Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Фармакологические пути снижения пересыщения мочи в коррекции экспериментального оксалатного нефролитиаза

На правах рукописи

005049350 А^Т^7

-----

КУДИНОВ АЛЕКСЕЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ ПУТИ СНИЖЕНИЯ ПЕРЕСЫЩЕНИЯ МОЧИ В КОРРЕКЦИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ОКСАЛАТНОГО НЕФРОЛИТИАЗА

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

7 ФЕВ 2013

Томск-2013

005049350

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Алтайский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Брюханов Валерий Михайлович

Официальные оппоненты:

Поветьева Татьяна Николаевна, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт фармакологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, лаборатория фитофармакологии, ведущий научный сотрудник

Новожеева Татьяна Петровна, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт психического здоровья» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, лаборатория нейробиологии, старший научный сотрудник

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Новосибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится «_» _ 2013 г. в _ часов на

заседании диссертационного совета Д 001.031.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт фармакологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (634028, г. Томск, пр. Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт фармакологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Автореферат разослан «_»_2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук

Амосова Евдокия Наумовна

Актуальность темы: Мочекаменная болезнь (МКБ) - одно из наиболее частых урологических заболеваний и встречается у 10 - 15% населения, причем наиболее часто это мужчины в трудоспособном возрасте - 20-50 лет. Больные уролитиазом составляют 30-40% всего контингента урологических стационаров [Тиктинский О.Л., 2000; Сое F.L., 2005; Daudon М., 2005].

В настоящее время в развитых странах мира из 10 млн. человек 400 тыс. страдают мочекаменной болезнью. Ежегодно регистрируется 85 тыс. заболеваний мочекаменной болезнью, при этом 62 тыс. из них - рецидивные камни. При этом абсолютное число зарегистрированных больных мочекаменной болезнью в мире ежегодно увеличивается. Так в РФ в период с 2002 по 2009 гг. количество случаев увеличилось на 17,3%: с 629 453 до 738 130 [Аполихин О.И., Сивков A.B., 2011]. Максимальный показатель частоты встречаемости мочекаменной болезни на 100 000 населения в 2009 г. отмечался в Дальневосточном федеральном округе (564,6), а минимальный в СевероКавказском федеральном округе (395,6). По регионам наиболее высокие показатели частоты встречаемости мочекаменной болезни на 100 000 населения были отмечены в Алтайском крае (1261,9) и в Ненецком автономном округе (1001,8), а минимальный уровень в Еврейской автономной области (212,0). Основной клинической формой МКБ является оксалатный нефролитиаз, так как от 50% до 80% почечных камней в качестве главного структурного компонента содержат оксалат кальция [Вощула В.И., 2006].

Страдающие нефролитиазом нуждаются в применении высокотехнологичных методов обследования и лечения как малоинвазивных, так и хирургических. Создание метода дистанционной, или экстракорпоральной нефро- и уретеролитотрипсии намного сократило число оперативных вмешательств по поводу камней почек и мочеточников. К сожалению, больше половины регистрируемых сегодня камней являются рецидивирующими. При этом по данным статистики процент рецидивов резко возрастает с течением времени после удаления камня. Так уже через 1 год после удаления камня число случаев рецидивов составляет - 10% от всего числа обращений, через 5 лет - 35%, через - 10 лет - 50% [Кадыров З.А, 2006; Тиктинский О.Л., 2000; Heilberg I.P., 2006; Hess В., 2003; Reynolds Т.М., 2005]. Таким образом, удаление камня в большинстве случаев не приводит к полному решению проблемы, так как оно не устраняет причин его образования. В то же время, предотвращение процесса литогенеза должно позволить снизить количество клинических случаев камней и их рецидивов. В настоящее время существует несколько теорий камнеобразования [Кадыров З.А., 2006; Тиктинский O.JL, 2000]. При этом основополагающим моментом во всех случаях является пересыщение мочи литогенными ионами. В случае оксалатного нефролитиаза основными ионами-камнеобразователями являются оксалат-ионы, фосфат-ионы и ионы кальция. Кроме этого, процессу литогенеза также способствуют условия среды: изменение уровня pH и снижение защитных коллоидов. К сожалению, сегодня возможности фармакологической коррекции оксалатного нефролитиаза весьма ограничены: недостаточная изученность причин и механизмов развития нефролитиаза препятствуют поиску новых медикаментозных подходов в

лечении этого заболевания, что пока определяет инструментальные методы решения данной проблемы как основные [Кадыров З.А., 2006; Тиктинский

0.Л., 2000].

Все выше сказанное определяет высокую актуальность поиска эффективных, фармакологических средств, снижающих пересыщение мочи отмеченными ионами. В связи с этим возникает необходимость более детального изучения показателей состояния мочи в условиях оксалатного нефролитиаза и их роли в патогенезе данной нозологии, для последующей оценки эффективности применения средств снижающих пересыщение мочи. Это позволит в дальнейшем расширить возможности подходов к лечению данного заболевания неинвазивными методами.

Цель исследования: Разработать и изучить пути снижения пересыщения мочи оксалат-ионами, фосфат-ионами и ионами кальция при оксалатном нефролитиазе у крыс.

Основные задачи исследования:

1. Провести сравнительную оценку роли концентрации и экскреции литогенных ионов в прогнозе пересыщения мочи при оксалатном нефролитиазе в эксперименте.

2. Изучить влияние фармакологических средств, ослабляющих пересыщение мочи ионами кальция в эксперименте.

3. Изучить влияние фармакологических средств, ослабляющих пересыщение мочи фосфат-ионами в эксперименте.

4. Изучить влияние фармакологических средств, ослабляющих пересыщение мочи оксалат-ионами в эксперименте.

5. Разработать комплексный подход снижения пресыщения мочи литогенными ионами при оксалатном нефролитиазе в эксперименте.

Научная новизна работы: Впервые проведена оценка показателей концентрации и экскреции оксалат-ионов, фосфат-ионов и ионов кальция в прогнозе пересыщения мочи при экспериментальном оксалатном нефролитиазе. Установлен приоритет использования показателя концентрации, а не экскреции ионов при описании характера пересыщения мочи. Предложены методы снижения пересыщения мочи литогенными ионами при оксалатном нефролитиазе при помощи различных фармакологических средств. Установлено, что на пересыщение мочи ионами кальция оказывают влияние натрия цитрат и натрия фитат, фосфат-ионами - натрия пирофосфат, оксалат-ионами - натрия сульфит и цинка аспарагинат. Исследована возможность предложенной комбинации натрия цитрата, натрия пирофосфата и натрия сульфита влиять на течение заболевания.

Научная и практическая значимость: Проведена сравнительная оценка роли показателей концентрации и экскреции литогенных ионов в прогнозе пересыщения мочи при оксалатном нефролитиазе. Установлено, что не всегда изменения экскреции ионов-камнеобразователей с мочой определяют характер литогенных процессов в тканях почек. В большей степени это зависит от концентрации рассматриваемых ионов.

Изучено влияние средств, снижающих пересыщение мочи, на пересыщение мочи при оксалатном нефролитиазе. В ходе применения изучаемых средств фиксировалось снижение содержания в моче ионов-камнеобразователей и изменение в некоторых случаях рН среды. При этом было показано, что на пересыщение мочи ионами кальция могут оказывать свое влияние натрия фитат и натрия цитрат; на пересыщение фосфат-ионами -натрия пирофосфат; на пересыщение оксалат-ионами - натрия сульфит и цинка аспарагинат. По результатам морфометрии срезов почек, окрашенных по Коссу, было зафиксировано снижение количества и размеров кальциевых депозитов во всех случаях применения средств снижающих пересыщение, за исключением цинка аспарагината, использование которого привело к уменьшению размеров кальциевых депозитов с одновременным увеличением их количества в поле зрения.

Комбинация натрия цитрата, натрия пирофосфата и натрия сульфита позволяет обеспечить снижение концентрации всех трех рассматриваемых нами ионов-камнеобразователей и в большей степени добиться уменьшения размеров кальциевых депозитов и их количества в поле зрения.

Результаты проведенных экспериментов открывают новые возможности для дальнейших исследований в данном направлении с целью создания новых подходов в лечении оксалатного нефролитиаза.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. В качестве оценки развития оксалатного нефролитиаза целесообразно использовать показатель концентрации ионов-камнеобразователей, а не их экскрецию.

2. Длительное применение средств, ослабляющих пересыщение мочи ионами кальция облегчает протекание оксалатного нефролитиаза.

3. Длительное применение средств, ослабляющих пересыщение мочи фосфат-ионами облегчает протекание оксалатного нефролитиаза.

4. Длительное применение средств, ослабляющих пересыщение мочи оксалат-ионами облегчает протекание оксалатного нефролитиаза.

5. Использование комбинации ингибиторов, каждый из которых по отдельности оказывал положительный эффект на состояние концентрации определенного иона, привело к снижению пересыщения мочи по всем изучаемым ионам, что одновременно сопровождалось подщелачиванием мочи. Результатом этого стало значительное снижение количества и размеров кальциевых депозитов по сравнению с группой контроля.

Апробация материалов диссертации: Материалы диссертации доложены и обсуждены на Х1-ой городской научно-практической конференции молодых ученых «Молодежь - Барнаулу» (г. Барнаул, 2009), на научно-практической конференции посвященной 35-летию фармацевтического факультета АГМУ (г. Барнаул, 2010), на ХИ-ой городской научно-практической конференции молодых ученых «Молодежь - Барнаулу» (г. Барнаул, 2010), на I-ой Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Сибирский медико-биологический конгресс» (г. Барнаул, 2011), на П-ой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием

«Современные проблемы фармакологии и фармации» (г. Новосибирск, 2011).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 16 работ, из них 5 - в журналах, включенных в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий.

Объем и структура диссертации: Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста, иллюстрирована 27 рисунками, 20 таблицами, состоит из введения, обзора литературы, 2 глав собственных исследований, обсуждения результатов, общих выводов, списка цитируемой литературы, в котором приведено 136 источников, из них 109 - иностранных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проведены на 152 сертифицированных крысах обоего пола линии Wistar массой 200-250 г., полученных из вивария Института цитологии и генетики СО РАН (г. Новосибирск), с соблюдением положений Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в научных целях (Страсбург, 2 января 1991 г). Животные находились в индивидуальных клетках, приспособленных для сбора мочи, в стандартных условиях содержания на естественном световом режиме, при свободном доступе к воде и пище. Кормление животных осуществляли в одно и то же время дважды в день. В качестве питья использовали бидистиллированную воду с добавлением ионов в соответствии с санитарно-эпидемиологическими правилами (СанПиН 2.1.4.1116-02). Это было сделано для того, чтобы исключить влияние колебаний ионного состава водопроводной воды на ход эксперимента.

После того, как крысы помещались в клетку, им предоставлялось 5-7 дней на адаптацию. В последующем проводили серию контрольных определений для установления исходных значений функциональных параметров почек у крыс. Когда показатели функции почек стабилизировались, переходили непосредственно к моделированию оксалатного нефролитиаза.

Оксалатный нефролитиаз у крыс инициировали по общепринятой этиленгликолевой методике [Green M.L., 2005; Khan S.R., 1997; Kumar S., 1991; Yamaguchi S., 2005].

Для проведения исследования, направленного на изучение фармакологических путей снижения пересыщения мочи при экспериментальном оксалатном нефролитиазе, была избрана следующая экспериментальная схема:

Оценка роли пересыщения мочи в развитии нефррлитизаа

питья

Ограничение питья

Фармакологическая коррекция пересыщения

Первая серия экспериментов была посвящена роли пересыщения мочи в развитии оксалатного нефролитиаза, в ходе которой также была проведена сравнительная оценка значения концентрации и экскреции литогенных ионов в прогнозе пересыщения мочи при данной патологии. Для этого животные были разделены на 3 группы. Крысы 1-й группы (группа сравнения, контрольная группа) на протяжении 3-х недель получали в виде питья 1%-ный раствор этиленгликоля (ЭГ) в свободном доступе. В этой группе ежедневно проводили измерение количества потребляемой животными жидкости. В результате были получены данные, позволившие определить средний объем выпиваемой за сутки жидкости, который составил около 18 мл. Крысы второй группы находились в условиях ограниченного потребления жидкости, ежедневно получая при этом по 12 мл 1,4%-ного раствора ЭГ в сутки в течение 21 дня, т.е. объем потребляемой жидкости для них был уменьшен на 30% с сохранением дозы ЭГ. Животные третьей группы находились в условиях увеличенного на 30% относительно группы сравнения потребления жидкости, получая по 24 мл 0,75%-ного раствора ЭГ (водная экспансия). Учитывая, что добиться добровольного питья животными увеличенного объема жидкости не представляется возможным, введение питьевого раствора осуществляли дробно по 8 мл 3 раза в сутки внутрижелудочно. При этом свободный доступ к питьевому раствору исключался.

Как было отмечено ранее, оксалатный нефролитиаз неразрывно связан с пересыщением мочи ионами-камнеобразователями. Поэтому, в следующей

части экспериментов, нами была проверена возможность фармакологической коррекции пересыщения мочи ионами кальция, фосфат-ионами и оксалат-ионами. У животных первой (контрольной) группы вызывали экспериментальный нефролитиаз по описанной выше методике, с той лишь разницей, что длился он 6 недель. Это впоследствии позволило нам провести сравнения показателей контрольной группы с показателями крыс подопытных групп. У животных подопытных групп на фоне развития нефролитиаза, проводили его коррекцию. Введение фармакологических средств осуществлялось ежедневно, начиная с 4-й недели опыта, на протяжении последующих 3-х недель.

В качестве фармакологических средств нами были использованы следующие вещества:

1. Натрия цитрат - фармакопейное лекарственное средство (статья 429 ГФ X Вып.). Являясь анионом лимонной кислоты, натрия цитрат способен связывать ионы кальция. В то же время, будучи солью слабой кислоты и сильного основания, натрия цитрат способен при гидролизе защелачивать мочу, и повышать растворимость оксалатных солей кальция. Субстанция натрия цитрата (ЗАО "Купавнареактив", Россия) вводилась подопытным крысам внутрижелудочно в дозе 200 мг/кг.

2. Натрия фитат - хелатный компонент природного происхождения. Широко используется в производстве косметики, и в качестве хелатообразующего агента в некоторых лекарственных средствах. Натрия фитат является полидентатным лигандом, способным хелатировать катионы Са2+, путем образования нескольких координационных связей. Субстанция натрия фитата (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Италия) в виде 1%-ного раствора в 1% растворе ЭГ предоставлялся крысам в качестве питья в свободном доступе.

3. Натрия пирофосфат - натриевая соль пирофосфорной кислоты. По существующим литературным данным натрия пирофосфат обладает возможностью препятствовать кристаллизации солей фосфата кальция. Эта способность реализуется через связывание с фосфатными группами, препятствуя формированию конкремента. Субстанция натрия пирофосфата (Panreac Química S.L.U., Испания) вводилась подопытным крысам внутрижелудочно в дозе 2000 мг/кг.

4. Цинка аспарагинат. Цинк - 2-х валентный металл, который в силу схожести своего атомного строения с Са2+ (это бинарные электролиты одного типа), имеет сродство к связыванию с оксалат ионами. Конкурентное связывание цинка с оксалат-ионами, должно позволить снизить пересыщение мочи этим анионом. Цинка аспарагинат, в отличие от неорганических солей цинка, не обладает раздражающим действием на слизистые и имеет более высокую биодоступность. Субстанция цинка аспарагината (ОАО «ГосНИИ «Кристалл», Россия) вводилась подопытным крысам внутрижелудочно в дозе 10 мг/кг.

5. Натрия сульфит. Из литературных данных известно, что образование эндогенного аниона щавелевой кислоты происходит в печени и катализируется

двумя ферментами: лактатдегидрогеназой и пероксидазой [Baker P. R., 2004; Sakhaee К., 2009]. По имеющимся сведениям натрия сульфит может снижать образование оксалат-ионов в гепатоцитах, ингибируя лакгатдегидрогеназу [Sharma 1993]. В связи с этим возникло предположение, что применение натрия сульфита позволит снизить пересыщение мочи оксалат-ионами через снижение их образования в печени. Субстанцию натрия сульфита (ЗАО "Купавнареактив", Россия) вводили подопытным крысам внутрижелудочно в дозе 150 мг/кг.

6. Комбинации фармакологических средств. В результате проведенных экспериментов были получены данные, свидетельствующие о положительных эффектах применяемых веществ на течение экспериментального нефролитиаза. При этом в отдельных случаях это влияние было связано с отдельными звеньями нефролитиаза: влияние на концентрацию оксалат-ионов, фосфат-ионов, ионов кальция, а в отдельных случаях и на рН мочи. Таким образом, появилась идея скомбинировать изучаемые вещества и изучить влияние смеси на пересыщение мочи при экспериментальном оксалатном нефролитиазе. Для этого мы выбрали три вещества на основе следующих критериев: 1) вещества должны влиять на разные звенья нефролитиаза; 2) должны обладать физико-химической совместимостью; 3) быть эффективными при раздельном применении. Этими веществами стали натрия цитрат, натрия сульфит и натрия пирофосфат. Смесь субстанций натрия цитрата, натрия пирофосфата и натрия сульфита вводилась подопытным крысам внутрижелудочно в виде взвеси в 2%-ной крахмальной слизи. Дозы веществ в комбинации были уменьшены в 3 раза по сравнению с их раздельным применением (для исключения возможного дозозависимого эффекта) соответственно до 67 мг/кг, 667 мг/кг и 50 мг/кг.

В ходе каждого эксперимента один раз в 3-4 дня в моче, собранной за сутки, проводили определение показателей функции почек: диурез, рН мочи, экскрецию креатинина, концентрацию и экскрецию с мочой ионов кальция, фосфат- и оксалат-ионов, одновременно в моче производили измерение ферментативной активности трех ферментов: лактатдегидрогеназы (ЛДГ), у-глютамилтрансфераза (ГГТ), N -ацетил-р-глюкозаминидаза (НАГ), которые являются типичными маркерами повреждения эпителия почечных канальцев. Определение рН мочи проводили при помощи иономера марки ЭСЛК-01.7 фирмы «Аквилон» (г. Подольск, Россия). Концентрацию в моче фосфат-ионов, ионов кальция, экскрецию креатинина и активность маркерных ферментов (ЛДГ, ГГТ, НАГ) определяли фотометрически. Определение концентрации оксалат-ионов моче проводили с использованием метода высоко эффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на приборе Милихром-А02. Расчёт экскреции проводили умножением концентрации изучаемых ионов на величину суточного диуреза для конкретного животного. По истечении трех недель в экспериментах 1-ой и шести недель во И-ой серии экспериментов крыс декапитировали под эфирным наркозом и изымали у них почки для морфологического исследования. Морфологическое исследование почек

проводили при помощи метода светооптической микроскопии гистохимическим методом Косса на предмет наличия кальциевых депозитов.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы Stat Soft Statistica 6.0 для Windows. Так как количество животных в эксперименте не превышало 20, что можно считать малой группой (п<30), нами применялись непараметрические методы статистики с использованием критерия Манна-Уитни, для определения достоверности межгрупповых различий и критерия Уилкоксона для выявления внутригрупповых различий. Анализ межгрупповых различий проводили относительно группы сравнения (группа со свободным потреблением жидкости для первой серии экспериментов, группа шестинедельного потребления 1% раствора ЭГ - для второй), анализ внутригрупповых различий проводили в каждой подопытной группе относительно значений интактных животных (до начала эксперимента). Разница сравниваемых средних считалась достоверной, если показатель достоверности (р) был меньше 0,05, как это принято в биологических исследованиях. Данные представлены в виде х±т, гдех - среднее, т - ошибка. В таблицах звездочками (*) отмечены достоверные изменения по сравнению с исходным уровнем рассчитанные по критерию Уилкоксона; подчеркнуты достоверные отличия между соответствующими показателями пары «контроль-опыт», выявленные методом U-теста. Корреляционный анализ в первой серии экспериментов проводился между следующими параметрами: концентрацией и экскрецией литогенных ионов с количеством и размерами кальциевых депозитов по результатам измерений на 21-й день опыта с использованием рангового коэффициента корреляции Спирмена (р). Корреляционная связь признавалась существенной, если значение коэффициента Ipl превышало 0,3 при условии, что достоверность коэффициента по t-критерию Стьюдента (а) была меньше 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В ходе проведенного исследования, изучено влияние фармакологической коррекции пересыщения мочи на течение оксалатного нефролитиаза. Для этого в первой серии экспериментов нами был смоделирован оксалатный нефролитиаз, на фоне которого была изучена экскреторная функция почек в условиях различного потребления жидкости с целью отследить возникающие в моче изменения.

При употреблении ЭГ во всех экспериментальных группах зафиксировано появление оксалат-ионов в моче, чего не наблюдалось у здоровых крыс. Как известно, ЭГ - это низкомолекулярный двухатомный спирт, метаболизирующийся в организме гепатоцитами до щавелевой кислоты, анионы которой элиминируются почками, пересыщая мочу в просвете канальцев [Жариков А.Ю., 2009]. В условиях свободного потребления жидкости (табл. 1) концентрация оксалат-ионов в моче возрастала от 0,6+0,15 мг/мл в начале опыта до 1,4+0,36 мг/мл к моменту его завершения. На этом фоне при ограничении питья (табл. 2) величина описываемого показателя резко увеличивалась: от минимального значения в 1,7+0,18 мг/ мл до своего

Таблица 1

Показатели экскреции и концентрации ионов-камнеобразователей в моче крыс в условиях свободного доступа к воде

Дни

наблюдения

Параметры оксалурии

С(С20/-) мг/мл

Е(С20/")

мг/сутки

Параметры фосфатурии

С(Р043) мг/мл

ЕСРОЛ мг/сутки

Параметры кальциурии

С(Са ) мкмоль/мл

ЕССа31) мкмоль/ сутки

Исходный уровень

11,1+1,09

51,1+3,01

2,5+0,17

11,5±0,49

3 дня

0,6+0,15*

3,4+0,96*

10,7+0,51

61,0+4,94

Не

определялось

Не

определялось

7 дней

0,6+0,10*

3,8+0,67*

9,8+0,58

62,7+3,71

2,8+0,27

17,9+0,92

10 дней

0,6+0,08*

3,8+0,60*

9,6+0,62

61,4+3,96

2,0+0,21

12,8±0,85

14 дней

0,5+0,09*

2,8+0,24*

9,2+0,61

50,6+2,73*

2,8+0,25

15,4+0,53*

17 дней

1,4+0.26*

7,3±1,01*

9,4±0,62

48,9+4,37*

2,4+0,19

12,5+1,86

21 день

1,4±0,36*

9,6+1,01*

Не

определялось

Не

определялось

2,2+0,18

15,0+1,13

Таблица 2

Показатели экскреции и концентрации ионов-камнеобразователей в моче крыс в условиях ограничения питья

Дни

наблюдения

Исходный уровень

Параметры оксалурии

С(СгО„4") мг/мл

Е(с2О/-)

мг/сутки

Параметры фосфатурии

С(РО„5-) мг/мл

9,8+0,31

Е(Р043) мг/сутки

61,7+1,73

Параметры кальциурии

С(Са )

мкмоль/

мл

1,9+0,31

Е(Са )

мкмоль/

сутки

12,0+1,27

3 дня

1.7±0.18*

5.8+0.38*

12,6+1,18*

42.8+2.18*

Не

определялось

Не

определялось

7 дней

1.9^0.14*

6.3+0.67*

15.5+1.48*

51.2±2,75*

2,6+0,35

8.6+0,90

10 дней

14 дней

2.5+0.15*

9.0+0.75*

12,2+1,11*

44.0+3.57*

Не

определялось

Не

определялось

2.4+0.22*

9.8+1.37*

14.7+1.29*

60,3±3,20

3,3±0,50*

13,5+1,48

17 дней

2.9+0.29*

15.0+1.09*

9,2+0,54

47,8+2,90

Не

определялось

Не

определялось

21 день

2.3+0.20*

12,0+0,95*

9.5+0.89

49.4+5.42

1,9+0,20

9.9+0.79

максимума в 2,9+0,2 мг/мл, т. е. прирост концентрации оксалат-ионов по сравнению с 1-й группой составил от 107 до 183%.

В условиях увеличения потребления жидкости (табл. 3), напротив, наблюдалось многократное снижение данного показателя: 0,2-0,4 мг/мл в течение эксперимента. Иными словами, относительно группы сравнения

концентрация океалат-ионов в моче снизилась в 3-3,5 раза. Сопоставление этих данных наглядно демонстрирует, что уменьшение питья значительно усиливает, а увеличение ослабляет пересыщение мочи оксалат-ионами. Во многом аналогичная зависимость от питьевых режимов прослеживалась и для динамики концентрации фосфат-ионов в моче, что также позволяет судить об определенном влиянии количества потребляемой жидкости на пересыщение мочи фосфатами.

Таблица 3

Показатели экскреции и концентрации ионов-камнеобразователей в ___моче крыс в условиях водной нагрузки___

Дни наблюдения Параметры оксалурии Параметры фосфатурии Параметры кальциурии

мг/мл Е(С2ол) мг/сутки С(р043) мг/мл щроЛ мг/сутки С(Са2+) мкмоль/мл Е(Са ) мкмоль/ сутки

Исходный уровень 0 0 8,3+0,32 59,8+2,67 2,7+0,25 19,4±1,87

3 дня 0,4+0,02* 5.3+0.38* 3.2±0,17* 42.2+3.66* Не определялось Не определялось

7 дней 0,4±0,04* 5,4+0,52* 2,9+0.22* 39.2+3.40* 2,5±0,12 33.8+2.97*

10 дней 0.3+0,03* 4,б±0,41* 4.0±0,44* 60,8+3,64 2,2+0,05 33,4+3,06*

14 дней 0.2+0,02* 2,9+0,33* 3.7+0.52* 54,4±6,58 2,3±0,08 33,8+2,43*

17 дней 0,3±0,04* 4.7±0.42* 4,2+0,51* 66.0+6,58 2,1+0,08 33,0+3,19*

21 день 0,2+0,02* 2.9+0.22* 4.7+0.53* - 68.6+6.16 2,4+0,10 35.0±1,60*

Следует отметить еще одну важную деталь: в ходе эксперимента приходилось наблюдать разнонаправленность изменений концентрации ионов в моче и динамики их экскреции. Поэтому, на наш взгляд, следует несколько по-иному расставлять акценты в отношении терминов "гипероксалурия", "гиперфосфатурия", "гиперкальциурия" при описании характера пересыщения мочи, поскольку, как показали проведенные нами эксперименты, они не отражают реальной картины пересыщения мочи, а иногда вовсе существенно ее искажают. Подтверждением высказанного мнения могут служить представленные результаты морфологических исследований - они четко демонстрируют прямую зависимость литогенных процессов в тканях почек от изменений именно концентрации ионов в моче, а не от экскреции этих ионов.

Для выявления связей между показателями концентрации и экскреции с одной стороны и размером и количеством кальциевых депозитов с другой, нами был проведён корреляционный анализ указанных показателей.

В результате была выявлена прямая статистически значимая корреляционная связь между показателями концентрации оксалат и фосфат-

ионов и средним размером кальциевого депозита, в то же время было установлено наличие обратной связи между средним размером депозита и экскрецией фосфат ионов и ионов кальция, а также диурезом (рис. 1).

В то же время при выявлении связей между указанными показателями и количеством кальциевых депозитов в поле зрения (рис. 2) было установлено наличие достоверной отрицательной связи лишь только для экскреции кальция и диуреза, в то время как наличие прямой положительной связи для показателей концентрации сохранялся.

Рис. 1. Корреляционный анализ между биохимическими показателями функции почек и средним размером кальциевого депозита

Рис. 2. Корреляционный анализ между биохимическими показателями функции почек и количеством кальциевых депозитов

Таким образом, полученные результаты показали, что в используемои нами этиленгликолевой модели существует прямая связь между пересыщением мочи и образованием конкрементов. Кроме того, были получены экспериментальные данные об уровне литогенных ионов и активности маркерных ферментов в ходе развития патологии.

Дальнейшая работа была посвящена снижению пересыщения мочи с помощью фармакологических средств, с целью уменьшения конечного количества кальциевых депозитов в почках подопытных животных.

Для этого мы вначале провели контрольный эксперимент, который отличался от стандартной 3-х недельной модели лишь продолжительностью: животные получали 1%-й раствор ЭГ в свободном доступе в течение 6 недель. Это было сделано для того, чтобы установить изменения основных показателей мочи в ходе 6-и недельного потребления 1%-го раствора ЭГ, используемых для описания оксалатного нефролитиаза в ходе 3-х недельной модели, для последующего сравнения изменений происходящих в опытных группах начиная с 4-ой недели на фоне применения средств, снижающих пересыщение

мочи.

В ходе контрольного эксперимента было зафиксировано некоторое увеличение диуреза, что на наш взгляд могло являться ответной компенсаторной реакцией на развивающуюся патологию, и связанное с этим снижение концентрации фосфат-ионов. При этом выявлено, что концентрация оксалат-ионов в ходе всего эксперимента была на достаточно высоком уровне, достигая пиковых значений на 4-ой и 6-ой неделях. Также не было зафиксировано статистически значимых изменений концентрации ионов кальция, хотя, как известно, его физиологического уровня вполне хватает для начала кристаллизации. Таким образом, в ходе 6-и недель опыта было зафиксировано пересыщение мочи оксалат ионами, незначительное снижение фосфат-ионов и постоянный уровень концентрации ионов кальция. Это все создавало условия для начала литогенеза, чему, кроме того, могло способствовать pH мочи, значения которого на протяжении всего опыта находились в диапазоне 5,8-6,4 единицы, что является вполне благоприятным для формирования оксалатных камней [Голованова O.A., 2005].

Как известно, помимо способности реагировать с ионами кальция и образовывать нерастворимые биоминералы вевеллита, оксалат-ионы вызывают деструкцию и дисфункцию уротелия, что сопровождается ростом активности в моче ферментов повреждения и является важным звеном в каскаде литогенных процессов, приводящих к образованию почечных камней [Брюханов В.М., 2008- Зверев Я.Ф., 2008; Toblli J.E., 2003]. В пользу развития патологии нам говорили результаты проведенного изучения активности в моче маркерных ферментов, экскреция которых в ходе опыта имела тенденцию к Р°сту, при этом пиковые значения приходились на период с 3-й по 6-ю недели и отличались от исходного уровня в 1,6-3,8 раз. Результаты проведенной морфометрии стали неоспоримым доказательством процесса литогенеза, согласно которым величина и количество кальциевых депозитов возрастала в сравнении с тремя неделями моделирования.

Проведенный контрольный эксперимент позволил в ходе дальнейших опытов оценить эффекты фармакологических средств, снижающих

пересыщение мочи, и их эффективность.

Применение натрия цитрата в течение 3-х недель способствовало, в первую очередь, снижению пересыщения мочи ионами кальция (рис. 3), выражавшееся в более, чем двукратном снижении показателя, что отличало его

Рис. 3. Динамика изменения пересыщения мочи ионами кальция в результате применения натрия цитрата в условиях оксалатного нефролитиаза

от других используемых веществ. Кроме того, как и ожидалось, еще одним положительным эффектом изучаемого средства стало подщелачивание мочи, составлявшее в отдельные дни эксперимента разницу с средним уровнем в ходе первых 3-х недель до 1,0. При этом натрия цитрат не оказывал влияния на динамику фосфат- и оксалат-ионов, что вполне укладывается в его описываемый механизм действия. Результатом уменьшения пересыщения, на наш взгляд, стало снижение, до этого возрастающих в течение первых 3-х недель, активности ферментов НАГ, ГГТ, ЛДГ - величина которых возвращалась к своему исходному уровню. Морфометрический контроль на 42-й день опыта показал правоту наших предположений - количество кальциевых депозитов снижалось в 3,4 раза, а средний размер в 1,9 раза.

В следующем эксперименте нами была поставлена задача изучить еще один способ снижения пересыщения мочи ионами кальция. Для этого нами был использован натрия фитат - вещество, обладающее по данным литературы способностью хелатировать кальций [Маши М.А., 1985].

В условиях эксперимента натрия фитат продемонстрировал весьма ощутимые антилитогенные свойства, причем некоторые его эффекты оказались

уровень

Дни эксперимента

Группа контроля ; > ж Группа лечения

весьма неожиданными. Так, например, было зафиксировано уменьшение концентрации в моче оксалат-ионов, что, без сомнения, является положительным результатом проведенной терапии. Кроме того, на фоне введения исследуемого препарата наблюдалось некоторое увеличение концентрации в моче фосфат-ионов, что, по-видимому, можно объяснить неспецифической реакцией используемых в методике реагентов с фосфатными группировками самого фитата. Наконец, в процессе лечения не было зафиксировано существенного уменьшения мочевой концентрации ионов кальция, что, на первый взгляд, противоречит хелатирующим способностям фитатов. Однако, как известно, в основе любого хелатного комплекса находится ион металла, который связан с органической молекулой двумя типами связей - ковалентными и водородными. Вместе с тем, кальций по своим основным свойствам слабее натрия, и видимо, его способность вытеснять последний из комплекса с фитат-ионом ограничена. Как следствие - низкая вероятность образования столь необходимых для хелатного комплекса ковалентных связей. Не исключено, что гораздо более важную роль может играть процесс образования водородных связей между ионами кальция, встроенными в грани кристаллической решетки апатита и вевеллита, и поляризованным атомом кислорода в фосфатных группировках фитата. В результате такого взаимодействия кристаллы теряют способность контактировать с отрицательно заряженными центрами молекул стимуляторов кристаллизации и проникать интерстициалыюе пространство тонкого, отдела петли Генле, где происходит первичное камнеобразование, а также не осаждаются на бляшках Рэндалла в просвете собирательных трубок.

К положительным сторонам антилитогенного действия натрия фитата можно отнести нормализацию среды мочи (рис. 4). Учитывая, что образование оксалатов кальция различной гидратированности и их осаждение из пересыщенного раствора максимально активно происходит при значениях рН=4,5-7,0 сдвиг рН мочи в слабощелочную сторону мог в определенной мере ослабить указанный процесс.

Кроме того, важным показателем уменьшения проявлений нефролитиаза под влиянием натрия фитата следует считать выраженное уменьшение активности маркерных ферментов, что указывает на восстановление нормальной структуры и функции уротелия, а также подавление оксидативного стресса. Эти процессы традиционно принято считать взаимосвязанными, поэтому такой синергетический эффект вполне логичен. Вероятно, препарат оказывает протективное действие в отношении почечного эпителия вследствие связывания ионов металлов, подавляя тем самым цепную реакцию образования активных форм кислорода.

В конечном счете, описанные стороны действия натрия фитата привели к главному результату: количество кальциевых депозитов в почках по сравнению с контролем заболевания снизилось в 1,5 раза (14,2+2,0), а их размер - в 2,8 раза (5,9±0,4 мкм).

Рис. 4. Изменения уровня рН в ходе использования натрия фитата

уровень

Дни эксперимента

: Гп/г.!:;* контроль т ípyr>oa лечуши*

Длительное применение натрия пирофосфата, в отличие от натрия цитрата, обусловило уменьшение концентрации оксалат-ионов в моче относительно контроля, несмотря на то что в процессе терапии крысы продолжали потреблять ЭГ, а значит, зафиксированный эффект можно объяснить именно действием пирофосфата, но не изменением экспериментальных условий. Параллельно нормализовалась концентрация фосфат-ионов в моче (рис. 5), что хорошо согласуется с уже известными свойствами пирофосфата как средства, обладающего способностью воздействовать на аппатитное звено камнеобразования [Costa-Bauza А., 2002; Grases F., 2000; March J.G., 2001].

Наконец, вследствие проведенного лечения существенно снижалась мочевая концентрация ионов кальция как по сравнению с 21-ми сутками, характеризующими пик экспериментальной патологии, так и относительно интактных значений. Данные наблюдения указывают на то, что под действием натрия пирофосфата ослаблялось пересыщение мочи литогенными ионами, что с высокой долей вероятности могло благоприятно сказаться на течении заболевания.

Кроме того, в результате длительного введения натрия пирофосфата нормализовалась диуретическая функция почек, ослабленная в условиях патологии. Учитывая, что интенсивность пересыщения мочи обратно пропорциональна объему и скорости мочеотделения, зафиксированное действие пирофосфата также могло внести определенный вклад в общую картину антилитогенных эффектов.

Рис. 5. Динамика изменения пересыщения мочи фосфат-ионами входе применения натрия пирофосфата

Известно, что важным физико-химическим параметром, регулирующим синтез кристаллического материала оксалатной природы и его дальнейшее осаждение из пересыщенного раствора, является рН мочи, причем наиболее активно указанный процесс происходит в диапазоне значений рН 4,5-7,0, ослабляясь при изменении среды в щелочную сторону [Голованова О.А., 2005]. В данном контексте обращает на себя внимание некоторое защелачивание мочи в первые 10 суток введения натрия пирофосфата. Опираясь на описанные выше физико-химические особенности, можно предположить, что в этот период времени образование нерастворимых солей оксалата кальция было уменьшено.

Происходящие изменения экскреторной функции почек сопровождались значительным ослаблением активности в моче маркерных ферментов повреждения почечного эпителия. В ходе проводимой терапии натрия пирофосфатом динамика ферментурии уже после 1-й недели применения изучаемого средства приобрела четкую тенденцию к снижению, в результате чего к моменту окончания эксперимента активность ЛДГ, ГГТ и НАГ возвращалась к нормальному уровню, зафиксированному у здоровых животных, и была существенно ниже показателей контрольной группы. Это означает, что проведенная терапия привела к восстановлению структурной целостности и функциональной активности нефроцитов, устраняя так называемый повреждающий фактор, столь необходимый для формирования почечных конкрементов [Жариков А.Ю., 2009]. Описанные стороны действия натрия пирофосфата при экспериментальном нефролитиазе воплотились в

главном - количество кальциевых депозитов в почках уменьшалось в 1,4 раза, а

их размер - в 1,9 раза.

Следующие 2 эксперимента были посвящены изучению возможности

снижения пересыщения мочи оксалат ионами.

Первым способом стало снижение концентрации оксалат-ионов в просвете почечного канальца. Как уже было сказано выше, для этого нами был использован катион цинка. В литературе хорошо описано благотворное влияние магния на течение оксалатного нефролитиаза [Спасов A.A., 2008;

! Johanson G., 1982; Vagelli G., 1998]. При этом многие авторы указывают в качестве естественного ингибитора литогенеза и катион цинка. Между тем, имеется информация и о возможной отрицательной стороне использования Ztf [Bazin D„ 2009; Carpentier X., 2011; Wu L. N„ 2009]. Нами было изучено влияние данного катиона на пересыщение мочи при оксалатном нефролитиазе.

В наших экспериментах применение цинка аспарагината более чем в 2 раза снижало пересыщение мочи оксалат-ионами (рис. 6), при этом, не оказывая влияния на динамику концентрации других литогенных ионов и уровень pH мочи. Следует отметить, что это сопровождалось возвращением экскреции ЛДГ на исходный уровень, в то время как активность ГГТ и НАГ в ходе проведенной терапии подвергались изменениям в меньшей степени. Полученные результаты морфометрии показали, что в то время как применение цинка аспарагината позволило снизить размер кальциевых депозитов в 1,5 раза, оно не снижало их количеств, а напротив привело к 2-х кратному росту. Это на наш взгляд можно связать с описываемой в литературе возможностью цинка включаться в состав конкремента [Carpentier X., 2011].

Рис. 6. Изменение концентрации оксалат-ионов в моче крыс в ходе применения цинка аспарагината

S* ол

т

Дни эксперимента

МЯВ

0,0

Исходный уровень

В следующем эксперименте в качестве средства, снижающего пересыщение, был использован натрия сульфит. Возможность снижения им пересыщения мочи оксалат-ионами строилась нами на основании имеющихся в литературе экспериментальных данных, о способности его in vitro в культуре клеток печени снижать образование оксалат-ионов, ингибируя лактатдегидрогеназу [Holmes R. Р., 1998; Ichiyama А., 2000; Sharma V., 1993].

Применение натрия сульфита снижало пересыщение мочи оксалат-ионами (рис. 7). Следует отметить, что на 3 день лечения был отмечен рост показателя концентрации, что, по-видимому, связано с медленным развитием эффекта и укладывается в описанное в литературе ингибирование натрия сульфитом лактатдегидрогеназы [Sharma V., 1993]. Но начиная с 7-го дня пересыщение оксалат-ионами постепенно снижалось, в 5 раз по отношению к пику концентрации на 3 день лечения. При этом, как и ожидалось, он не вносил изменений в динамику концентрации фосфат-ионов и ионов кальция. В то же время было зафиксировано увеличение рН, что может говорить о возможном влиянии натрия сульфита на ионный баланс мочи.

Рис. 7. Динамика пересыщения мочи оксалат-ионами в ходе применения натрия сульфита при оксалатном нефролитиазе

Снижение пересыщения мочи оксалат-ионами и некоторое ее ощелачивание благоприятно влияли на течение оксалатного нефролитиаза, что выражалось в значительном снижении активности маркерных ферментов, до уровней в некоторых случаях в разы ниже исходного. А проведенная морфометрия подтвердила результаты биохимии. Количество кальциевых депозитов снижалось в 3 раза, их размер - в 2,1 раза.

В ходе исследования фармакологической коррекции пересыщения мочи были получены результаты, которые натолкнули нас на мысль, о возможности комплексного снижения пересыщения мочи литогенными ионами. Нами были выбраны натрия цитрат - уменьшающий пересыщение ионами кальция, натрия сульфит - снижающий концентрацию в моче оксалат-ионов и натрия пирофосфат оказывавший в наших экспериментах действие на фосфат-ионы и ионы кальция. И в ходе следующего эксперимента мы выяснили, как полученная комбинация будет влиять на пересыщение мочи при оксалатном нефролитиазе. Отметим, что мы не смогли найти в литературе описания подобного подхода к проблеме пересыщения мочи при экспериментальном нефролитиазе, поэтому можно сказать, что это было проделано впервые.

Результаты применения разработанной комбинации были весьма перспективными. Во-первых, это снижение пересыщения мочи оксалат-ионами и ионами кальция, во-вторых некоторое увеличение содержания в моче фосфат-ионов, в-третьих - это увеличение диуреза, что в среднем было выше исходного уровня на 25%, и рост рН мочи в среднем почти на 1,0. При этом следует отметить, что развитие снижения концентрации мочевого оксалата происходило уже на 3-й день лечения, что выгодно отличало комбинацию от натрия сульфита, где эффект наступал только на 7-й день. Это все сопровождалось снижением в моче активности маркерных ферментов до своего исходного уровня. И как результат - снижение размеров и количества кальциевых депозитов (табл. 4). При этом результат по количеству кальциевых

Таблица 4.

Результаты морфомет] рии

Наименование группы Среднее количество Са-позитивного материала в поле зрения Средний размер Са-позитивного материала, в мкм

Контроль 3 недели 17,1±0,21 9,2±0,43

Контроль 6 недель 27,4+3,22 12,0+0,62

Натрия цитрат 8.0±1,36* 6,2+0,27*

Натрия пирофосфат 15.7±2,78 5,3+0,19*

Натрия сульфит 9.1+1,47* 5.6+0.26*

Комбинированный препарат 10,1±1,04* 4.9±0.19*

Примечание: в таблице подчеркнуты достоверные отличия в сравнение с контролем 6 недель, звездочками (*) отмечены достоверные отличия в сравнение с контролем 3 недель, выявленные методом и-теста

депозитов находился между натрия сульфитом и натрия пирофосфатом, в то время как размер депозита был самым наименьшим в числе используемых средств вне комбинации. Таким образом, применение комбинации натрия цитрата, натрия сульфита и натрия пирофосфата позволило комплексно снизить пересыщение мочи литогенными ионами, следствием чего удалось достичь наименьшего размера кальциевых депозитов и одно из самых низких значений их количества в поле зрения (табл. 4).

ВЫВОДЫ

1. Использование показателя мочевой концентрации литогенных ионов, а не их экскреции, позволяет повысить точность прогноза развития оксалатного нефролитиаза.

2. Длительное применение фармакологических средств, ослабляющих пересыщение мочи ионами кальция, облегчают течение оксалатного нефролитиаза, при этом, более эффективным в паре натрия цитрат - натрия фитат, является натрия цитрат.

3. Применение натрия пирофосфата при оксалатном нефролитиазе приводит к снижению пересыщения мочи оксалат-ионами и ионами кальция, сдвигом pH в щелочную сторону, что сопровождается снижением количества и размеров кальциевых депозитов.

4. Длительное применение фармакологических средств, ослабляющих пересыщение мочи оксалат-ионами, приводит к облегчению протекания оксалатного нефролитиаза. Большую эффективность в паре натрия сульфит — цинка аспарагинат показал натрия сульфит. При этом применение цинка аспарагината на фоне оксалатного нефролитиаза сопровождается снижением размеров при увеличении числа кальциевых депозитов.

5. Использование комбинации из натрия цитрата, натрия пирофосфата и натрия сульфита, привело к выраженному торможению пересыщения мочи ионами оксалатов, фосфатов и кальция, сопровождавшееся сдвигом pH мочи в щелочную сторону, снижением активности маркерных ферментов повреждения и уменьшением количества и размеров кальциевых депозитов, что позволяет рекомендовать ее для дальнейших исследований.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. К механизму образования кальциевых депозитов при экспериментальном нефролитиазе / Жариков А.Ю., Талалаева О.С., Мотина Н.В., Кудинов A.B.// Материалы XI научно- практической конференции молодых ученых "Молодежь-Барнаулу". - Барнаул, 2010. - Т. 2. - С. 118-119.

2. Влияние натрия цитрата на пересыщение мочи при экспериментальном нефролитиазе / Кудинов A.B., Жариков А.Ю. // Сборник научных статей фармацевтического факультета "Актуальные проблемы фармакологии и фармации". - Барнаул, 2010. - Вып. VII. — С. 99-103.

3. Влияние объёма потребляемой жидкости на течение экспериментального нефролитиаза / Кудинов A.B., Жариков А.Ю., Брюханов В.М., Зверев Я.Ф., Лампатов В.В. // Материалы научно-практической

конференции "Фармацевтическому факультету АГМУ 35 лет: итоги и перспективы". - Барнаул, 2010. - С. 76-81.

4. Особенности экспериментального нефролитиаза в условиях различных питьевых режимов / Кудинов A.B., Жариков А.Ю., Брюханов В.М., Зверев Я.Ф., Лампатов В.В. // Материалы Российской научно-практической конференции "Вестник Пермской государственной фармацевтической академии". - Пермь, 2010. - №7. - С. 105-108.

5. Новый способ определения оксалат-ионов в моче / Жариков А.Ю., Лампатов В.В., Зверев Я.Ф., Брюханов В.М., Кудинов A.B. // Клиническая лабораторная диагностика. - 2010. - № 12.- С. 3-5.

6. Опыт применения натрия сульфита при экспериментальном оксалатном нефролитиазе / Кудинов A.B., Жариков А.Ю., Мотин Ю.Г. // Молодежь - Барнаулу: Материалы XII научно-практической конференции молодых ученых. - Барнаул, 2010. - С. 22-23.

7. Влияние питьевых режимов на движущие силы кристаллизации при экспериментальном нефролитиазе / Брюханов В.М., Зверев Я.Ф., Лампатов В.В., Жариков А.Ю., Кудинов A.B., Мотина Н.В. // Урология. - 2011. - №1. - С. 6-10.

8. Опыт применения натрия пирофосфата при оксалатном нефролитиазе в эксперименте / Жариков А.Ю., Зверев Я.Ф., Лампатов В.В., Брюханов В.М., Азарова О.В., Талалаева О.С., Кудинов A.B., Мотин Ю.Г. // Бюллетень сибирской медицины. - 2011. - Т. 10, №1. - С. 32-37.

9. Фармакологическая коррекция пересыщения мочи при экспериментальном оксалатном нефролитиазе / Кудинов A.B. // Материалы I Всероссийской научно-практической конференции молодых учёных "Сибирский медико-биологический конгресс ". - Барнаул, 2011.- С. 34-36.

10. Влияние натрия фитата на течение экспериментального нефролитиаза / Жариков А.Ю., Зверев Я.Ф., Лампатов В.В., Брюханов В.М., Кудинов A.B., Мотин Ю.Г. // Сибирский медицинский журнал. - 2011. -№5. - С. 30-33.

11. Влияние цинка аспарагината на течение экспериментального нефролитиаза / Кудинов A.B., Жариков А.Ю. // Сборник научных статей фармацевтического факультета "Актуальные проблемы фармакологии и фармации". - Барнаул, 2011. - Вып. VIII. - С. 35-36.

12. Фармакологическая коррекция экспериментального нефролитиаза натрия сульфитом /Кудинов A.B., Лампатов В.В. // Вестник уральской медицинской академической науки тематический выпуск по фармации. - 2011. -№3/1 (37).-С. 32-33.

13. Оценка эффективности различных путей снижения пересыщения мочи оксалат-ионами при экспериментальном оксалатном нефролитиазе / Кудинов A.B. // Вестник уральской медицинской академической науки тематический выпуск по фармации. - 2011. - №3/1 (37). - С. 31-32.

14. Опыт применения комбинации фармакологических средств, снижающих пересыщение мочи при оксалатном нефролитиазе / Брюханов В.М., Зверев Я.Ф., Кудинов A.B., Лампатов В.В., Жариков А.Ю. // Материалы всеукраинской научно-практической конференции студентов и молодых

учёных "Актуальные вопросы создания новых лекарственных средств". -Харьков, 2012.-Т. 2.- С. 364.

15. Сравнение эффективности двух фармакологических подходов к снижению пересыщения мочи при экспериментальном оксалатном нефролитиазе // Материалы IV съезда фармакологов России «Инновации в современной фармакологии». - Москва, 2012. - С. 106-107.

16. Комбинированный подход к фармакологической коррекции пересыщения мочи при экспериментальном оксалатном нефролитаазе // Материалы II Всероссийской научно- практической конференции молодых учёных «Сибирские медико-биологические чтения». - Барнаул, 2012. - С. 3133.

Кудинов Алексей Владимирович

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ ПУТИ СНИЖЕНИЯ ПРЕСЫЩЕНИЯ МОЧИ В КОРРЕКЦИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ОКСАЛАТНОГО НЕФРОЛИТИАЗА

Автореф. дис. на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 15.01.2013 Заказ № 12 Формат 60 х 90/16 Усл. печ. л. 1,5. Тираж 100 экз.

Отпечатано в типографии «Принт-технология» Красногорское, ул. Раздольная, 2

Актуальность темы: Мочекаменная болезнь (МКБ) — одно из наиболее частых урологических заболеваний и встречается у 10 - 15% населения, причем наиболее часто это мужчины в трудоспособном возрасте - 20-50 лет. Больные уролитиазом составляют 30-40 % всего контингента урологических стационаров [17, 25, 45, 49, 71, 109].

В настоящее время в развитых странах мира из 10 млн. человек 400 тыс. страдают мочекаменной болезнью. Ежегодно регистрируется 85 тыс. заболеваний мочекаменной болезнью, при этом 62 тыс. из них — рецидивные камни. При этом абсолютное число зарегистрированных больных мочекаменной болезнью в мире ежегодно увеличивается [2, 25, 49]. Так в РФ в период с 2002 по 2009 гг. количество случаев увеличилось на 17,3%: с 629 453 до 738 130 [2]. Максимальный показатель частоты встречаемости мочекаменной болезни на 100 000 населения в 2009 г. отмечался в Дальневосточном федеральном округе (564,6), а минимальный в СевероКавказском федеральном округе (395,6). По регионам наиболее высокие показатели частоты встречаемости мочекаменной болезни на 100 000 населения были отмечены в Алтайском крае (1261,9) и в Ненецком автономном округе (1001,8), а минимальный уровень в Еврейской автономной области (212,0). Основной клинической формой МКБ является оксалатный нефролитиаз, так как от 50% до 80% почечных камней в качестве главного структурного компонента содержат оксалат кальция [6].

Страдающие нефролитиазом нуждаются в применении высокотехнологичных методов обследования и лечения как малоинвазивных, так и хирургических. Создание метода дистанционной, или экстракорпоральной нефро- и уретеролитотрипсии намного сократило число оперативных вмешательств по поводу камней почек и мочеточников. К сожалению, больше половины регистрируемых сегодня камней являются рецидивирующими. При этом по данным статистики процент рецидивов резко возрастает с течением времени после удаления камня. Так уже через 1 год после удаления камня число случаев рецидивов составляет - 10% от всего числа обращений, через 5 лет - 35%, через - 10 лет - 50% [68, 71, 109, 115]. Таким образом, удаление камня в большинстве случаев не приводит к полному решению проблемы, так как оно не устраняет причин его образования. В то же время, предотвращение процесса литогенеза должно позволить снизить количество клинических случаев камней и их рецидивов. В настоящее время существует несколько , теорий камнеобразования. При этом основополагающим моментом во всех случаях является пересыщение мочи литогенными ионами. В случае оксалатного нефролитиаза основными ионами-камнеобразователями являются оксалат-ионы, фосфат-ионы и ионы кальция. Кроме этого, процессу литогенеза также способствуют условия среды: изменение уровня рН и снижение защитных коллоидов. К сожалению, сегодня возможности фармакологической коррекции оксалатного нефролитиаза весьма ограничены: недостаточная изученность причин и механизмов развития нефролитиаза препятствуют поиску новых медикаментозных подходов в лечении этого заболевания, что пока определяет инструментальные методы решения данной проблемы как основные [9, 15, 23, 24, 25].

Все выше сказанное определяет высокую актуальность поиска эффективных фармакологических средств, снижающих пересыщение. В связи с этим возникает необходимость более детального изучения показателей состояния мочи в условиях оксалатного нефролитиаза и их роли в патогенезе данной нозологии, для последующей оценки эффективности применения средств снижающих пересыщение мочи. Это позволит в дальнейшем расширить возможности подходов к лечению данного заболевания неинвазивными методами.

Цель исследования: Разработать и изучить пути снижения пересыщения мочи оксалат-ионами, фосфат-ионами и ионами кальция при оксалатном нефролитиазе у крыс.

Основные задачи исследования:

1. Провести сравнительную оценку роли концентрации и экскреции литогенных ионов в прогнозе пересыщения мочи при оксалатном нефролитиазе в эксперименте.

2. Изучить влияние фармакологических средств, ослабляющих пересыщение мочи ионами кальция в эксперименте.

3. Изучить влияние фармакологических средств, ослабляющих пересыщение мочи фосфат-ионами в эксперименте.

4. Изучить влияние фармакологических средств, ослабляющих пересыщение мочи оксалат-ионами в эксперименте.

5. Разработать комплексный подход снижения пересыщения мочи литогенными ионами при оксалатном нефролитиазе в эксперименте.

Научная новизна работы: Впервые проведена оценка показателей концентрации и экскреции оксалат-ионов, фосфат-ионов и ионов кальция в прогнозе пересыщения мочи при экспериментальном оксалатном нефролитиазе. Установлен приоритет использования показателя концентрации, а не экскреции ионов при описании характера пересыщения мочи. Предложены методы снижения пересыщения мочи литогенными ионами при оксалатном нефролитиазе при помощи различных фармакологических средств. Установлено, что на пересыщение мочи ионами кальция оказывают влияние натрия цитрат и натрия фитат, фосфат-ионами — натрия пирофосфата, оксалат-ионами - натрия сульфит и цинка аспарагинат. Исследована возможность предложенной комбинации натрия цитрата, натрия пирофосфата и натрия сульфита влиять на течение заболевания.

Научная и практическая значимость Проведена сравнительная оценка роли показателей концентрации и экскреции литогенных ионов в прогнозе пересыщения мочи при оксалатном нефролитиазе. Установлено, что не всегда изменения экскреции ионов-камнеобразователей с мочой определяют характер литогенных процессов в тканях почек. В большей степени это зависит от концентрации рассматриваемых ионов.

Изучено влияние средств, снижающих пересыщение мочи, на пересыщение мочи при оксалатном нефролитиазе. В ходе применения изучаемых средств фиксировалось снижение содержания в моче ионов-камнеобразователей и изменение в некоторых случаях рН среды. При этом было показано, что на пересыщение мочи ионами кальция могут оказывать свое влияние натрия фитат и натрия цитрат; на пересыщение фосфат-ионами — натрия пирофосфат; на пересыщение оксалат-ионами - натрия сульфит и цинка аспарагинат. По результатам морфометрии срезов почек, окрашенных по Коссу, зафиксировано снижение количества и размеров кальциевых депозитов во всех случаях применения средств снижающих пересыщение, за исключением цинка аспарагината, использование которого привело к уменьшению размеров кальциевых депозитов с увеличением их количества в поле зрения.

Комбинация натрия цитрата, натрия пирофосфата и натрия сульфита позволяет обеспечить снижение концентрации всех трех рассматриваемых нами ионов-камнеобразователей и в большей степени добиться уменьшения размеров кальциевых депозитов и их количества в поле зрения.

Результаты проведенных экспериментов открывают новые возможности для дальнейших исследований в данном направлении с целью создания новых подходов в лечении оксалатного нефролитиаза.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. В качестве оценки развития оксалатного нефролитиаза целесообразно использовать показатель концентрации ионов-камнеобразователей, а не их экскрецию.

2. Длительное применение средств, ослабляющих пересыщение мочи ионами кальция облегчает протекание оксалатного нефролитиаза.

3. Длительное применение средств, ослабляющих пересыщение мочи фосфат-ионами облегчает протекание оксалатного нефролитиаза.

4. Длительное применение средств, ослабляющих пересыщение мочи оксалат-ионами облегчает протекание оксалатного нефролитиаза.

5. Использование комбинации ингибиторов, каждый из которых по отдельности оказывал положительный эффект на состояние концентрации определенного иона, привело к снижению пересыщения мочи по всем изучаемым ионам, что одновременно сопровождалось подщелачиванием мочи. Результатом этого стало значительное снижение количества и размеров кальциевых депозитов по сравнению с группой контроля.

Апробация материалов диссертации: Материалы диссертации доложены и обсуждены на Х1-ой городской научно-практической конференции молодых ученых «Молодежь - Барнаулу» (г. Барнаул, 2009), на научно-практической конференции посвященной 35-летию фармацевтического факультета АГМУ (г. Барнаул, 2010), на ХП-ой городской научно-практической конференции молодых ученых «Молодежь - Барнаулу» (г. Барнаул, 2010), на 1-ой Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Сибирский медико-биологический конгресс» (г. Барнаул, 2011), на И-ой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Современные проблемы фармакологии и фармации» (г. Новосибирск, 2011).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 16 работ, из них 5 - в журналах, включенных в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий.

Объем и структура диссертации: Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста, иллюстрирована 27 рисунками, 20 таблицами, состоит из введения, обзора литературы, 2 глав собственных исследований, обсуждения результатов, общих выводов, списка цитируемой литературы, в котором приведено 136 источников, из них 109 - иностранных авторов.

ВЫВОДЫ

1. Использование показателя мочевой концентрации литогенных ионов, а не их экскреции позволяет повысить точность прогноза развития оксалатного нефролитиаза

2. Длительное применение фармакологических средств, ослабляющих пересыщение мочи ионами кальция облегчают течение оксалатного нефролитиаза, при этом более эффективным в паре натрия цитрат — натрия фитат является натрия цитрат.

3. Применение натрия пирофосфата при оксалатном нефролитиаза приводит к снижению пересыщения мочи оксалат-ионами и ионами кальция, сдвигом рН в щелочную сторону, что сопровождается снижением количества и размеров кальциевых депозитов.

4. Длительное применение фармакологических средств, ослабляющих пересыщение мочи оксалат-ионами приводит к облегчению протекания оксалатного нефролитиаза. Большую эффективность в паре натрия сульфит - цинка аспарагинат показал натрия сульфит. При этом применение цинка аспарагината на фоне оксалатного нефролитиаза сопровождается снижением размеров при увеличении числа кальциевых депозитов.

5. Использование комбинации из натрия цитрата, натрия пирофосфата и натрия сульфита, привело к выраженному торможению пересыщения мочи ионами оксалатов, фосфатов и кальция, сопровождавшееся сдвигом рН мочи в щелочную сторону, снижением активности маркерных ферментов повреждения и уменьшением количества и размеров кальциевых депозитов, что позволяет рекомендовать ее для дальнейших исследований.

4.6 Заключение

В ходе проведённых экспериментов было установлено, что длительное применение фармакологических средств, таких как натрия цитрат, натрия фитат, натрия пирофосфат, цинка аспарагинат и натрия сульфит, в той или иной мере ослабляющих пересыщение мочи ионами кальция, фосфат-ионами, оксалат-ионами, облегчают течение оксалатного нефролитиаза, снижая число и количество кальциевых депозитов в почках. При этом применение цинка аспарагината на фоне оксалатного нефролитиаза сопровождается снижением размеров при увеличении числа кальциевых депозитов. Использование комбинации из натрия цитрата, натрия пирофосфата и натрия сульфита, привело к выраженному торможению пересыщения мочи ионами оксалатов, фосфатов и кальция, сопровождавшееся сдвигом рН мочи в щелочную сторону, снижением активности маркерных ферментов повреждения и уменьшением количества и значительным уменьшением размеров кальциевых депозитов.

ГЛАВА V. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В ходе проведенного исследования, необходимо было изучить возможности фармакологической коррекции пересыщения мочи ионами кальция, оксалат- и фосфат-ионами на течение оксалатного нефролитиаза.

На наш взгляд, это позволит расширить уровень знаний о процессах литогенеза и возможностях его снижения, открывая новые пути в подходах к лечению данной нозологии.

Для этого в первой серии экспериментов нами был смоделирован оксалатный нефролитиаз, на фоне которого была изучена экскреторная функция почек в условиях различного потребления жидкости с целью отследить возникающие в моче изменения .

Как известно, пересыщение мочи ионами кальция, оксалата и фосфата создает условия для их химического взаимодействия, в результате которого образуются в большом количестве нерастворимые соединения СаС204 и СаНР04. Последние, в случае превышения соответствующей им верхней границы метастабильности, выпадают в осадок и провоцируют камнеобразование. Одним из важнейших регуляторов верхней границы метастабильности является концентрация литогенных ионов в моче, которая, в свою очередь, зависит от многих факторов, в том числе от объема мочи и скорости ее протекания по нефрону, причем данная зависимость всегда носит обратно пропорциональный характер. Как и ожидалось, изменение объема потребления жидкости существенно повлияло на уровень мочеотделения у крыс за счет уменьшения или увеличения объема и скорости тока образовавшейся мочи по нефрону. Тем не менее само по себе увеличение или уменьшение объема мочи и скорости ее тока совсем не обязательно приводит к изменениям верхней границы метастабильности. В связи с этим был проведен прямой анализ влияния различных питьевых режимов на изменения концентраций литогенных ионов в моче и их суточной экскреции.

При употреблении ЭГ во всех экспериментальных группах было зафиксировано появление оксалат-ионов в моче, чего не наблюдалось у здоровых крыс. Как известно, ЭГ - это низкомолекулярный двухатомный спирт, метаболизирующийся в организме гепатоцитами до щавелевой кислоты, анионы которой элиминируются почками, пересыщая мочу в просвете канальцев [10]. В условиях свободного потребления жидкости концентрация оксалат-ионов в моче возрастала от 0,6 ±0,15 мг/мл в начале опыта до 1,4 ± 0,36 мг/мл к моменту его завершения. На этом фоне при ограничении питья величина описываемого показателя резко увеличивалась: от минимального значения в 1,7 ± 0,18 мг/ мл до своего максимума в 2,9±0,2 мг/мл, т. е. прирост концентрации оксалат-ионов по сравнению с 1-й группой составил от 107 до 183%. В условиях увеличения потребления жидкости, напротив, наблюдалось многократное снижение данного показателя: 0,2—0,4 мг/мл в течение эксперимента. Иными словами, относительно группы сравнения концентрация оксалат-ионов в моче снизилась в 3 - 3,5 раза. Сопоставление этих данных наглядно демонстрирует, что уменьшение питья значительно усиливает, а увеличение ослабляет пересыщение мочи оксалат-ионами. Во многом аналогичная зависимость от питьевых режимов прослеживалась и для динамики концентрации фосфат-ионов в моче, что также позволяет судить об определенном влиянии количества потребляемой жидкости на пересыщение мочи фосфатами.

На этом фоне несколько выделяется картина, характеризующая изменения концентрации ионов кальция в моче: во всех экспериментальных группах она практически не менялась, несмотря на существенные изменения функции почек. По-видимому, это можно объяснить тем, что обмен кальция в организме регулируется мощными, разнообразными механизмами, в результате чего на фоне даже значительных колебаний функционального состояния мочевыделительной системы концентрация указанного электролита в моче остается относительно стабильной.

Стоит отметить еще одну важную деталь: в ходе эксперимента приходилось наблюдать разнонаправленность изменений концентрации определяемых ионов в моче и динамики их экскреции. Поэтому, на наш взгляд, следует несколько по-иному расставлять акценты в отношении терминов "гипероксалурия", "гиперфосфатурия", "гиперкальциурия" при описании характера пересыщения мочи, поскольку, как показали проведенные нами эксперименты, они не отражают реальной картины пересыщения мочи, а иногда вовсе существенно ее искажают.

Для выявления связей между показателями концентрации и экскреции с одной стороны и размером и количеством кальциевых депозитов с другой, нами был проведён корреляционный анализ указанных показателей. Было установлено, что в используемой нами этиленгликолевой модели существует прямая корреляционная связь между показателями концентрации оксалат-ионов, фосфат-ионов и размером кальциевого депозита и средним количеством депозитов в поле зрения. В то же время при корреляционном анализе показателей экскреции литогенных ионов фиксировалась обратная отрицательная связь для пар: «экскреция фосфат-ионов — средний размер кальциевого депозита» и «экскреция ионов кальция - средний размер кальциевого депозита», а при установлении корреляционной связи между показателями экскреции литогенных ионов и количеством кальциевых депозитов в поле зрения она выявлялась только для экскреции ионов кальция. Важно отметить, что во всех случаях сила корреляционной связи для показателей концентрации была больше, что подтверждается более высоким значением коэффициента корреляции (Я).

Кроме того, в ходе первой серии экспериментов были получены экспериментальные данные об уровне литогенных ионов и активности маркерных ферментов в ходе развития патологии.

Дальнейшая работа была посвящена снижению пересыщения мочи с помощью фармакологических средств, с целью уменьшения конечного количества кальциевых депозитов в почках подопытных животных.

Для этого мы вначале провели контрольный эксперимент, который отличался от стандартной 3-х недельной модели лишь продолжительностью: животные получали 1%-й раствор ЭГ в свободном доступе в течение 6 недель. Это было сделано для того, чтобы установить изменения основных показателей мочи в ходе 6-и недельного потребления 1%-го раствора ЭГ, используемых для описания оксалатного нефролитиаза в ходе 3-х недельной модели, для последующего сравнения изменений происходящих в опытных группах начиная с 4-ой недели на фоне применения средств, снижающих пересыщение мочи.

В ходе контрольного эксперимента было зафиксировано некоторое увеличение диуреза, что на наш взгляд могло являться ответной компенсаторной реакцией на развивающуюся патологию, и связанное с этим снижение концентрации фосфат-ионов. При этом было выявлено, что концентрация оксалат-ионов в ходе всего эксперимента была на достаточно высоком уровне, имея свои пиковые значения на 4-ой и 6-ой неделях. Также не было зафиксировано статистически значимых изменений концентрации ионов кальция, хотя, как известно, его физиологического уровня вполне хватает для начала кристаллизации. Таким образом, в ходе 6-и недель опыта было зафиксировано пересыщение мочи оксалат ионами, незначительное снижение фосфат-ионов и постоянный уровень концентрации ионов кальция. Это все создавало условия для начала литогенеза, чему, кроме того, могло способствовать pH мочи, значения которого на протяжении всего опыта находились в диапазоне 5,8-6,4 единицы, что является вполне благоприятным для формирования оксалатных камней [7].

Как известно, помимо способности реагировать с ионами кальция и образовывать нерастворимые биоминералы вевеллита, оксалат-ионы вызывают деструкцию и дисфункцию уротелия, что сопровождается ростом активности в моче ферментов повреждения и является важным звеном в каскаде литогенных процессов, приводящих к образованию почечных камней [5, 14, 126]. В пользу развития патологии нам говорили результаты проведенного изучения активности в моче маркерных ферментов, экскреция которых в ходе опыта имела тенденцию к росту, при этом пиковые значения приходились на период с 3-й по 6-ю недели и отличались от исходного уровня в 1,6 - 3,8 раз. Результаты проведенной морфометрии стали неоспоримым доказательством процесса литогенеза, согласно которым величина и количество кальциевых депозитов возрастала в сравнении с тремя неделями моделирования.

Проведенный контрольный эксперимент позволил в ходе дальнейших опытов оценить эффекты фармакологических средств, снижающих пересыщение мочи, и их эффективность.

Известно, что катионы кальция - основной химический «инструмент» синтеза нерастворимых биоминералов. Кроме того, кальций выполняет функцию мишени в кристаллической решетке для взаимодействия с модуляторами камнеобразования, что обсуждалось ранее [13]. Учитывая это,

2+ понятно, что, связав ионы Са , можно повлиять одновременно на несколько звеньев литогенеза, добившись тем самым благоприятного эффекта.

Так же известно, что натрия цитрат является естественным ингибитором нефролитиаза, о чем свидетельствует проведенный анализ мочи пациентов с почечными камнями, который в большом числе случаев фиксировал гипоцитратурию [50, 105, 108, 123, 125]. В литературе описаны проведенные эксперименты, в которых действие натрия цитрата изучали на искусственной моче и моче пациентов с зафиксированными случаями камней, согласно полученным результатам цитрат препятствовал росту кристаллов оксалата кальция [35, 44, 61, 72, 74, 83, 93, 120]. Напомним, что по существующим данным механизм антилитогенного действия цитрата связывают со снижением пересыщения мочи ионами кальция, что обусловлено способностью образовывать с ионами Са более растворимое соединение - цитрат кальция, который в силу своих физико-химических свойств не вступает в процесс кристаллизации.

Применение натрия цитрата в течение 3-х недель способствовало в первую очередь снижению пересыщения мочи ионами кальция, выражавшееся в более, чем двукратном снижении показателя, что отличало его от других используемых веществ. Кроме того, как и ожидалось, еще одним положительным эффектом изучаемого средства стало подщелачивание мочи, составлявшим в отдельные дни эксперимента разницу с средним уровнем в ходе первых 3-х недель до 1,0. При этом натрия цитрат не оказывал влияния на динамику фосфат- и оксалат-ионов, что вполне укладывается в его описываемый механизм действия. Результатом уменьшения пересыщения, на наш взгляд, стало снижение, до этого возрастающих в течение первых 3-х недель, активности ферментов НАГ, ГТТ, ЛДГ - величина которых возвращалась к своему исходному уровню. Морфометрический контроль на 42-й день опыта показал правоту наших предположений - количество кальциевых депозитов снижалось в 3,4 раза, а средний размер в 1,9 раза.

В следующем эксперименте нами была поставлена задача изучить еще один способ снижения пересыщения мочи ионами кальция. Для этого нами был использован натрия фитат - вещество, обладающее по данным литературы способностью хелатировать кальций [90].

В условиях эксперимента натрия фитат продемонстрировал весьма ощутимые антилитогенные свойства, причем некоторые его эффекты оказались весьма неожиданными. Так, например, было зафиксировано уменьшение концентрации в моче оксалат-ионов, что, без сомнения, является положительным результатом проведенной терапии. Кроме того, на фоне введения исследуемого препарата наблюдалось некоторое увеличение концентрации в моче фосфат-ионов, что, по-видимому, можно объяснить неспецифической реакцией используемых в методике реагентов с фосфатными группировками самого фитата. Наконец, в процессе лечения не было зафиксировано существенного уменьшения мочевой концентрации ионов кальция, что, на первый взгляд, противоречит хелатирующим способностям фитатов. Однако, как известно, в основе любого хелатного комплекса находится ион металла, который связан с органической молекулой двумя типами связей - ковалентными и водородными. Вместе с тем, кальций по своим основным свойствам слабее натрия, и видимо, его способность вытеснять последний из комплекса с фитат-ионом ограничена. Как следствие - низкая вероятность образования столь необходимых для хелатного комплекса ковалентных связей. Не исключено, что гораздо более важную роль может играть процесс образования водородных связей между ионами кальция, встроенными в грани кристаллической решетки апатита и вевеллита, и поляризованным атомом кислорода в фосфатных группировках фитата. В результате такого взаимодействия кристаллы теряют способность контактировать с отрицательно заряженными центрами молекул стимуляторов кристаллизации и проникать интерстициальное пространство тонкого отдела петли Генле, где происходит первичное камнеобразование, а также не осаждаются на бляшках Рэндалла в просвете собирательных трубок.

К положительным сторонам антилитогенного действия натрия фитата можно отнести нормализацию среды мочи. Учитывая, что образование оксалатов кальция различной гидратированности и их осаждение из пересыщенного раствора максимально активно происходит при значениях рН=4,5-7,0 сдвиг pH мочи в слабощелочную сторону мог в определенной мере ослабить указанный процесс.

Кроме того, важным показателем уменьшения проявлений нефролитиаза под влиянием натрия фитата следует считать выраженное уменьшение активности маркерных ферментов, что указывает на восстановление нормальной структуры и функции уротелия, а также подавление оксидативного стресса. Эти процессы традиционно принято считать взаимосвязанными, поэтому такой синергетический эффект вполне логичен. Вероятно, препарат оказывает протективное действие в отношении почечного эпителия вследствие связывания ионов металлов, подавляя тем самым цепную реакцию образования активных форм кислорода.

В конечном счете, описанные стороны действия натрия фитата привели к главному результату: количество кальциевых депозитов в почках по сравнению с контролем заболевания снизилось в 1,5 раза, а их размер - в 2,8 раза.

Длительное применение натрия пирофосфата, в отличие от натрия цитрата, обусловило уменьшение концентрации оксалат-ионов в моче относительно контроля, несмотря на то что в процессе терапии крысы продолжали потреблять ЭГ, а значит, зафиксированный эффект можно объяснить именно действием пирофосфата, но не изменением экспериментальных условий. Параллельно нормализовалась концентрация фосфат-ионов в моче, что хорошо согласуется с уже известными свойствами пирофосфата как средства, обладающего способностью воздействовать на аппатитное звено камнеобразования [47, 59,79, 89].

Наконец, вследствие проведенного лечения существенно снижалась мочевая концентрация ионов кальция как по сравнению с 21-ми сутками, характеризующими пик экспериментальной патологии, так и относительно интактных значений. Данные наблюдения указывают на то, что под действием натрия пирофосфата ослаблялось пересыщение мочи литогенными ионами, что с высокой долей вероятности могло благоприятно сказаться на течении заболевания.

Кроме того, в результате длительного введения натрия пирофосфата нормализовалась диуретическая функция почек, ослабленная в условиях патологии. Учитывая, что интенсивность пересыщения мочи обратно пропорциональна объему и скорости мочеотделения, зафиксированное действие пирофосфата также могло внести определенный вклад в общую картину антилитогенных эффектов.

Известно, что важным физико-химическим параметром, регулирующим синтез кристаллического материала оксалатной природы и его дальнейшее осаждение из пересыщенного раствора, является рН мочи, причем наиболее активно указанный процесс происходит в диапазоне значений рН 4,5 - 7,0, ослабляясь при изменении среды в щелочную сторону [7]. В данном контексте обращает на себя внимание некоторое защелачивание мочи в первые 10 суток введения натрия пирофосфата. Опираясь на описанные выше физико

I ' 1 ' , «, \ •

120 химические особенности, можно предположить, что в этот период времени образование нерастворимых солей оксалата кальция было уменьшено.

Происходящие изменения экскреторной функции почек сопровождались значительным ослаблением активности в моче маркерных ферментов повреждения почечного эпителия. В ходе проводимой терапии натрия пирофосфатом динамика ферментурии уже после 1-й недели применения изучаемого средства приобрела четкую тенденцию к снижению, в результате чего к моменту окончания эксперимента активность ЛДГ, ГГТ и НАГ возвращалась к нормальному уровню, зафиксированному у здоровых животных, и была существенно ниже показателей контрольной группы. Это означает, что проведенная терапия привела к восстановлению структурной целостности и функциональной активности нефроцитов, устраняя так называемый повреждающий фактор, столь необходимый для формирования почечных конкрементов [11]. Описанные стороны действия натрия пирофосфата при экспериментальном нефролитиазе воплотились в главном -количество кальциевых депозитов в почках уменьшалось в 1,4 раза, а их размер -в 1,9 раза.

Следующие 2 эксперимента были посвящены изучению возможности снижения пересыщения мочи оксалат ионами.

Первым способом стало снижение концентрации оксалат-ионов в просвете почечного канальца. Как уже было сказано выше, для этого нами был использован катион цинка. В литературе хорошо описано благотворное влияние магния на течение оксалатного нефролитиаза [22, 78, 113, 127]. При этом ряд авторов указывает в качестве ингибитора литогенеза и катион цинка [5]. В то время как есть информация и об отрицательной стороне использования

33, 42, 132]. Нами было изучено влияние данного катиона на пересыщение мочи при оксалатном нефролитиазе.

В наших экспериментах применение цинка аспарагината более чем в 2 раза снижало пересыщение мочи оксалат-ионами, при этом, не оказывая влияния на динамику концентрации других литогенных ионов и уровень рН мочи. Стоит отметить, что это сопровождалось возвращением экскреции ЛДГ на исходный уровень, в то время как активность ГТТ и НАГ в ходе проведенной терапии подвергались изменениям в меньшей степени. Полученные результаты морфометрии показали, что в то время как применение цинка аспарагината позволило снизить размер кальциевых депозитов в 1,5 раза, оно не снижало их количеств, а напротив привело к 2-х кратному росту. Это, на наш взгляд, можно связать с описываемой в литературе возможностью цинка включаться в состав конкремента [42].

В следующем эксперименте в качестве средства, снижающего пересыщение, был использован натрия сульфит. Возможность снижения им пересыщения мочи оксалат-ионами строилась нами на основании имеющихся в литературе экспериментальных данных, о способности его in vitro в культуре клеток печени снижать образование оксалат-ионов, ингибируя лактатдегидрогеназу [122]. К тому же, как известно, ЭГ также метаболизируется в печени под действием указанной ферментной системы. Таким образом, это на наш взгляд должно позволить уменьшить пересыщение мочи оксалат-ионами и облегчить протекание оксалатного нефролитиаза.

Применение натрия сульфита снижало пересыщение мочи оксалат-ионами. Стоит отметить, что на 3 день лечения был отмечен рост показателя концентрации, что, по-видимому, связано с медленным развитием эффекта и укладывается в описанное в литературе ингибирование натрия сульфитом лактатдегидрогеназы [122], что было подтверждено последующими измерениями. Начиная с 7-го дня, пересыщение оксалат-ионами постепенно снижалось, в 5 раз по отношению к пику концентрации на 3 день лечения. При этом, как и ожидалось, он не вносил изменений в динамику концентрации фосфат-ионов и ионов кальция. В то же время было зафиксировано увеличение рН, что может говорить о возможном влиянии натрия сульфита на ионный баланс мочи.

Снижение пересыщения мочи оксалат-ионами и некоторое ее ощелачивание благоприятно влияли на течение оксалатного нефролитиаза, что выражалось в значительном снижении активности маркерных ферментов, до уровней в некоторых случаях в разы ниже исходного. А проведенная морфометрия подтвердила результаты биохимии. Количество кальциевых депозитов снижалось в 3 раза, их размер - в 2,1 раза.

В ходе исследования фармакологической коррекции пересыщения мочи были получены результаты, которые натолкнули нас на мысль, о возможности комплексного снижения пересыщения мочи литогенными ионами.

В настоящее время применение комплексных препаратов в консервативном лечении МКБ связано в первую очередь с профилактикой уратных камней комбинациями на основе цитратных смесей, а также растительных препаратов [25]. При этом арсенал лекарственных препаратов для лечения оксалатных камней ограничен. Для реализации своей идеи мы из числа изученных средств отобрали те, что в индивидуальном применении показали хороший эффект и объединили их в комбинацию. При этом их действие должно было быть направленно на снижение разных литогенных ионов. И в ходе следующего эксперимента выяснили, как полученная комбинация будет влиять на пересыщение мочи при оксалатном нефролитиазе. Таким образом, нами были выбраны натрия цитрат - уменьшающий пересыщение ионами кальция, натрия сульфит - снижающий концентрацию в моче оксалат-ионов и натрия пирофосфат оказывавший в наших экспериментах действие на фосфат-ионы и ионы кальция. При этом доза каждого из них составила 1/3 от дозы, используемой в экспериментах по изучению индивидуального влияния указанных веществ на пересыщение мочи. Вещества вводились в виде суспензии в 2% крахмальной слизи, чтобы минимизировать их взаимодействие.

Результаты применения разработанной комбинации были весьма перспективными. Во-первых, это снижение пересыщения мочи оксалат-ионами и ионами кальция, во-вторых, некоторое увеличение содержания в моче фосфат-ионов, в-третьих — это увеличение диуреза, что в среднем было выше исходного уровня на 25%, и рост рН мочи в среднем почти на 1,0. При этом стоит отметить, что развитие снижения концентрации мочевого оксалата происходило уже на 3-й день лечения, что выгодно отличало комбинацию от натрия сульфита, где эффект наступал только на 7-й день. Это все сопровождалось снижением в моче активности маркерных ферментов до своего исходного уровня. И как результат - снижение размеров и количества кальциевых депозитов. При этом результат по количеству кальциевых депозитов находился между натрия сульфитом и натрия пирофосфатом, в то время как размер депозита был самым наименьшим в числе используемых средств вне комбинации. Таким образом, применение комбинации натрия цитрата, натрия сульфита и натрия пирофосфата позволило комплексно снизить пересыщение мочи литогенными ионами, в следствие чего удалось достичь наименьшего размера кальциевых депозитов и низкого значения их количества в поле зрения.