Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Перекисное окисление липидов и антиоксидантная защита печени стареющего организма при экспериментальной интоксикации тетрахлорметаном

На правах рукописи

Чернов Василий Николаевич

ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ И АНТИОКСИДАНТНАЯ ЗАЩИТА ПЕЧЕНИ СТАРЕЮЩЕГО ОРГАНИЗМА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ ТЕТРАХЛОРМЕТАНОМ

14.00.16 - патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

0031Т61ЭТ

Москва - 2007

003176197

Работа выполнена на кафедре патофизиологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию и в отделе токсикологии ФГУН Уфимский НИИ медицины труда и экологии человека МЗ РФ

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Еникеев Дамир Ахметович

(ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию)

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор

Мышкин Владимир Александрович

(ФГУН Уфимский НИИ медицины труда и экологии человека МЗ РФ)

Официальные оппоненты: член-корр. РаАн, заслуженный деятель науки РФ,

лауреат премии Правительства РФ, доктор медицинских наук, профессор Решетник Виталий Кузьмич

(ФГУ Учебно-научный медицинский центр при Управлении делами Президента РФ)

заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Демуров Евгений Аркадьевич

(Российский университет дружбы народов)

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Защита состоится «_»_2007 г в_часов

на заседании диссертационного совета Д 208.102 03 при Российском университете дружбы народов по адресу 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д 6.

Автореферат разослан « / г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор

Г. А. Дроздова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. В современной стареющей популяции людей патология гепатобилиарной системы распространена достаточно широка и, по данным С Д По-дымовой (1998), достигает 60 случаев на 10000 населения. В Российской Федерации доля лиц в возрасте 60 лег и старше увеличилась с 12 до 18,5%, а доля лиц 75 лет и старше с 2,5 до 4,1% населения страны (Донцов В И, 1999).

В этих условиях приоритетной научной задачей становится не столько увеличение продолжительности жизни, сколько повышение ее качества, эффективной профилактики и лечения заболеваний лиц пожилого и старческого возраста.

Всемирная организация здравоохранения ежегодно отмечает увеличение заболеваний печени, вызванных ксенобиотиками К ядам с избирательной или преимущественной гепа-тотсжсичбсстыо относит производственные токсиканты, природные соединения и лекарственные средства, всего более 40 групп химических веществ (Куценко С А, 2004) По данным А. И Арчакова и И. И. Карузиной (1998), известно около 80000 ксенобиотиков и более 200 лекарственных препаратов, способных вызывать гепаготоксические эффекты,

В 30% случаен острых отравлений возникают клинические проявления химического повреждения печени, у 7% людей, получавших лекарственные препараты, развивается токсическое поражение этого органа (Лужников Е. А, 2000).

Вследствие принципиальной общности молекулярных механизмов повреждения ге-патоцитов вне зависимости от природы химического повреждающего воздействия общемедицинское значение приобрели исследования поражения клеток печени гепатотроп-ным ядом - тетрахлорметаном Эта классическая модель патологии паренхиматозных клеток печени широко и с успехом используется для решения различных проблем клинической и экспериментальной гепатологии, в том числе для изучения патогенеза токсических, вирусных поражений печени и поиска новых эффективных гепатозащитных средств (Губский Ю. И, 1989, Насыров X М, 1995, Хавинсон В X и соавт, 2003, Никитина И. А, 2004) Несмотря на усилия многих исследователей, ряд вопросов патохимиче-ских механизмов поражения гепатоцитов остались не выясненными, а способы специфической профилактики и терапии химических поражений печени недостаточно эффективны. Онтогенетический аспект данной проблемы до сих пор малоисследован (Васильев Г. А., 1991, Заладнкж В И, 1990,1997, Зимницкий А Н., 2005).

В то же время медикаментозная коррекция у лиц пожилого и старческого возраста, имеющих сниженные функциональные резервы печени связана со значительными трудностями и ограничениями К этой категории относятся, прежде всего, больные, перенесшие инфекционные гепатиты, злоупотребляющие алкоголем, а также лица со злокачественными новообразованиями, подлежащие массированной фармако- и химиотерапии Особую группу составляют лица, длительное время проработавшие в условиях вредного химического производства (Карамова Л М., 2002, Фёклина Т Ю И соавт., 2003)

Нарушения функционального состояния печени пагубно отражаются и на адаптационной возможности организма, существенно снижают его резистеатность к действию различных факторов среды, способствуют обострению хронических заболеваний, ухудшают их прогноз. В этой связи возникший аспект является актуальным, ]рмеет социальную и медицинскую значимость, требует разработки адекватных методов! коррекции, способных улучшить функциональное состояние печени у лиц пожилого и старческого возраста, защитить от различных токсикантов, повысить ее регенераторный потенциал.

На модели частичной гепатэктомии недавно установлено, что некоторые лекарственные средства активируют регенераторный йотенциал «старых» донорских гепатоцитов в ус- ч

ловиях токсического поражения печени тетрахлормеганом (далее ТХМ). В то же время механизмы защитно-юсстановительных процессов в этом случае требуют дальнейшего изучения (Реутов А А, 2004). Получившая в геронтологии признание концепдая свободаоради-кальных механизмов старения и повреждения клетки предполагает, что свободные радикалы, несомненно, могут играть важную роль в патогенезе химического поражения печени в стареющем организме, а антиоксиданты являются средствами патогенетического лечения В этой связи отметим, что гепатопротекторное действие многих лекарственных средств, применявшихся ранее эмпирически, впоследствии было объяснено обнаруженными у них штгаоксидангными свойствами (Скакун Н П, 1985,1987, Саратитов А. С. и соавт., 1995).

в то же время известно, что другим патогенетическим механизмом химического поражения печени является гипоксия (ишемия) (Голиков С. Н и соавт., 1986), которая в свою очередь может являться мощным механизмом усиления процессов радикально-цепного окисления в мембранах гепатоцитов (АбдуллаевН. X. и соавт, 1989, Билен-ко М. В, 1989) Это определило перспективу применения для защиты печени препаратов, сочетающих антиоксидантную и противогипоксическую активность К числу подобных препаратов, положительно зарекомендовавших себя в клинике, относятся препараты, содержащие янтарную кислоту (Западнюк В И, 1997; Ивницкий Ю. Ю и соавт, 1998, Воронина Т А., 2000, 2001, Семиголовский Н Ю, 2004; Лукьянова Л Д, 2004, 2005) Исследования новых производных пиримидина на моделях токсического поражения печени крыс ТХМ, алкоголем, полихлорвиниловыми бифимилами, дихлорэтаном показали эффективность оксиметилурацила (Хайбуллина 3 Г, 1994, Савлу-ков А И., 2000, Мирсаев Т Р , 2002, Мышкин В А и соавт, 2005)

Вместе с тем возможности данного препарата, его комбинации с янтарной кислотой по метаболической коррекции поражения печени тетрахлормеганом у животных разного возраста остаются не изученными, что и определило целесообразность данного исследования

Цель: определение патогенетической значимости нарушений в системе антиокислительной защиты, активности ПОЛ при интоксикации тетрахлормеганом взрослых и старых животных и изучение возможности использования антиоксидантных препаратов, содержащих сукцинат-мексидола и комплекса оксиметилурацила с янтарной кислотой для коррекции выявленных нарушений и выживаемости при экстремальной гапокеической нагрузке

Задачи исследования. Для достижения цели должны быть решены следующие задачи

1 Изучить функционально-метаболические показатели в печени и эритроцитах взрослых и старых крыс в условиях острой интоксикации ТХМ на фоне коррекции мексидолом, комплексным соединением оксиметилурацила с янтарной кислотой в эксперименте на основании

• состояния системы ПОЛ-АОЗ в печени и крови (количество ДК, ШО, ТБК-РП, активность каталазы, Г-6-ФДГ).

® гематологических показателей (эритроцит, ретикулоцигы, гемоглобин, ЭФПЭ), ® биохимических показателей крдви (УрН, АлАТ, АсАТ, ЛДГ, ЩФ, БРБ, общий белок, мочевая кислота),

в морфофункциональных показателей (масса печени, плоидность гепатоцитов, гекееналовая проба, К ретенции БСФ)

2 Исследовать функционально-метаболические показатели в печени взрослых и старых крыс в условиях хронической интоксикации ТХМ на фоне коррекции мексидолом и комплексным соединением осиметилурацила с янтарной кислотой в эксперименте на основании

• биохимических показателей сыворотки крови (УрН, АлАТ, АсАТ, ЛДГ, ЩФ, БРБ, общий белок, мочевая кислота),

• активности ПОЛ (ДК, ТБК-Р11) и содержания АТФ,

• состояния экскреторной функции печени (К ретенции БСФ).

3. Провести сравнительную оценку гепатозащитной эффективности мексидола и комплексного соединения оксиметилурацила с янтарной кислотой у взрослых и старых крыс с токсическим поражением печени, вызванным острой и хронической интоксикацией тетрахлорметаном, по показателям морфометрических, биохимических и функциональных критериев.

4. Изучить влияние ТХМ, мексидола и комплексного соединения оксиметилурацила с янтарной кислотой на возрастную резистентность крыс к экстремальной гипоксической нагрузке по критерию выживаемости животных

Научная новизна. Впервые в комплексе изучены возрастные особенности функ-ционально-мегаболических изменений в печени и крови при острой интоксикации ТХМ, а также в печени в условиях хронической тетрахлорметановой интоксикации, эффективность их коррекции мексидолом, комплексным соединением оксиметилурацила с янтарной кислотой параллельно с оценкой влияния препаратов на резистентность организма к экстремальной гипоксической нагрузке

Выявлены возрастные различия в показателях активности процессов ПОЛ/АОЗ в печени и крови у животных в условиях острой и хронической интоксикации тетрахлорметаном При остром отравлении в крови старых животных более значительно, чем у взрослых, возрастает концентрация вторичных продуктов ПОЛ и подавляется активность антиоксидантных ферментов, в то время как в печени отмечается лишь более значительное увеличение количества вторичных продуктов ПОЛ без изменения активности антиоксидантных ферментов. Дисбаланс ПОЛ/АОЗ сопровождается гепа-тотоксическими эффектами, которые проявляются развитием цитолитического и холе-статического синдромов, нарушением экскреторной и антитоксической функций печени, а также изменением клеточной популяции гепатоцитов и их цитолизом более выраженным у взрослых крыс.

Впервые показано, что антиоксидантные препараты, содержащие янтарную кислоту, - оксиметилурацил и мексидол в условиях острой и хронической интоксикации ТХМ стабилизируют в печени и крови ПОЛ, в значительной степени препятствуют развитию патологических изменений в крови и печени взрослых и старых крыс.

Впервые в финале хронической тетрахлорметановой интоксикации обнаружены разнонаправленные реакции ПОЛ в печени активация у взрослых и подавление активности ПОЛ у старых животных

Комплексное соединение оксиметилурацила с янтарной кислотой и мексидол в условиях хронической тетрахлорметановой интоксикации препятствует развитию патологических изменений в печени старых крыс и более эффективно, чем при острой интоксикации, повышают резистентность организма взрослых и восстанавливают ее у старых животных в условиях экстремальной гипоксической нагрузки

Максимальные антиоксидантные и корригирующие эффекты наблюдаются при использовании комплексного соединения оксиметилурацила с янтарной кислотой

Проведенные исследования расширяют представления о возрастных особенностях реакции животных на химическую травму различной интенсивности и острую гипоксическую нагрузку в условиях лечебно-профилактического применения антиок-сидантов, содержащих янтарную кислоту.

Научно-практическое значение. Полученные результаты могут быть использо-в-гны при разработке клинических рекомендаций для включения антиоксидантов, обладающих антигипоксической активностью, в схемы лечения поражений печени при остром и/или хроническом течении патологического процесса у лиц пожилого и старческого возраста Они представляют интерес для дальнейших экспериментальных исследований по уточнению показателей возрастной нормы у интактных животных и крыс с экспериментальной химической патологией

Основные положения, выносимые на защиту:

! Возрастные различия в степени выраженности и особенности патогенеза поражения печени ТХМ в значительной мере определяются продолжительностью действия и дозой токсиканта - однократное (острое) или длительное (хроническое)

2 Наиболее общим звеном токсогенеза у взрослых и старых животных является дисбаланс в системе ПОЛ/АОЗ Хроническое воздействие ТХМ у старых животных сопровождается подавлением активности ПОЛ

3 Эффективными средствами коррекции дисбаланса в системе ПОЛ-АОЗ и функционально-метаболических нарушений в условиях острой и хронической интоксикации взрослых и старых животных являются мексидол и комплексное соединение оксимети-лурацила с янтарной кислотой

4 Мексидол и комплексное соединение оксиметилурацила с янтарной кислотой в условиях хронической интоксикации ТХМ восстанавливают резистентность организма к экстремальной гипоксической нагрузке у взрослых и старых животных, сукцинат оксиметилурацила более эффективен у старых крыс

Апробация работы. Результаты работы и основных положений диссертации доложены

Межрегиональная каучно-практ конф, посвящ 70-летию кафедры патанаотмии и патофизиологии БГМУ «Актуальные вопросы патологии», 5-6 октября 2004 г, г Уфа; Юбилейная науч конф КГМУ и сессия Центрально-Черноземного науч центра РАМН, посвящ 70-летию КГМУ Курск КГМУ, 2005; IX International Scientific Conference Dalyan, China, 2005, Межрегион науч -практ конф с междун. участием, поев 100 летаю основателя кафедры патофизиологии Башкирского государственного медицинского университета, заел деятеля науки БАССР, д м.н, профессора В А Самцова, Уфа, 2005, 4-я Российская конф с междунар участ, 12-14 октября 2005 г., г Москва, Научно-цракт конф., посвящ 70-летию НГМА 18—19 мая 2005, Новосибирск, 2005, VIII World Congress of International society for adaptive medicine june 21-24,2006, Moscow, Russia.

По теме диссертации опубликовано 17 работ

Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, трех глав собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы, включающего 123 отечественных и 88 иностранных источников Работа изложена на 140 страницах, иллюстрирована 47 таблицами и 18 рисунками

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование проведено на 408 взрослых крысах-самцах, массой 200-260 грамм (возраст 9-12 месяцев) и 425 старых крысах-самцах, массой 400 граммов и более (возраст >26 месяцев) Распределение животных по возрастным группам и сериям опытов представлено в таблице 1

Общая характеристика работы» основные этапы исследования, а также использованные модели и методы представлены в таблице 2 Для моделирования поражения печени ТХМ использовали 50% раствор токсиканта в оливковом масле Острое поражение печени у крыс вызывали путем однократного введения в желудок ТХМ в дозе 3,5 мл/кг Хроническое поражение печени у взрослых и старых крыс вызывали путем ежедневного введения в желудок 50% масляного раствора ТХМ в дозе 2 мл на кг массы тела через день в течение 30 суток. Выбор доз ТХМ для моделирования острой и хронической интоксикации был обусловлен предварительным экспериментальным тестированием а также данными, опубликованными в работах 3 Г. Хайбуллиной (1994), Н.П.Скакун (1984), Т, Р. Мирсаева (2002) и методических рекомендациях Фармкомитета РФ (2003). В качестве средств фармакологической коррекции функционально-метаболических повреждений печени использовали антиоксиданты - мек-сидол (2-этил-6-метил-3-оксипиридина сукцинат, ампулы по 2 мл 5% раствора, ООО МУ «Эллара») и комплексный препарат оксиметилурацила (5-гидрокси-6-метилурацил) с янтарной кислотой, синтезированный в институте органической химии Уфимского научного центра РАН доктором химических наук В. П Кривоноговым. Дозы антиоксвдантов были рассчитаны исходя из результатов предварительного тестирования, а также исходя из рекомендаций содержащихся в работах А В Зорькиной (1997), В А Мышкина (1998); 3 Г Хайбуллиной (1994).

Коррекцию токсического поражения печени проводили взрослым и старым крысам по следующим схемам в условиях острой интоксикации ТХМ мексидол в дозе 50 мг/кг вводили крысам перорально за 2 часа до токсиканта и затем через 24 часа ежедневно в течение пяти дней. Комплексный препарат оксиметилурацила с янтарной кислотой в дозе 50 мл/кг на 2% крахмальной слизи по той же схеме Интактные животные обоих возрастных групп получали крахмальную слизь в соответствующих объемах

В условиях хронической интоксикации ТХМ группа взрослых и старых крыс в течение 30 дней ежедневно получала помимо масляного раствора, мексидол в дозе 50 мг/кг, а другая группа взрослых и старых крыс - комплексный препарат оксимети-чурацила суммарно в той же дозе (по 50 мг/кг) в виде суспензии на 2% крахмальной слизи При острой интоксикации ТХМ тестирование показателей проводили на вторые и седьмые сутки, а при хронической - на 30 сутки эксперимента

Таблица 1

Распределение животных по возрастным группам и сериям опытов

Раздел исследований, серия опытов Вид животных, возрастная группа Количество животных

I Острая интоксикация ТХМ Взрослые крысы 136

Старые крысы 148

П Хроническая интоксикация ТХМ Взрослые крысы 166

Старые крысы 192

Ш Влияние ТХМ, аншоксидантов на резистентность животных к острой гипоксии Взрослые крысы 106

Старые крысы 85

Итого. . . Взрослые крысы 408

Старые крысы 425

Таблица 2

Общая характеристика работы, основные этапы исследования, модели и методы

№ п/п Этапы исследования Характер и объем исследований Модели, методы

1 Изучение функционально-метаболических показателей в печени и эритроцитах взрослых и старых крыс в условиях острой интоксикации ТХМ на фоне коррекции мексидолом и комплексным соединением ок-симетилурацила с янтарной кислотой Исследования плоидно-сти гепатоцитов содержания, продуктов ПОЛ, активности ферментов АОЗ, отражающих метаболизм и экскреторной и антитоксической функции печени Взрослых крыс -136 Старых крыс - 148 Модель острой интоксикации ТХМ, система ПОЛ-АОЗ (ДК, ШО, ТБК-РП спектрофотометрическом и спеирофлуориметрическим методами), Активность каталазы, Г-6-ФДГ и УрН биохимическими методами Активность АлАг, АсАТ, ЛДГ, ЩФ, МК на биохимическом анализаторе «Encore» Общий белок, Билирубин, холестерин Крет -БСФ, гексенаповый сон Гематологические методы - эритроциты, гемоглобин, электрический заряд эритроцитов (ЭФПЭ) В плазме крови - Na +, К+

2 Исследование функционально-метаболических показателей в печени взрослых и старых крыс в условиях хронической интоксикации ТХМ на фоне коррекции мексидолом и комплексным соединением оксиметилурацила с янтарной кислотой Оценка системы ПОЛ/АОЗ, экскреторной функции печени, функциональное состояние гепатоцитов Взрослые крысы - 126 Старые крысы - 152 Модель хронической интоксикации ТХМ Определение в печени продуктов ПОЛ (ДК и ТБК-РП) исследование активности спектрофото-метрическим методом каталазы, Г-6-ФДГ биохимическими методами, На автоматическом анализаторе определение активности сывороточных трансаминаз, ЩФ, МК Активность уроканиназы в крови, определение экскреторной функции (К ретенции БСФ)

3 Изучение влияния ТХМ, мексвдола, комплексного соединения оксиметилурацила с янтарной кислотой на резистентность взрослых и старых крыс к острой гипоксии По критерию выживаемости животных Взрослые крысы -106 Старые крысы - 85 Экстремальное гипоксическое воздействие Подъем на высоту 11500 метров со скоростью 50 м/сек

Взрослых и старых крыс, с острым и хроническим отравлением ТХМ, леченных антиоксидантами по окончании опыта подвергали экстремальной нагрузке - «подъему» в барокамере на высоту 11500 метров со скоростью 50 м/сек. Смертность регистрировали в течение 10 минут пребывания на «высоте» и 30 минут после окончания ги-поксического воздействия (Васильев Г А и соавт., 1991, Хайцев Н В , 1991) Оценку эффективности действия препаратов проводили по выживаемости.

В каждой возрастной группе первая подгруппа животных являлась контрольной (интактные животные) Вторую подгруппу составили животные с интоксикацией (острой или хронической) тетрахлорметаном В третьей группе животных токсическое по-

ражение ТХМ корригировалась мексидолом, а в четвертой - комплексом оксиметилу-рацила с янтарной кислотой

У животных изучали.

• Морфо-функциональные показатели (массу тела, печени, клеточный состав и плоидность гепатоцитов, количество купферовских клеток, некоторые морфометриче-ские показатели)

• Биохимические показатели крови (активность уроканиназы, АлАТ, АсАТ, ЛДГ, ШФ, холестерин, билирубин, мочевую кислоту, общий белок)

• Гематологические показатели (количество эритроцитов, гемоглобина, электро-форетическую подвижность эритроцитов, концентрацию ионов Na, К в гемолизате)

• Процессы СРО и состояние АОЗ в эритроцитах, ткани печени путем определения продуктов ПОЛ и активности ферментов АОЗ

• Антитоксическую и экскреторную функцию печени по продолжительности гек-сеналового наркоза и коэффициента ретенции бромсульфалеина.

• Состояние биоэнергетических процессов в ткани печени по общему уровню АТФ,

Массу печени определяли руководствуясь «Методическими рекомендациями по

доклиническому изучению гепатозащитных средств» ФК РФ (1999). Для гистологического изучения печень фиксировали в 10% забуференном формалине и заливали в парафин Определяли ядерно-цитоплазматические отношения, отношение стромы к паренхиме, содержание купферовских клеток Данные показатели подсчитывали на срезах с помощью сетки Вейбеля в 10 полях зрения на каждое стекло при общем увеличении 400 Количество двуядерных и безъядерных гепатоцитов рассчитывали на 500 клеток при общем увеличении 630 (Weibel Е. R 1979; Автандилов Г. Г, 1990)

Уровень диеновых коньюгаюв (ДК) в печени крыс определяли спектрофотометриче-ским методом (Tappel А. К., 1973), в эритроцитах - по Плацеру (Плацер 3 и соавт., 1970). Содержание шиффовых оснований (ШО) в печени крыс определяли спектрофлуориметри-ческим методом (ton F. et al, 1987; Fletcher В. L et al 1973) ТБК-реагарующие продукты (ТБК-РП) - по реакции с тиобарбшуровой кислотой (Стальная И Д, Гаришвили Т Г., 1977)

Оценивали активность ряда ферментных систем в ткани печени и сыворотке крови крыс (таблица 3).

Таблица 3

Биохимические методы исследования

Показатели Единица измерения Биологический материал Метод Прибор

1 2 3 4 5

Уроканиназа (УрН) Ммоль/ч*л Сыворотка крови Спек1рофотоме*рический СФ-26

АлАТ Ммоль/ч*л Тоже Тоже Анализатор Encore (Швейцария)

АсАТ Ммоль/ч*л Тоже Тоже Тоже

ДЦГ Ммоль/ч*л Тоже Тоже Тоже

ЩФ Ммоль/ч*л Тоже Тоже Тоже

Билирубин Ммоль/ч*л Тоже

Мочевая кислота Ммоль/ч*л Тоже Тоже Тоже

Общий белок Ммоль/л Тоже Lowry

1 2 3 4 5

Холестерин Ммоль/л Тоже Метод FUain в модификации Roshlau

Диеновые конью-гаты л=232 нм Относ ед опт пл Ткань печени Спектрофотометрический СФ-26

ДК при л=232 нм Нмоль/г гемоглобина Эритроциты По Плацеру

Шиффовы основания, л=460 нм Относ ед. флюоресценции Ткань печени Спекгрофлуориметриче-ский

ТБК-РП л=532-535 нм Нмоль/мг белка «Тени» эритроцитов Метод Стальной К Д иГаришвилиТ Г

Катал аза Ммоль в мин/г белка Гемолиза? ткани печени Биохим.метод В В Кораблева и соавт ФКФ-3

Г-6-ФДГ Нмоль вмин/мгбелка Цитошшмат фракция гемолиза печени Биохим метод GLOCK ФКФ-3

АТФ Мкмоль/г Ткань печени По убыли окислившегося НАДН, Javorek J, GruberW etall

Катал аз ну ю активность крови (показатель катал азы) определяли методом А Н Баха, путем титрования избытка перекиси водорода перманганатом калия в кислой среде Элек-трофоретическую подвижность эритроцитов (ЭФПЭ) исследовали на автоматическом измерительном приборе «Пармаквант-2» Концентрация ионов в плазме и гемолизате определяли потенциометрически на биологическом микроанализаторе ОР-266/1 Содержание гемоглобина округляли гемоглобинцианидным методом, количество ретикулоцитов подсчитывали в мазках крови, окрашенных бриллианткрезиловым синим (Меньшиков В. В., 1987). Статистическую обработку полученных данных проводили на основе расчета средних арифметических (М) и их ошибок (±т) Различия показателей, по сравнению с контролем и между группами определялись методом вариационной статистики с использованием критерия Стьюдента и х2 (Гланц С., 1999; Беленький М А, 1963)

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ I. Функционально-метаболические изменения в печени и крови у крыс разного возраста в условиях острого отравления тетрахлорметаном, коррекции мек-сидолом и комплексным препаратом оксиметилурацила с янтарной кислотой. В

результате проведенных исследований установлено, что однократное введение ТХМ в организм взрослых и старых крыс в токсической дозе закономерно вызывает активацию ПОЛ, нарушение экскреторной функции, гиперферментемию, увеличение содержания холестерина мочевой кислоты

Кроме того, в организме взрослых крыс в отличие от старых, нарушается антитоксическая функция печени, что подтверждается удлинением продолжительности гексеналового наркоза (таблица 4). В то же время выявляется определенное различие в метаболических реакциях печени взрослых и старых животных на ТХМ. Так воздействие экстремального фактора на организм старых животных вызывает более значитель-

ное увеличение в их печени количества ШО по сравнению со взрослыми крысами Если в печени старых крыс, отравленных ТХМ, содержание ШО составило 0,880±0,036 усл. ед на мг липидов, то в печени у взрослых этот показатель был почти в 2 раза ниже и равен 0,420±0,030 (Р<0,001). Таким образом, в печени старых крыс ТХМ оказывает более сильное влияние на активность ПОЛ Установлено различие в активности ЩФ, холестерина, АлАТ и ЛДГ. Так у старых крыс, отравленных 1 ХМ, сывороточная активность ЩФ равна 28,5±1,0 ммоль/чл, а у взрослых - только 20,4±0,38 (Р<0,05) Статистически значима также разница в содержании холестерина его сывороточный уровень у старых животных составил 9,6±0,42 ммоль/л, а у взрослых крыс достигал только 6,8±0,22 ммоль/л (Р<0,05) Активность АлАТ у отравленных ТХМ старых животных в сыворотке крови составила 6,7±0,66 ммоль/ч л, а у взрослых - почти в 2,5 раза выше т. е 16,2±0,58 (Р<0,01). Активность ЛДГ старых крыс была равна 44,5±2,32 ммоль/ч л, а у взрослых животных - 120,5±9,90 (Р<0,05)

Таким образом, при острой интоксикации ТХМ повреждаются различные метаболические системы геттоцитов, экскреторная и антитоксическая функции печени у взрослых и старых животных примерно в одинаковой степени, что согласуется с данными других исследований (Четыреххлорисгый углерод МРПТХВ, 1983, Реутов А А., 2004)

Таблица 4

Функционально-метаболические показатели печени взрослых и старых крыс в условиях острой интоксикации тетрахлорметаном (М±т), п=8-10

Показатели Вз| рослые Старые

иотактные ТХМ ингакгаые ТХМ

Катализа, ммоль/мин/г белка 328±24,0 318±12,0 306±17,0 298±12

Г-6-ФДГ, нмоль/мин/г белка 58,3±3,1 54,6±2,6 60,8±2,9 56,^2,9

ЦК, уел ед. оптич. плотности 0,415±0,025 0,506±0,025*' 0,454±0,022 0,605±0,032"

ШО, уел ед на мг липидов 0,330±0,02* 0,420 ±0,03*хх 0,570*0,040* 0,880 ±0,03б"х

Уроканиназа, мкмоль/ч л 3,5±0,66 14,9±3,5* 4,8±0,44 18,5±4,2**

АлАТ, ммоль/ч л 3,5±0,26 16,2±0,58^ 4,2±0,18 6,7*0,66"**

АсАТ, ммоль/ч л 8,7±0,14s 15,3±0,45* 19,5±0,33г 13,8±0,95

ЛДГ, ммоль/ч л 30,0±1,0 120,5±9,90*хх 28,5±4,9 44,5 ± 2 32*^

ЩФ, ммоль/ч л 15,1±0,40 20,4 ±0,34« 21,6±0,56 28,5 11,0 Ц,

Общий билирубин мкмоль/л 29,0±0,60 38,5±2,42* 32,6±2,48 42,3±2,3**

Холестерин, ммоль/л 4,9±,029# 6,8±0,22^хх 5,6±0Д8# 9,6 ±0,42*;»

Мочевая кислота, ммоль/л 244,5±5,8* 107,0±6,6 * 351,3±6,2* 143,8±5,2"

К ретенции бромсульфалеина 2,3±0,66* 6,6 ± 0,48t, 3,4±0,33*х 8,7 ±0,40*^

Гексенагювый сон 15±1,3 29,0±1,9* 18,3±1,5 24,8±1,б

Примечание. * - Р<0,05 между интактными и ТХМ «взрослые»,х* - Р<0,05 между интакг-ными и ТХМ «старые», ***- Р<0,05 между ТХМ «взрослые» и «старые», " - Р<0,01 мезвду интактными и ТХМ «взрослые» и «старые», *** - Р<0,05 между ТХМ «взрослые» и «старые», * -Р<0,05 между интактными «взрослые» и «старые»

В то же время в ранние сроки (24-48 часов) после однократного воздействия ТХМ на организм животных, выявляется более выраженная активация ПОЛ (по показателю количества Шиффовых оснований) в печени старых животных по сравнению со взрослыми Можно предположить, что причиной более сильного прооксидантного эффекта ТХМ у старых крыс является более высокий уровень стационарной активности ПОЛ у животных этого возраста Однако, более вероятно, что это различие отражает обшую закономерность в изменении активности ПОЛ в ранние сроки после однократного воздействия экстремальных факторов, установленную при изучении системы крови у старых крыс (Ястребов А. П., Мещанинов В, Н, 2005). Данное научное положение находит полное подтверждение при исследовании периферической крови Так через 24-48 часов после острого отравления ТХМ количество ТБК-реагирукмцих продуктов в «тенях» эритроцитов у старых крыс выше, чем у взрослых 1,32±0,06 ммоль/кг белка против 1,07±0,08 (Р<0,05) (таблица 5).

Таким образом, в условиях острого воздействия одного и того же экстремального фактора (ТХМ) на организм старых и взрослых крыс активация ПОЛ происходит более интенсивно у старых животных, как в печени, так и в крови

В то же время в крови отравленных ТХМ взрослых и старых крыс по сравнению с интактными животными, наряду с увеличением количества продуктов ПОЛ, установлено повышение активности каталазы У взрослых отравленных крыс это повышение составило 0,78±0,05 усл. ед против 0,50±0,08 (Р<0,05), а у старых животных 0,61±0,04 против 0,43±0,06 соответственно (Р<0,05)

Однократное введение ТХМ крысам зрелого возраста снижает содержание гемоглобина и плазменный уровень катиона натрия У старых крыс в anaiioi ичных условиях увеличение количества ретикулоцитов й содержание катиона калия в плазме крови (таблица 5).

Таблица 5

Гематологические показатели у животных различных возрастных групп при острой интоксикации тетрахлорметаном (М±ш), п=8-10

Показатели Взрослые крысы Старые крысы

ингакгные ТХМ шпактные ТХМ

Гемо! лобин, г/л 138,0*7,61 116,2*5,5* 128,8*4,4 104,0*5,46

Эритроциты, 102 л 3,87±0,42 4,36*0,24 4,05*0,5 4,38±0,44

Ретикулоциты, %о 27,5*1,99 29,5*2,32 28,4*2,02 35,6*2,05"

Показатель каталазы, уел 0,5040,08 0,78*0,05* 0,43±0,06 0,61±0,04"

ТБК-РП, ммоль/мг 0,36±0,04 1,07 ±0,08^ 0,48±0,05 1,32±0,0бГ

№ + плазмы крови, ммоль/л 131,6*3,58 120,8±1,33* 122,6*1,33 115,8*2,39"

К + щквмы крови, ммоль/л . 5,82*0,21 5,7±0,61 5,7*0,33 3,83*0,28"

Средняя электрофоретическая подвижность эритроцитов, 10"* м2/л с 1,12*0,013 1,10*0,01 1,100*0,012 1,102*0,08

Примечание. * - Р<0,05 к взрослым интактным ** - Р<0,05 к старым интактным, * -Р<0,05 между группами взрослых и старых

Мексидол нормализует уровень ДК у взрослых животных и значительно (ниже нормы) снижает их количество в печени старых крыс. Препарат снижает также, увеличенный ТХМ уровень ШО, у взрослых и старых животных, что также свидетельствует об антиоксидантной активности препарата (рисунок 1). Аналогичный эффект оказывает и другой препарат содержащий янтарную кислоту - комплексный препарат оксиметилурацила (рисунок 2).

I I 1

□ взрослые крысы ТХМ

(контроль) 0 взрослые крысы ТХМ+мекощол 53 старые крысы ТХМ (контроль)

Рис. 1. Состояние ПОЛ-АОЗ печени взрослых и старых крыс при острой интоксикации ТХМ на фоне коррекции мексидолом

О взрослые крысы ТХМ (контрольная группа) а взрослые крысы ТХМ+ОМУ-ЯК

Б старые крысы ТХМ (контрольная труппа)

■ старые крысы ТХМ+ОМУ-ЯК

Рис. 2. Состояние ПОЛ-АОЗ печени взрослых и старых крыс при острой интоксикации ТХМ и коррекции сукцинатом оксиметилурацила

3 организме зрелых и старых крыс мексидол и комплекс оксиметилурацила не оказывает существенного влияния на деструктивно-некротическое повреждение печени, так как практически не изменяется активность уроканиназы органоспецифического фермента -маркера данного вида повреждений (Мардашев С. Р., Буробин В. А., 1979). В то же время введение мекеидола и комплекса оксиметилурацила отравленным крысам зрелого возраста, в отличие от старых животных приводит к уменьшению длительности гексеналового наркоза и значения К ретенции бромсульфалеина, что свидетельствует о гепатозащитном действии препаратов на крыс зрелого возраста. Об этом же свидетельствует положительные результаты влияния препаратов на сывороточную активность АлАТ, АсАТ и ЩФ.

В то же время, мексидол эффективен у старых крыс по показателю ЩФ, а комплекс оксиметилурацила по показателю МК (рисунки 3 и 4).

< ь

со о щ с

в 3"

□ взрослые крысы ТХМ

(контроль) И взрослы« крысы ТХМ+максвдол н старые крысы ТХМ (контроль)

старые крысы _

ЕШ-.

".Пат

Рис. 3. Биохимические показатели крови у взрослых и старых крыс при острой интоксикации ТХМ на фоне коррекции мексидолом

П взрослые крысы ТХМ (контрольная группа) и взрослые крысы ТХМ+ОМУ-ЯК а старые крысы ТХМ (контрольная группа) ■ старые крысы ТХМ+ОМУ-ЯК__

Рис. 4. Биохимические показатели крови взрослых и старых крыс при острой интоксикации ТХМ на фоне коррекции сукцинатом оксиметилурацила

2. Функционально-метаболические изменения в печени у крыс разного возраста в условиях длительной тетрахлорметановой интоксикации на фоне коррекции мексидолом и комплексным препаратом оксиметилурацила с янтарной кислотой. В периферической крови взрослых крыс наблюдалось увеличение количества ретикулоцитов достигающее к 30 суткам 156,2±15,0 г/л (Р<0,05) Средняя ЭФПЭ снижалась до 0,048±0,007 10"* м2/ус. В мембранной фракции эритроцитов возрастало количество ТБК-РП до 0,43±0,03 нмоль/мг белка, что достоверно превышает показатели интактных крыс, на фоне снижения показателя катал азы с 0,69±0,07 уел единиц до 0,20±0,04 условных единиц (Р<0,05), что свидетельствует о нарушении равновесия в системе ПОЛ-АОЗ периферической крови.

В тех же условиях опыта у старых крыс отмечались регикулоцитоз и значительное возрастание ТБК-РП в эритроцитах на фоне незначительных колебаний показателя ката-лазы (0,50±0,08 уел ед против 0,56±0,06 усл.ед в контроле) ,что свидетельствует о большей степе™ преобладания ПОЛ над антиоксидантной защитой

В печени взрослых и старых крыс подавляется активность катал азы, Г-6-ФДГ, изменяется количество ДК и ТБК-РП, снижается общий уровень АТФ, развивается гиперферментемия и нарушается экскреторная функция печени (таблица 6) Однако в организме старых животных сдвиги в системе ПОЛ-АОЗ отличаются от показателей животных зрелого возраста В печени старых крыс, в отличие от зрелых отравленных ТХМ крыс, установлено снижение количества ДК и ТБК-РП Так, если в печени взрослых животных, отравленных ТХМ, количество ДК составило 0,550±0,032 усл. ед оптической плотности против 0,415±0,025 в контроле (Р<0,05), то у старых, напротив, обнаружено снижение количества ДК с 0,454±0,022 в контроле (интактные) до 0,310±0,016 в опыте (Р<0,05) Выявлено также уменьшение уровня ТБК-РП в печени старых крыс, отравленных ТХМ. Количество продуктов ПОЛ у интактных старых животных равно 5,41±0,35 ммоль/г ткани, а у отравленных соответственно 3,81±0,30 (Р<0,01) Поскольку различие в уровне ТБК-РП и ДК между старыми и взрослыми отравленными крысами статистически достоверно в обоих случаях, можно сделать вывод о снижении в условиях хронической интоксикации ТХМ активности процессов ПОЛ у старых животных. В этой связи отметим, что химическое поражение печени липофильными прооксидантами в ряде случаев вызывает не активацию, а подавление активности ПОЛ (Мышкин В А , 1998, 2003; ХалеНо А И и соавт., 2002, Фйклина Т. Ю и соавт., 2003) Возрастные механизмы этого феномена практически не исследованы. Можно предположить, что в условиях хронической интоксикации ТХМ в организме старых крыс с исходно повышенной скоростью протекания процессов СРО происходит более быстрое «выгорание» мембранных фосфолипидов по сравнению с животными зрелого возраста на фоне более значительного подавления активности ферментов антиоксидантной защиты В наших опытах активность ключевого фермента антиоксидантной защиты - ката-лазы в печени у старых крыс, отравленных ТХМ ниже, чем у взрослых животных, хотя и не различается достоверно (Р>0,05).

Нет достоверного различия в активности Г-6-ФДГ между старыми и взрослыми крысами, отравленными ТХМ, хотя в обоих случаях эта активность ниже, чем у интактных животных разного возраста.

Изменения в системе ПОЛ-АОЗ у крыс разного возраста протекают на фоне развивающегося гипоэргоза. Об этом косвенно свидетельствует снижение в печени общего уровня АТФ: с 242±10,6 мкМ на г ткани печени до 194,3±12,2 у взрослых (Р<0,05) и

с 196,5±12,3 до 112,0±13,8 (Р<0,05) у старых, причем различие между показателями взрослых и старых крыс статистически достоверно Это указывает на более тяжелое поражение печени старых животных ТХМ

Однако деструкция ткани печени у взрослых крыс, судя по уровню повышения активности уроканиназы выше, чем у старых В пользу этого свидетельствует также более высокая активность АлАТ и ЛДГ в сыворотке крови взрослых крыс по сравнению со старыми животными (таблица 6) Это соответствует ранее полученным данным (четыреххлористый углерод, МРПТХВ, 1983) и объясняется более высокой реактивностью гепатоцитов крыс зрелого возраста на повреждающее воздействие ТХМ Холе-стаз, вызванный ТХМ, судя по показателю ЩФ, более выражен у старых крыс В то же время, количество общего билирубина в сыворотке крови взрослых крыс, отравленных ТХМ, выше, чем у старых животных 12,5±0,62 мкмоль/л против 7,61±0,34 (Р<0,001), что косвенно может свидетельствовать о более тяжелом холестазе у взрослых крыс

В то же время, у старых крыс в условиях хронической интоксикации ТХМ установлено более тяжелое нарушение экскреторной функции печени по сравнению с животными зрелого возраста, что видно из результатов определения К ретенции БСФ (таблица 6) Поскольку в условиях острого отравления ТХМ экскреторная функция печени у взрослых и старых крыс не имеет достоверных различий (таблица 5), а по данным В И Западнюк (1987) она в большей степени нарушена у крыс зрелого возраста, можно сделать вывод о важном значении влияния на данный показатель дозы и кратности введения ТХМ в организм крыс.

Таблица 6

Функционально-метаболические показатели печени взрослых и старых крыс при длительной интоксикации тетрахлорметаном (М±ш), п=8-10

Показатели Взрослые крысы Старые крысы

иэтактные ТХМ шшкгные ТХМ

Каталаза, ммоль/мин/г белка 328±24,0 233±18* 308±19 202±16*х

Г-6-ФДГ, нмоль/мин/мг белка 58,3±3,1 30,4±3д* б6,5±2,6 22,8^=4,3**

ДК 232, уел ед оптач плотн 0,415±0,025 0,550 ± 0,032*хх 0,454±0,022 0,30+0,016^

ТБК-РП, адмоль / г ткани 4,13±0,11 7,11±0,5С 5,41±0,35х 3,81±0,ЗСх

АТФ, мкм на г ткани печени 242,0±10,6 194,3±12,^хх 196,51:12,3 112,0 ± 13,

Уроканиназа, нмоль/с-л 6,11±0,25 13,8±0,51ххх 4,72±1,350 7,61 ±0,34^

АлАТ, ммоль/ч л 0,94±0,05 2,33±0,66^< 0,86±0,03 0,93*0,02""

АсАТ, ммоль/ч л 1,61±0,06* 3,28±0,08* 2,38±0,09# 2,52±0,11

ЛДГ, ммоль/ч л 26,7±1,07 37,8 ±2,54^ 25,2±1,52 27,0*1,25""

Билирубин, мкмоль/л б,02±0,40 12,5±0,бС 5,82±0,б6 7,61 ±0,34^

Общий белок, г/л 66,8±1,85 56,3±2,55 69,9±1,32 63,0±3,1

К ретенции БСФ 1,3±0,06* 3,6 ± 0,92хх* 2,8±0,42* 11^4,12^,

ЩФ, ммоль/ч л 2,74±0,09* 3,46±0,17^х 4,15±0,37* 6,05±3,С

Примечание ° - Р<0,05 между интактными и ТХМ «взрослые», ** - Р<0,05 между ин-тактными и ТХМ «старые», *** - Р<0,05 между ТХМ «взрослые» и «старые», * - Р<0,05 между интактными «взрослые» и «старые»

Мексидол в печени взрослых крыс снижает повышенное ТХМ количество ДК и ТБК-РП, приближая их уровень к показателям здоровых животных и оказывает корригирующий эффект в организме старых животных, в значительной степени восстанавливает содержание продуктов ПОЛ. Препарат оказывает защитно-восстановительный эффект у взрослых и старых крыс на активность каталазы, Г-6-ФДГ и общий уровень АТФ (рисунок 5).

Так, под влиянием мексидола активность каталазы в печени взрослых крыс повысилась на 21% (Р<0,05), и на 27% (Р<0,05), в печени старых по сравнению с нелечен-ными животными.

У леченных мексидолом взрослых и старых крыс активность Г-6-ФДГ в обоих случаях повышалась на 26% (Р<0,05), приближаясь к показателям интактных животных. Общий уровень АТФ в аналогичных условиях опыта также повышался у животных разного возраста соответственно на 15,8% (Р<0,05) и 28,1% (Р<0,05). Защитно-восстановительная эффективность комплексного препарата оксиметилурацида была близка к таковой у мексидола по всем исследованным показателям (рисунок 6). Таким образом, исследованные препараты, содержащие янтарную кислоту в условиях хронической интоксикации ТХМ проявляют антиоксидантный эффект, предупреждают и восстанавливают в печени взрослых и старых крыс функционирование системы ПОЛ-АОЗ и общий уровень АТФ.

200 180 160 140 120 100 80 60 40 20

Рис. 5. Показатели ПОЛ-АОЗ, уровень АТФ в печени взрослых и старых крыс при длительной интоксикации ТХМ и коррекции мексидолом

г

Рис. 6. Состояние ПОЛ-АОЗ, уровень АТФ в печени взрослых и старых крыс при длительной интоксикации ТХМ на фоне коррекции сукцинатом оксиметилурацила

Важной задачей нашей работы являлось исследование маркеров цитолитического и хо-лестатического действия ТХМ в условиях хронической интоксикации и оценка гепатоза-щитного действия препаратов, содержащих янтарную кислоту у животных разного возраста На фоне применения мексидола не произошло статистически значимого снижения активности уроканиназы. В сыворотке крови взрослых и старых крыс, отравленных ТХМ (рисунок 7) активность фермента в сыворотке практически не отличалась от таковой в соответствующих контрольных группах.

Рис. 7. Биохимические показатели крови взрослых крыс при длительной интоксикации ТХМ на фоне коррекции мексидолом

Как видно из рисунка 7, у взрослых животных, леченных мексидолом произошло также снижение активности АлАТ на 96% (Р<0,05), снизилась активность ЛДГ на 40% (Р<0,05) и ЩФ на 25% (Р<0,05).

На фоке применения мексидола не произошло статистически значимых изменений сывороточной активности АлАТ, АсАТ и ЛДГ у старых крыс. И в то же время препарат оказал в этой группе животных позитивное влияние на активность ЩФ. Активность фермента была ниже уровня в группе отравленных крыс на 29,6% (Р<0,05).

Применение комплекса оксиметилурацила с янтарной кислотой также сопровождалось коррекцией ферментного спектра крови (рисунок 8), проявляющейся в статистически достоверном снижении у взрослых животных повышенной ТХМ активности уроканиназы, АлАТ, ЛДГ и ЩФ. На фоне введения препарата в организм взрослых крыс отмечено снижение активности УрН на 83% (Р<0,05), АлАТ на 139% (Р<0,05), ЛДГ на 54% (Р<0,05), ЩФ на 124% (Р<0,05).

Лечение комплексным препаратом оксиметилурацила старых крыс привело к снижению активности ЩФ на 48% (Р<0,05).

Полученные результаты согласуются с литературными данными и связаны с антиоксидантными, противогипоксическими, гепатопротекторными, мембрано-протекторными свойствами препаратов, что вызывает стабилизацию клеточных мембран, количества продуктов ПОЛ в ткани печени, а также восстановление общего уровня АТФ.

275

□ взрослые крысы ТХМ (контроль) га взрослые крысы ТХМ+ОМУ-ЯК в старые крысы ТХМ (контроль) _ » старые крысы ТХМ-ЮМУ-ЯК-

Рис. 8. Биохимические показатели крови взрослых и старых крыс в условиях длительной интоксикации ТХМ и коррекции сукцинатом оксиметилурацила

3. Влияние тетрахлорметаиа, мексидола и комплекса оксиметилурацила с янтарной кислотой на выживаемость взрослых и старых крыс в условиях ост-

рой гипоксии. Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что острая интоксикация ТХМ у «взрослых» крыс не оказывает существенного влияния на их выживаемость при экстремальной гипоксической нагрузке, в то же время, для «старых» животных она значима, поскольку смертность старых крыс в данных условиях увеличивается (таблица 7) Защищенные мексидолом старые животные, также как и незащищенные препаратом крысы 2-й группы с острым отравлением ТХМ выживали хуже, чем «старые» крысы, подвергнутые воздействию одной ш-поксии Это может свидетельствовать о снижении резистентности организма старых крыс к экстремальной гипоксической нагрузке

Хроническая интоксикация ТХМ на устойчивость взрослых и старых крыс, подвергнутых гипоксической нагрузке оказала выраженное однонаправленное влияние -выживаемость снижалась, а смертность животных соответственно увеличилась Так у взрослых крыс выживаемость составила только 13,3% (Р<0,05), а у старых еще ниже -8,3% (выжило одно животное из 12, (Р<0,05). Различие между возрастными группами недостоверно, но оно достоверно между «старыми» крысами 4 группы, и «взрослыми» животными 2 группы, т е. между животными с острой и хронической интоксикацией ТХМ, что свидетельствует о снижении резистентности организма старых крыс, перенесших хроническое отравление ТХМ.

Таблица 7

Влияние тетрахлорметана и антноксидантов на выживаемость взрослых и старых крыс в условиях острой гипоксии

Условия эксперимента Выжило/общее количество

взрослые старые

1 Острая гипоксия 7/22° 14/19°

2 Острая интоксикац ия ТХМ+гипоксия 9/25° 4/15#

3 Острая интоксикация ТХМ ■+ мексидол + гипоксия 4/12 3/12*

4 Хроническая интоксикация ТХМ + гипоксия 2/15* 1/12"

5 Хроническая интоксикация ТХМ + мексидол+гипоксия 10/15** 9/20"*

б Хроническая интоксикация ТХМ + комплексное соединение ок-симетилурацила с янтарной кислотой + гипоксия 8/12" 9/12<т

Примечание. * - Р<0,05 с группой 1 «взрослые», ** - Р<0,05 с группой 4 «взрослые», й -Р<0,05 с группой 1 «старые»,т - Р<0,05 с группой 4 «старые»,0 - Р<0,05 между взрослыми» и «старыми» в группе 1, 0 - Р<0,05 между «старыми» (4 гр ) и «взрослыми» (2 гр ), * - Р<0,05 между «старыми» 5 и 6 групп

Применение мексидола у крыс р хронической интоксикацией ТХМ оказывает благоприятное влияние на выживаемость взрослых и старых крыс она достоверно выше, чем у животных, которым препарат не вводился. Комплекс янтарной кислоты с оксиметилурацилом, также как и мексидол, в данных условиях эксперимента проявляет антигипоксическую и геронротекторную активность, причем геропротектор-ная эффективность комплексного препарата выше, чем у мексидола что подтверждается более высокой выживаемостью старых крыс в б группе по сравнению с 5 группой животных.

Положительная роль метаболических сукцинатсодержащих антиоксидантов в повышении резистентности организма взрослых крыс и восстановлении резистентности организма старых крыс отравленных ТХМ в условиях острой гипоксии может быть связана не только с восстановлением энергетического обеспечения ге-патоцитов, что подтверждается восстановительным эффектом препаратов на уровень АТФ, но и с возможным их влиянием на равновесное соотношение в системе ПОЛ-АОЗ, которое особенно выражено в условиях хронической интоксикации ТХМ у старых крыс

ВЫВОДЫ

1 Выявлены возрастные особенности острого гепато- и гематотоксического эффектов тетрахлорметана. В печени старых крыс по сравнению со взрослыми более выражены нарушения клеточной популяции, экскреторной функции, холестаз, установлено увеличение содержания шиффовых оснований, а также повышение количества ТБК-реагирующих продуктов в «тенях» эритроцитов У взрослых крыс в печени преобладает цитолитическое действие, а в крови - снижение содержания гемоглобина

2. Функционально-метаболическое состояние печени взрослых и старых крыс в условиях хронической интоксикации тетрахлорметаном характеризуется цитолитиче-ским и холестатическим эффектами, нарушением экскреторной и антитоксической функций печени, нарушением процессов перекисного окисления липидов и снижением общего уровня аденозинтрифосфорной кислоты Гепатотоксический эффект тетрахлорметана более выражен у старых животных

3 Нарушение процессов перекисного окисления липидов и активности антиокси-дантных ферментов является наиболее общим звеном токсогенеза В условиях острой интоксикации тетрахлорметаном в эритроцитах старых животных более значительно, по сравнению со взрослыми, возрастает концентрация ТБК-реагирующих продуктов при снижении активности каталазы, а в печени преобладает увеличение шиффовых оснований при сохранении активности каталазы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы При хронической интоксикации выявлена противоположная динамика перекисного окисления липидов в печени активация у взрослых крыс и подавление активности у старых животных

4 Терапевтический эффект сукцината оксиметилурацила и мексидола более выражен в условиях хронической интоксикации Препараты препятствуют развитию патологических изменений в печени, стабилизируют перекисное окисление липидов и нормализуют общий уровень аденозинтрифосфорной кислоты Максимальные корригирующие эффекты сукцината оксиметилурацила выявлены у старых крыс

5 Сукцинат оксиметилурацила и мексидол оказывают положительное влияние на выживаемость взрослых и старых крыс в условиях хронической интоксикации тетрахлорметаном и экстремальной гипоксической нагрузки, выживаемость старых животных, леченных сукцинатом оксиметилурацила выше Введение мексидола взрослым и старым животным с острым отравлением тетрахлорметаном не оказывает защитного эффекта

тетрахлорметан

г

радикалы и метаболиты

МЕКСИДОЛ

СУКЦИНАТ

Периферическая кровь

ЛОЛ -АОЗ

X

Окислительно-энергетический потенциал эритроцитов

I:

Ретикулоцить

Гиперферментемия

Печень

мембраны гепатоцитоа

.........................а.............................

ПОЛ -АОЗ

Ж

_Уцоеэнь АТФ

Изменение экскреторной и антитоксической функции

Изменение суммарного окислительного потенциала

, -----------------------5-----------------

............ ! ..--ПРГ) .---

П

-ь

п о л

СРО •— "Эндогенный антиоксидант А

О =Г]

л -ё-

| Протективиый биосинтез белков

[ (кзгалааа, Г-6-ФДГ и др.)

.......................I....... ж..........................................................,

Соотношение про- и антиоксидантоз —

I

устойчивость к гипоксии

Токсическое и

прооксидантноэ

действие

Снижение устойчивости

Восстановление УСТОЙЧИВО£ГИ

Частичное или

полное восстановление функционально-матаболических нарушений

Рис.9. Принципиальная схема участия ПОЛ в патогенезе интоксикации тетрахлорметаном и формировании устойчивости к гипоксии взрослых и старых крыс.

Примечание.

на фоне коррекции

Список работ опубликованных по теме диссертации:

1 Влияний бемитила на перекисное окисление липидов в печени мышей при экспериментальной гипоксии / Игбаев Р. К., Чфнов В. Н., Мышкин В А, Срубилин Д В, Енике-ев Д. А. // Здравоохранение Башкортостана, 2004, спец выпуск. № 4, (Мат Межрегиональной научно-практ конф., посвящ 70-летию кафедры патанатомии и патофизиологии БГМУ «Актуальные вопросы патологии», 5-6 октября 2004 г., г Уфа), Уфа, 2004, с 112-113

2 Влияние бемитила на перекисное окисление липидов в головном мозге мышей при экспериментальной гипоксии / Чернов В Н, Игбаев Р К., Мышкин В, А, Срубилин Д. В , Енижеев ДА// Там же. - С. 203-204.

3. Комбинированная фармакокоррекция гипоксии, вызванной экспериментальной нитритной интоксикацией / Мышкин В. А., Игбаев Р К., Ибатуллина Р. Б, Чернов В Н., Еникеев Д А И В кн «Университетская наука- Взгляд в будущее Сборник трудов юбилейной науч. конф КГМУ и сессии Центрально-Черноземного науч центра РАМН, посвящ. 70-летию КГМУ. В 2-х томах. - Курск: КГМУ, 2005 Т. 2 -С 135

4 Новый способ экспериментального моделирования патологии печени с использованием полихлорированных бифенилов / Мышкин В А., Савлуков А. И, Ибатуллина Р Б., Игбаев Р. К., Чернов В. Н, Еникеев Д. А //В кн. «Университетская наука Взгляд в будущее. Сборник трудов юбилейной науч. конф КГМУ и сессии Центрально-Черноземного науч центра РАМН, посвящ 70-летию КГМУ. В 2-х томах - Курск: КГМУ, 2005. Т. 2.-С. 136

5 Применение цистамина и мексидола для коррекции перекисного окисления липидов при экспериментальной гемической гипоксии, вызванной нитритом натрия / Мышкин В. А., Игбаев Р. К, Срубилин Д. В., Чернов В. Н, Ибатуллина Р. Б., Еникеев Д. А //В кн.- «Family Health m the XXI century» (Materials of IX International Scienti-fik Conference). Dalyan, China, 2005, c. 216-218.

6. Экскреторная функция печени при поражении полихлорированными бифе-нилами и коррекции гепатопротекторами / Ибатуллина Р Б , Мышкин В А , Чернов В Н., Шафиков А Р., Мирсаяпов Р III, Еникеев Д А. // Здравоохранение Башкортостана, 2005, спец. выпуск № 7, (Матер, межрегион науч.-практ. конф. с междун участием, поев 100-летию основателя кафедры патофизиологии Башкирского государственного медицинского университета, Заел деятеля науки БАССР, д м н., профессора В. А Самцова), с 84-85.

7. Влияние полихлорированных бифенилов и гепатоиротекторов на активность урока-ниназы в сыворотке крови / Мустаева Л И., Мышкин В А, Ибатуллина Р Б, Чернов В. Н, Шафиков А. Р, Еникеев Д. А // Здравоохранение Башкортостана, 2005, спец выпуск № 7, (Матер, межрегион науч.-практ. конф с междун. участием, поев 100-летию основателя кафедры патофизиологии Башкирского государственного медицинского университета, Заел деятеля науки БАССР, д.м.н., профессора В. А Самцова), с. 133-134.

8. Влияние сукцината оксиметилурацила и бемитила на биоэнергетические процессы в печени и головном мозге крыс в условиях острой гипоксии / Мышкин В. А., Гуляева И. Л., Чернов В. Н, Ибатуллина Р Б., Шафиков А Р , Мирсаяпов Р Ш, Еникеев ДА// Здравоохранение Башкортостана, 2005, спец выпуск № 7, (Матер межрегион науч -практ конф с междун. участием, поев 100-летию основателя кафедры патофизиологии Башкирского государственного медицинского университета, Заел деятеля науки БАССР, д.м.н., профессора В А. Самцова), с 160-161

9 Активность индикаторных ферментов цитолиза и холестаза в условиях интоксикации ПБХ и восстановительной коррекции / Шафиков А Р, Ибатуллина Р Б.,

Мышкин В А, Чернов В Н, Мирсаяпов Р Ш, Еникеев Д А. // Здравоохранение Башкортостана, 2005, спец выпуск № 7, (Матер межрегион, науч -практ. конф с между н участием, поев 100-летию основателя кафедры патофизиологии Башкирского государственного медицинского университета, Заел деятеля науки БАССР, дмн, профессора В А Самцова), с 217-218

10 Комбинированная фармакокоррекция перекисного окисления липидов при острой гемической гипоксии / Игбаев Р К , Мышкин В А , Срубилин Д В , Чернов В Н , йбатуллина Р Б , Еникеев Д А // В кн. «Гипоксия, механизмы, адаптация, коррекция» (Матер 4-й Российской конф с междунар участ, 12-14 окт. 2005 г , г Москва) М , 2005, с 49-50

11 Поиск антигипоксантов среди комплексных соединений производных пиримидина с дикарбоновыми кислотами и ■у-лаетоном 2,3-Дигидрогулоновой кислоты / Мышкин В А, Чернышенко Ю Н, Игбаев Р К, Чернов В. Н., Йбатуллина Р. Б, Еникеев Д. А, Абдрахма-нов И Б // В кн «Гипоксия, механизмы, адаптация, коррекция» (Матер. 4-й Российской конф с междунар участ, 12-14 окт. 2005 г, г Москва). М., 2005, с 81.

12 Влияние сукцината оксиметилурацила на метаболические процессы в печени при экспериментальной интоксикации полихлорированными бифенилами / Савлуков А. И, Чернышенко Ю Н, Чернов В Н, Мышкин В А, Йбатуллина Р Б, Еникеев Д А, Абдрахма-нов И Б // В кн «Современные проблемы фармакологии и фармации» (Сборник статей на-учно-практ. конф, посвящ 70-летию НГМА 18-19 мая 2005, Новосибирск, 2005, с

13 The effects of bemithyl and silimarine on lipid peroxidation, activity of catalase and enzymes of urea formation in hepatocytes in experimentally-induced cirrosis / Myshkin V A , Gulyaeva I L , Chernov V. N, Ibatullina R В , Emkeyev D. A., Sergeeva S A, Shafikov AR// VIII World Congress of International society for adaptive medicine june 21-24, 2006, Moscow, Russia, p 50-51

14 Функционально-метаболические показатели печени взрослых и старых крыс в условиях интоксикации тетрахлорметаном / Чернов В Н, Мышкин В А, Еникеев Д А, Йбатуллина Р Б // В кн «Family Health m the XXI Century Oncology - XXI Century» (Materials of XI International Scientific Conference and II International Scientific Oncological Conference 24 04-2 05 2007) Netherlands-Germany-France - Пермь Изд-во «ПОНИЦАА», 2007 - С 294-297

15 Влияние тетрахлорметана, мексидола и соединения оксиметилурацила с янтарной кислотой на устойчивость взрослых и старых крыс к шпоксической гипоксии / Чернов В.Н, Еникеев Д А, Мышкин В.А // В кн «Family Health m the XXI Century. Oncology - XXI Century» (Materials of XI International Scientific Conference and II International Scientific Oncological Conference. 24 04-2.05 2007) Netherlands-Germany-France - Пермь Изд-во «ПОНИЦАА», 2007 - С 293-294

16 Влияние мексидола на перекисное окисление липидов и функционально-метаболические показатели печени старых крыс при интоксикации тетрахлорметаном / Мышкин В А , Чернов В Н., Еникеев Д А // В кн. «Family Health in the XXI Century Oncology - XXI Century» (Materials of XI International Scientific Conference and II International Scientific Oncological Conference. 24.04—2 05 2007) Netherlands - Germany -France - Пермь Изд-во «ПОНИЦАА», 2007 - С 219-222 .

17 Влияние оксиметилурацила на перекисное окисление липидов и функционально-метаболические показатели печени при интоксикации старых крыс тетрахлорметаном / Чернов В Н , Мышкин В. А, Йбатуллина Р Б , Савлуков А И, Еникеев Д А // Патофизиология и экспериментальная терапия — 2007 — № 4 - С 29-30.

Чернов Василий Николаевич

Перекисное окисление липидов и антиоксидаитная защита печени стареющего организма при экспериментальной интоксикации ТХМ

На 368 крысах зрелого возраста и 385 старых крысах проведено исследование возрастных особенностей молекулярно-патологических изменений в печени и крови при остром отравлении ТХМ, а также в печени в условиях хронической тетрахлорме-тановой интоксикации на фоне коррекции сукцинатсодержащими антиоксидантами -мексидолом и комплексным препаратом оксиметилурацила

Цель работы — определение роли системы антиокислительной защиты, активности ПОЛ в патогенезе гепатотоксического, гематоксического действия тетрахлормета-на у взрослых и старых животных и изучение возможности использования антиокси-дантных препаратов, содержащих сукцинат для коррекции выявленных нарушений и повышения их выживаемости при экспериментальной гипоксической нагрузке Нарушение процессов ПОЛ и активности ферментов АОЗ является наиболее общим звеном токсогенеза.

Выявлены возрастные различия в показателях активности в системе ПОЛ-АОЗ в печени при остром и хроническом отравлении ТХМ. Дисбаланс ПОЛ-АОЗ сопровождается гепатотоксическими эффектами, которые проявляются развитием цитолитическо-го, холестатического синдромов, нарушением экскреторной и антитоксической функции печени. Впервые в финале хронического отравления ТХМ обнаружены разнонаправленные реакции ПОЛ в печени активация у взрослых и подавление активности ПОЛ у старых животных. Впервые установлено, что сукцинат оксиметилурацила и сук-цинатсодерлсащий антиоксидант мексидол в условиях хронической интоксикации ТХМ не только эффективно препятствует развитию патологических изменений в печени старых крыс, но и восстанавливают резистентность взрослых и старых крыс к экстремальной гипоксической нагрузке Наши данные позволяют сделать вывод об эффективности и целесообразности изучения гепатопротекторной эффективности мексидола и оксиметилурацила в качестве средств антиоксида^тной терапии в комплексе лечебных мероприятий у пациентов зрелого и пожилого возраста с токсическими поражениями печени, направленных на коррекцию ее функционально-метаболических повреждений и восстановление адаптационной способности организма в целом

Chernov Vasiliy

Lipids peroxide oxidation and liver antioxidant protection of an aged organism in the case of experimental intoxication by tetrachiormethane

368 rats of a mature age and 385 aged ones were involved m our experiment We studied ageing peculiarities of molecular-pathological changes in liver and blood in the case of an acute poisoning by tetrachlormetane (TCM) We also examined a liver in the case of a chronic TCM intoxication at the background of correction of succanatecontainmg antioxi-dants-mexidol and oxymethyluracil complex preparation

The aim of our study was to determine the system role antioxidative protection (AOP), lipids peroxide oxidation (LPO) activity in pathogenesis of hepatotmic hemotoxic action of TCM m mature and aged animals We also studied usage capabilities of antioxidative preparations, containing succinate in order to correct the revealed disorders and increase their survival rate in the case of experimental hypoxic loadmg LPO processes and AOP engymes activity disorder is the most common toxogenesis link

We found out ageing differences ui activity indices in the liver LPO-AOP system m the case of an acute and chronic poisoning by TCM LPO-AOP imbalance in accompanied by hepatotoxic effects, which are characterized by cytolytic and cholestatic syndromes development, excretory and antitoxic liver function disorder At the end of chronic poisoning by TCM we discovered for the first time LPO differently directed liver reactions- LPO activation in the mature rats and LPO activity inhibition m old ones. We determinated for the first time that oxymethyluracil succinate and succmatecontaining antioxidant mexidol in the case of chronic intoxication by TCM not only effectively prevent pathological changes development m old rats livers, but also restore mature and old rats resistance to extreme hypoxic loading

Our findings allow us to make a conclusion about effectiveness and advisability of studying of mexidol and oxymethyluracil hepatoprotective effectiveness as antioxidative therapy agents in curative measures comlex in mature and agedpatients with liver toxic failure, aimed at its functional-metabolic disorders correction and organism adaptation capability restoration on the whole

Чернов Василий Николаевич

ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ И АНТИОКСИДАНТНАЯ ЗАЩИТА ПЕЧЕНИ СТАРЕЮЩЕГО ОРГАНИЗМА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ ТЕТРАХЛОРМЕТАНОМ

Автореферат диссертаций на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Издательская лицензия № 06788 от 01 11 2001 г ООО «Издательство «Здравоохранение Башкортостана» 450000, РБ, г Уфа, а/я 1293; тел /факс (347) 25Й2-49

Подписано в печать 26 10 2007 г. Формат 60*84/16 Гарнитура Times New Roman Бумага офсетная Отпечатано на ризографе,