Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Новые фармакологические подходы к лечению мочекаменной болезни

На правах рукописи

ЖАРИКОВ АЛЕКСАНДР ЮРЬЕВИЧ

НОВЫЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К ЛЕЧЕНИЮ МОЧЕКАМЕННОЙ БОЛЕЗНИ

(экспериментальное исследование)

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

1 5 НОЯ 2012

Томск-2012

005055241

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Алтайский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Брюханов Валерий Михайлович

Официальные оппоненты:

Крылова Светлана Геннадьевна, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт фармакологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, лаборатория онкофармакологии, ведущий научный сотрудник

Толстикова Татьяна Генриховна, доктор биологических наук, профессор Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Новосибирский институт органической химии им. H.H. Ворожцова Сибирского отделения Российской академии наук, лаборатория фармакологических исследований отдела природных и биологически активных соединений, заведующая лабораторией

Ласукова Татьяна Викторовна, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Томский государственный педагогический университет», кафедра медико-биологических дисциплин, профессор кафедры

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Новосибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

•> \ 1 00 Защита состоится « » V'-Ss'g-c^S" 2012 г. в часов на заседании

диссертационного совета Д 001.0314)1 при Федеральном государственном

бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт фармакологии»

Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (634028, г. Томск,

пр. Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт фармакологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Автореферат разослан «_» _2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Амосова E.H.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы: Мочекаменная болезнь (МКБ) - распространенное урологическое заболевание, которым в современном мире, по данным статистики, страдают около 10-15% населения развитых стран [Сое et ah, 2005; Daudon et al., 2011; Evan, 2010]. При этом в Российской Федерации средние показатели заболеваемости идентичны общемировым. Мочекаменная болезнь зачастую становится причиной снижения трудоспособности и даже инвалидизации, поэтому борьба с данной патологией имеет важное социальное значение.

Основной нозологической субъединицей МКБ является кальций-оксалатный нефролитиаз, поскольку, согласно современной минералогической классификации, около 60% всех почечных камней состоят преимущественно из кальций-оксалатных биоминералов: вевеллита (СаС204хН20) и веделлита (СаС204*2Н20) [Вощула, 2006; Кадыров и др., 2005; Тиктинский и др., 2000]. Следует отметить, что оксалатному нефролитиазу в основном подвержены наиболее трудоспособные слои населения - мужчины в возрасте от 20 до 50 лет [Вощула, 2006; Голованова и др., 2005; Тиктинский и др., 2000]. Кроме того, проблему в значительной степени усугубляет тот факт, что, по прогнозам специалистов, заболеваемость нефролитиазом в ближайшие годы во всем мире будет неуклонно увеличиваться. Так, например, только в юго-восточных регионах США к 2050 г. ожидается прирост диагностированных случаев МКБ на 1,62,2 миллиона [Evan, 2010]. Аналогичная тенденция имеет место и в нашей стране.

Среди причин массового распространения мочекаменной болезни выделяют хроническую дегидратацию организма человека на фоне глобального потепления климата, ухудшение качества питьевой воды и продуктов питания, бесконтрольное применение лекарственных препаратов, многие из которых могут спровоцировать формирование почечных конкрементов, и др. [Evan, 2010]. Вместе с тем, наиболее весомым фактором происходящего процесса все же следует признать достаточно низкую эффективность существующих сегодня методов лечения и профилактики МКБ [Сое et al., 2005].

Основным методом лечения мочекаменной болезни, начиная с середины 80-х годов двадцатого столетия, по сей день остается дистанционная ударно-волновая литотрипсия, общая суть которой заключается в разрушении почечных камней акустическими волнами инфразвуковой природы [Вощула, 2006; Тиктинский и др., 2000]. Однако, несмотря на все достоинства названного метода, не подлежит сомнению очевидный факт - литотрипсия не излечивает нефролитиаз, поскольку не влияет на его причины и основные звенья патогенеза, приводя к частым рецидивам. При этом она имеет целый ряд противопоказаний и вызывает достаточно серьезные осложнения: гематурия (в 100% случаев), гематомы почки, обструкция мочевыводящих путей осколками раздробленного камня [Вощула, 2006; Лопаткин и др., 2006;

Назаров и др., 2007]. Все это в значительной степени ограничивает эффективность литотрипсии, а также суживает область ее применения в клинической практике.

В связи с вышеназванными обстоятельствами, в медицине до сих пор существует крайне высокая потребность в более эффективном и безопасном лечении МКБ при помощи лекарственных средств, которая не может быть удовлетворена без надлежащего фармакологического исследования. К сожалению, возможности лечения нефролитиаза сегодня очень ограниченны, что до настоящей поры могло объясняться малой изученностью этиологии и патогенеза МКБ. Тем не менее, стимулом к поиску новых методов фармакотерапии МКБ стала череда фундаментальных исследований, произошедших в начале XXI века и ознаменовавшихся настоящим прорывом в области изучения патогенеза МКБ [Сое, 2005; Evan, 2008; Wendt-Nordahl, 2008]. Все это привело к выявлению целого ряда ранее неизвестных потенциальных мишеней для патогенетической терапии нефролитиаза, что открывает широкие перспективы для успешного поиска новых фармакологических подходов к лечению мочекаменной болезни.

Данная работа посвящена разработке новых направлений фармакотерапии мочекаменной болезни, а также выявлению ранее неизвестных механизмов антилитогенного действия некоторых уже используемых с указанной целью лекарственных препаратов. Цель исследования:

Разработать и апробировать в эксперименте новые фармакологические подходы к таргетному патогенетическому лечению мочекаменной болезни. Задачи исследования:

1. Разработать новые фармакологические подходы к таргетной коррекции кальций-оксалатного нефролитиаза, открывающие ранее недоступные возможности консервативного лечения мочекаменной болезни.

2. Оценить эффективность лечения экспериментальной мочекаменной болезни при помощи монотаргетных антилитогенных средств: менадиона натрия бисульфит (средство, стимулирующее образование фрагмента протромбина 1 в почечных канальцах вследствие увеличения выработки протромбина в печени), пиоглитазон (средство, повышающее чувствительность почечных тканей к инсулину), нифедипин (средство, ингибирующее начальную фазу кристаллизации за счет блокады кальциевых каналов на мембране нефроцитов), амилорид (средство, ослабляющее кальциевый парадокс в нефроцитах из-за блокады Na+/H+-обменника на клеточной мембране).

3. Изучить политаргетное влияние антилитогенного средства природного происхождения (гистохром) и фитокомплексов из лекарственных растений (экстракт из культуры клеток марены сердцелистной, культура клеток маакии амурской) на течение экспериментальной мочекаменной болезни.

4. Установить влияние а-токоферола ацетата (средство, обладающее антиоксидантной активностью), натрия цитрата, натрия фитата и натрия

пирофосфата (средства, хелатирующие ионы кальция и кальциевые кристаллы в моче) на уровень оксидативного стресса и экспрессии внутрипочечных ингибиторов кристаллизации (протеин Тамма-Хорсфалла, остеопонтин и бикунин) при экспериментальной мочекаменной болезни. 5. Доказать корреляцию между таргетным действием апробированных антилитогенных средств и конечным терапевтическим эффектом заявленных фармакологических подходов к патогенетическому лечению мочекаменной болезни.

Научная новизна работы: Выполненное исследование открывает новые направления в фармакотерапии мочекаменной болезни. Впервые предложена, теоретически обоснована и экспериментально доказана возможность эффективного монотаргетного патогенетического лечения мочекаменной болезни при помощи менадиона натрия бисульфита (средство, стимулирующее образование фрагмента протромбина 1 в почечных канальцах вследствие увеличения выработки протромбина в печени), пиоглитазона (средство, повышающее чувствительность почечных тканей к инсулину) и нифедипина (средство, ингибирующее начальную фазу кристаллизации за счет блокады кальциевых каналов на мембране нефроцитов). Впервые на доклиническом уровне установлен приоритет политаргетной антилитогенной активности лекарственных средств природного происхождения (препарат гистохром) и фитокомплексов из лекарственных растений (экстракт из культуры клеток марены сердцелистной, культура клеток маакии амурской). Открыты ранее неизвестные механизмы антилитогенного действия а-токоферола ацетата (нормализация экспрессии внутрипочечных ингибиторов кристаллизации и снижение пересыщения мочи оксалат-ионом), натрия цитрата, натрия фитата и натрия пирофосфата (ослабление оксидативного повреждения нефроцитов и нормализация экспрессии внутрипочечных ингибиторов кристаллизации). Доказана корреляция между таргетной направленностью действия апробированных антилитогенных средств и конечным терапевтическим эффектом заявленных фармакологических подходов к патогенетическому лечению мочекаменной болезни. Впервые установлено, что калийсберегающий диуретик амилорид стимулирует кристаллизационные процессы в почках, увеличивая количество кальциевых депозитов, формирующихся в области почечного сосочка. Разработаны новые практические рекомендации, расширяющие возможности патогенетического лечения мочекаменной болезни.

Научная и практическая значимость: Практическая значимость работы заключается в открытии принципиально новых фармакологических подходов к лечению мочекаменной болезни, большинство из которых могут быть быстро и эффективно внедрены в клиническую практику.

Результаты проведенного исследования позволяют сделать целый ряд рекомендаций для практического использования изученных лекарственных препаратов. Показанная антилитогенная эффективность менадиона натрия

бисульфита, пиоглитазона, нифедипина и гистохрома в совокупности с их уже известными свойствами определяет целесообразность применения данных препаратов при мочекаменной болезни, сочетающейся с нарушениями гемостаза, сахарным диабетом II типа, гипертонической болезнью и стенокардией.

Выявленная пролитогенная активность амилорида дает важную информацию о ранее неизвестном побочном действии калийсберегающих диуретиков.

Установленная эффективность экстракта из культуры клеток марены сердцелистной и культуры клеток маакии амурской при экспериментальном нефролитиазе дает основание для их дальнейшего исследования с перспективой создания новых антилитогенных лекарственных препаратов.

Результаты исследования доказывают положения, вносящие вклад в расширение представлений о механизмах антилитогенного действия антиоксидантных и хелатирующих средств и возможности их реализации в терапии мочекаменной болезни.

Положения, выносимые на защиту:

1. Разработаны новые фармакологические подходы к таргетной патогенетической коррекции кальций-оксалатного нефролитиаза: стимуляция синтеза протромбина в печени, повышение чувствительности почечных тканей к инсулину, ингибирование начальной фазы кристаллизационного процесса, устранение кальциевого парадокса в нефроцитах, применение средств природного происхождения.

2. Менадиона натрия бисульфит (средство, стимулирующее образование фрагмента протромбина 1 в почечных канальцах вследствие увеличения выработки протромбина в печени), пиоглитазон (средство, повышающее чувствительность почечных тканей к инсулину), нифедипин (средство, ингибирующее начальную фазу кристаллизации за счет блокады кальциевых каналов на мембране нефрощггов), корригируя комплиментарное им звено патогенеза кальций-оксалатного нефролитиаза, значительно облегчают течение экспериментальной мочекаменной болезни.

3. Лекарственный препарат природного происхождения гистохром и фитокомплексы из лекарственных растений (экстракт из культуры клеток марены сердцелистной, культура клеток маакии амурской) в условиях экспериментальной мочекаменной болезни проявляют комплексное антилитогенное действие на разных этапах патогенеза кальций-оксалатного нефролитиаза (пересыщение мочи ионами оксалата и кальция, повреждение нефроцитов, оксидативный стресс, формирование кальциевых депозитов).

4. Амилорид (средство, ослабляющее кальциевый парадокс в нефроцитах из-за блокады Ка+/Н+-обменника на клеточной мембране) увеличивает количество кальциевых депозитов в почках при экспериментальной мочекаменной болезни.

5. Раскрыты новые механизмы антилитогенного действия а-токоферола ацетата (нормализация экспрессии внутрипочечных ингибиторов кристаллизации и снижение пересыщения мочи оксалат-ионом), натрия цитрата, натрия фитата и натрия пирофосфата (ослабление оксидативного повреждения нефроцитов и нормализация экспрессии внутрипочечных ингибиторов кристаллизации).

6. Доказана корреляция между таргетным действием апробированных антилитогенных средств и конечным терапевтическим эффектом заявленных фармакологических подходов к патогенетическому лечению мочекаменной болезни.

Апробация материалов диссертации: Материалы диссертации докладывались и обсуждались на VI сибирском физиологическом съезде (г. Барнаул, 2008 г.), на Всероссийском конгрессе нефрологов (г. Санкт-Петербург, 2009 г.), на XI научно-практической конференции молодых ученых «Молодежь - Барнаулу» (г. Барнаул, 2009 г.), на VII съезде научного общества нефрологов России (г. Москва, 2010 г.), на Третьем съезде нефрологов юга России (г. Ростов-на-Дону, 2010 г.), на научно-практической конференции, посвященной 35-летию фармацевтического факультета АГМУ (г. Барнаул, 2010 г.), на научно-практической конференции «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (г. Пятигорск, 2011 г.), на научно-практической Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 45-летию педиатрического факультета АГМУ (г. Барнаул, 2011 г.), на ежегодной научной конференции «Фармация и общественное здоровье» (г. Екатеринбург, 2011 г.), на I Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Сибирский медико-биологический конгресс» (г. Барнаул, 2011 г.).

Публикации: Основные положения диссертации отражены в 43 научных работах, в том числе в 3 патентах РФ на изобретение и 25 статьях в журналах, рекомендованных ВАК РФ для диссертаций на соискание ученой степени доктора наук.

Объем и структура диссертации: Диссертация изложена на 242 страницах машинописного текста, иллюстрирована 44 рисунками, 31 таблицей, состоит из общей характеристики работы, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, списка цитируемой литературы, в котором приведено 332 источника, из них 279 -иностранных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы исследования.

Исследования проводились в условиях хронического эксперимента на 452 аутбредных крысах-самцах сток Вистар в возрасте 2-3 месяца массой от 180 до 300 граммов, выращенных в питомнике ГУ НИИ цитологии и генетаки СО РАН (г. Новосибирск), из которых непосредственно для исследования таргетной коррекции нефролитиаза использовались 163. Эксперименты на животных проводились в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации (2000 г.), Европейской конвенцией «О защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных или иных научных целей» (Страсбург, 1986 г.), и Федеральным законом Российской Федерации «О защите животных от жестокого обращения» от 01.01.1997.

Методы исследования.

Моделирование экспериментального оксалатного нефролитиаза осуществлялось согласно общепринятой «этиленгликолевой модели», суть которой заключается в создании гипероксалурии у крыс при помощи двухатомного спирта этиленгликоля, одним из метаболитов которого является оксалат-ион [Khan, 1995].

Моделирование экспериментального нефролитиаза осуществлялось следующим образом. Подопытные животные помещались в индивидуальные клетки, приспособленные для сбора мочи, где находились в условиях стандартной лабораторной диеты, непрерывно получая в виде питья 1%-ный раствор этиленгликоля в свободном доступе на протяжении 6 недель. Введение лекарственных средств осуществлялось ежедневно, начиная с 4-й недели опыта, на протяжении последующих 3-х недель.

Для апробации новых фармакологических подходов к таргетной патогенетической терапии мочекаменной болезни были использованы следующие лекарственные средства:

1. Менадиопа натрия бисульфит.

Менадиона натрия бисульфит является водорастворимым аналогом витамина К. В основе механизма действия - стимуляция синтеза в печени II, VII, IX, X факторов свертывания крови. Препарат вводился животным подкожно в дозе 500 мкг/кг. Раствор для инъекций готовился путем разведения заводской лекарственной формы «Викасол» (ОАО Мосхимфармпрепараты им. H.A. Семашко, г. Москва) физиологическим раствором.

2. Пиоглитазон.

Пиоглитазон относится к группе средств, понижающих резистентность тканей к инсулину. В основе механизма действия - увеличение продукции инсулиновых рецепторов на клеточной мембране за счет повышения транскрипции некоторых инсулин-чувствительных генов. Субстанция пиоглитазона гидрохлорида (Sigma Aldrich, США, каталожный номер Е6910) вводилась в дозе 1 мг/кг внутрь в виде раствора в 2%-ной крахмальной слизи.

3. Нифедипин.

Нифедипин - блокатор кальциевых каналов L-типа. Субстанция нифедипина (Sigma Aldrich, США, каталожный номер N7634) вводилась подопытным крысам внутрь через зонд в дозе 10 мг/кг в виде взвеси в 2%-ной крахмальной слизи.

4. Амилорид.

Амилорид относится к группе калийсберегающих диуретиков. Механизм действия - блокада NaVlC-обмешшка на клеточной мембране. Субстанция амилорида (Sigma Aldrich, США, каталожный номер А7410) вводилась подкожно в виде водного раствора в дозе 500 мкг/кг.

5. а-токоферола ацетат.

а-токоферола ацетат является препаратом витамина Б, обладает антиоксидантным действием. Препарат вводился крысам внутрь через зонд в виде масляного раствора в дозе 300 мг/кг. Раствор для введения готовился путем разведения заводской лекарственной формы под торговым названием «Раствор а-токоферола ацетата (витамина Е) 10% в масле» (ОАО «Фармацевтическая фабрика Санкт-Петербурга», Санкт-Петербург, Россия) оливковым маслом для приготовления лекарственных форм с таким расчетом, чтобы доза препарата содержалась в 1 мл полученного раствора.

6. Хелатирующие средства.

К хелатирующим средствам (средства, связывающие в хелатный комплекс ионы кальция либо кальциевые кристаллы) были отнесены натрия цитрат (субстанция Sigma Aldrich, США, каталожный номер С3674), натрия пирофосфат (субстанция Sigma Aldrich, США, каталожный номер Р8010) и натрия фитат (субстанция Sigma Aldrich, США, каталожный номер Р8810). Первые два вещества вводились крысам внутрь через зонд в дозах 200 мг/кг и 2 г/кг соответственно; в отношении 3-го была выбрана следующая схема: 1%-ный раствор натрия фитата в лечебных целях предоставлялся крысам в качестве питья в свободном доступе.

7. Гистохром.

Гистохром вводился крысам подкожно в дозе 1 мг/кг. Раствор для инъекций готовился путем разведения заводской лекарственной формы гистохрома для внутривенных инъекций (ампулы по 5 мл, содержащие 1%-ный раствор эхинохрома, номер регистрации 002363/01-2003 от 14.04.2003) с таким расчетом, чтобы необходимая доза препарата содержалась в 1 мл изотонического раствора.

8. Экстракт из культуры клеток марены сердцелистной (ККМС).

Экстракт из культуры клеток марены сердцелистной (Rubia cordifolia L„

сем. Rubiaceae) вводился подопытным животным внутрь через зонд в виде взвеси в 2%-ной крахмальной слизи в дозе 75 мг/кг.

9. Культура клеток маакии амурской (ККМА).

Культура клеток маакии амурской (Maackia amiirensis Rupr. et Maxim., семейства бобовые - Fabaceae) вводилась крысам внутрь в виде взвеси в 2%-ной крахмальной слизи в дозе 10 мг/кг.

Определение концентрации оксалат-иона в моче проводилось с использованием метода Высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на приборе «Милихром-А02» по разработанной и запатентованной нами методике (Патент РФ № 2410692).

Определение концентрации фосфат-иона в моче осуществлялось методом фотоэлектроколориметрии (ФЭК), в основе которого лежала реакция образования фосфорно-молибден-ванадиевого комплекса. Для определения концентрации иона кальция в моче также использовался метод ФЭК, в основе которого лежала реакция комплексообразования ионов Са2+ с о-крезолфталеином. Экскреция креатинина с мочой определялась по реакции Яффе методом ФЭК [Брюханов и др., 2009].

Активность лакгатдегидрогеназы (ЛДГ) в моче определялась методом спектрофотометрии по реакции восстановления пирувата до молочной кислоты. Эта реакция катализируется ЛДГ, а ее скорость пропорциональна активности фермента. Каталитическая активность у-глютамилтрансферазы (ГГТ) в моче, для измерения которой использовался метод ФЭК, рассчитывалась пропорционально количеству п-нитроанилина, образующегося в результате реакции взаимодействия Ь-у-глутамил-З-карбокси-4-нитроаншщца и глицилглицина. Определение активности Г*!-ацетил-р-О-глюкозаминидазы (НАГ) в моче проводилось по модифицированной методике МагисЬ. Согласно этой методике, активность НАГ пропорциональна количеству п-нитрофенола, образующегося в результате реакции гидролиза п-нитро-К-ацетил-р-глюкозамида, которую катализирует указанный фермент [Брюханов и др., 2009].

Для изучения активности процесса свободно-радикального окисления и проведения морфологических исследований у подопытных крыс в каждой серии экспериментов производился забор почек. С этой целью животных декапитировали на специальной лабораторной гильотине. У декапитированных животных изымались обе почки. Одна почка использовалась для изучения активности в почечной ткани процесса свободно-радикального окисления, другая - для проведения морфологических исследований.

Активность процесса свободно-радикального окисления (СРО) в гомогенате почечной ткани оценивалась по совокупности показателей прооксидантного и антиоксидантного статусов. Показателями прооксидантного статуса служили концентрация тиобарбитуратреактивных продуктов (ТБРП) и общая прооксидантная активность (ОПА), а показателями антиоксидантного статуса явилась активность антиоксидантных ферментов: глутатионпероксидазы (ГПО), супероксиддисмутазы (СОД) и катапазы (КАТ).

Тиобарбитуратреактивные продукты - малоновый диальдегид и другие продукты окисления свободных жирных кислот - определяли по реакции с тиобарбитуровой кислотой. Общую прооксидантную активность оценивали по накоплению продуктов перекисного окисления ТВИН-80, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой. Активность глутатионпероксидазы определялась

по снижению концентрации восстановленного глутатиона. Активность супероксиддисмутазы определялась по подавлению образования нитроформазана - окрашенного продукта окисления нитротетразолия супероксидными радикалами, образующимися при взаимодействии феназинметасульфата и никотинамиддинуклеотида (НАДН). В основу методики определения активности каталазы была положена способность фермента подавлять окисления молибдата натрия пероксидом водорода [Талалаева, 2006].

Срезы почек крыс толщиной 10-15 мкм окрашивались гематоксилином и эозином, а затем на них импрегнацией серебром по гистохимическому методу Косса идентифицировались кальциевые депозиты и при помощи компьютерной программы на снимках подсчитывалось количество кальциевых депозитов в поле зрения и определялся их размер.

Определение экспрессии малонового диальдегида (МДА), супероксиддисмутазы, протенна Тамма-Хорсфалла (ПТХ), остеопонтина (ОПН) и бикунина (БИК) проводилось при помощи непрямого двухшагового стрептавидин-биотинового метода с контролем специфичности реакции [Гуревич, 1999; Яцковский, 1987].

Результаты экспериментальных исследований обработаны следующими статистическими методами: сравнение внутри экспериментальных групп и между группами при одинаковой выборке проводилось с использованием критерия Вилкоксона; межгрупповые сравнение при разной выборке осуществлялись с использованием критерия Манна-Уитни. Разница сравниваемых средних считалась достоверной, если показатель достоверности (р) был меньше 0,05. Корреляционный анализ между изученными параметрами проводился по результатам измерений на 42-й день опыта с использованием рангового коэффициента корреляции Спирмена (р). Корреляционная связь признавалась существенной, если значение коэффициента | р \ превышало 0,3 при условии, что достоверность коэффициента по t-критерию Стьюдента (а) была меньше 0,05 [50]. Все расчеты велись на персональном компьютере по общепринятым формулам. Для расчетов использовалась компьютерная программа SigmaStat 3.5 (Systat Software Inc., США) для Windows.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Приступая к изложению результатов проведенных экспериментов, еще раз отметим, что основой, на которой базировалось наше исследование, стала разработка новых фармакологических подходов к таргетной коррекции кальций-оксалатного нефролитиаза при мочекаменной болезни (рис. 1). Такими походами стали: стимуляция синтеза протромбина в печени (менадиона натрия бисульфит), повышение чувствительности почечных тканей к инсулину (пиоглитазон), ингибирование начальной фазы кристаллизационного процесса (нифедипин), устранение кальциевого парадокса в нефроцитах (амилорид), применение средств природного происхождения (гистохром) и фитокомплексов из растений (экстракт из культуры клеток марены сердцелистной, культура клеток маакии амурской).

Кроме того, предполагалось изучить новые механизмы антилитогенного действия а-токоферола ацетата, натрия цитрата, натрия фитата и натрия пирофосфата.

Основные звенья патогенеза оксалатного нефролитиаза

<

са н

о ^

и

Сц

и ад

I

Й

х и и о н к

н

X <

14

и и

рц

£ О

к о

<

д н

о «

Й 0-, о из

ИИ

л X

X «

о и к |=: а н

з

н

м

I-

н

а «

о с

Рис. 1. Схема разработки новых фармакологических подходов к таргетнон коррекции кальций-оксалатного нефролитиаза

Эксперименты показали, что в ходе моделирования оксалатного нефролитиаза наблюдались характерные биохимические и морфологические признаки развития заболевания.

Так, отмечалось выраженное пересыщение мочи оксалат-ионом на уровне 1,1-1,7 мг/мл, притом что до начала опыта этот ион в моче не обнаруживался (табл. 1).

Кроме того, наблюдалось существенное увеличение активности маркерных ферментов повреждения почечного эпителия: ЛДГ - в 2,9 раза к моменту завершения эксперимента; ГГТ - в 1,6 раза; НАГ - в 3,8 раза (табл. 2).

Таблица 1

Показатели экскреторной функции почек у крыс при

экспериментальном оксалатном нефролитиазе_

Дни Оксалат мг/мл Фосфат мг/мл Кальций мкмоль/мл Диурез мл/ сутки Креатинин ммоль в сутки

Исходный уровень

- 9,1±0,38 (п=15) 1,8±0,10 (п=15) 5,3±0,36 (п=15) 7,1±0,38 (п=15)

Моделирование нефролитиаза

3 1,3 ±0,29* (п=12) 9,0±0,47 (п=12) 1,9±0,19 (п=8) 5,9±0,65 (п=12) 9,3±0,66* (п=8)

7 1,2±0,14* (п=15) 8,0±0,44 (п=15) 1,3±0,09* (п=15) 5,4±0,48 (п=15) 8,5±0,61 (п=15)

10 1,3±0,10* (п=9) 8,5±0,40 (п=9) Не определялось 6,5±0,64 (п=9) Не определялось

14 1,4±0,13* (п=15) 8,2±0,33 (п=15) 1,6±0,22 (п=15) 5,9±0,43 (п=15) 6,3±0,44 (п=15)

17 1,1±0,10* (п=15) 8,1±0,21 (п=15) 1,9±0,13 (п=15) 7,7±0,96* (п=15) 10,9±0,63* (п=15)

21 1,3±0,13* (п=15) 7,4±0,46* <п=15) 1,9±0,23 (п=15) 6,7±0,55* (п=15) 7,2±0,49 (п=15)

24 1,6±0,17* (п=15) 5,9±0,43* (п=15) 1,4±0,14 (п=15) 7,6±1,41 (п=15) 9,2±0,84 (п=15)

28 1,6±0,16* (п=15) 6,2±0,40* (п=15) 1,5±0,10 (п=15) 7,7±0,78* (п=15) 8,6±1,00 (п=15)

31 1,3±0,12* (п=8) 7,9±0,63 (п=8) 1,5±0,28 (п=8) 9,4±1,73* (п=8) Не определялось

35 1,3±0,12» (п=15) 6,1±0,50* (п=15) 1,6±0,06 (п=15) 8,2±1,01* (п=15) 8,4±0,74 (п=15)

38 1,7±0,21* (п=9) 8,2±0,17 (п=8) Не определялось 5,6±0,64 (п=9) 9,8±0,68* (п=9)

42 1,3±0,14* (п=15) 6,2±0,45* (п=15) 1,6±0,17 (п=15) 9,0±1,19* (п=15) 8,3±1,03 (п=14)

Примечание: здесь и далее: звездочкой обозначены достоверные изменения относительно исходного уровня (р<0,05); п - количество проб для анализ!

Параллельно у больных животных наблюдался выраженный оксидативный стресс, о чем в первую очередь свидетельствовало увеличение концентрации ТБРП в 8,3 раза относительно уровня интактных крыс (с 2,9±0,18 мкмоль до 24,1±0,62 мкмоль). Вместе с этим была выявлена некоторая тенденция к увеличению ОПА: с 75,5±2,71 % у интактных крыс до 78,2*2,71 % после моделирования заболевания (рис. 2).

Таблица 2

Ферментативная активность в моче крыс с экспериментальным _оксалатным нефролитиазом_^_

лдг ГГТ НАГ (х103)

Дни и / мг креатинина в сутки

1 {сходный уровень

0,18±0,015 (п=15) 0,26±0,015 (п=15) 8,4±0,32 (п=15)

Моделирование нефролитиаза

7 0,32±0,024* (п=15) 0,30±0,015 (п=15) 14,4±2,48* (п=15)

14 0,50±0,033* (п=15) 0,32±0,011* (п=15) 19,4±1,40* (п=15)

21 0,52±0,032* (п=15) 0,37±0,015* (п=15) 20Д±2,11* (п=15)

28 0,44±0,018* (п=15) 0,30±0,010 (п=15) 17,2±0,90* (п=15)

35 0,45±0,025* (п=15) 0,42±0,049* (п=15) 15,4±1,26* (п=15)

42 0,53±0,018* (п=15) Не определялось 31,9±2,86* (п=15)

ТБРП (мкмоль) ОПА (%)

Рис. 2. Показатели оксидантного статуса в почечной ткани крыс при

экспериментальном оксалатном нефролитиазе Примечание:

По вертикальной оси: слева - концентрация ТБРП, мкмоль; справа - ОПА, %.

- интактные крысы;

- крысы с нефролитиазом.

Кроме того, активность ГПО достоверно уменьшилась в 1,3 раза (с 37,4±1,88 % в норме до 29,9±2,45 % на фоне нефролитиаза; р<0,02). Аналогичные изменения прослеживались в активности СОД. Так, в почках крыс, 6 недель получавших этиленгликоль, она составила 11,6±1,26 %, что в 1,3 раза уступало показателю интактных животных — 14,9±1,61 %. Активность каталазы, несмотря на длительное употребление крысами этиленгликоля, оставалась стабильной: 11,9±0,79 % у здоровых животных против 13,6±1,50 % на фоне нефролитиаза (рис. 3).

СОД 04) КАТ{%)

ГПО (%)

Рис. 3. Активность антиоксидантных ферментов в почечной ткани крыс при экспериментальном оксалатном нефролитиазе

Примечание:

По вертикальной оси: активность ферментов, %;

Н- интактные крысы; - крысы с нефролитиазом.

Далее были изучены особенности экспрессии внутрипочечных ингибиторов кристаллизации в условиях моделирования оксалатного нефролитиаза. Оказалось, что после 6 недель применения этиленгликоля степень экспрессии ПТХ относительно интактных крыс достоверно увеличилась на 4,6%, экспрессия ОПН ослабилась на 3,2%, а экспрессия БИК незначительно превышала показатели интактной группы.

Финальным подтверждением возникновения литогенных процессов в почках крыс, 42 дня употреблявших этиленгликоль, явились результаты морфометрии почечных срезов (рис. 4). Как и ожидалось, в области почечного сосочка фиксировались многочисленные кальциевые депозиты, количество которых составило 27,4±3,23 в поле зрения, а их средний размер - 12,0±0,62 мкм.

Таким образом, в результате проведенных экспериментов получена ясная патогенетическая картина нефролитиаза у крыс, длительного употреблявших в качестве питья раствор этиленгликоля.

Рис. 4. Экспериментальный нефролитиаз, 42 сут. Кальциевый депозит в просвете собирательной трубки. Окраска по Коссу. х 400.

Предполагалось, что одним из новых фармакологических подходов к патогенетическому лечению мочекаменной болезни должна стать медикаментозная стимуляция синтеза протромбина, поскольку важным звеном патогенеза кальций-оксалатного нефролитиаза является ослабление активности внутрипочечных ингибиторов кристаллизации, к числу которых относится фрагмент протромбина 1 [Kumar, 2003]. Учитывая это, мы изучили влияние менадиона натрия бисульфита - водорастворимого аналога витамина К, стимулирующего синтез протромбина в печени - на течение экспериментальной мочекаменной болезни.

Было установлено, что во время курса лечения в 2 раза относительно периода моделирования нефролитиаза снижалась концентрация в моче оксалат-иона (табл. 3).

Кроме того, после лечения наблюдалось уменьшение активности в моче ЛДГ и ГГТ вплоть до уровня интактных крыс (табл. 4).

Параллельно было установлено, что концентрация ТБРП на 42-й день опыта равнялась 21,0±1,09 мкмоль, уступая контрольному показателю на 15% (р<0,05). Одновременно в 1,1 раза ослаблялась ОПА: с 78,2±2,24 % в контроле до 70,0±3,64 % по итогам курса применения изучаемого средства.

На этом фоне были отмечены характерные изменения активности антиоксидантных ферментов. В первую очередь это касается активности СОД, которая у пролеченных крыс в 2 раза превосходила показатели,

зафиксированные у животных контрольной группы: 23Д±0,95 % против 11,6±1,26 % (р<0,001).

Параллельно наблюдалось некоторое увеличение активности КАТ в почках крыс, получавших препарат. Оказалось, что величина данного критерия антиоксидантной защиты составила 15,9±1,17 %. В сравнение с контролем заболевания это значение было больше в 1,2 раза, а относительно интактной группы - в 1,3 раза (р<0,05).

Таблица 3

Показатели экскреторной функции почек крыс в условиях лечения экспериментального оксалатного нефролнтиаза _ менадиона натрия бисульфитом__

Дни Оксалат мг/мл Фосфат мг/мл Кальций мкмоль/мл Диурез мл/сутки Креатинин ммоль/ сутки

Исходный уровень

8,8±0,18 1,7±0,06 4,7±0,33 7,1±0,30

(п=12) (п=12) (п=12) (п=12)

Моделирование нефролнтиаза

1,8±0,30* 8,8±0,43 Не 4,4±0,63 7,2±0,61

(п=12) (п=12) определялось (п=12) (п=12)

1,6±0,26* 9,7±0,73 1,6±0,23 5,7±0,62 9,8±0,63*

/ (п=12) (п=12) (п=12) (п=12) (п=8)

10 1,6±0,08* 8,7±0,49 1,б±0,19 5,0±0,54 8,0±0,44

(п=11) (п=12) (п=8) (п=12) (п=8)

14 1,2±0,10* 8,3±0,67 1,6±0,25 6,2±1,12 8,4±0,83

(п=10) (п=10) (п=10) (п=10) (п=9)

17 1,7±0,17* 9,1±0,51 1,8±0,15 4,9±0,67 8,0±0,49

(п=12) (п=12) (п=9) (п=12) (п=10)'

21 1,3±0,21* 7,8±0,76 1,6±0,10 5,4±0,73 8,6±0,51*

(п=8) (п=8) (п=8) (п=8) (п=8)

Лечение

24 1,8±0,19* 7,5±1,15 1,5±0,12 4,4±1,16 7,3±0,6б

(п=9) (п=8) (п=9) (п=9) (п=9)

28 0,9±0,0б* (п=9) 8,8±0,54 (п=9) 1,2±0,12 (п=9) 7,5±1,27 (п=12) Не определяло сь

31 1,0±0,07* 8,4±0,50 1,4±0,16 6,2±1,19 8,7±0,99*

(п=8) (п=8) (п=8) (п=8) (п=8)

35 0,9±0,08* 8,1±0,55 1,5±0,21 6,3±1,03 8,4±0,47*

(п=8) (п=9) (п=9) (п=9) (п=9)

38 1,0±0,10* 8,1±0,37 Не 7,3±1,19 9,6±1,06

(п=10) (п=11) определялось (п=11) (п=11)

42 0,9±0,08 7,7±0,35 1,4±0,18 8,6±0,94* 9,9±0,58*

(п=12) (п=Ч0) (п=10) (п=12) (п=10)

Наиболее весомым доказательством эффективности коррекции экспериментального кальций-оксалатного нефролитиаза менадиона натрия бисульфитом стали результаты морфометрического исследования, согласно которым количество кальциевых депозитов в области почечного сосочка подопытных животных уменьшилось в 1,5 раза (с 27,4±3,22 до 18,2±2,13 в поле зрения; р<0,02), а их средний размер - в 1,7 раза (с 12,0±0,62 мкм до 7,0±0,28 мкм; р<0,001).

Таблица 4

Показатели ферментативной активности в моче крыс в условиях лечения экспериментального оксалатного нефролитиаза

менадиона натрия бисульфитом

ЛДГ ГГТ НАГ

Дни и / мг креатинина в сутки

Исходный уровень

0,21±0,011 (п=9) 0,28±0,015 (п=8) 9,3±0,19 (п=11)

Моделирование нефролитиаза

7 0,29±0,014* (п=12) 0,30±0,010 (п=8) Не определялось

14 0,44±0,030* (п=12) 0,32±0,027 (п=8) 17,2±1,24* (п=12)

21 0,50±0,023* (п=9) 0,35±0,030* (п=8) 12,8±0,98* (п=8)

Лечение

28 0,33±0,026* (п=9) 0,27±0,016 (п=12) 9,1±0,32 (п=12)

35 0,28±0,022* (п=12) 0,22±0,025 (п=9) 10,0±0,34 (п=8)

42 0,27±0,031 (п=9) 0,29±0,020 (п=10) 12,8±0,35* (п=8)

Еще одним перспективным фармакологическим подходом к патогенетическому лечению мочекаменной болезни, на наш взгляд, может являться применение лекарственных средств, повышающих чувствительность тканей к инсулину, поскольку установлено, что при снижении чувствительности почечной ткани к инсулину ослабляется ингибирующая функция ренального цитрата, в результате чего возникают благоприятные условия для формирования почечных конкрементов [Сирюй, 2007]. В этой связи мы изучили влияние пиоглитазона - классического представителя указанной группы - на течение кальций-оксалатного нефролитиаза в эксперименте.

Проведенные опыты показали, что под влиянием испытуемого препарата произошло уменьшение мочевой концентрации оксалат-иона в 2,8-3,5 раза относительно периода моделирования патологии (табл. 5).

Таблица 5

Показатели экскреторной функции почек крыс в условиях лечения экспериментального оксалатного нефролнтназа

пиоглитазоном _

Дни Оксалат мг/мл Фосфат мг/мл Кальций мкмоль/мл Диурез мл/сутки Креатинин ммоль/ сутки

Исходный уровень

- 8,0±0,30 (п=12) 1,8±0,10 (п=12) 6,0±0,63 (п=12) 7,4±0,47 (п=24)

Моделирование нефролитиаза

3 1,5±0,19 (п=12) 9,3±0,47 (п=11) 1,4±0,12* (п=12) 5,7±1,10 (п=12) 7,1±0,78 (п=12)

7 1,3±0,15 (п=10) 8,5±0,56 (п=10) 1,4±0,15* (п=12) 5,5±0,70 (п=12) 8,1±0,52 (п=12)

10 1,1±0,09 (п=12) 8,0±0,34 (п=12) 2,0±0,16 (п=12) 5,5±0,70 (п=12) 6,9±0,78 (п=12)

14 1,2±0,15 (п=9) 9,8±1,02* (п=9) 1,8±0,18 (п=8) 5,7±0,88 (п=9) 8,1±0,80 (п=8)

17 1,4±0,17 (п=11) 9,1±0,55 (п=12) 1,8±0,17 (п=12) 5,4±0,77 (п=12) 7,5±0,73 (п=12)

21 1,4±0,16 (п=9) 10,2±1,47 (п=12) 1,8±0,20 (п=11) 6,1±1,04 (п=12) 8,6±0,73 (п=12)

Лечение

24 0,8±0,10 (п=11) 9,9±1,13 (п=11) 1,3±0,12* (п=11) 6,0±1,16 (п=11) 8,4±0,96 (п=11)

28 0,7±0,09 (п=12) 8,2±0,39 (п=12) 1,7±0,08 (п=12) 8,4±1,08* (п=12) 10,3±0,72* (п=12)

31 0,6±0,07 (п=12) 8,0±0,38 (п=12) 1,5±0,09 (п=12) 7,9±1,14 (п=12) 9,2±0,76* (п=12)

35 0,6±0,06 (п=12) 7,6±0,57 (п=12) 1,6±0,12 (п=12) 10,0±1,52* (п=12) 10,9±0,91* (п=12)

38 0,5±0,04 (п=12) 7,2±0,48 (п=12) Не определялось 11,9±1,56* (п=12) 12,0±0,79* (п=12)

42 0,4±0,03 (п=12) 6,7±0,58* (п=12) 1,3±0,06* (п=12) 12,4±1,80* (п=12) 11,8±0,75* (п=12)

На этом фоне активность ЛДГ, ГГТ и НАГ, значительно повышенная при моделировании нефролитиаза, в результате лечения многократно снижалась, из-за чего к концу курса применения препарата соответствовала исходным цифрам или даже была меньше таковых (табл. 6).

Наряду с этим, длительное непрерывное введение испытуемого лекарственного средства обусловило значительное уменьшение концентрации ТБРП относительно контроля. Оказалось, что величина данного параметра после проведенного лечения равнялась 11,4±1,07 мкмоль, что в 2,1 раза уступало контрольному уровню (р<0,001).

Таблица 6

Показатели ферментативной активности в моче крыс в условиях лечения экспериментального оксалатного нефролитиаза

пиоглитазоном

лдг ГТТ НАГ (хЮ3)

Дни и / мг креатинина в сутки

Исходный уровень

0,22±0,016 (п-12) 0,34±0,010 (п=9) 9,5±0,46 (п=10)

Моделирование нефролитиаза

7 0,35+0,030* (п=12) 0,42±0,014* (п=12) 9,8±0,45 (п=12)

14 0,46±0,031* (п=9) 0,42±0,018* (п=9) 14,8±0,49* (п=9)

21 0,44±0,028* (п=12) 0,41±0,014* (п=11) Не определялось

Лечение

28 0,37±0,022* (п=12) 0,40±0,013* (п=12) 5,9±0,24* (п=12)

35 0,07±0,013* (п=11) 0,27±0,017* (п=12) 5,5±0,17* (п=12)

42 0,10±0,016* (п=12) Не определялось 8,0±0,19* (п=12)

Параллельно отмечалось ослабление ОПА на 17% по сравнению с таковой у крыс с вызванным нефролитиазом (р<0,01). Как следствие, величина суммарной активности всех прооксидантов в почках пролеченных животных составила 66,9±3,05 %.

Весьма примечательные изменения на фоне длительного введения пиоглитазона происходили в активности антиоксидантных ферментов. Так, антиоксидантная активность СОД и КАТ по итогам проведенного курса терапии существенно возрастала. Как оказалось, активность СОД в почках, изъятых в подопытной группе на 42-й день эксперимента, составила 24,7±1,25 %, превышая контрольные цифры в 2,1 раза (р<0,001), и это значение было больше, чем у интактных животных, в 1,6 раза (р<0,001). Активность КАТ под влиянием пиоглитазона возрастала еще более интенсивно: величина данного показателя в почках литогенезированных

крыс, получавших лечение, составила 32,9±2,21 %, что превосходило контрольный уровень в 2,4 раза (р<0,001), а интактное значение — в 2,8 раза.

Проведенная морфометрия срезов почек крыс, которым 3 недели вводился пиоглитазон, подтвердила высокую антилитогенную эффективность выбранного способа фармакотерапии нефролитиаза. Оказалось, что после курса применения препарата количество кальциевых депозитов относительно контрольной группы уменьшилось в 19,6 раза (с 27,4±3,22 до 1,4±0,27 в поле зрения), а их средний размер - в 4 раза (с 12,0±0,62 мкм до 3,0±0,34 мкм).

Согласно современной минералогической классификации, практически все почечные камни состоят из кальциевых биоминералов (вевеллит, веделлит, апатит, брушит и др.). Установлено, что процесс образования кальциевых камней берет свое начало в интерстиции почечного сосочка, прилегающем к тонкому отделу петли Генле, что обусловлено анатомическими и физиологическими особенностями данного отдела нефрона. При этом важнейшее значение здесь имеют процессы трансмембранного переноса ионов кальция, которые определяют первичное увеличение концентрации данного электролита в интерстициальном пространстве. Известно, что на базальной мембране клеток дистальных канальцев, а также собирательных трубок внешнего и внутреннего мозгового веществ почки присутствуют кальциевые каналы Ь-типа (Са„1.2-каналы) [НауаэЫ, 2007]. Не исключено, что они могут играть существенную роль в указанном выше транспорте ионов Са2+. В этой связи логично было предположить, что перспективным фармакологическим направлением лечения мочекаменной болезни может стать применение блокаторов кальциевых каналов, представителем которых для исследования нами был выбран нифедипин.

Оказалось, что концентрация иона кальция в моче под влиянием нифедипина существенно снижалась, вследствие чего к концу опыта она в 2,6 раза уступала исходному уровню. Одновременно фиксировалось снижение мочевой концентрации оксалат-иона в 4,6 раза по сравнению с периодом моделирования патологии (табл. 7).

Кроме того, по результатам эксперимента у крыс с нефролитиазом, получавших в течение трех недель нифедипин, было выявлено существенное снижение активности ЛДГ и ГГТ вплоть до уровня интактных животных или даже ниже него (табл. 8).

Параллельно было установлено, что у пролеченных животных концентрация ТБРП в почечном гомогенате уступала таковой в контроле заболевания в 1,6 раза: 15,1±1,66 мкмоль против 24,1±0,62 мкмоль соответственно (р<0,001).

Одновременно фиксировался существенный рост активности КАТ. Оказалось, что по итогам трехнедельного курса терапии нифедипином она равнялась 21,4±2,19 %, что было выше контрольного уровня в 1,8 раза (р<0,001), а также на 80% превосходило средний показатель интактной группы.

Таблица 7

Показатели экскреторной функции почек крыс в условиях лечения экспериментального оксалатного нефролитиаза нифедипином

Дни Кальций мкмоль/мл Оксалат мг/мл Фосфат мг/мл Диурез мл/сутки Креатинин ммоль/ сутки

Исходный уровень

1,8±0,07 (п=15) - 8,8±0,26 (п=25) 3,1 ±0,22 (п=30) 5,9±0,23 (п=30)

Моделирование нефролитиаза

3 1,9±0,11 (п=15) 1,4±0,16* (п=14) 10,0±0,80 (п=15) 3,2±0,40 (п=15) 6,5±0,51 (п=15)

7 Не определял ось 2,7±0,21* (п=15) Не определялось 2,7±0,22 (п=15) 7,2±0,19* (п=15)

10 1,7±0,10 (п=15) 2,2±0,17* (п=15) 8,9±0,60 (п=15) 3,8±0,31 (п=15) 7,1±0,33* (п=15)

14 1,7±0,14 (п=14) 2,3±0,19* (п=15) 10,1±0,80 (п=15) 4,5±0,48 (п=15) 7,6±0,29 (п=15)

17 1,7±0,06 (п=15) 2,0±0,12* (п=14) 8,5±0,25 (п=15) 4,0±0,24 (п=14) 6,4±0,24 (п=13)

21 1,5±0,10 (п=?1 2,3±0,11* (п=15) 7,6±0,27 (п=15) 5,7±0,61* (п=15) 7,9±0,39* (п=15)

Лечение

24 1,7±0,11 (п=11) 1,5±0,21* (п=11) 6,4±0,29* (п=11) 8,1±0,94* (п=11) 9,7±0,77* (п=11)

28 1,2±0,13* (п=15) 0,8±0,08* (п=15) 5,4±0,32* (п=15) 9,1±0,48* (п=15) 9,7±0,36* (п=15)

31 1,7±0,1б (п=15) 0,8±0,15* (п=15) 6,7±0,78* (п=15) 7,6±1,12* (п=15) 12,3±1,60* (п=15)

35 1,0±0,12* (п=10) 0,7±0,08* (п=10) 5,5±0,56* (п=10) 9,0±1,15* (п=10) 9,4±0,36* (п=10)

38 0,7±0,05* (п=10) 0,5±0,06* (п=9) 4,2±0,56* (п=10) 10,5±1,65* (п=10) 9,8±0,90* (п=10)

42 0,8±0,08* (п=14) 0,5±0,07* (п=14) 4,7±0,5б* (п=14) 11,5±1,19* (п=14) 10,5±0,53* (п=14)

Таблица 8

Показатели ферментативной активности в моче крыс в условиях лечения экспериментального оксалатного нефролитиаза _нифедипином___

лдг ГТТ НАГ(хЮ^)

Дни и / мг креатинина в сутки

Исходный уровень

0,15±0,015 (п=15) 0,31±0,014 (п=10) 6,1±0,47 (п=14)

Моделирование нефролитиаза

7 0,42±0,021* Гп=15) 0,32±0,013 (п=13) 11,2±0,40* (п=15)

14 0,43±0,023* (п=15) 0,31±0,017 (п=11) 14,3 ±0,71* (п=9)

21 0,44±0,019* (п=10) 0,38±0,017* (п=10) 12,5±0,59* (п=8)

Лечение

28 0,40±0,018* (п=11) Не определялось 12,1±0,64* (п=11)

35 0,28±0,024* (п=11) 0,25±0,023* (п=11) 11,4±0,38* (п=10)

42 0,15±0,036 (п=10) 0,23±0,034* (п=10) 9,5±0,22* (п=10)

По результатам морфометрии, на фоне нифедипина размер кальциевых депозитов относительно контрольного показателя не изменился, однако их количество в области почечного сосочка уменьшилось в 4,6 раза (с 27,4±3,22 до 5,9±1,11 в поле зрения; р<0,001).

Существует предположение, что важную роль в камнеобразовании играет «кальциевый парадокс» в нефроцитах. Вместе с тем, известно, что кальциевый парадокс, например, в кардиомиоцитах может быть ослаблен лекарственными средствами, ингибирующими №+/Н+ обменник на мембране клеток, к числу которых относятся калийсберегающие диуретики [Зверев, 2003]. Поэтому далее мы изучили влияние амилорида на течение экспериментального оксалатного нефролитиаза.

По результатам эксперимента, была получена картина, существенно отличающаяся от описанных выше данных.

С одной стороны, на фоне применения диуретика наблюдались отчетливые признаки снижения мочевой концентрации оксалат-иона с 0,7-0,9 мг/мл в период моделирования заболевания до 0,4-0,5 мг/мл во время лечения, что можно было расценивать в качестве положительного прогностического признака лечения нефролитиаза.

Однако оказалось, что, несмотря на длительное применение амилорида, активность всех трех маркерных ферментов повреждения почечных тканей в целом сохранялась неизменной на протяжении всего опыта.

Более того, по результатам морфометрического исследования было установлено, что у крыс, получавших амилорид, происходило увеличение количества кальциевых депозитов в 1,9 раза относительно контроля заболевания (с 27,4±3,22 до 53,0±4,48 в поле зрения; р<0,001).

Существенное значение в процессе формирования почечных камней имеет оксидативный стресс, из-за чего в последние годы для лечения нефролшиаза применяют антиоксиданты [Битйга, 2005]. Поэтому в следующей части нашего исследования мы воспроизвели влияние а-токоферола ацетата на течение оксалатного нефролитиаза в эксперименте, чтобы раскрыть новые механизмы его антилитогенного действия.

Оказалось, что концентрация ТБРП после проведенного курса лечения равнялась 2,9±0,30 мкмоль, что в 8,3 раза было меньше чем в контроле заболевания и полностью соответствовало уровню здоровых крыс. Кроме того, под влиянием а-токоферола ацетата наблюдалось существенное ослабление ОПА. Так, если в контрольной группе ОПА имела значение 78,2±2,24 %, то у подопытных животных она была меньше в 1,4 раза и равнялась 54,2±3,89 % (р<0,001).

Таблица 9

Показатели ферментативной активности в моче крыс в условиях лечения экспериментального оксалатного нефролитиаза

а-токоферола ацетатом

лдг ггт НАГ

Дни и / мг креатинина в сутки

Исходный уровень

0,25±0,009 (п=15) 0,25±0,026 (п=15) 6,7±0,56 (п=13)

Моделирование нефролитиаза

7 0,33±0,025* (п=9) 0,29±0,036 (п=9) 11,0±1,40* (п=9)

14 0,49±0,025* (п=11) Не определялось 9,0±0,40* (п=11)

21 0,61±0,040* (п=13) 0,36±0,022* (п=13) 11,0±1,18* (п=13)

Лечение

28 0,45±0,028* (п=14) 0,10±0,022* (п=14) 8,3±0,24* (п=14)

35 0,29±0,027 (п=14) 0,24±0,017 (п=14) 7,6±0,32 (п=14)

42 0,28±0,024 (п=15) 0,25±0,011 (п=15) 6,2±0,46 (п=15)

Как следует из таблицы 9, динамика активности ЛДГ, ГГТ и НАГ в условиях фармакологической коррекции экспериментального нефролитиаза путем длительного применения а-токоферола ацетата, характеризовалась единой тенденцией: существенное увеличение в первые 3 недели, а затем -последовательное снижение вплоть до уровня здоровых животных к концу опыта.

Для установления новых сторон антилитогенного действия а-токоферола ацетата представлялось интересным изучить его влияние на экспрессию внутрипочечных ингибиторов кристаллизации - ПТХ, ОПН и БИК - при экспериментальном нефролитиазе. Было установлено, что на фоне лечения происходило ослабление экспрессии ПТХ, усиление экспрессии ОПН, а также уменьшение экспрессии БИК, в результате чего уровень экспрессии ПТХ и ОПН после курса антиоксидантной терапии соответствовал таковому у здоровых животных, а аналогичный показатель для БИК даже уступал интактным цифрам на 2,7% (табл. 10).

Таблица 10

Показатели экспрессии внутрипочечных ингибиторов кристаллизации в условиях лечения экспериментального _ нефролитиаза «-токоферола ацетатом_

Ингибиторы кристаллизации Группы животных

Интактные крысы . Крысы с нефролитиазом Подопытные крысы

Степень экспрессии

Баллы % Баллы % Баллы %

Протеин Тамма-Хорсфалла 2+ 49,8 3+ 54,4 2+ 51,1

(п=22) (п=20) (п=30)

Остеопонтин 2+ 50,0 1+ 46,8 2+ 51,2

(п=30) (п=30) (п=30)

Бикунин 2+ 50,6 2+ 52,0 1+ 47,9

(п=30) (п=30) (п=30)

Параллельно фиксировались благоприятные изменения в экскреторной функции почек у крыс с нефролитиазом, которым длительно вводился а-токоферола ацетат. Оказалось, что в процессе лечения двукратно снизилась концентрация оксапат-иона в моче.

Подтверждение антилитогенного действия а-токоферола ацетата было получено по итогам морфометрического исследования. Количество

кальциевых депозитов, откладывающихся в области почечного сосочка, уменьшилось в 1,6 (с 27,4±3,23 до 17,6±2,39 в поле зрения; р<0,03), а их средний размер - в 2,2 раза (с 12,0±0,62 мкм до 5,4±0,28 мкм; р<0,001).

Как известно, для лечения мочекаменной болезни применяются хелатирующие средства: натрия цитрат, натрия фитат и натрия пирофосфат [Вощула, 2002]. В нашем исследовании мы изучили влияние этих средств на оксидативное повреждение почек и экспрессию внутрипочечных ингибиторов кристаллизации у крыс при оксалатном нефролитиазе.

Установлено, что на фоне лечения нефролитиаза натрия цитратом концентрация ТБРП по сравнению с контрольным значением уменьшилась в 2,9 раза, составив при этом 8,2±0,52 мкмоль (р<0,001). Кроме того, у подопытных крыс ОПА равнялась 68,6±3,15 %, уступая контрольному уровню в 1,1 раза (р<0,02) (рис. 5).

ТБРП (мкмоль) ОПА (%)

Рис. 5. Показатели оксидантного статуса после лечения

экспериментального оксалатного нефролитиаза натрия цитратом Примечание:

По вертикальной оси: слева - концентрация ТБРП, мкмоль; справа - ОПА, %.

Здесь и далее: ВЦ - величина показателя у шггактных крыс; ; | - величина показателя у крыс контрольной группы; НЭ - величина показателя на фоне применения фармакологического средства.

Знаком # обозначены достоверные изменения относительно контроля.

ГПО(%) СОД(%) КАТ (%)

Рис. 6. Показатели активности антиоксидантных ферментов после

лечения экспериментального оксалатного нефролитиаза натрия цитратом

Параллельно активность ГПО в почках крыс, получавших натрия цитрат, возросла по сравнению с контролем заболевания в 1,3 раза, полностью соответствуя в итоге показателям здоровых животных: 37,9±1,33 % (р<0,001). Параллельно были выявлены признаки увеличения активности СОД и КАТ. Так, антирадикальная емкость СОД после трех недель введения натрия цитрата в количественном выражении составила 13,0±0,99 %, что на 12% превышало контрольный уровень и практически полностью совпадало с интактным. Активность КАТ в гомогенате почечной ткани подопытных крыс под влиянием испытуемого средства приобрела значение 16,3±0,62 %, что было несколько выше контрольных цифр и в 1,4 раза превосходило уровень интактной группы (р<0,001) (рис. 6).

В отношении экспрессии внутрипочечных ингибиторов кристаллизации на фоне действия натрия цитрата было установлено, что уровень экспрессии ПТХ понизился относительно контроля, экспрессия ОПН, наоборот, усиливалась, а экспрессия БИК - ослабилась на 3,4% (табл. 11).

Подтверждением эффективности натрия цитрата при нефролитиазе послужили результаты морфометрического исследования. Оказалось, что количество кальциевых депозитов в области почечного сосочка подопытных крыс уменьшилось по сравнению с контролем заболевания в 3,4 раза (с 27,4±3,23 до 8,0±1,36 в поле зрения; р<0,001), а их средний размер - в 1,9 раза (с 12,0±0,62 мкм до 6,2±0,27 мкм; р<0,001).

Таблица 11

Показатели экспрессии внутрипочечных ингибиторов кристаллизации в условиях лечения экспериментального _оксалатного нефролитиаза натрия цитратом_

Ингибиторы кристаллизации Группы животных

Интактные крысы Крысы с нефролитиазом Подопытные крысы

Степень экспрессии

Баллы % Баллы % Баллы %

Протеин Тамма-Хорсфалла 2+ 49,8 3+ 54,4 2+ 51,2

(п=22) (п=20) (п=30)

Остеопонтин 2+ 50,0 1+ 46,8 2+ 49,3

(п=30) (п=30) (п=30)

Бикунин 2+ 50,6 2+ 52,0 2+ 48,6

(п=30) (п=30) (п=30)

В отношении натрия фитата было установлено, что в результате лечения концентрация ТБРП в почечном гомогенате больных животных снизилась по сравнению с контролем в 5,7 раза и равнялась 4,2±0,27 мкмоль (р<0,001) (рис. 7).

ТБРП (мкмоль) ОПА (%)

Рис. 7. Показатели оксидантного статуса после лечения

экспериментального оксалатного нефролитиаза натрия фитатом

Весьма характерные изменения отмечались в динамике активности антиоксидантных ферментов. Оказалось, что в условиях длительного применения натрия фитата активность ГПО увеличилась относительно контроля заболевания в 1,1 раза, в результате чего приобрела значение 33,6±1,74 % и не отличалась от уровня здоровых крыс. Активность СОД в почках животных подопытной группы после осуществленного лечения превышала контрольные значения в 1,2 раза, составив при этом 14,2±0,89 %, что в точности соответствовало показателям интактных крыс. Активность каталазы, в контроле составившая 13,6±1,50 %, под влиянием натрия фитата увеличилась в 1,8 раза, достигнув уровня 24,4±1,60 % (р<0,001), что, к тому же, превышало значения интактной группы в 2,1 раза (рис. 8).

то (%) сод(%> кат (%)

Рис. 8. Показатели активности антиоксидантных ферментов после

лечения экспериментального оксалатного нефролитиаза натрия фитатом

Изучение влияния натрия фитата на экспрессию внутрипочечных ингибиторов кристаллизации при нефролитиазе показало, что в результате лечения уровень экспрессии всех трех белков соответствовал таковому в интактной группе (табл. 12).

Подтверждение антилитогенной эффективности натрия фитата получено при морфометрии, согласно которой количество кальциевых депозитов в области почечного сосочка подопытных крыс уменьшилось по сравнению с контролем в 1,9 раза (с 27,4±3,23 до 14,2±2,00 в поле зрения; р<0,001), а их средний размер - в 2 раза (с 12,0±0,62 мкм до 5,9±0,41 мкм; р<0,001).

Таблица 12

Показатели экспрессии внутрипочечных ингибиторов кристаллизации в условиях лечения экспериментального нефролитиаза

Ингибиторы кристаллизации Группы животных

Интактные крысы Крысы с нефролитиазом Подопытные крысы

Степень экспрессии

Баллы % Баллы % Баллы %

Протеин Тамма-Хорсфалла 2+ 49,8 3+ 54,4 2+ 51,7

(п=22) (п=20) (п=30)

Остеопонтин 2+ 50,0 1+ 46,8* 2+ 50,4

(п=30) (п=30) (п=30)

Бикунин 2+ 50,6 2+ | 52,0* 2+ | 48,4

(п=30) (п=30) (п=30)

Анализируя действие натрия пирофосфата при экспериментальном нефролитиазе, отметим, что после 21 дня введения препарата концентрация ТБРП снизилась в 2,8 раза относительно показателей животных, 6 недель получавших только этиленгликоль: с 24,1±0,62 мкмоль в контроле до 8,6±0,44 мкмоль в подопытной группе (р<0,001). Кроме того, по итогам проведенного курса терапии произошло ослабление ОПА. Так, если при шестинедельном нефролитиазе ОПА составляла 78,2±2,24 %, то у подопытных крыс она уменьшилась в 1,2 раза, достигнув отметки 66,7±2,83 % (р<0,01) (рис. 9).

Далее мы изучили динамику изменений экспрессии внутрипочечных ингибиторов кристаллизации в условиях лечения нефролитиаза натрия пирофосфатом. Оказалось, что в результате проведенного лечения происходила нормализация уровня экспрессии указанных белков до показателей интактных крыс (табл. 13).

По результатам морфометрии установлено, что после лечения нефролитиаза натрия пирофосфатом количество кальциевых депозитов в области почечного сосочка относительно группы сравнения уменьшилось в 1,8 раза (с 27,4±3,23 до 15,7±2,78 в поле зрения; р<0,01), а их средний размер - в 2,3 раза (с 12,0±0,62 мкм до 5,3±0,19 мкм; р<0,001).

ТБРП (мк»юль) ОПА (%)

Рис. 9. Показатели оксидантного статуса после лечения

экспериментального оксалатного нефролитиаза натрия пирофосфатом

Таблица 13

Показатели экспрессии внутрипочечных ингибиторов кристаллизации в условиях лечения экспериментального _ нефролитиаза натрия пирофосфатом_

Ингибиторы кристаллизации Группы животных

Интактные крысы Крысы с нефролитиазом Подопытные крысы

Степень экспрессии

Баллы % Баллы % Баллы %

Протеин Тамма-Хорсфалла 2+ 49,8 3+ 54,4 2+ 49,9

(п=22) (п=20) (п=30)

Остеопонтин 2+ 50,0 1+ 46,8 2+ 49,6

(п=30) (п=30) (п=30)

Бикунин 2+ 50,6 2+ 52,0 2+ 47,8

(п=22) (п=20) (п=30)

Перспективным направлением политаргетной фармакотерапии кальций-оксалатного нефролитиаза, на наш взгляд, может стать применение лекарственных средств природного происхождения. В этой связи было

решено изучить влияние препарата гистохром, экстракта из культуры клеток марены сердцелистной и культуры клеток маакии амурской на течение экспериментального оксалатного нефролитиаза.

В изложенном контексте в первую очередь мы исследовали потенциальную антилитогенную активность официального лекарственного препарата гистохром.

Таблица 14

Показатели экскреторной функции почек крыс в условиях лечения

экспериментального оксалатного нефролитиаза гистох( ЮМОМ

Дни Кальций мкмоль/мл Оксалат мг/мл Фосфат мг/мл Диурез мл/сутки Креатинин ммоль/ сутки

Исходный уровень

2,5±0,16 (п=15) - 11,1±0,44 (п=15) 5,2±0,25 (п=15) 9,46±0,31 (п=15)

Моделирование нефролитиаза

3 2,3±0,08 (п=12) 1,3±0,09 (п=12) 9,9±0,28 (п=12) 8,6±0,77 (п=12) Не определяло сь

7 2,7±0,31 (п=8) 1,3±0,09 (п=П) 12,3 ±0,87 (п=8) 4,7±0,42 (п=11) 9,20±0,62 (п=11)

10 2,1±0,07 (п=11) 1,7±0,23 (п=8) 10,1±0,33 (п=11) 5,6±0,45 (п=11) 9,8±0,59 (п=11)

14 2,9±0,20 (п=10) Не определял ось 11,9±0,74 (п=11) 5,2±0,39 (п=11) 10,3±0,18* (п=11)

17 2,5±0,12 (п=11) 1,4±0Д5 (п=11) 9,6±0,53 (п=11) 6,7±0,66* (п=11) 10,9±0,50* (п=11)

21 2,3±0,17 (п=11) 1,8±0,14 (п=11) 9,2±0,83 (п=11) 6,7±0,73* (п=11) 10,3±0,49 (п=11)

Лечение

24 2,3±0,06 (п=11) 1,3±0,14 (п=11) 9,2±0,56* (п=11) 5,4±0,71 (ч=11) 9,0±0,42 (п=11)

28 2,3±0,0б (п=И) 1,5±0,11 (п=8) 10,8±0,45 (п=10) 5,1±0,57 (п=11) 7,9±0,58* (п=11)

31 2,1±0,14 (п=11) 1,7±0,14 (п=10) п,1±ио (п=11) 5,9±0,79 (п=11) 10,7±0,51* (п=11)

35 1,8±0,14* (п=11) 1,6±0,18 (п=11) 10,9±0,86 (п=11) 6,6±0,91 (п=11) 11,0±0,84 (п=11)

38 1,4±0,24* (п=8) 1,5±0,17 (п=9) 9,8±0,66 (п=9) 5,7±0,80 (п=9) 10,1±0,71 (п=9)

42 1,3±0,08* (п=10) 1,2±0,10 (п=11) 9,0±0,44* (п=11) 7,8±0,91* (п=И) 12,0±1,04* (п=11)

Оказалось, что на фоне лечения концентрация иона кальция к концу эксперимента снизилась в 1,9 раза относительно исходного уровня (табл. 14).

Кроме того, под влиянием препарата нормализовалась активность ЛДГ и НАГ, которая была существенно повышена при заболевании (табл. 15).

Таблица 15

Показатели ферментативной активности в моче крыс в условиях лечения экспериментального оксалатного нефролитиаза

гистохромом

Дни ЛДГ | ГГТ НАГ(*1(Г)

и / мг креатинина в сутки

Исходный уровень

0,30±0,013 (п=15) 0,09±0,010 (п=15) 7,4±0,60 (п=15)

Моделирование нефролитиаза

7 0,52±0,023* (п=И) 0,10±0,018 (п=10) 14,2±1,74* (п=11)

14 Не определялось 0,24±0,019* (п=11) 14,5±1,08* (п=11)

21 0,51±0,031* (п=11) 0,39±0,015* (п=11) 18,8±0,37* (п=11)

Лечение

28 0,31±0,014 (п=11) 0,26±0,012* (п=11) 18,7±0,92* (п=11)

35 0,28±0,025 (п=11) 0,38±0,015* (п=11) 15,9±0,76* (п=11)

42 0,34±0,021 (п=11) 0,29±0,013* (п=11) 7,8±0,28 (п=П)

Также было установлено, что концентрация ТБРП в почечном гомогенате у пролеченных животных уступала контрольному уровню в 5,1 раза, составив при этом 4,7±0,17 мкмоль. Параллельно происходили весьма существенные изменения активности ферментов антиоксидантной защиты нефроцитов. Оказалось, что после трехнедельного курса применения гистохрома активность ГПО составила 35,2±2,55 %, превосходя аналогичный показатель у крыс, которые 6 недель получали только этиленгликоль, в 1,2 раза, и теперь активность ГПО не отличалась от величины, зарегистрированной у интактных животных. Кроме того, антирадикальная емкость СОД увеличилась относительно контрольной группы в 1,6 раза и равнялась 18,1±0,85 % (р<0,01), превышая, к тому же, уровень интактных крыс на 21% (р<0,05). Активность КАТ тоже возросла как по сравнению с контролем, так и относительно интактной группы (в 1,4 раза ив 1,6 раза соответственно; для обоих - р<0,01), и имела значение 18,8±0,61 %.

Наиболее весомым подтверждением высокой эффективности гистохрома при экспериментальном оксалатном нефролитиазе явились результаты

морфометрического исследования, согласно которым после проведенного лечения количество кальциевых депозитов, откладывающихся в области почечного сосочка, относительно контроля заболевания уменьшилось в 2,6 раза (с 27,4±3,22 до 10,6±2,07 в поле зрения; р<0,001), а их средний размер -в 1,9 раза (с 12,0±0,62 мкм до 6,3±0,22 мкм; р<0,001).

Далее мы изучили антилитогенное действие экстракта из культуры клеток марены сердцелистной (ККМС).

Таблица 16

Показатели экскреторной функции почек крыс в условиях лечения экспериментального оксалатного нефролитиаза

Дни Оксалат мг/мл Фосфат мг/мл Кальций мкмоль/мл Диурез мл/сутки Креатинин ммоль/ сутки

Исходный уровень

- 8,2±0,33 (п=П) 1,9±0,15 (п=11) 6,2±0,64 (п=11) 7,6±0,56 (п=И)

Моделирование нефролитиаза

3 1,5±0,26 (п=11) 8,4±0,50 (п=10) 1,3±0,08* (п=11) 4,7±0,78 (п=11) 6,5±0,68 (п=11)

7 1,3±0,11 (п=9) 8,0±0,40 (п=10) 1,3±0,08* (п=9) 4,7±0,78 (п=11) 7,9±0,64 (п=11)

10 1,0±0,05 (п=11) 7,6±0,34 (п=11) 1,9±0,15 (п=11) 6,6±0,66 (п=И) 7,8±0,55 (п=11)

14 1,4±0,24 (п=8) 8,3±0,68 (п=10) 1,7±0,13 (п=10) 6,1±0,94 (п=И) 8,3±0,76 (п=11)

17 1,0±0,09 (п=10) 8,2±0,40 (п=10) 1,7±0,26 (п=Ю) 5,8±0,85 (п=Ю) 7,7±0,78 (п=Ю)

21 1,1±0,09 (п=9) 8,4±0,71 (п=11) 1,6±0,14 (п=9) 7,1±0,88* (п=11) 9,7±0,93 (п=11)

Лечение

24 0,5 ±0,07 (п=8) 7,3 ±0,61 (п=11) 1,2±0,08* (п=И) 8,2±1Д1 (п=11) 10,3±0,85* (п=11)

28 0,4±0,02 (п=11) 7,2±0,31 (п=11) 1,5±0,07 (п=11) 9,9±0,96* (п=11) 10,8±0,87* (п=11)

31 0,3±0,03 (п=11) 7,0±0,41* (п=11) 1,4±0,11 (п=11) 10,0±1,09* (п=11) 10,7±0,78* (п=И)

35 0,4±0,03 (п=11) 6,6±0,49* (п=11) 1,5±0,15 (п=11) 12,5±1,41* (п=11) 12,4±0,97* (п=11)

38 0,4±0,03 (п=11) 6,2±0,48* (п=10) 0,9±0,02* (п=10) 14,1±1,44* (п=И) 13,3±1,06* (4=11)

42 0,3±0,04 (п=И) 5,2±0,41* (п=10) 1,1±0,03* (п=11) 13,8±1,28* (п=11) 12,1±0,90* (п=И)

Установлено, что длительное применение ККМС при экспериментальном нефролитиазе способствует более чем двукратному снижению мочевой концентрации ионов оксалата и кальция относительно периода моделирования нефролитиаза (табл. 16).

Благоприятное действие ККМС подтверждалось динамикой ферментативной активности. Установлено, что активность ЛДГ, ГГТ и НАГ под влиянием испытуемого средства значительно ослаблялась, вследствие чего к концу опыта она не превышала уровень интактных крыс (табл. 17).

Таблица 17

Показатели ферментативной активности в моче крыс в условиях лечения экспериментального оксалатного нефролитиаза

экстрактом культуры клеток марены сердцелистной

Дни ЛДГ ГГТ | НАГ(х10°)

и / мг креатинина в сутки

Исходный уровень

0,18±0,028 (п=9) 0,37±0,014 (п=8) 9,8±0,41 (п=Т0)

Моделирование нефролитиаза

7 0,33±0,027* (п=11) 0,40±0,013 (п=11) 10,2±0,57 (п=11)

14 0,40±0,025* (п=9) 0,42±0,020 (п=10) 14,0±0,48* (п=10)

21 0,44±0,020* (п=11) 0,38±0,014 (п=11) Не определялось

Лечение

28 0,37±0,021* (п=11) 0,35±0,011 (п=11) 6,0±0,27* (п=11)

35 0,13±0,030* (п=И) 0,22±0,010* (п=11) 4,6±0,27* (п=11)

42 0,11±0,018* (п=10) Не определялось 8,2±0,30 (п=11)

Кроме того, по итогам курса применения ККМС были зафиксированы четкие признаки подавления оксидативного стресса в почечной ткани подопытных крыс. Так, в результате проведенного лечения концентрация ТБРП уступала контрольному уровню в 2 раза и равнялась 12,0±1,01 мкмоль (р<0,001).

Параллельно отмечались характерные изменения в активности антиоксидантных ферментов. Было установлено, что активность СОД и КАТ после проведенного курса фитотерапии существенно возрастала. Оказалось, что активность СОД у пролеченных крыс находилась на отметке 20,3±1,53 %, что было больше контрольной величины в 1,8 раза (р<0,001) и превосходило уровень интактных крыс на 36% (р<0,02). При этом активность КАТ

равнялась 31,8±1,44 %, превышая контрольные цифры в 2,3 раза, а показатель здоровых животных - в 2,7 раза (для обоих - р<0,001).

Результаты морфометрии показали, что количество кальциевых депозитов, откладывающихся в области почечного сосочка, после проведенного лечения ККМС уменьшилось относительно контроля заболевания в 6,7 раза (с 24,1±3,22 до 4,1±0,42 в поле зрения; р<0,001), а их размер - в 3,4 раза (с 12±0,62 мкм до 3,5±2,45 мкм; р<0,001).

На завершающем этапе нашего исследования мы изучили влияние культуры клеток маакии амурской (ККМА) на течение экспериментального нефролитиаза.

Оказалось, что при применении данного фармакологического средства у литогенезированных крыс произошло двукратное снижение концентрации оксалат-иона в моче относительно периода моделирования патологии (табл. 18).

Таблица 18

Показатели экскреторной функции почек крыс в условиях лечения

экспериментального оксалатного нефролитиаза _культурой клеток маакии амурской__

Дни Оксалат мг/мл Фосфат мг/мл Диурез мл/сутки Креатинин ммоль/ сутки

Исходный уровень

- 9,9±1,04 (п=12) 4,6±0,55 (п=12) 6,4±0,67 (п=12)

Моделирование нефролитиаза

7 1,6±0,34 (п=11) 9,6±1,55 (п=11) 5,5±1,02 (п=11) 7,1±0,61 (п=11)

14 1,0±0,15 (п=11) 9,6±1,29 (п=11) 5,1 ±0,76 (п=11) 6,4±0,67 (п=11)

21 1,0±0,12 (п-12) 10,0±1,47 (п=11) 6,0±0,82 (п=11) 7,4±0,68 (п=11)

Лечение

28 0,6±0,09 (п=11) 7,7±0,93 (п=11) 7,3±0,84 (п=11) 8,0±0,72 (п=11)

35 0,5±0,08 (п=11) 5,3±0,82* (п=И) 11,8±1,16* (п=11) 8,6±0,63* (п=11)

42 0,5±0,13 (п=11) 4,8±0,88* (п=11) 11,0±2,09* (п=11) 7,0±0,76 (п=11)

Изучение активности процесса свободно-радикального окисления в нефроне подопытных крыс показало, что после проведенного курса фитотерапии концентрация ТБРП составила 2,2±0,17 мкмоль, что меньше контрольных цифр в 11 раз и полностью соответствует уровню интактных крыс. Параллельно наблюдалось отчетливое снижение ОПА. Так, у

животных, которым длительно вводилось испытуемое средство, величина описываемого показателя в почках равнялась 27,4±0,97 %, уступая таковой в контроле заболевания в 2,9 раза (р<0,001) и, к тому же, отличаясь в меньшую сторону от значения, зарегистрированного у интактных животных, в 2,8 раза.

Параллельно отмечалось ослабление многократно повышенной на пике заболевания активности ЛДГ, ГТТ и НАГ до уровня интактных животных к моменту завершения опыта (табл. 19).

Таблица 19

Показатели ферментативной активности в моче крыс в условиях лечения экспериментального оксалатного нефролитиаза

культурой клеток маакии амурской

ЛДГ ГГТ НАГ (хЮ'3)

Дни и / мг креатинина в сутки

Исходный уровень

0,15±0,021 0,28±0,021 8,8±0,44

(п=12) (п=12) (п=12)

Моделирование нефролитиаза

0,35±0,038 0,43±0,036* 32,5±3,2*

/ (п=11) (п=11) (п=11)

14 0,76±0,021 (п=11) Не определялось 33,6±1,87* (п=11)

21 0,79±0,020 (п=11) 0,40±0,017* (п-И) ____ 35,4±3,45* (п=11)

Лечение

28 0,41±0,020* (п=11) 0,20±0,013* (п=И) 17,0±1,10* (п=11)

35 0,24±0,019* (п=11) 0,19±0,022* (п=11) 13,0±1,50* (п=11)

42 0,17±0,013 (п=11) 0,22±0,034 (п=11) 9,0±0,90 (п=11)

На этом фоне отмечались не менее существенные изменения активности антиоксидантных ферментов. Установлено, что после применения ККМА способность СОД нейтрализовать высокореактивные радикалы кислорода в почках подопытных крыс превышала контрольное значение в 2,7 раза (30,8±1,23 %) и было выше уровня здоровых животных в 2,1 раза (для обоих - р<0,001). Кроме того, активность КАТ в подопытной группе также ощутимо увеличилась (в 1,5 раза и в 1,7 раза по сравнению с контрольной и интактной группами соответственно; р<0,001) и равнялась 20,4±1,24 %.

По результатам морфометрии, количество кальциевых депозитов относительно контроля уменьшилось после лечения ККМА в 3,9 раза (с

27,4±3,22 до 7,1±0,57 в поле зрения; р<0,001), а их средний размер снизился в 6,3 раза (с 12,0±0,62 мкм до 1,9±0,09 мкм; р<0,001).

Таким образом, полученные результаты демонстрируют высокую эффективность разработанных подходов к таргетной фармакотерапии мочекаменной болезни. Для подтверждения связи между точечным действием антилитогенного средства и конечным лечебным эффектом мы провели корреляционный анализ параметров функции почек подопытных животных.

Оказалось, что в группе крыс, получавших менадиона натрия бисульфит, среди параметров, демонстрирующих эффективность лечения, выявляется одна статистически значимая корреляционная связь (рис. 10).

Рис. 10. Корреляционный анализ биохимических параметров

функции почек после лечения менадиона натрия бисульфитом

На наш взгляд, это косвенно подтверждает корректность нового фармакологического подхода к лечению мочекаменной болезни, подразумевавшего медикаментозную стимуляцию синтеза протромбина с последующим усилением ингибирующей активности фрагмента протромбина 1. Концентрация самого протромбина 1 в моче не измерялась, а иных механизмов антилитогенного действия не подразумевалось, что логично сопоставляется с результатами корреляционного анализа.

На этом фоне после курса применения пиоглитазона были зафиксированы 3 корреляционные связи (рис. 11). Полученные данные позволяют предположить, что решающее значение в антилитогенном эффекте пиоглитазона имело его влияние на состояние мембран нефроцитов. При этом известно, что повышение чувствительности тканей к инсулину под влиянием производных тиазолидиндиона (которое было заявлено нами в качестве нового фармакологического подхода к лечению МКБ) достигается за счет синтеза новых инсулиновых рецепторов, локализующихся на мембране. В совокупности с литературными данными [Вае, 2010] это хорошо

согласуется с предложенной нами стратегией разработки новых фармакологических подходов к лечению МКБ.

Рис. 11. Корреляционный анализ биохимических параметров функции почек после лечения пиоглитазоном

Примечание:

Здесь и далее: сплошная линия - прямая положительная связь;

пунктирная линия - обратная отрицательная связь.

Результаты корреляционного анализа в группе нифедипина подтверждают существенную связь между таргетным действием указанного препарата и конечным лечебным эффектом (рис. 12). Изначально предполагалось, что мишенью для антилнтогенного действия нифедипина могут являться кальциевые каналы на мембране нефроцитов, что в первую очередь должно было отразиться на внутрипочечном транспорте кальция и функциональном состоянии клеточных мембран. Выявленные связи подтверждают это, дополнительно позволяя судить о важной роли гипооксалурического эффекта препарата в конечном эффекте.

В отношении а-токоферола ацетата было установлено наличие корреляции между концентрацией ТБРП и активностью ДДГ, концентрацией ТБРП и активностью НАГ, концентрацией ТБРП и оксалат-иона, а также между активностью ЛДГ и ГГТ (на рисунке не представлено). Отметим, что наибольший интерес представляло возможное наличие корреляции между иммуногистохимическими (экспрессия ПТХ, ОПН и БИК) и морфометрическими (количество и размер кальциевых депозитов) критериями, поскольку они демонстрировали новые стороны антилнтогенного действия препарата. Однако статистически значимых связей среди таковых выявлено не было. Логично предположить, что благоприятные изменения названных параметров могут коррелировать не друг с другом, а с биохимическими показателями ослабления оксидативного стресса под воздействием а-токоферола ацетата, однако произвести расчет

этой корреляции не представлялось возможным в силу несопоставимости биохимических и морфологических методик исследования.

Рис. 12. Корреляционный анализ биохимических параметров функции почек после лечения нифедипином

Примерно та же картина описывала конечный антилитогенный эффект натрия цитрата и натрия пирофосфата (на рисунке не представлено). Среди сопоставимых показателей для первого препарата наблюдалась лишь одна корреляционная связь (между количеством и размером кальциевых депозитов), а для второго таковых зафиксировано не было.

Гораздо более наглядные результаты корреляционного анализа имели место в отношении натрия фитата (рис. 13). По-видимому, изменения, происходившие в почках больных крыс под влиянием натрия фитата, имеют более сложный и многогранный характер взаимоотношений и не ограничиваются хелатированием ионов кальция в моче. Выявленные корреляционные зависимости подтверждают новизну установленных

Рис. 13. Корреляционный анализ биохимических и морфологических параметров функции почек после лечения натрия фитатом

По результатам корреляционного анализа в группе применения гистохрома показано, что полученные данные хорошо согласуются с предполагаемыми политаргетными механизмами антилитогенного действия препарата, а именно: хелатирование кальция в моче, антиоксидантное действие за счет усиления активности ГПО и мембраностабилизирующее действие (рис. 14).

Рис. 14. Корреляционный анализ биохимических параметров функции почек после лечения гистохромом

Результаты корреляционного анализа применения экстракта из культуры клеток марены сердцелистной представлены на рисунке 15.

Рис. 15. Корреляционный анализ биохимических параметров

функции почек после лечения экстрактом из культуры клеток марены сердцелистной

Полученные данные подтверждают, что экстракт из ККМС, фитокомплекс из лекарственного растения, оказывает политаргетное воздействие на разные звенья патогенеза кальций-оксалатного нефролитиаза, что может объясняться многообразием фитохимического состава ККМС.

Схожая в целом картина характеризовала корреляционные связи в группе крыс, получавших культуру клеток маакии амурской (рис. 16).

Рис. 16. Корреляционный анализ биохимических параметров функции почек после лечения культурой клеток маакии амурской

В заключение, суммируя все вышеизложенное, отметим: в нашем исследовании разработаны новые фармакологические подходы к таргетному патогенетическому лечению мочекаменной болезни. Базируясь на этих подходах, мы на доклиническом уровне доказали благоприятную перспективу лечения МКБ путем стимуляции синтеза протромбина, повышения чувствительности почечных тканей к инсулину, ингибирования начальной фазы кристаллизационного процесса, применения препарата природного происхождения гистохром и фитокомплексов из лекарственных растений (экстракт из культуры клеток марены сердцелистной, культура клеток маакии амурской). Кроме того, установлены ранее неизвестные механизмы антилитогенного действия а-токоферола ацетата (средство, обладающее антиоксидантной активностью), натрия цитрата, натрия фитата и натрия пирофосфата (средства, обладающие способностью хелатировать ионы кальция и кальциевые биоминералы в моче). Описанные подходы могут являться основой для создания новых путей патогенетической коррекции кальций-оксалатного нефролитиаза при мочекаменной болезни (Табл. 20).

Таблица 20

Рекомендации по внедрению в практику результатов исследования новых фармакологических подходов к лечению мочекаменной болезни

№ Новый фармакологический подход к лечению мочекаменной болезни Фармакологическое средство Внедрение в практику

1 Медикаментозная стимуляция синтеза протромбина Менадиона натрия бисульфит Лечение МКБ, сочетанной с нарушениями гемостаза

2 Повышение чувствительности почечных тканей к инсулину Пиоглитазон Лечение МКБ, сочетанной с сахарным диабетом II типа

3 Ингибирование начальной фазы кристаллизационного процесса Нифедипин Лечение МКБ, сочетанной с нарушениями кальциевого обмена и заболеваниями сердечно-сосудистой системы

4 Устранение кальциевого парадокса в нефроцитах Амилорид Противопоказан больным МКБ

5 Применение средств природного происхождения Гистохром Экстракт из культуры клеток марены сердцелистной Культура клеток маакии амурской Проведение дальнейших исследований с перспективой создания новых лекарственных препаратов

6 Изучение новых механизмов антшштогенного действия антиоксидантных и хелатирующих средств а-токоферола ацетат Натрия цитрат Натрия фитат Натрия пирофосфат Расширение знаний о фармакодинамике антиоксидантных и хелатирующих средств при МКБ

выводы

1. Новые фармакологические подходы к таргетной патогенетической коррекции кальций-оксалатного нефролитиаза (стимуляция синтеза протромбина в печени, повышение чувствительности почечных тканей к инсулину, ингибирование начальной фазы кристаллизационного процесса, применение средств природного происхождения) позволяют расширить арсенал антилитогенных лекарственных средств.

2. Менадиона натрия бисульфит (средство, стимулирующее образование фрагмента протромбина 1 в почечных канальцах вследствие увеличения выработки протромбина в печени), пиоглитазон (средство, повышающее чувствительность почечных тканей к инсулину), нифедипин (средство, ингибирующее начальную фазу кристаллизации за счет блокады кальциевых каналов на мембране нефроцитов), воздействуя на комплиментарное звено патогенеза нефролитиаза, значительно облегчают течение экспериментальной мочекаменной болезни. Наиболее выраженное антилитогенное действие проявил пиоглитазон.

3. Лекарственный препарат природного происхождения гистохром обладает выраженным политаргетным антилитогенным действием, снижая пересыщение мочи ионом кальция, уменьшая степень повреждения нефроцитов, ослабляя оксидативный стресс и усиливая антиоксидантную защиту почечных тканей, а также уменьшая количество и размер кальциевых депозитов в области почечного сосочка.

4. Фитокомплексы из лекарственных растений (экстракт из культуры клеток марены сердделистной, культура клеток маакии амурской) на модели кальций-оксалатного нефролитиаза проявляют политаргетное антилитогенное действие за счет комплексной коррекции основных патологических процессов, происходящих при оксалатном нефролитиазе (пересыщение мочи ионами оксалата и кальция, повреждающий фактор, оксидативный стресс, формирование конкрементов в почках).

5. Амилорид (средство, ослабляющее кальциевый парадокс в нефроцитах из-за блокады Ыа7Н+-обменника на клеточной мембране) увеличивает количество кальциевых депозитов в почках при экспериментальной мочекаменной болезни.

6. Раскрыты новые механизмы антилитогенного действия а-токоферола ацетата (нормализация экспрессии внутрипочечных ингибиторов кристаллизации и снижение пересыщения мочи оксалат-ионом), натрия цитрата, натрия фитата и натрия пирофосфата (ослабление оксидативного повреждения нефроцитов и нормализация экспрессии внутрипочечных ингибиторов кристаллизации).

7. Подтверждена эффективность патогенетически обоснованной антилитогенной терапии апробированных средств таргетного и политаргетного действия в обосновании ключевых мишеней мочекаменной болезни.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Патенты на изобретение

1. Патент № 2408367. Российская Федерация. Диуретическое средство / В.В. Лампатов, А.Ю. Жариков, С.А. Фсдорсев, Н.П. Мищенко (РФ). - 10.01.2011.

2. Патент № 2410692. Российская Федерация. Способ определения ионов оксалата в моче / А.Ю. Жариков, В.В. Лампатов, Я.Ф. Зверев, В.М. Брюханов (РФ).-27.01.2011.

3. Патент № 2451935. Российская Федерация. Способ прогнозирования мочекаменной болезни / А.Ю. Жариков, В.В. Лампатов, Я.Ф. Зверев и др. (РФ). -27.05.2012.

Работы, опубликованные в журналах, рекомендованных ВАК:

1. Жариков, А.Ю. Современные методы моделирования оксалатного нефролитиаза / А.Ю. Жариков, В.М. Брюханов, Я.Ф. Зверев, В.В. Лампатов // Нефрология. - 2008. - Т. 12, № 4. - С. 28-35.

2. Зверев, Я.Ф. Современные представления о роли физико-химических факторов в патогенезе кальциевого нефролитиаза / Я.Ф. Зверев, В.М. Брюханов, В.В. Лампатов, А.Ю. Жариков//Нефрология.-2009.-Т. 13,№ 1.-С. 39-50.

3. Жариков, А.Ю. Современные представления о модуляторах оксалатного нефролитиаза. I. Стимуляторы кристаллизации / А.Ю. Жариков, Я.Ф. Зверев, В.М. Брюханов, В.В. Лампатов // Нефрология. - 2009. - Т. 13, №1. - С. 56-72.

4. Брюханов, В.М. Методические подходы к изучению функции почек в эксперименте на животных / В.М. Брюханов, Я.Ф. Зверев, В.В. Лампатов,

A.Ю. Жариков // Нефрология. - 2009. - Т. 13, № 3. - С. 52-62.

5. Жариков, А.Ю. Механизм формирования кристаллов при оксалатном нефролитиазе / А.Ю. Жариков, Я.Ф. Зверев, В.М. Брюханов, В.В. Лампатов // Нефрология. - 2009. - Т. 13, № 4. - С. 37-50.

6. Мотина, Н.В. Морфологические изменения в почках крыс при экспериментальном нефролитиазе на фоне длительного применения клеточной культуры Маакии амурской // Н.В. Мотина, В.М. Брюханов, О.В. Азарова и др. // Нефрология. - 2009. - Т. 13, № 4. - С. 75-79.

7. Зверев, Я.Ф. Современные представления о модуляторах оксалатного нефролитиаза Ингибиторы кристаллизации // Я.Ф. Зверев, АЛО. Жариков,

B.М. Брюханов, В.В. Лампатов // Нефрология. - 2010. - Т. 14, № 1. - С. 29-49.

8. Мотина, Н.В. Оксидативное повреждение почек при экспериментальном оксалатном нефролитиазе / Н.В. Мотина, Я.Ф. Зверев, A.B. Лепилов и др. // Нефрология.-2010.-Т. 14,№ 1.-С. 68-72.

9. Брюханов, В.М. Влияние культуры клеток маакии амурской на течение экспериментального нефролитиаза / В.М. Брюханов, В.П. Булгаков, АЛО. Жариков и др. // Бюллетень СО РАМН. - 2010. - Т. 30, № 5. - С. 32-37.

10. Мотина, Н.В. Структурная перестройка почки на ранних сроках экспериментального нефролитиаза / Н.В. Мотина, A.B. Лепилов, А.Ю. Жариков, Ю.Г. Мотин // Вестник РУДН, серия медицина. - 2010. -№ 4. С. 360-361.

11. Жариков, А.Ю. Новый способ определения оксалат-ионов в моче / АЛО. Жариков, В.В. Лампатов, Я.Ф. Зверев и др. // Клиническая лабораторная диагностика.-2010. — № 12.-С. 3-5.

12. Жариков, А.Ю. Роль антиоксидантной терапии в фармакологической коррекции экспериментального нефролитиаза / А.Ю. Жариков, О.С. Талалаева, Я.Ф. Зверев и др. // Нефрология. 2010. - Т. 14, № 4. - С. 53-58.

13. Брюханов, В.М. Влияние питьевых режимов на движущие силы кристаллизации при экспериментальном нефролитиазе / В.М. Брюханов, Я.Ф. Зверев, В.В. Лампатов и др. //Урология.-2011.-№ 1.-С. 6-11.

14. Жариков, А.Ю. Опыт применения натрия пирофосфата при оксалатном нефролитиазе в эксперименте / А.Ю. Жариков, Я.Ф. Зверев, В.В. Лампатов и др. //Бюллетень сибирской медицины.-2011.-Т. 10,№ 1.-С. 32-37.

15. Жариков, А.Ю. Влияние натрия фитата на течение экспериментального оксалатного нефролитиаза / А.Ю. Жариков, Я.Ф. Зверев, В.В. Лампатов и др. // Сибирский медицинский журнал (Иркутск). - 2011. - №. 5. - С. 30-34.

16. Мотина, Н.В. Роль оксидативного повреждения в развитии оксалатного нефролитиаза у крыс / Н.В. Мотина, А.Ю. Жариков, Я.Ф. Зверев и др. // Якутский медицинский журнал. - 2011. - № 2. - С. 50-53.

17. Мотина, Н.В. Благоприятное воздействие антиоксидантной терапии на структурную перестройку почки в условиях экспериментального оксалатного нефролитиаза / Н.В. Мотина, В.М. Брюханов, Я.Ф. Зверев и др. // Нефрология. -2011.-Т. 15,№2.-С. 57-61.

18. Талалаева, О.С. Влияние гистохрома на экскреторную функцию почек в эксперименте / О.С. Талалаева, А.Ю. Жариков, С.А. Федореев и др. // Бюллетень сибирской медицины.-2011. —Т. 10,№5.-С. 101-105.

19. Жариков, А.Ю. Влияние а-токоферола ацетата на экспрессию внутрипочечных ингибиторов кристаллизации при экспериментальном нефролитиазе / А.Ю. Жариков, Ю.Г. Мотин, Я.Ф. Зверев и др. // Медицина в Кузбассе. - 2011. - Т. X, № 3. - С. 37-31.

20. Жариков, А.Ю. Антилитогенное действие пиоглитазона при экспериментальном оксалатном нефролитиазе / А.Ю. Жариков, В.М. Брюханов,

B.В. Лампатов, О.С. Талалаева // Вестник уральской медицинской академической науки. Тематический выпуск по фармации. - 2011. - № 3/1. -

C. 25-26.

21. Жариков, А.Ю. Благоприятное влияние натрия цитрата и натрия фитата на оксидативное повреждение почек при экспериментальном нефролитиазе / А.Ю. Жариков, Ю.Г. Мотин, Я.Ф. Зверев, С.В. Замятина // Вестник уральской медицинской академической науки. Тематический выпуск по фармации. -2011. -№3/1.-С. 26.

22. Жариков, А.Ю. Особенности экспрессии протеина Тамма-Хорсфалла при экспериментальном нефролитиазе / А.Ю. Жариков, Ю.Г. Мотин, Я.Ф. Зверев, В .В. Лампатов // Морфология. - 2011. - Т. 140,№5.-С. 86.

23. Жариков, А.Ю. О роли блокаторов кальциевых каналов в фармакологической коррекции экспериментального нефролитиаза / А.Ю. Жариков, Я.Ф. Зверев, В.М. Брюханов и др. // Сибирский медицинский журнал (Томск). - 2011. - Т. 26, № 3 выпуск 1. - С. 129-134.

24. Жариков, А.Ю. Особенности экспрессии внутрипочечных ингибиторов кристаллизации при экспериментальном нефролитиазе / А.Ю. Жариков,

Ю.Г. Мотин, В.М. Брюханов и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2012. - Т. 153, №2. - С. 261-264.

25. Жариков, А.Ю. Применение викасола как перспективного средства фармакологической коррекции экспериментального нефролитиаза / А.Ю. Жариков, Я.Ф. Зверев, В.В. Лампатов и др. И Бюллетень сибирской медицины.-2012.-Т. 11,№1.-С. 18-25.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

МКБ - мочекаменная болезнь;

ВЭЖХ- высокоэффективная жидкостная хроматография;

ФЭК - фотоэлектроколориметрия;

ЛДГ - лактатдегидрогеназа;

ГГТ - у-глютамилтрансфераза;

НАГ - И-ацетил-р-О-глюкозаминидаза;

СРО - свободно-радикальное окисление;

ТБРП - тиобарбитуратреактивные продукты;

ОПА - общая прооксидантная активность;

ГПО - глутатионпероксидаза;

СОД - супероксиддисмутаза;

КАТ - катал аза;

МДА - малоновый диальдегид;

ПТХ - протеин Тамма-Хорсфалла;

ОПН - остеопонтин;

БИК - бикунин;

ККМС - культура клеток марены сердцелистной; ККМА - культура клеток маакии амурской.

Подписано в печать 28.08.2012 Формат 60x90/16. Бумага офсетная. Печать ризографическая. Гарнитура Тайме Нью Роман. Тираж 150 экз. Объем 2,0 п. л. Заказ № 96

Алтайский государственный медицинский университет г. Барнаул, пр. Ленина, 40

Актуальность темы: Мочекаменная болезнь (МКБ) - распространенное урологическое заболевание, которым в современном мире, по данным статистики, страдают около 10-15% населения развитых стран [73, 83, 84, 100, 105, 115, 158, 174, 234, 235, 243, 318]. При этом в Российской Федерации средние показатели заболеваемости идентичны общемировым [5, 13, 21, 37, 48]. Мочекаменная болезнь зачастую становится причиной снижения трудоспособности и даже инвалидизации, поэтому борьба с данной патологией имеет важное социальное значение.

Основной нозологической субъединицей МКБ является кальций-оксалатный нефролитиаз, поскольку, согласно современной минералогической классификации, около 60% всех почечных камней состоят преимущественно из кальций-оксалатных биоминералов: вевеллита (СаС204хН20) и ве-деллита (СаС204х2Н20) [4, 13, 14, 48, 51, 83, 84, 100, 115, 151, 158, 174, 243, 318]. Следует отметить, что оксалатному нефролитиазу в основном подвержены наиболее трудоспособные слои населения - мужчины в возрасте от 20 до 50 лет [13, 14, 48, 174]. Кроме того, проблему в значительной степени усугубляет тот факт, что, по прогнозам специалистов, заболеваемость нефроли-тиазом в ближайшие годы во всем мире будет неуклонно увеличиваться. Так, например, только в юго-восточных регионах США к 2050 г. ожидается прирост диагностированных случаев МКБ на 1,6-2,2 миллиона [115]. Аналогичная тенденция имеет место и в нашей стране.

Среди причин массового распространения мочекаменной болезни выделяют хроническую дегидратацию организма человека на фоне глобального потепления климата, ухудшение качества питьевой воды и продуктов питания, бесконтрольное применение лекарственных препаратов, многие из которых могут спровоцировать формирование почечных конкрементов, и др. [4, 8, 21, 39, 100, 105, 115, 151, 158, 174]. Вместе с тем, наиболее весомым фактором происходящего процесса все же следует признать достаточно низкую эффективность существующих сегодня методов лечения и профилактики МКБ [39, 100, 105, 115].

Основным методом лечения мочекаменной болезни, начиная с середины 80-х годов двадцатого столетия, по сей день остается дистанционная ударно-волновая литотрипсия, общая суть которой заключается в разрушении почечных камней акустическими волнами инфразвуковой природы [2, 13, 26, 28, 31, 33, 48, 100, 151, 158, 174]. Однако, несмотря на все достоинства названного метода, не подлежит сомнению очевидный факт - литотрипсия не излечивает нефролитиаз, поскольку не влияет на его причины и основные звенья патогенеза, приводя к частым рецидивам. При этом она имеет целый ряд противопоказаний и вызывает достаточно серьезные осложнения: гематурия (в 100% случаев), гематомы почки, обструкция мочевыводящих путей осколками раздробленного камня [13, 26, 33, 48]. Все это в значительной степени ограничивает эффективность литотрипсии, а также суживает область ее применения в клинической практике.

В связи с вышеназванными обстоятельствами, в медицине до сих пор существует крайне высокая потребность в более эффективном и безопасном лечении МКБ при помощи лекарственных средств, которая не может быть удовлетворена без надлежащего фармакологического исследования. К сожалению, возможности лечения нефролитиаза сегодня очень ограниченны, что до настоящей поры могло объясняться малой изученностью этиологии и патогенеза МКБ. Тем не менее, стимулом к поиску новых методов фармакотерапии МКБ стала череда фундаментальных исследований, произошедших в начале XXI века и ознаменовавшихся настоящим прорывом в области изучения патогенеза МКБ [100, 117-121, 123, 124, 132, 133, 231, 318, 326]. Все это привело к выявлению целого ряда ранее неизвестных потенциальных мишеней для патогенетической терапии нефролитиаза, что открывает широкие перспективы для успешного поиска новых фармакологических подходов к лечению мочекаменной болезни.

Данная работа посвящена разработке новых направлений фармакотерапии мочекаменной болезни, а также выявлению ранее неизвестных механизмов антилитогенного действия некоторых уже используемых с указанной целью лекарственных препаратов.

Цель исследования:

Разработать и апробировать в эксперименте новые фармакологические подходы к таргетному патогенетическому лечению мочекаменной болезни.

Задачи исследования:

1. Разработать новые фармакологические подходы к таргетной коррекции кальций-оксалатного нефролитиаза, открывающие ранее недоступные возможности консервативного лечения мочекаменной болезни.

2. Оценить эффективность лечения экспериментальной мочекаменной болезни при помощи монотаргетных антилитогенных средств: менадиона натрия бисульфит (средство, стимулирующее образование фрагмента протромбина 1 в почечных канальцах вследствие увеличения выработки протромбина в печени), пиоглитазон (средство, повышающее чувствительность почечных тканей к инсулину), нифедипин (средство, ингибирующее начальную фазу кристаллизации за счет блокады кальциевых каналов на мембране нефроцитов), амилорид (средство, ослабляющее кальциевый парадокс в нефроцитах из-за блокады №+/Н+-обменника на клеточной мембране).

3. Изучить политаргетное влияние антилитогенного средства природного происхождения (гистохром) и фитокомплексов из лекарственных растений (экстракт из культуры клеток марены сердцелистной, культура клеток маакии амурской) на течение экспериментальной мочекаменной болезни.

4. Установить влияние а-токоферола ацетата (средство, обладающее антиок-сидантной активностью), натрия цитрата, натрия фитата и натрия пиро-фосфата (средства, хелатирующие ионы кальция и кальциевые кристаллы в моче) на уровень оксидативного стресса и экспрессии внутрипочечных ингибиторов кристаллизации (протеин Тамма-Хорсфалла, остеопонтин и бикунин) при экспериментальной мочекаменной болезни. 5. Доказать корреляцию между таргетным действием апробированных анти-литогенных средств и конечным терапевтическим эффектом заявленных фармакологических подходов к патогенетическому лечению мочекаменной болезни.

Научная новизна работы: Выполненное исследование открывает новые направления в фармакотерапии мочекаменной болезни. Впервые предложена, теоретически обоснована и экспериментально доказана возможность эффективного монотаргетного патогенетического лечения мочекаменной болезни при помощи менадиона натрия бисульфита (средство, стимулирующее образование фрагмента протромбина 1 в почечных канальцах вследствие увеличения выработки протромбина в печени), пиоглитазона (средство, повышающее чувствительность почечных тканей к инсулину) и нифедипина (средство, ингибирующее начальную фазу кристаллизации за счет блокады кальциевых каналов на мембране нефроцитов). Впервые на доклиническом уровне установлен приоритет политаргетной антилитогенной активности лекарственных средств природного происхождения (препарат гистохром) и фи-токомплексов из лекарственных растений (экстракт из культуры клеток марены сердцелистной, культура клеток маакии амурской). Открыты ранее неизвестные механизмы антилитогенного действия а-токоферола ацетата (нормализация экспрессии внутрипочечных ингибиторов кристаллизации и снижение пересыщения мочи оксалат-ионом), натрия цитрата, натрия фитата и натрия пирофосфата (ослабление оксидативного повреждения нефроцитов и нормализация экспрессии внутрипочечных ингибиторов кристаллизации). Доказана корреляция между таргетной направленностью действия апробированных антилитогенных средств и конечным терапевтическим эффектом заявленных фармакологических подходов к патогенетическому лечению мочекаменной болезни. Впервые установлено, что калийсберегающий диуретик амилорид стимулирует кристаллизационные процессы в почках, увеличивая количество кальциевых депозитов, формирующихся в области почечного сосочка. Разработаны новые практические рекомендации, расширяющие возможности патогенетического лечения мочекаменной болезни.

Научная и практическая значимость: Практическая значимость работы заключается в открытии принципиально новых фармакологических подходов к лечению мочекаменной болезни, большинство из которых могут быть быстро и эффективно внедрены в клиническую практику.

Результаты проведенного исследования позволяют сделать целый ряд рекомендаций для практического использования изученных лекарственных препаратов. Показанная антилитогенная эффективность менадиона натрия бисульфита, пиоглитазона, нифедипина и гистохрома в совокупности с их уже известными свойствами определяет целесообразность применения данных препаратов при мочекаменной болезни, сочетающейся с нарушениями гемостаза, сахарным диабетом II типа, гипертонической болезнью и стенокардией.

Выявленная пролитогенная активность амилорида дает важную информацию о ранее неизвестном побочном действии калийсберегающих диуретиков.

Установленная эффективность экстракта из культуры клеток марены сердцелистной и культуры клеток маакии амурской при экспериментальном нефролитиазе дает основание для их дальнейшего исследования с перспективой создания новых антилитогенных лекарственных препаратов.

Результаты исследования доказывают положения, вносящие вклад в расширение представлений о механизмах антилитогенного действия антиокси-дантных и хелатирующих средств и возможности их реализации в терапии мочекаменной болезни.

Положения, выносимые на защиту:

1. Разработаны новые фармакологические подходы к таргетной патогенетической коррекции кальций-оксалатного нефролитиаза: стимуляция синтеза протромбина в печени, повышение чувствительности почечных тканей к инсулину, ингибирование начальной фазы кристаллизационного процесса, устранение кальциевого парадокса в нефроцитах, применение средств природного происхождения.

2. Менадиона натрия бисульфит (средство, стимулирующее образование фрагмента протромбина 1 в почечных канальцах вследствие увеличения выработки протромбина в печени), пиоглитазон (средство, повышающее чувствительность почечных тканей к инсулину), нифедипин (средство, ингибирующее начальную фазу кристаллизации за счет блокады кальциевых каналов на мембране нефроцитов), корригируя комплиментарное им звено патогенеза кальций-оксалатного нефролитиаза, значительно облегчают течение экспериментальной мочекаменной болезни.

3. Лекарственный препарат природного происхождения гистохром и фито-комплексы из лекарственных растений (экстракт из культуры клеток марены сердцелистной, культура клеток маакии амурской) в условиях экспериментальной мочекаменной болезни проявляют комплексное антилито-генное действие на разных этапах патогенеза кальций-оксалатного нефролитиаза (пересыщение мочи ионами оксалата и кальция, повреждение нефроцитов, оксидативный стресс, формирование кальциевых депозитов).

4. Амилорид (средство, ослабляющее кальциевый парадокс в нефроцитах из-за блокады Иа^УН^-обменника на клеточной мембране) увеличивает количество кальциевых депозитов в почках при экспериментальной мочекаменной болезни.

5. Раскрыты новые механизмы антилитогенного действия а-токоферола ацетата (нормализация экспрессии внутрипочечных ингибиторов кристаллизации и снижение пересыщения мочи оксалат-ионом), натрия цитрата, натрия фитата и натрия пирофосфата (ослабление оксидативного повреждения нефроцитов и нормализация экспрессии внутрипочечных ингибиторов кристаллизации).

6. Доказана корреляция между таргетным действием апробированных анти-литогенных средств и конечным терапевтическим эффектом заявленных фармакологических подходов к патогенетическому лечению мочекаменной болезни.

Апробация материалов диссертации: Материалы диссертации докладывались и обсуждались на VI сибирском физиологическом съезде (г. Барнаул, 2008 г.), на Всероссийском конгрессе нефрологов (г. Санкт-Петербург, 2009 г.), на XI научно-практической конференции молодых ученых «Молодежь -Барнаулу» (г. Барнаул, 2009 г.), на VII съезде научного общества нефрологов России (г. Москва, 2010 г.), на Третьем съезде нефрологов юга России (г. Ростов-на-Дону, 2010 г.), на научно-практической конференции, посвященной 35-летию фармацевтического факультета АГМУ (г. Барнаул, 2010 г.), на научно-практической конференции «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (г. Пятигорск, 2011 г.), на научно-практической Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 45-летию педиатрического факультета АГМУ (г. Барнаул, 2011 г.), на ежегодной научной конференции «Фармация и общественное здоровье» (г. Екатеринбург, 2011 г.), на I Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Сибирский медико-биологический конгресс» (г. Барнаул, 2011 г.).

Публикации: Основные положения диссертации отражены в 43 научных работах, в том числе в 3 патентах РФ на изобретение и 25 статьях в журналах, рекомендованных ВАК РФ для диссертаций на соискание ученой степени доктора наук.

Объем и структура диссертации: Диссертация изложена на 242 страницах машинописного текста, иллюстрирована 44 рисунками, 31 таблицей, состоит из общей характеристики работы, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, списка цитируемой литературы, в котором приведено 332 источника, из них 279 - иностранных авторов.

205 ВЫВОДЫ

1. Новые фармакологические подходы к таргетной патогенетической коррекции кальций-оксалатного нефролитиаза (стимуляция синтеза протромбина в печени, повышение чувствительности почечных тканей к инсулину, ингибирование начальной фазы кристаллизационного процесса, применение средств природного происхождения) позволяют расширить арсёнал ан-тилитогенных лекарственных средств.

2. Менадиона натрия бисульфит (средство, стимулирующее образование фрагмента протромбина 1 в почечных канальцах вследствие увеличения выработки протромбина в печени), пиоглитазон (средство, повышающее чувствительность почечных тканей к инсулину), нифедипин (средство, ин-гибирующее начальную фазу кристаллизации за счет блокады кальциевых каналов на мембране нефроцитов), воздействуя на комплиментарное звено патогенеза нефролитиаза, значительно облегчают течение экспериментальной мочекаменной болезни. Наиболее выраженное антилитогенное действие проявил пиоглитазон.

3. Лекарственный препарат природного происхождения гистохром обладает выраженным политаргетным антилитогенным действием, снижая пересыщение мочи ионом кальция, уменьшая степень повреждения нефроцитов, ослабляя оксидативный стресс и усиливая антиоксидантную защиту почечных тканей, а также уменьшая количество и размер кальциевых депозитов в области почечного сосочка.

4. Фитокомплексы из лекарственных растений (экстракт из культуры клеток марены сердцелистной, культура клеток маакии амурской) на модели кальций-оксалатного нефролитиаза проявляют политаргетное антилитогенное действие за счет комплексной коррекции основных патологических процессов, происходящих при оксалатном нефролитиазе (пересыщение мочи ионами оксалата и кальция, повреждающий фактор, оксидативный стресс, формирование конкрементов в почках).

5. Амилорид (средство, ослабляющее кальциевый парадокс в нефроцитах из-за блокады Ыа^УН^-обмеиника на клеточной мембране) увеличивает количество кальциевых депозитов в почках при экспериментальной мочекаменной болезни.

6. Раскрыты новые механизмы антилитогенного действия а-токоферола ацетата (нормализация экспрессии внутрипочечных ингибиторов кристаллизации и снижение пересыщения мочи оксалат-ионом), натрия цитрата, натрия фитата и натрия пирофосфата (ослабление оксидативного повреждения нефроцитов и нормализация экспрессии внутрипочечных ингибиторов кристаллизации).

7. Подтверждена эффективность патогенетически обоснованной антили-тогенной терапии апробированных средств таргетного и политаргетного действия в обосновании ключевых мишеней мочекаменной болезни.