суммы флаволигнанов в расторопши сиропе Для определения суммы флаволигнанов в "Расторопши сиропе" использовали спектрофотометрический метод и ВЭЖХ аналогично анализу холемарина. Для этого применяли ацетоновый раствор флаволигнанов сиропа расторопши: совмещали 25 мл ацетона и 50,0 г сиропа в делительной колонке, где осуществлялся переход флаволигнанов из фазы сиропа в фазу ацетона до обесцвечивания фазы сиропа.

Спиртовой раствор ацетонового раствора флаволигнанов сиропа расторопши имеет максимум поглощения при длине волны 289 нм, причем характер УФ-спектра (8ресоп1 М 40, ЕЮЫ) практически совпадает с таковым раствора ГСО силибина и, следовательно, определяется в основном флаволигнанами, имеющими флаваноноловую природу.

В предложенных методиках количественного определения использовали образец ГСО силибина, определяя оптическую плотность при длине волны 289 нм (спектрофотометрия). Результаты статистической обработки проведенных опытов свидетельствуют о том, что ошибка единичного определения с доверительной вероятностью 95 % составляет ±4,88%. Достоверность предложенной методики определения суммы флаволигнанов в сиропе расторопши подтверждена опытами с добавками ГСО силибина в ацетоновый раствор флаволигнанов препарата и в раствор А. При этом ошибка определения суммы флаволигнанов в сиропе расторопши находится в пределах ошибки единичного определения, что свидетельствует об отсутствии систематической

ошибки. Результаты исследований с использованием разработанных методик свидетельствуют о том, что содержание суммы флаволигнанов в сиропе расторопши в пересчете на силибин составляет в среднем 0,22 % (спектрофотометрия).

Содержание суммы флаволигнанов в пересчете на силибин в препарате должно быть не менее 0,2 %.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. В результате сравнительного изучения химического состава плодов, шрота, жома расторопши пятнистой [Silybum marianum ( Е.) Оаейп.] выделены и идентифицированы с помощью УФ, 1Н-ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии, а также различных химических превращений флаволигнаны силибин, силидианин, силикристин.

2. Из плодов и обезжиренного сырья расторопши пятнистой, культивируемой в Российской Федерации и странах СНГ, впервые выделен 2,3-дегидросилибин.

3. Определены оптимальные условия выделения 2,3-дегидросилибина из плодов и обезжиренного сырья расторопши пятнистой, культивируемой в Самарской обл.: использование в способе выделения 80% этилового спирта позволяют исчерпывающе извлекать целевое вещество, а предложенный способ дает увеличение выхода целевого продукта в 9-10 раз из плодов расторопши пятнистой по сравнению с прототипом.

4. Разработаны методики качественного ТСХ-анализа лекарственных средств «Холемарин» и «Расторопши сироп», основанные на обнаружении доминирующего флаволигнана растения - силибина (ГСО) и использовании данных УФ-спектра с характерным максимумом при 289 нм±2нм.

5. Разработаны методики количественного определения суммы флаволигнанов в новых гепатопротекторных лекарственных средствах «Холемарин» и «Расторопши сироп» с использованием прямой спектрофотометрии при аналитической длине волны 289 нм. Ошибка единичного определения содержания суммы флаволигнанов в холемарине с помощью разработанных методик с доверительной вероятностью 95% составляет ±4,67, в сиропе - ±4.88%.

6. Определены числовые показатели препарата «Холемарин»: содержание суммы флаволигнанов, сухой остаток, концентрация спирта, а также установлен срок годности. В качестве нижнего предела содержания суммы флаволигнанов в холемарине рекомендован показатель 0.4%.

7. Определены числовые показатели расторопши сиропа: содержание суммы флаволигнанов, концентрация спирта, установлен срок годности. В качестве нижнего предела содержания суммы флаволигнанов в сиропе рекомендован показатель 0,2%.

8. На основании полученных данных разработан проекты ФСП «Холемарин» и «Расторопши сироп».

9. Установлено, что 2,3-дегидросилибин обладает выраженными антиоксидантными свойствами, в 1,4 раза превосходящими таковой эффект силибина.

10. Научно обоснована целесообразность использования в медицинской практике новых гепатопротекторных лекарственных средств «Холемарин» и «Расторопши сироп».

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Куркин, В.А., Профилактика силибохолом нарушения антиоксидантных систем печени при токсическом поражении четыреххлористым углеродом /В.А. Куркин, А.А. Лебедев, Е.А. Батаков, Г.Г. Запесочная, Е.В. Авдеева, А.В. Волоцуева //Растительные ресурсы.-2001.- Т. 37, вып. 3.- С. 23-27.

2. Куркин, В.А. Антиоксидантные свойства комплексного гепатопротекторного лекарственного препарата силибохол / В.А. Куркин, А.А. Лебедев, Е.А. Батаков, ГГ. Запесочная, Е.В. Авдеева, Г.В. Симонова, А.В. Волоцуева // Растительные ресурсы.-2001.-Т.37, вып. 2. - С. 69-73.

3. Куркин, В.А. Теоретические и практические предпосылки создания комбинированных препаратов на основе плодов расторопши пятнистой / В.А. Куркин, А.А. Лебедев, Г.Г. Запесочная, Е.В. Авдеева, А.А. Суздалъцев, А.В. Волоцуева, Л.Л. Попова//Растительные ресурсы. - 2000.- Т.36, вып.1. - С. 27-29.

4. Куркин, В.А. Флаволигнаны плодов Silybum marianum I В.А. Куркин, А.А. Лебедев, Г.Г. Запесочная, А.В. Волоцуева, К.С. Пименов II Химия природных соединений. - 2001,- № 5.- С.56-60.

5. Куркин, В. А. Высокоэффективная жидкостная хроматография в анализе флаволигнанов плодов расторопши пятнистой / В.А. Куркин, Е.В. Авдеева, Р.А.

Минахметов, Л.А. Онучак, А.В. Волоцуева, Н.В. Масленникова II Материалы VIII Всероссийского симпозиума по молекулярной жидкостной хроматографии и капиллярному электрофорезу: [Тез. докл.]. - М., 2001. - С. 59.

6. Куркин, В.А. Нейротропные свойства некоторых фитопрепаратов, содержащих фенилпропаноиды / В.А. Куркин, А.В. Дубищев, И.Н. Титова, А.В. Волоцуева, Е.С. Петрова, Н.В. Жесткова, И.Ю. Климова II Растительные ресурсы. - 2003.- Т. 39, вып.З. - С. 115-120.

7. Куркин, В.А. Антиоксидантные свойства флаволигнанов плодов Silybum marianum ( L. ) Gaertn. / В.А. Куркин, А.А. Лебедев, Г.Г. Запесочная, А.В. Волоцуева, Е.А. Лебедева, М.В. Булатова II Растительные ресурсы.-2003.- Т. 39, вып. 1.- С. 89-93.

8. Куркин, В. А. Новые фитопрепараты на основе флавоноидов и фенилпропаноидов / В.А. Куркин, Г.Г. Запесочная, Е.В. Авдеева, А. А. Лебедев, СВ. Первушкин, В.Н. Ежков, Г.В. Симонова, А.В. Куркина, З.В. Болтабекова, А.В. Волоцуева // Человек и лекарство: Тез. докл. VIII Российского национального конгресса 19-23 апр. 2001 г. - М.: «Фармединфо», 2001. - С.583.

9. Пат. 2209063. Способ получения вещества, обладающего антиоксидантным действием / В.А. Куркин, А.А. Лебедев, Г.Г. Запесочная и др.; СамГМУ. - А 61 К 31/357, 35/78, А 61 Р 39/06; Заявл. 08.02.2002; Опубл. 27.07.2003; Приор. 08.02.2002 (Россия). - 6 с. - В сведениях перед текстом также: Е.В. Авдеева, Е.А. Батаков, А.В. Волоцуева, Е.А. Лебедева, П.А. Лебедев, М.В. Булатова

10. Волоцуева, А.В. Фармакогностические аспекты исследования плодов расторопши пятнистой / А.В. Волоцуева II Материалы II Международной конференции молодых ученых: [Тез. докл.]. - Курск, 2001.- С. 48.

11. Волоцуева, А.В. Аналитические аспекты исследования сырья и препаратов плодов расторопши пятнистой / А.В. Волоцуева //Аспирантские чтения -2000: Тез. докл. - Самара, 2000. - С.25.

12. Волоцуева, А.В. Фармакогностическое исследование по созданию гепатопротекторных лекарственных средств на основе плодов расторопши пятнистой, культивируемой в Самарской области / А.В. Волоцуева II Актуальные

проблемы современной науки: Тез. докл. II Международная конференция студентов и молодых. - Самара, 2001. - С. 34.

13. Волоцуева, А.В. Фитохимическое исследование плодов расторопши пятнистой / А.В. Волоцуева //Аспирантские чтения - 2001: Тез. докл.- Самара, 2001. - С. 49.

14. Волоцуева, А.В., Фармакоэкономические и фитохимические аспекты исследования по созданию новых лекарственных средств на основе плодов расторопши пятнистой / А.В. Волоцуева II Актуальные проблемы современной науки: Тез. докл. I международной конференции молодых ученых и студентов . -Курск, 2000. - С. 45.

15. Волоцуева, А.В. Фармакогностическое исследование компонентного состава плодов расторопши пятнистой / А.В. Волоцуева, В.А. Куркин II Материалы I международной конференции молодых ученых и студентов: [Тез. докл.]. - Томск, 1999. - С. 34.

16 Волоцуева, А.В Фитохимическое исследование плодов растроропши пятнистой, культивируемой в Самарской области / А.В. Волоцуева, В.А. Куркин, II Науки о человеке: Тез. докл. Ш Международного конгресса молодых ученых. - Томск, 2002. - С. 28.

17. Волоцуева, А.В. Фитохимическое исследование плодов растроропши пятнистой, культивируемой в Самарской области / А.В. Волоцуева // Аспирантские чтения - 2002: Тез. докл. - Самара, 2002. - С. 33.

18. Волоцуева, А.В. Фармакогностическое исследование по созданию лекарственных средств гепатопротекторного действия на основе плодов расторопши пятнистой, культивируемой в Самарской области / А.В. Волоцуева //Аспирантские чтения - 2003: Тез. докл. - Самара, 2003. - С. 33.

19. Куркин, В.А. Нейротропная активность фитопрепаратов, содержащих фенилпропаноиды / В.А. Куркин, А.В. Дубищев, И.Н. Титова, А.В. Волоцуева, З.В. Болтабекова, КС. Петрова, И.Ю. Климова, Н.В. Жесткова II Фармация. - 2003.-№6.-С. 30-31.

Подписано в печать 29.09.2004 г. Формат 60x84/16. Бумага офсетная. Печать оперативная. Объем 1,63 усл. печ. л. Тираж 100 экз. Заказ 565.

Отпечатано в типографии ООО «ОФОРТ» 443068, г. Самара, ул. Межевая, 7. Лицензия ПД 7-0050 от 30.08.2000 г. Тел. 35-37-01,35-37-45,79-08-22.

#20213

РНБ Русский фонд

2005-4 20967

Актуальность темы: В настоящее время плоды расторопши пятнистой \Silybum тапапит (Ь.) ОаеЛп., сем. А&^егасеае - Астровых] широко применяют в России и за рубежом для производства таких ценных гепатопротекторных препаратов, как Силимар,' Карсил, Легалон, Силибор и другие. Уникальность данных препаратов заключается в том, что их гепатозащитные свойства обусловлены новой группой биологически активных соединений (БАС) флаволигнанами, в частности, силибином, силидианином и силикристином. Механизм действия указанных БАС включает в себя снижение перекисного окисления фосфолипидов в ткани печени и повышение активности таких антиоксидантных ферментов, как каталаза и супероксиддисмутаза, а также стимуляцию регенерации клеток печени.

При этом важно подчеркнуть, что гепатопротекторы ■ на основе плодов расторопши пятнистой используются не только для лечения патологии печени, но и в качестве вспомогательной терапии многих инфекционных поражений (хронический бронхит, хламидиоз, токсоплазмоз и.т.д.), а также для профилактики различных заболеваний, возникших в результате воздействия на организм неблагоприятных факторов окружающей среды. Однако отсутствие на сегодняшний день достаточного ассортимента отечественных аналогов и дороговизна импортных препаратов не позволяют удовлетворять острую потребность населения в данной группе лекарственных средств. > Огромные возможности для создания современных гепатопротекторов на основе флаволигнанов расторопши пятнистой имеются в Самарской области, где находится мощная сырьевая база растения.

Таким образом, разработка отечественных, эффективных, безопасных, доступных по цене гепатопротекторных фитопрепаратов, применимых и в педиатрической практике, представляется актуальной и перспективной как в научном, так и в практическом отношении.

Цель и задачи исследования: Целью настоящей работы является изучение фармакогностических и аналитических аспектов создания лекарственных средств на основе плодов расторопши пятнистой. Для достижения этой цели решались следующие задачи:

1. Сравнительное изучение химического состава плодов, шрота,

Л ' ' жома растропши пятнистой, культивируемой в Самарской области.

2. Обоснование способа получения нового гепатопротекторного лекарственного средства «Холемарин».

3. Разработка методик качественного и количественного анализа нового гепатопротекторного лекарственного средства «Холемарин».

4. Разработка методик качественного и количественного анализа гепатопротекторного лекарственного средства «Расторопши сироп».

5. Разработка числовых показателей новых гепатопротекторных лекарственных средств «Холемарин» и «Расторопши сироп».

6. Разработка проектов нормативной документации ФСП «Холемарин» и ФСП «Расторопши сироп».

Научная новизна:

В результате изучения химического состава плодов расторопши пятнистой, культивируемой в Самарской области, выделены и идентифицированы силибин, силидианин, силикристин, а также впервые получено и охарактеризовано индивидуальное вещество флаволигнан (один из основных биологически активных соединений) 2,3-дегидросилибин. Выявлено, что 2,3-дегидросилибин обладает выраженным антиоксидантным действием, что позволяет относить данный флаволигнан к основным биологически активным соединениям плодов расторопши пятнистой. Для установления структуры и определения физико-химических свойств дегидросилибина использованы УФ-спектрометрия, 'Н-ЯМР-спектроскопия и масс-спектрометрия, а также различные химические превращения. На основе принципа унификации разработаны унифицированные методики качественного и количественного анализа препаратов «Холемарин», «Расторопши сироп» с использованием тонкослойной хроматографии и прямой спектрофотометрии и Государственнного стандартного образца (ГСО) силибина. Научно обоснована целесообразность использования шрота плодов (после экстракции хладоном-12) для получения гепатопротекторных препаратов. Проведено сравнительное фитохимическое исследование плодов, шрота и жома плодов, экстракта, холемарина и сиропа расторопши.

Практическая значимость:

1. Обоснована технология получения экстракта расторопши жидкого и лекарственного средства «Холемарин» (достигается максимальное извлечение основных БАС плодов расторопши пятнистой из нативных плодов и обезжиренного сырья) и методы качественного и количественного анализа, позволяющие определять содержание суммы флаволигнанов в сырье и препаратах.

2. Получен Патент на изобретение № 2209063 «Способ получения вещества, обладающего антиоксидантным действием» по заявке № 2002103533 от 08.02.2002.

3. Разработаны методики качественного и количественного анализа препаратов «Холемарин» и «Расторопши сироп» с использованием ТСХ-анализа и прямой спектрофотометрии.

4. Определены числовые показатели препаратов «Холемарин», «Расторопши сироп»: содержание суммы флаволигнанов, сухой остаток, концентрация спирта, а также установлен срок годности.'

5. Обоснована целесообразность применения разработанных препаратов на основе плодов растропши пятнистой «Холемарин» и «Расторопши сироп» в медицинской практике в качестве гепатопротекторных лекарственных средств.

6. Результаты исследований используются в практическом здравоохранении, научных изысканиях и в учебном процессе на кафедре фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии Самарского государственного медицинского университета (акты внедрения от 10.03.2004 г.). " Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 научных работ, в том числе 1 патент РФ на изобретение.

Апробация работы. Материалы работы доложены и обсуждены на VII, VIII и IX Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 2000-2002 гг.); на II Международной научной конференции «Биологическое разнообразие. Интродукция растений» (С.Пб, 1999 г.); на Международной научной конференции «Поиск, разработка и внедрение новых лекарственных средств и организационных форм фармацевтической деятельности»,-(Томск, 2000 г.); на VI и VII Всероссийском конгрессе «Экология и здоровье человека» (Самара, 2001, 2002 гг.); на научной конференции «Достижения, проблемы, перспективы фармацевтической науки и практики», посвященной 35-летию фармацевтического факультета Курского государственного медицинского университета (Курск, 200 1г.); на юбилейной IX научно-практической конференции «Актуальные вопросы диагностик, лечения и реабилитации больных» Пензенского института усовершенствования врачей МЗ РФ с участием регионов

России (Пенза, 2002 г.); на XXI Международной конференции по полифенолам (Марокко, 2002 г.).

Связь задач исследования с проблемным . планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ Самарского государственного медицинского университета (№ Государственной регистрации 01200105332) и Республиканских программ:

1. «Совершенствование лекарственного обеспечения населения и лечебно-профилактических учреждений в рыночных условиях» по теме: «Создание лекарственных средств природного происхождения антимикробного, адаптогенного и гепатопротекторного действия» (№ Государственной регистрации 01990005277).

2. «Разработка методик качественного и количественного анализа сырья и препаратов лекарственных растений, содержащих фенилпропаноиды и флавоноиды» (№ государственной регистрации 01990007536).

Положения, выдвигаемые на защиту:

1. Результаты сравнительного изучения химического состава плодов и обезжиренного сырья (жома и шрота) расторопши пятнистой.

2. Методики качественного и количественного анализа нового гепатопротекторного лекарственного средства «Холемарин».

3. Методики качественного и количественного . анализа лекарственного средства «Расторопши сироп».

4. Результаты определения показателей качества препаратов. Объем и структура работы:

Диссертационная работа изложена на 140 страницах машинописного текста, содержит 16 таблиц, 7 рисунков. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, описания объектов и

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. В результате сравнительного изучения химического состава плодов, шрота, жома (обезжиренного сырья) расторопши пятнистой \Silybum таНапит ( Ь.) ОаегШ.] выделены и идентифицированы с помощью УФ-, 'Н-ЯМР-спектроскопии . и масс-спектрометрии, а также различных химических превращений флаволигнаны силибин, силидианин, силикристин.

2. Из плодов и обезжиренного сырья расторопши пятнистой, культивируемой в Российской Федерации и странах СНГ, впервые выделен 2,3-дегидросилибин.

3. Определены оптимальные условия выделения 2,3-дегидросилибина из плодов и обезжиренного сырья расторопши пятнистой, культивируемой в Самарской обл.: использование в способе выделения 80% этилового спирта ' позволяют исчерпывающе извлекать целевое вещество,а предложенный способ дает увеличение выхода целевого продукта в 9-10 раз из плодов расторопши пятнистой по сравнению с прототипом.

4. Разработаны методики качественного ТСХ-анализа лекарственных средств «Холемарин» и «Расторопши сироп», основанные на обнаружении доминирующего флаволигнана растения - силибина (ГСО) и использовании данных УФ-спектра с характерным максимумом при 289 нм+2нм.

5. Разработаны методики количественного определения суммы флаволигнанов в новых гепатопротекторных лекарственных средствах «Холемарин» и «Расторопши сироп» с использованием прямой спектрофотометрии при аналитической длине волны 289 нм. Ошибка единичного определения содержания суммы флаволигнанов в холемарине с помощью разработанных методик с Д9верительной вероятностью 95% составляет +4,67, в сиропе - +4.88% соответственно.

6. Определены числовые показатели препарата «Холемарин»: содержание суммы флаволигнанов, сухой остаток, концентрация спирта, а также установлен срок годности. В качестве нижнего предела содержания суммы флаволигнанов в холемарине рекомендован показатель 0,4%.

7. Определены числовые показатели расторопши сиропа: содержание суммы флаволигнанов, концентрация спирта, установлен срок годности. В качестве нижнего предела содержания суммы флаволигнанов в сиропе рекомендован показатель 0,2%.

8. На основании полученных данных разработан проекты ФСП «Холемарин» и «Расторгший сироп».

9. Установлено, что 2,3-дегидросилибин обладает выраженными антиоксидантными свойствами, в 1,4 раза превосходящими таковой эффект силибина.

10.Научно обоснована целесообразность использования в медицинской практике новых гепатопротекгорных лекарственных средств «Холемарин» и «Расторопши сироп».