Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Фармакологические механизмы нейропротекторного эффекта прекондиционирования при полной ишемии головного мозга

На правах рукописи

ГАВРИЛИНА ТАТЬЯНА ВИКТОРОВНА

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ НЕЙРОПРОТЕКТОРНОГО ЭФФЕКТА ПРЕКОНДИЦИОНИРОВАНИЯ ПРИ ПОЛНОЙ ИШЕМИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология 14.00.16 - патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Улан-Удэ - 2004

Работа выполнена в Иркутском государственном медицинском университете Минздравсоцразвития РФ.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор

Кулинский Владимир Ильич

Официальные оппоненты'

кандидат медицинских наук, доцент

Чукаев Сергей Александрович

доктор медицинских наук, профессор

Пивоваров Юрий Иванович

Ведущая организация'

Институт цитологии и генетики СО РАН

Защита состоится 3 ноября 2004 года в 10 часов на заседании диссертационного совета К 003 028 01 при Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН по адресу 670047, г. Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной научной библиотеке Бурятского научного центра СО РАН.

Автореферат разослан «¿¿у октября 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандадат биологических наук

Хобракова В.Б

2005-4 13422

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность. Ишемические повреждения головного мозга лежат в основе группы патологических процессов, дающих высокий уровень смертности и инвалидности. Причинами ишемии являются нарушения мозгового кровообращения, возникающие в результате атеросклероза, тромбоза, эмболии или спазма мозговых сосудов, кровоизлияний в субарахноидальное пространство и вещество мозга, черепно-мозговых травм и нейрохирургических вмешательств, равно как и системные нарушения гемодинамики. Последние сопровождают тяжелые аритмии и блокады, остановку сердца, коллапс, шок

В мире на сегодняшний день около 9 млн человек страдают цереброваскулярпыми болезнями. В нашей стране доля острых нарушений мозгового кровообращения в структуре общей смертности составляет 21,4%, а инвалидизация после перенесенного инсульта достигает 3,2 на 10 тыс. населения, занимая первое место среди всех причин первичной инвалидности В России инсульт ежегодно развивается более чем у 450 тыс человек, из которых примерно 35% умирают в остром периоде заболевания [Гусев Е И., Скворцова В И., Стаховская Л.В., 2003, Гусев Е И., 2003] Смертность от цереброваскулярных расстройств занимает третье место в мире после сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний [Ямагучи Т., 2003, Hunter A J , ct al, 1995] В структуре инсультов отмечается явное преобладание ишемических над геморрагическими: 80% против 20% [Верещагин Н В , 2003] Таким образом, ишемический инсульт является чрезвычайно значимой медицинской и социальной проблемой

На современном этапе возможны два основных подхода к лечению инсульта-1 восстановление кровотока в ишемизированнной области посредством тромболизиса,

Принятые сокращения: ГТД - гипо1ермическое действие, ИГМ ишемия головного мозга, НПЭ - нейропротекторный эффею, ПК - прекондиционировапие, CPA - Ы6-циклопентиладенозин, DPCPX дипропилциклопентилксантин, 5-HD - 5-гидроксидеканоат.

2 иейропрогекция, то есть защита нейронов на клеточном и молекулярном уровне.

В качестве нейропротекторов с хорошими результатами в эксперименте применяют: антагонисты NMDA- и АМРА-рецепторов, перехватчики свободных радикалов, блокаторы действия цитокинов [Фишер М, Шебитц В., 2001, Фишер М, 2003], агонисты адснозиновых, ГАМК-, а2-рецепторов [Кулинский В.И., 2000] и i Литвиновых рецепторов [Гусев Е.И., Скворцова ВИ, 2002] Однако при клинических испытаниях четкие положительные результаты не доказаны [Фишер М , 2003] Следовательно, разработка новых, эффективных и безопасных методов профилактики и лечения ишемических повреждений головного мозга была и остается одной из наиболее актуальных проблем современной медицины.

Таким новым методом является прекондиционирование (ПК), то есть повышение толерантности к ишемии путем какого-либо предварительного воздействия (ишемии, гипоксии, гипотермии, введения некоторых веществ и т.д.). Ишемическое ПК становится признанной экспериментальной моделью, однако его использование в клинической практике затруднено ввиду опасности для пациентов В последние 4-7 лет появились новые методы - это ПК гипоксической гипоксией [Vannucci R С. et al, 1998, Bergeron М. et al., 2000, Sharp F.R. et al., 2001, Кулинский В И, Минакина JIН., Гаврилина Т.В., 2002] и химическое ПК (инъекции 3-нитропропионата [Wiegand F. et al., 1999, Horiguchi Т. et al., 2003] или СоС12 [Bergeron M et al , 2000, Sharp FR et al, 2001]) Эти термины характеризуют только методический подход, детальные же механизмы действия этих видов прекондиционирования не изучены. В отличие от ишемического, эффективность ПК гипоксической гипоксией и химического ПК показана лишь для поздней фазы (дни) и только при фокальной ишемии Пока нет данных для полной глобальной ишемии i оловного мозга (ИГМ) - самой жесткой модели ишемии, которая принципиально отличается отсутствием юны полутени (penumbra) В настоящее время в литературе накопилось достаточное количество данных, подтверждающих защитное действие i ипотермии при ИГМ [Schaller В , Graf R, 2003, Hypothermia for Acute Brain Damage, 2004], но ее значение в защитном эффекте ПК пока не ясно. Изучается роль

рецепторов аденозина и КАТФ-каиалов при ПК [Weih М., et al., 2001, Schaller В., Graf R., 2002], но их значение при полной глобальной ишемии не исследовалось

Цель работы: выявление влияния различных видов ирекондиционирования на толерантность головного мозга к глобальной ишемии и выяснение роли аденозиновых рецепторов, Кдтф-каналов и гипотермии в механизме их действия

Задачи исследования:

- определить влияние фармакологического, химического и функционального ПК на толерантность головного мозга к ишемии, провести их сравнительный анализ и обосновать оптимальные условия

' для проявления их нейропротекторного эффекта (НПЭ);

- сравнить значение центральных и периферических механизмов в защитной активности разных видов ПК;

- при помощи селективных агонистов и антагонистов выяснить роль аденозиновых рецепторов и КАтФ-каналов в НПЭ прекондиционирования;

- выявить значение гипотермического действия (ГТД) для реализации НПЭ ПК, сопоставить его с защитным действием прямого охлаждения.

Научная новизна:

- впервые при ишемии головного мозга обнаружен НПЭ пинацидила, PI075, NaNC>2, NiCh, малоната калия, пребывания в термокамере и кровопускания, впервые при полной глобальной ишемии - эффект диазоксида и СоСЬ;

- впервые при полной глобальной ИГМ показано значение при этих воздействиях аденозиновых рецепторов, КАТФ-каналов и гипотермии, изучена роль КАТф-каналов в НПЭ аденозина и циклопентиладенозина;

- впервые выявлено развитие гипотермии при ПК и оценена ее роль в его НПЭ;

- выявлено значение периферических и центральных механизмов действия NaN02, СоСЬ, NiCI2, малоната калия и диазоксида;

- впервые установлены отличия в механизмах защитного действия гипотермии при прекондиционировании от гипотермии при охлаждении

Научно-практическая значимость и внедрение в практику.

Полученные результаты показали эффективность разных видов ПК при полной глобальной ИГМ и преимущество нейропротекции прекондиционированием перед прямым глубоким охлаждением в эксперименте. Результаты работы позволяют расширить представление о механизмах развития НПЭ ПК, свидетельствуют о целесообразности его дальнейшего изучения. Материалы диссертации включены в курсы лекций по фармакологии, клинической фармакологии и биохимии на трех факультетах Иркутского государственного медицинского университета, а также в курс лекций кафедры клинической фармакологии Иркутского государственного института усовершенствования врачей. Оформлены 7 рационализаторских предложений- № 4199, 4203, 4204,4206, 4277-4279 (Иркутск, ИГМУ, 2001-2004 гг.).

Апробация работы.

Материалы диссертации представлены и обсуждены на следующих симпозиумах: Пироговской студенческой научной конференции (Москва 2001 и 2003), Всероссийском научно-практическом молодежном симпозиуме "Экология Байкала и Прибайкалья" (Иркутск, 2001), Юбилейной Международной студенческой научно-практической конференции (Красноярск, 2002), Third Mongolian-Russian International Symposium (Ulaanbaatar, 2002), 3-й Всероссийской конференции "Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция" (Москва, 2002), 4-м (2002) и 5-м (2003) Конгрессах с Международным участием "Паллиативная медицина и реабилитация в здравоохранении", FEBS Special Meeting 2003 on Signal Transduction (Brussels, 2003), XI Международном симпозиуме "Эколого-физиологические проблемы адаптации" (Москва, 2003), 4-м Конгрессе молодых ученых и специалистов "Науки о человеке" (Томск, 2003), International Symposium

«G-Protein Coupled Receptors New Approaches to Maximise the Impact of GPCRs in Drug Discovery» (London, 2004), JRME NIIGATA'04 The Eleventh International Symposium of the Japan-Russia Medical Exchange (Niigata, 2004), International Brain Hypothermia Symposium (Tokyo, 2004).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 17 научных работ

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 152 страницах машинописного текста и состоит из введения, 5 разделов и выводов. Работа проиллюстрирована 18 таблицами и 36 рисунками. Список литературы содержит 236 источников, из них 54 отечественных и 182 зарубежных.

Положения, выносимые на защиту.

1. Фармакологическое, химическое и функциональное прекондиционирование обладают выраженным нейропротекторным эффектом при полной глобальной ИГМ.

2. В защитном эффекте разных видов ПК участвуют аденозиновые рецепторы А|-подтипа, при большинстве воздействий - и КАта>-каналы.

3. Нейропротекторный и гипотермический эффекты нитрита натрия, К2-малоната, хлоридов кобальта и никеля обусловлены в основном периферическими, а диазоксида - как центральными, так и периферическими механизмами.

4. В защитном действии ПК важную роль играет гипотермическая толерантная стратегия, но она не является единственным механизмом увеличения толерантности к ишемии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Работа выполнена на 1170 взрослых здоровых беспородных мышах обоего пола в возрасте 2,5-4 мес. С целью фармакологического ПК использовали агонисты аденозиновых рецепторов аденозин (неселективный) и циклопентиладенозин (CPA, селективный Агагонист) и активаторы КАТф-канапов диазоксид, пинацидил и Р1075. В ходе эксперимента разработан ряд моделей гипоксического (химического и функционального) ПК. Для создания гемической гипоксии применяли инъекции NaN02 (метгемоглобинобразующего яда), C0CI2, NiCh, а для тканевой гипоксии -обратимый ингибитор сукцинатдегидрогеназы К2-малонат. Модель гипоксической гипоксии включает прерывистую четырехкратную гипоксию в термокамере объемом 100 мл. Длительность гипоксии составляет 12 и 16 минут, перерывов - 10 минут. Вторая модель отличается использованием натронной извести - поглотителя С02 и паров воды, таким образом создавали условия гипобарической нормокапнической гипоксии при нормальной влажности. Циркуляторную гипоксию моделировали при помощи пункции сердца, забирая кровь в количестве 1,6% от массы тела. При изучении механизмов действия использовали селективные блокаторы аденозиновых рецепторов и КАТф-каналов в оптимальных дозах. Большинство веществ вводили в водных растворах подкожно в объеме 10 мл/кг, ряд веществ - интрацеребровентрикулярно в объеме 3 мкл.

Для создания ишемии использовали декапитационную модель, разработанную Lowry О.Н. et al. (1964) и Araki Н. (1988). Она дает действительно полную глобальную ишемию головного мозга, апробирована в ряде биохимических и фармакологических исследований [Бобков Ю.Г., Иванова И А., 1987; Николова М. и соавт , 1991; Nikolov R. et al, 1992; Amano M. et al., 1993; Matsumura T. et al., 1993; Vannucci R.C., Brueklacher R.M., 1994; Nonaka M. et al., 1998; St-John W.M., 1999; St-Jacques R-, St-John W.M., 2000; Gosal D., Torres J.E., 2001]. НПЭ оценивали по продолжительности гаспинга (gasping - атональное дыхание), определяемой по секундомеру.

Температуру тела измеряли электротермометром ТПЭМ-1 в кишечнике на глубине 2,5 см. Запланированную гипотермию вызывали охлаждением в рефрижераторе при температуре О'С до необходимой температуры тела.

Продолжительность гаспинга не соответствует нормальному распределению [Кулинский В И. и соавт., 1993, 1996], поэтому для статистической обработки результатов использован непараметрический критерий U Манна-Уитни. Результаты представлены в виде медианы и децилей [Закс Л., 1976]. Показатели температуры тела соответствуют нормальному распределению, результаты представлены в виде средних со стандартной ошибкой. Серии сравнивали по дисперсиям (критерий F) и средним (критерий t). Проводили корреляционный анализ по Спирмену и регрессионный анализ с использованием программного пакета "Excel 7 0 for Windows 98" и "BIOSTAT". Различия считали статистически значимыми при р<0,05. Описаны только значимые результаты.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Нейропротекторный эффект прекондиционирования.

На модели полной глобальной ИГМ у мышей фармакологическое ПК -инъекции агонистов аденозиновых рецепторов аденозина и циклопентиладенозина и агонистов КдтФ-каналов диазоксида и пинацидила, химическое ПК с использованием гемической (введение СоС12, NiCb и NaN02) и тканевой гипоксии (К2-малонат), а также функциональное прекондиционирование с использованием гипоксической (два варианта гермокамерного ПК) и циркуляторной гипоксии (кровопускание) обладают выраженным НПЭ (увеличивают продолжительность гаспинга в среднем в 1,4-4,2 раза - рис. 1). При этом наибольшим НПЭ обладают, хлориды кобальта и никеля («4,2 раза) и селективный агонист Агрецепгоров CPA (»3,9 раза). Неселективный агонист А-рецепторов аденозин и агонисты КА1о>-каналов диазоксид и пинацидил, нитрит натрия, К2-малонат, i ермокамерное ПК в двух вариантах и кровопотеря вызывают умеренную защиту («1,4-1,9 раза) Малоактивен Р1075 - активатор КАтФ-каналов с преимущественным действием на

3 0 0 -2 0 0 -10 0 -

а

П П И п п

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

-4 -

-1 2

-1 6

ТТТТГ

отг

•с

Рис. 1. Влияние различных видов прекоидииионирования на продолжительность гаспинга и температуру тела мышей.

По оси ординат- вверх - прирост гаспинга к контролю (%), вниз - гипотермия (Д1 °С) I - аденозин (0,749 ммоль/кг за 1 ч подкожно), 2 - СРА (0,007 ммоль/кг за 3 ч подкожно), 3 -диазоксид (0,434 ммоль/кг за 2 ч интраперитонеально), 4 - пинацидил (0,039 ммоль/кг за 15 мин интраперитонеально), 5 - Р1075 (0,043 ммоль/кг за 15 мин-6 ч интраперитонеально), 6 - хлорид кобальта (0,358 ммоль/кг за 6 ч подкожно), 7 - хлорид никеля (0,24 ммоль/кг за 6-9 ч подкожно), 8 - нитрит натрия (2,18 ммоль/кг за 1-2 ч подкожно), 9 - малонат калия (10 ммоль/кг за 2 ч подкожно), 10 термокамера (4 воздействия гипоксией по 12 мин с перерывами по 10 мин и без интервала перед ИГМ), 11 - термокамера с натронной известью (режим тот же, но длительность воздействий - 16 мин), 12 - кровопускание (в количестве 1,6% от массы тела) Значимость различий с контролем: а - р<0,1,6- р<0,05, в - р<0,01; г - р<0,002.

сосуды, а не на нейроны головного мозга. Все представленные виды ПК обладают значительным ГТД - температура тела снижается на 1,6-12,5 °С.

НПЭ и ГТД СоС1г и кровопускания оценивали в динамике: максимум увеличения толерантности при кровопускании приходится на 5 часов, при введении хлорида кобальта - на 6 часов (рис. 2). В более поздние сроки эффекты плавно снижаются.

•с

Рис. 2. Влияние СоСЬ в дозе 358 мкмоль/кг и кровопускания (1,6% от массы тела) на продолжительность гаспинга и температуру тела мышей.

По оси абсцисс - время, ч, по оси ординат вверх - прирост гаспинга, % к контролю, вниз -снижение температуры тела, °С

Непрерывная линия - C0CI2, пунктирная линия - кровопускание (оба воздействия в оптимальных условиях) Темные значки - значимые различия с контролем (р < 0,05), светлые - различия незначимы (р > 0,05)

2. Изучение фармакологических механизмов прекондиционирования. Значение А-рецепторов и КАТФ-каналов.

Фармакологические механизмы развития эффектов ПК и селективных агонистов А-рецепторов и КАтф-каналов изучали при помощи двух независимых подходов- сравнительное изучение влияния веществ при разных путях введения и блокаторный анализ эффектов С целью выяснения роли центрального и периферического компонентов в НПЭ и ГТД прекондиционирования ряд веществ вводили интрацеребровентрикулярно и периферически (подкожно и внутрибрюшинно) (табл. 1).

НПЭ при ишрацеребровентрикулярном введении №Ы02 и К2-малоната в среднем в 3,1 раза, а СоС12 и №С12 в 11,5 раза ниже, чем при периферическом введении, гипотермия также значительно уменьшается. Однако при разных путях введения диазоксида значимой разницы в развитии НПЭ не обнаружено. Очевидно, НПЭ и ГТД СоС12, N¡02, N81402 и К2-малоната реализуются в основном периферическими механизмами, а диазоксида - как центральными, так и периферическими механизмами.

Таблица 1.

Сравнение изменений длительности гаспинга и гипотермии при периферическом и интрацеребровентрикулярном введении СоСЬ, N102, Ма!\Ог, Кг-малоната и диазоксида.

Тип Путь п Доза, Длительность Продолжительность Температура

во иене I Вия вве мкмоль/кг интервала перед гаспинга, секунды тела, йС

дения глобальной ишемией, часы Медианы 0,-0, х±5„

Контроль ПК 48 1-24 16,0 15-19 36,6±0,15

ицв 22 - 0,25-24 16,0 14-18 36,1±0,28

СоСЬ ПК 8 331-385 6 67,5' 22-86 26,Ь± 1,73 '

иив 6 15,4-17,7 0,25-0,5 21.0' " 19-25 33.0±0,60' "

МС1. ПК 10 240 6-9 66,5' 48-85 25.8±0,20'

ИЦВ 8 7,86 0,25-1,0 20,0' " 18-23 34,1±0,58' и

ПК 11 2180 1-2 24,0' 21-27 28,6±0,90'

ИЦВ 9 726-1161 0,25-1,5 19,0" " 16-23 34,5±0,50' "

К мллонлт ПК 8 10000 2 29,5' 20-45 28,2±1,73'

ИЦВ 5 44.4 0,5 20,0 " 18-26 35Д±0,73 " *

Диачоксид вб 10 434 2 22,0' 18-32 35.ftt0.36 1

ИЦВ II 0,043 0,5 20,0' 18-25 36,0±0,25 "

Примечание Значимость различий с контролем а-р<0,1,б-р< 0,05, в - р < 0,01, г - р <0,002, с периферически введенным веществом к - р < 0,1, л - р < 0,05, м - р < 0,01, н р <0,002 [1к -подкожно, ицв интрацеребровентрикулярно, вб - внутрибрюижнно ОгЭч - децили

Введение неселективною блокатора А-рецепторов теофиллина и сильного высокоселективного блокатора А|-подтипа аденозиновых рецепторов ЭРСРХ НПЭ МаКт02 устраняет полностью, а НПЭ аденозина, СРА, СоС12, №С12 и гермокамерного ПК значительно снижает (табл. 2). Результаты блокады эффекта К2-малоната приближаются к значимому уровню (р<0,1), однако такие же значения

сохранившихся эффектов (20 секунд) были в опытах со статистически значимой блокадой ОРСРХ действия А-агонистов (р>0,1) Это свидетельствует в пользу роли А г рецепторов в НПЭ К2-малоната.

Таким образом, НПЭ всех указанных видов ПК частично или полностью определяется мобилизацией эндогенного аденозина и его действием на аденозиновые рецепторы, в основном на А|-подтип.

Таблица 2

Доля сохранившихся эффектов прекоилиционироваиия (%%) на фоне блокады А-рецепторов при периферическом введении блокаторов.

Блокаторы, мкмоль/кг {мг/ki ) Адеиозин 749 (200), за 1 ч CPA 7,2 (2,4), за 3 ч СоСЬ 331-385 (43 50), за 6 ч NiCI. 240 (30), за 69ч NaNO, 2180(150), за 1 2ч К,-малонат 10000(1803), за 2 ч Герчокачер-ное прекоидицио-нироваиие

, Нейропротекторпый эф< >ект

Теофиллин 100-400 (20-80) -- 0'", п=8* 15,6 е", п=13 31,4 ' п=6 0 ". п 6 - 41,6'", п=11

DPCPX 3,3 (1,0) 26,6'", п-14» 7,6'", п=14* 25,0'", п=10 0'", п=6 29,6 п 7 16,7 ", п=6

Гипотермический эффект

Теофиллин - 0'" ♦ 54,3 1" 72,4' * 100" - 100'

DPCPX 38,01" « 15,2"'* 39,5'" - 100 91,7' 100'

Примечание значимость различий с контролем а - р<0,|, б - р<0,05, в - р<0,01, г - р<0,002; с прекондиционированием - к - р<0,1, л - р<0,05, м - р<0,01, н - р<0,002 Теофиллин вводили за 15 минут, DPCPX - за I ч до ПК * - данные получены в совместной работе с Минакиной Jl Н

Теофиллин и DPCPX значительно снижают ГТД аденозина, CPA (ГТД CPA теофиллин блокирует полностью - температура на фоне блокатора значимо выше контрольной), СоСЬ и NiC12 Блокаторы А-ренспторов не влияют на развитие гипотермии при введении нитрита натрия, К2-малоната и гермокамерном ПК Следовательно, аденозиновые рецепторы играют важную роль в развитии гипотермии при введении А-агонистов, CoCI2, NiCl2 и не принимают участия в ГТД NaN02, К2-малоната и 1ермокамеры.

Глибенкламид, блокатор КАтФ-каналов плазматических мембран и митохондрий, как при интраперитонеалыюм, так и при интрацеребровентрикулярном введении значительно снижает НПЭ CPA, NaN02 и гермокамерного ПК, при интраперитонеалыюм - аденозина и малоната, и не влияет на повышение толерантности к ишемии при введении СоС12 (табл. 3)

Таблица 3

Доля сохранившихся эффектов преконднционирования (%%) на фоне блокады КДТф-каналов при периферическом и иитрацеребровентрикулярном введении блокаторов.

Блокаторы, мкмоль/кг (мг/кг) Аденознн 749 (200), за 1 ч CPA 7,2 (2,4), за 3 ч СоС1г 331-385 (4350), за 6 ч NaNO: 2180(150), за 1-2 ч К2-малоиат 10000(1803), за 2 ч Гермокамер-ное прекондицио-нирование

Нейропротекторный эффект

Глибенкламид 116 (55)(вб) 60,0 '•", п=6 43,5п=14 100' ,п=6 0 п'6 11,1 -",п=6 0' ", п=13

Глибенкламид 8.1 (2)(ицв) -- 19,6'", п=7 96,9' , п=7 18.8 *,п=6 -- 33,3 •". п=7

5-HD249(53)(nK) -- 82,6' , п=7 - 41,6'", п=6

5-HD 0,079 (0,017) (ицв) 100г", п=6 - 0 ■", п=9 - 25,0'", п=7

Гипотермический эффект

Глибенкламид (вб) 100' 85,6'" 100'-* 100' 69,0' 54,3 "

Глибенкламид (ицв) - 88,8' 100'" 100" - 100'

5-HD (пк) -- 100' - - 76,7

5-HD (ицв) -• 100" -- 100' -- 100'

Примечание значимость различий с контролем - а - р<0,1, б - р<0,05, в - р<0,01; г - р<0,002, с ПК -к - р<0,1, л - р<0,05, м - р<0,01, н - р<0,002. Глибенкламид вводили за I ч и виутрибрюшинно (вб) и интрацеребровентрикулярно (ицв), 5-HD - за 30 мин подкожно (пк) и за 15 мин интрацерсбровентрикулярно до ПК

5-гидроксидеканоат (5-HD), селективный блокатор митохондриальных КАТф-каналов, подобно глибенкламиду при подкожном и интрацеребровентрикулярном введении снижает НПЭ гермокамерного ПК, при интрацеребровентрикулярном -нитрита натрия, но в отличии от глибенкламида не влияет на НПЭ CPA Следовательно, в НПЭ гермокамерного ПК и NaN02 принимают участие как центральные, так и периферические КА1ф-каналы, в том числе митохондриальные НПЭ CPA, вероятно, реализуется центральными и периферическими КАТф-каналами плазматических мембран КАТФ-каналы реализуют НПЭ аденозина и малоната, но не СоС12.

Глибенкламид при интраперигонеальном, но не при интрацеребровентрикулярном введении значимо снижает гипотермический эффект только термокамеры, 5-HD не влияет на гипотермию, развивающуюся при гермокамерном ПК При любых путях введения ни глибенкламид, ни 5-HD не влияют на ГТД описанных моделей. По-видимому, в ГТД термокамеры играют роль

периферические КАТф-каналы плазматических мембран, при других видах ПК КАтф-каналы не участвуют.

3. Исследование значения гипотермии в реализации НПЭ прекондиционирования.

На всем материале имеется высокозначимая и сильная связь длительности гаспинга и температуры тела г = -0,73 (п=793), однако коэффициент корреляции различен при использовании разного материала: он максимально высок для серий с ПК: г = -0,83 (п=514, при сравнении с г по всему материалу р<0,01), меньше при сочетании антагонистов и ПК: г = -0,63 (п=208, ПК р>0,6) и самое низкое значение -в опытах только с антагонистами г = -0,35, п=71 (при сравнении с г по сочетанию антагонистов и ПК р<0,01) (рис. 3). Таким образом, в опытах с антагонистами наблюдается частичное разобщение НПЭ и ГТД. Следовательно, гипотермия является важным, но не единственным механизмом повышения толерантности к ишемии головного мозга при разных видах ПК.

Для выяснения вопроса о количественном вкладе гипотермии в НПЭ ПК были проведены опыты с прямым охлаждением тела. Использовали три основных варианта охлаждения: температуру тела снижали в среднем на 4-5, 7-8 и 15-17 °С. Все виды прекондиционирования разбили на три группы по выраженности развивающейся гипотермии (рис. 4). Охлаждение до температуры, аналогичной гипотермии при гермокамерном ПК и кровопускании, не обладает НПЭ (р>0,2), в то время как эти воздействия увеличивают толерантность к ишемии более чем в 1,5 раза и по своему НПЭ в среднем в 11 раз превышают прямое охлаждение (р«0,002). Охлаждение на 7-8 °С дает НПЭ, не отличающийся от такового при введении NaN02 и К2-малоната (р>0,2), однако защита аденозином в среднем вдвое выше (р<0,01). В последней группе даже при значимо более низкой гипотермии защитный эффект СоС12, NiCl2 и CPA примерно в 3 раза превышает НПЭ прямого охлаждения (р«0,002).

с

прекондиционироваиия.

Приведены данные по средним величинам серий А - весь материал, Б - серии с ПК, Б ПК на фоне антагонистов, Г - антагонисты. По оси абсцисс - температура тела, °С, по оси ординат -продолжительность гаспинга, с

Таким образом, НПЭ разных видов ПК, за исключением и малоната, в

среднем в 2,9 раза (от 2 до 11 раз) превышает таковой при аналогичной гипотермии, вызванной охлаждением (р«0,002). Блокаторный анализ прямого охлаждения показал, что, в отличие от ПК, ни Агрецепторы, ни КАТф-каналы не принимают участия в его НПЭ и гипотермии (табл. 4). Можно сделать вывод, что НПЭ и снижение температуры при охлаждении по механизму развития качественно отличаются от ПК.

го

П П П_■ п П

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

1 . ■1и1 а I

- В <

•с

Рис. 4. Сравнение нейропротекторного эффекта охлаждения и разных видов прекондиционирования.

По оси ординат: вверх прирост гаспинга к контролю (%), вниз гипотермия (Д1 °С) 1 - охлаждение на 4-5 °С, 2 - термокамера (4 воздействия гипоксией по 12 мин с перерывами по 10 мин и без интервала перед ИГМ), 3 - термокамера с натронной известью (режим тот же, но длительность воздействий - 16 мин), 4 - кровопускание (в количестве 1,6% от массы тела), 5 -охлаждение на 7-8 °С, 6 - №МС>2 (2,18 ммоль/кг за 1-2 ч подкожно), 7 - Кгмалонат (10 ммоль/кг за 2 ч подкожно), 8 - аденозин (0,749 ммоль/кг за 1 ч подкожно), 9 - охлаждение на 15-17 °С, 10 -СоСЬ (0,358 ммоль/кг за 6 ч подкожно), 11 - М|СЬ (0,236 ммоль/кг за 6-9 ч подкожно), 12 - СРА (0,007 ммоль/кг за 3 ч подкожно).

Примечание значения р приведены по отношению к соответствующему охлаждению а - р < 0,1, б - р < 0,05; в - р < 0,01; г - р < 0,001.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Впервые при полной глобальной ИГМ проведено комплексное сравнительное изучение эффектов различных видов ПК. При всех видах прекондиционирования и при всех типах гипоксии (гипоксической, циркуляторной, гемической и тканевой)

наблюдается качественное совпадение эффектов - развитие толерантности к ИГМ и снижение температуры тела; последнее свидетельствует об использовании

Таблица 4

Доля сохранившихся эффектов охлаждения (%%) на фойе блокады А [-рецепторов и КЛТФ-каналов при периферическом введении блокаторов.

Блокаторы Охлаждение на 15-17 "С с интервалом перед ИГМ 15 мин Охлаждение на 15-17 "С с интервалом перед ИГМ 60 мин

Нейропротекторный эффект

ОРСРХЗ.З(1,0) 74,3 '", п~6 100",п=6

Глибенкламид 116 (55) 70,3 п=б 81,6", п=6

Гнпотермнческий эффект

ЭРСРХ 3,3(1,0) 83,4' 94,9"

Глибенкламид 116 (55) 83,4" 85,3"

Примечание значимость различий с контролем - а - р<0,1, б - р<0,05, в - р<0,01, г - р<0,002; с охлаждением - к - р<0,1, л - р<0,05, м - р<0,01, н - р<0,002 ЭРСРХ и глибенкламид вводили - за 1 ч до охлаждения

толерантной стратегии. Однако гипотермия не является единственным механизмом повышения толерантности к ишемии головного мозга. В опытах с селективными антагонистами и агонистами доказано значение аденозиновых А-рецепторов и КАтф-каналов в защитном эффекте ПК. Выяснена роль центральных и периферических механизмов в реализации НПЭ и ГТД прекондиционирования.

Обобщая данные, можно отметить сходство фармакологических процессов, протекающих в организме при ПК: выброс эндогенного аденозина, его действие на А-рецепторы, в основном на А]-подтип, открытие через в,-белок КАтФ-каналов (рис. 5). Это, очевидно, вызывает гиперполяризацию и ингибирование нейронов. НПЭ нитрита натрия полностью, а других видов ПК в основном реализуется установленными нами молекулярными механизмами.

Все эти явления уменьшают потребность в кислороде, ингибируют аэробные процессы, уменьшают энергозатраты и тормозят метаболизм в целом, и, следовательно, снижают функциональную активность головного мозга. Указанные сдвиги могут быть как первичными в ответ на мобилизацию эндогенного аденозина и ею ингибиторное действие, так и вторичными - в ответ на развивающуюся гипотермию.

Рис 5. Молекулярные механизмы нейропротекторного эффекта различных видов прекондиционирования (обобщающая схема).

выводы.

1 Фармакологическое (аденозин, циклопентиладенозин, диазоксид, пинацидил, РЮ75), химическое (СоС12, №С12, NaN02, К2-малонат) и функциональное (пребывание в термокамере, кровопускание) прекондиционирование защищают головной мозг при полной глобальной ишемии. Воздействие на разные клеточные и молекулярные мишени: гем, митохондрии, аденозиновые Агрецепторы и КАТф-каналы дают качественно однотипный нейропротекторный эффект.

2 Действие хлоридов кобальта и никеля, нитрита натрия и К2-малоната реализуется в основном периферическими, а НПЭ диазоксида - центральными и периферическими механизмами.

3 В нейропротскторном эффекте разных видов прекондиционирования участвуют аденозиновые рецепторы А гподтипа (опыты с селективными антагонистами и агонистами).

4 Действие всех видов прекондиционирования, кроме введения хлорида кобальта, полностью или в значительной мере опосредовано КАтФ-каналами, в том числе митохондриальными (опыты с блокаторным анализом). В эффекте пиклопентиладенозина, ЫаЫ02 и гермокамерного прекондиционирования участвуют как центральные, так и периферические КАТФ-каналы.

5 Все виды прекондиционирования вызывают выраженную гипотермию, которая является важным, но не единственным механизмом повышения толерантности к [лобальной ишемии Гипотермическое действие циклопентиладенозина, аденозина, хлоридов кобальта и никеля частично или полностью определяется А |-рецепторами КАТф-каналы участвуют в развитии гипотермии только при гермокамерном прекондиционировании.

6. НПЭ гипотермии, вызванной прямым охлаждением, в отличие от НПЭ прекондиционирования, не связан с аденозиновыми рецепторами.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гаврилина ТВ. Повышение устойчивости к ишемии головного мозга гипоксическим прекондиционированием./ Т В. Гаврилина // Вестник РГМУ -2001.-№2, Т. 17.-С. 127

2. Гаврилина Т В Повышение гипоксической тренировкой толерантности к полной глобальной ишемии головного мозга и значение А-реиепторов и гипотермии / Т В Гаврилина, Л Н Минакина, В.И Кулинский // Сибирский медицинский журнал.-2001 -№3 -С. 23-26.

3 Кулинский В.И. Нейропротекторный эффект гипоксического прскоидиционирования' феномен и механизмы./ В И. Кулинский, Л Н Минакина, Т.В Гаврилина.// Бюл. эксп биол. мед. - 2002 -№2, Т. 133 - С 237-240.

4. Нейропротекторный эффект А-агонистов и разных видов ГПК при ИГМ / В И Кулинский, Л.Н Минакина, Т.В. Гаврилина. // Мат 3-й Всероссийск конф "Гипоксия- механизмы, адаптация, коррекция" - М , РАМН, 2002. - С 71.

5 Повышение устойчивости к ишемии головного мозга различными способами гипоксической тренировки / Гаврилина Т.В // Мат юбилейной международ студенч научно-нрактич конф. посвящ. 60-летию КрасГМА - Красноярск, 2002 - С 91-93

6. Гаврилина Т В Влияние хлорида кобальта на толерантность головного мозга к ишемии./ Т.В. Гаврилина, Л.Н. Минакина, В И Кулинский // Паллиативная медицина и реабилитация. - 2002. - №2-3. - С 129

7. Кулинский В И Влияние хлорида никеля, нитрита натрия и кровопускания на толерантность головного мозга к ишемии / В И Кулинский, Т.В Гаврилина, Л Н Минакина//Паллиативная медицина и реабилитация - 2003 -№2 - С 147

8. Гаврилина Т В Различные модели прекондиционирования при полной глобальной ишемии головного мозга, роль аденозиновых А-рецепторов, КЛто>-каналов и гипотермии./ Т.В Гаврилина//Вестник РГМУ - 2003. - №2(28) - С. 153.

9 Роль Кдтф-каналов в прекондиционировании полной глобальной ишемии головного мозга / В.И. Кулинский, Т В Гаврилина, Л Н Минакина // Мат XI Международ. Симп «Эколо! о-физиологическис проблемы адаптации» - Москва, РУДН, 2003.-С. 301-302.

10. Значение КАТФ-каналов, как фактора, повышающего толерантность к полной глобальной ишемии головного мозга / Т.В. Гаврилина // Мат. 4-го Конгресса молодых ученых и специалистов «Науки о человеке». - Томск, КСНМ, 2003 - С

11 Гаврилина Т В Прекондиционирование ишемии головного мозга' модели, феномены, механизмы./ Т.В. Гаврилина, JT Н. Минакина // Сибирский медицинский журнал - 2003. - №2. - С. 23-26.

12.Кулинский В И Влияние охлаждения на толерантность головного мозга мышей к полной глобальной ишемии./ В И. Кулинский, Т.В. Гаврилина, JI Н. Минакина // Паллиативная медицина и реабилитация. - 2004. - №2. - С 117.

13 Hypoxic precondition: models, effects and possible mechanisms / T.V Gavrilina, L.N Minakina, VI Kulinsky. // Abstracts of Third Mongolian-Russian International Medical Symposium - Ulaanbaatar, 2002. - P. 22-23.

14 Kulinsky V.I. Tolerance mechanisms to the complete global cerebral ischemia / V.I. Kulinsky, L.N Minakina, T.V. Gavrilina // European Journal of Biochem. - 2003 -Vol.270, Suppl.l. - P.43.

15 Neuroprotective effects of different types of hypoxic preconditioning / V I Kulinsky, T.V Gavrilina, L N. Minakina. // G-Protein Coupled Receptors New Approaches to Maximise the Impact of GPCRs in Drug Discovery - London, IBC Life Sciences,

16 The role of cerebral KATP-channels in a neuroprotective effect of hypoxic preconditioning / V.l. Kulinsky, T V Gavrilina, L N. Minakina // JRME NIIGATA'04. The Eleventh International Symposium of the Japan-Russia Medical Exchange Program - Abstract (II) Supplement. - Niigata, 2004. - P.60.

17 Influence of Hypothermia on Neuroprotective Effect of Inhibiting Neurotransmitters and Agonists of Their Receptors / V.l. Kulinsky, L.N. Minakina, T.V. Gavrilina, S.S. Gavrilov, T.N. Medvedeva, G.V. Mikhelson. // Hypothermia for Acute Brain Damage: Pathomechanism and Practical Aspects. Eds: N. Hayashi, R Bullock, D.W. Dietrich, T. Maekawa, A. Tamura. - Tokyo, Springer, 2004. - P.41 -46.

147-148.

2004.

#18572

РЫБ Русский фонд

2005-4 13422

Актуальность.

Ишемические повреждения головного мозга лежат в основе группы патологических процессов, дающих высокий уровень смертности и инвалидности. Причинами ишемии являются нарушения мозгового кровообращения, возникающие в результате атеросклероза, тромбоза, эмболии или спазма мозговых сосудов, кровоизлияний в субарахноидальное пространство и вещество мозга, черепно-мозговых травм и нейрохирургических вмешательств, равно как и системные нарушения гемодинамики. Последние сопровождают тяжелые аритмии и блокады, остановку сердца, коллапс, шок.

В мире на сегодняшний день около 9 млн. человек страдают цереброваску-лярными болезнями. В нашей стране доля острых нарушений мозгового кровообращения в структуре общей смертности составляет 21,4%, а инвалидизация после перенесенного инсульта достигает 3,2 на 10 тыс. населения, занимая первое место среди всех причин первичной инвалидности. В России инсульт ежегодно развивается более чем у 450 тыс. человек, из которых примерно 35% умирают в остром периоде заболевания [Гусев Е.И., 2003; Гусев Е.И. и др., 2003]. Смертность от цереброваскулярных расстройств занимает третье место в мире после сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний [Ямагучи Т., 2003; Hunter A J., et al., 1995]. В структуре инсультов отмечается явное преобладание ишемических над геморрагическими: 80% против 20% [Верещагин Н.В., 2003]. Таким образом, ишемический инсульт является чрезвычайно значимой медицинской и социальной проблемой.

На современном этапе возможны два основных подхода к лечению инсульта:

1. восстановление кровотока в ишемизированнной области посредством тромболизиса;

2. нейропротекция, то есть прямая защита нейронов.

В качестве нейропротекторов с хорошими результатами в эксперименте применяют антагонисты NMDA- и АМРА-рецепторов, перехватчики свободных радикалов, блокаторы действия цитокинов [Фишер М., Шебитц В., 2001, Фишер М., 2003] и, в особенности, агонисты аденозиновых, ГАМК-, а2-рецепторов [Кулинский В.И., 2000] и глициновых рецепторов [Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2002а]. Однако при клинических испытаниях четкие положительные результаты не доказаны [Фишер М., 2003]. Следовательно, разработка новых, эффективных и безопасных методов профилактики и лечения ишемиче-ских повреждений головного мозга была и остается одной из наиболее актуальных проблем современной медицины.

Таким новым методом является прекондиционирование (ПК), то есть повышение толерантности к ишемии путем какого-либо предварительного воздействия (ишемии, гипоксии, гипотермии, введения некоторых веществ и т.д.). Ишемическое ПК становится признанной экспериментальной моделью, однако его использование в клинической практике затруднено ввиду опасности для пациентов. В последние 4-7 лет появились новые методы - это ПК гипоксической гипоксией [Кулинский В.И. и соавт., 2002; Vannucci R.C. et al., 1998; Bergeron M. et al., 2000; Sharp F.R. et al., 2001] и химическое ПК (инъекции 3-нитропропионата [Wiegand F. et al., 1999; Horiguchi Т. et al., 2003] или СоСЬ [Bergeron М. et al., 2000; Sharp F.R. et al., 2001]). Эти термины характеризуют только методический подход, детальные же механизмы действия этих видов ПК не изучены. В отличие от ишемического, эффективность ПК гипоксической гипоксией и химического ПК показана лишь для поздней фазы (дни) и только при фокальной ишемии. Пока нет данных для полной глобальной ишемии головного мозга (HTM) - самой жесткой модели ишемии, которая принципиально отличается отсутствием зоны полутени (penumbra). В настоящее время в литературе накопилось достаточное количество данных, подтверждающих защитное действие гипотермии при ИГМ [Schaller В., Graf R., 2003; Bernard S.A., 2004; Schwab S., 2004], но ее наличие и значение в защитном эффекте ПК пока не ясно. Широко освещается роль рецепторов аденозина и КАтФ-каналов при ПК [Weih М., et al., 2001; Schaller В., Graf R., 2002a], но их значение при полной глобальной ишемии не показано.

Цель работы.

Выявление влияния различных видов ПК на толерантность головного мозга к полной глобальной ишемии; выяснение роли аденозиновых рецепторов, КАтФ-каналов и гипотермии в механизме их действия.

Задачи исследования:

- определить влияние фармакологического, химического и функционального ПК на толерантность головного мозга к ишемии, провести их сравнительный анализ и обосновать оптимальные условия для проявления их нейропротекторного эффекта (НПЭ);

- сравнить значение центральных и периферических механизмов в защитной активности разных видов ПК;

- при помощи селективных агонистов и антагонистов выяснить роль аденозиновых рецепторов и КдтФ-каналов в НПЭ прекондициониро-вания;

- выявить значение гипотермического действия (ГТД) для реализации НПЭ ПК, сопоставить его с защитным действием прямого охлаждения. у

Научная новизна:

- впервые при ишемии головного мозга обнаружен НПЭ пинацидила, PI075, NaN02, NiCl2, малоната калия, пребывания в термокамере и кровопускания, впервые при полной глобальной ишемии — эффект диазоксида и СоСЬ;

- впервые при полной глобальной ИГМ показано значение при этих воздействиях аденозиновых рецепторов, КАтФ-каналов и гипотермии, изучена роль КАтф-каналов в НПЭ аденозина и циклопентиладенози-на;

- впервые выявлено развитие гипотермии при ПК и оценена ее роль в его НПЭ;

- выявлено значение периферических и центральных механизмов действия №N02, СоС12, МСЬ, малоната калия и диазоксида;

- впервые установлены отличия в механизмах защитного действия гипотермии при прекондиционировании от гипотермии при охлаждении.

Научно-практическая значимость и внедрение в практику.

Полученные результаты показали эффективность разных видов гипоксического ПК при полной глобальной ИГМ и преимущество нейропротекции прекондиционированием перед прямым глубоким охлаждением в эксперименте. Результаты работы позволяют расширить представление о механизмах развития НПЭ ПК, свидетельствуют о целесообразности его дальнейшего изучения. Материалы диссертации включены в курсы лекций по фармакологии, клинической фармакологии и биохимии на трех факультетах Иркутского государственного медицинского университета, а также в курс лекций кафедры клинической фармакологии Иркутского государственного института усовершенствования врачей. Оформлены 7 рационализаторских предложений: № 4199, 4203, 4204, 4206, 4277-4279 (Иркутск, ИГМУ, 2001-2004 гг.).

Апробация работы.

Материалы диссертации представлены и обсуждены на следующих симпозиумах: Пироговской студенческой научной конференции (Москва 2001 и

2003), Всероссийском научно-практическом молодежном симпозиуме "Экология Байкала и Прибайкалья" (Иркутск, 2001), Юбилейной Международной студенческой научно-практической конференции (Красноярск, 2002), Third Mongolian-Russian International Symposium (Ulaanbaatar, 2002), 3-й Всероссийской конференции "Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция" (Москва, 2002), 4-м (2002) и 5-м (2003) Конгрессах с Международным участием "Паллиативная медицина и реабилитация в здравоохранении", FEBS Special Meeting 2003 on Signal Transduction (Brussels, 2003), XI Международном симпозиуме "Эколого-физиологические проблемы адаптации" (Москва, 2003), 4-м Конгрессе молодых ученых и специалистов "Науки о человеке" (Томск,

2003), International Symposium «G-Protein Coupled Receptors. New Approaches to Maximise the Impact of GPCRs in Drug Discovery» (London, 2004), JRME NIIGATA'04 The Eleventh International Symposium of the Japan-Russia Medical Exchange (Niigata, 2004), International Brain Hypothermia Symposium (Tokyo,

2004).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 17 научных работ. Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 152 страницах машинописного текста и состоит из введения, 5 разделов и выводов. Работа проиллюстрирована 18 таблицами и 36 рисунками. Список литературы содержит 237 источников, из них 55 отечественных и 182 зарубежных.

ВЫВОДЫ.

1. Фармакологическое (аденозин, циклопентиладенозин, диазоксид, пинаци-дил, Р1075), химическое (СоС12, №С12, МаЖ)2, К2-малонат) и функциональное (пребывание в термокамере, кровопускание) прекондициониро-вание защищают головной мозг при полной глобальной ишемии. Воздействие на разные клеточные и молекулярные мишени: гем, митохондрии, аденозиновые А]-рецепторы и КАТФ-каналы дают качественно однотипный нейропротекторный эффект.

2. Действие хлоридов кобальта и никеля, нитрита натрия и К2-малоната реализуется в основном периферическими, а НПЭ диазоксида - центральными и периферическими механизмами.

3. В нейропротекторном эффекте разных видов прекондиционирования участвуют аденозиновые рецепторы А]-подтипа (опыты с селективными антагонистами и агонистами).

4. Действие всех видов прекондиционирования, кроме введения хлорида кобальта, полностью или в значительной мере опосредовано КАТФ-каналами, в том числе митохондриальными (опыты с блокаторным анализом). В эффекте циклопентиладенозина, №>Ю2 и гермокамерного прекондиционирования участвуют как центральные, так и периферические КАтФ-каналы.

5. Все виды прекондиционирования вызывают выраженную гипотермию, которая является важным, но не единственным механизмом повышения толерантности к глобальной ишемии. Гипотермическое действие циклопентиладенозина, аденозина, хлоридов кобальта и никеля частично или полностью определяется Аррецепторами. КАТФ-каналы участвуют в развитии гипотермии только при гермокамерном прекондиционировании.

НПЭ гипотермии, вызванной прямым охлаждением, в отличие от прекондиционирования, не связан с аденозиновыми рецепторами.