Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Фармакогностическое изучение растений рода Arisaema

На правах рукописи

НГУЕН ТХИ КИМ НГАН

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ РАСТЕНИЙ РОДА АШБАЕМА

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

3 о сен т

Москва - 2015 005562683

005562683

Диссертационная работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научный руководитель:

Ермакова Валентина Алексеевна — доктор фармацевтических наук, профессор Официальные оппоненты:

Киселева Татьяна Леонидовна - доктор фармацевтических наук, профессор, директор научно-исследовательского центра НО «Профессиональная Ассоциация Натур отерапевтов».

Потанина Ольга Георгиевна - доктор фармацевтических наук, директор центра научных исследований и разработок Центра коллективного пользования (научно-образовательный центр) ФГБОУ ВПО Российский университет дружбы народов.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений» (ФГБНУ BHJIAP)

Защита диссертации состоится « » 2015 г. в ^Р часов

на заседании Диссертационного Совета Д -208.040.09 при ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Минздрава России по адресу: 119019, г. Москва, Никитский бульвар, д. 13.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНМБ ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М.Сеченова Минздрава России по адресу: 119034, г. Москва, Зубовский бульвар, д. 37/1 и на сайте ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М.Сеченова http:// www.mma.ru

Автореферат разослан «-/¿g? »15 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д -208.040.09, доктор фармацевтических наук,

профессор Демина Наталья Борисовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Лекарственные средства растительного происхождения широко используются в медицинской практике. Они обладают разнообразными фармакологическими свойствами, низкой токсичностью и ценовой доступностью. Расширение ассортимента фитопрепаратов за счет рационального использования ресурсов дикорастущих лекарственных растений в различных регионах мира открывает новые возможности для фармацевтической науки и медицины.

Природное разнообразие флоры Юго-Восточной Азии представлено широким спектром пищевых, лекарственных, декоративных и технических растений. Однако, следует отметить слабую изученность многих перспективных для медицины видов с позиций ботанического ресурсоведения и фармакогностического анализа. К таким растениям относятся и виды рода Аризема (Arisaema).

Род Аризема, включает более 150 видов, произрастающих, в основном, в странах Юге - Восточной Азии, в Китае, на Дальнем Востоке РФ, в тропической зоне Африки.

Виды ариземы известны как декоративные и лекарственные растения.Они достаточно широко используются в традиционной медицине Китая : наружно в качестве отвлекающих средств в составе мазей, а также сырье, прошедшее специальную обработку, применяется как отхаркивающее средство. Лекарственные препараты из ариземы используются также при некоторых заболеваниях желудочно-кишечного тракта.

Порошок клубнелуковиц некоторых видов ариземы или сухой экстракт входит в состав комплексных китайских препаратов, разрешенных к медицинскому применению в ряде стран, в том числе и в России. В народной медицине сок клубней ариземы применяется в качестве противоревматического, антианемического, антисептического, противовоспалительного средства.

С фармакогностической точки зрения растения рода Аризема изучены недостачно: сырье трех видов ариземы (ариземы амурской, ариземы разнолистной, ариземы красноватой) включено в настоящее время только в Государственную Фармакопею КНР.

Аризема единокровная, произрастающая во Вьетнаме, используется в народной медицине в качестве отхаркивающего, противосудорожного, противовоспалительного средства.

Сведения о химическом составе растения весьма разноречивы. Фармакологические свойства препаратов ариземы единокровной не изучались. В то же время растение достаточно широко распространено на территории Вьетнама и может обеспечить сырье для производства лекарственных средств.

Все изложенное выше свидетельствует об актуальности фармакогностического изучения ариземы единокровной (Arisaema consanguineum Schott.) как перспективного источника биологически активных веществ и внедрения нового вида лекарственного растительного сырья (JIPC) в медицинскую практику Вьетнама.

Степень разработанности темы исследования. Несмотря на то, что некоторые виды ариземы (аризема амурская, аризема красноватая, аризема разнолистная) используются в традиционной китайской медицине (ТКМ), в народной медицине Социалистической Республики Вьетнам (СРВ) и РФ, аризема единокровная не нашла медицинского применения в научной медицине из-за недостаточный изученности химического состава и фармакологических свойств.

Цель настоящего исследования. Целью данной работы является информационно - аналитическое исследование данных литературы о растениях рода Arisaema : обоснование перспективности углубленного фармакогностического и фармакологического изучения ариземы единокровной; изучение химического состава сырья, его морфолога - анатомических особенностей; проведение исследований по стандартизации сырья с использованием современных методов анализа для разработки проекта НД и внедрения ариземы единокровной в медицинскую практику Вьетнама.

Постановка задач и выбор средств для их решения. Для осуществления поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить литературу по фармакогностическому анализу, фармакологии, химическому составу, методам анализа основных действующих веществ ариземы единокровной.

2. С помощью качественных реакций и методов хроматографического анализа определить качественный химический состав клубнелуковиц ариземы единокровной.

3. Изучить состав липофильных соединений клубнелуковищ ариземы единокровной.

4. Разработать методики идентификации и количественного определения флавоноидов в сырье.

5. С помощью современных физико-химических методов анализа исследовать качественный состав и определить количественное содержание аминокислот, свободных и связанных Сахаров, полисахаридов, дубильных веществ, свободных органических кислот.

6. Разработать методики идентификации и количественного определения сапонинов в сырье ариземы единокровной.

7. Провести оценку острой и хронической токсичности, а так же некоторых видов фармакологической активности изучаемого растения.

8. Исследовать морфологические и анатомо-диагностические признаки клубнелуковиц ариземы единокровной.

9. Определить числовые показатели сырье ариземы единокровной (влажности, золы общей, золы нерастворимой в 10 % растворе хлористоводородной кислоты и экстрактивных веществ).

10. На основе полученных результатов разработать проект фармакопейной статьи на клубнелуковицы ариземы единокровной для включения в ГФ СРВ.

Решение задач осуществлялось путем обобщения данных литературы и проведения экспериментальных исследований. Научная новизна.

Впервые проведено информационно-аналитическое исследование данных о растениях рода аризема и обоснована перспективность фармакогностического и фармакологического изучения ариземы единокровной.

Проведено фармакогностическое исследование сырья ариземы единокровной с целью изучения химического состава, фармакологических свойств, разработки характеристик подлинности и показателей качества.

Впервые в результате проведенных исследований с использованием методов хроматографии (ТСХ) получены новые данные о качественном составе биологически активных веществ в клубнелуковицах ариземы единокровной: флавоноидов, сапонинов, аминокислот, свободных и связанных Сахаров. Изучен состав липофильной фракции и установлено наличие 16 соединений, в том числе: этилового эфира пальмитиновой кислоты, и-цимола, ментона, бутановой кислоты, н-цетилового спирта, ментола и камфоры. Впервые разработаны методики для клубнелуковиц ариземы единокровной и подобраны условия количественного определения с использованием спектрофотометрического метода флавоноидов, сапонинов. С использованием аминокислотного анализа выявлен качественный и количественный состав аминокислот в клубнелуковицах ариземы единокровной. Обнаружено 19 аминокислот из них 9 - незаменимых. В процессе исследования качественного и количественного состава Сахаров в клубнелуковицах ариземы единокровной методом ВЭЖХ установлено, что в качестве свободных Сахаров присутствуют фруктоза и глюкоза, а связанные сахара представлены глюкозой, маннозой, ксилозой, галактозой и арабинозой. В клубнелуковицах определено количественное содержание полисахаридов, дубильных веществ и свободных органических кислот.

Выявлены диагностически значимые морфолого-анатомические признаки сырья, позволяющие проводить диагностику клубнелуковиц ариземы единокровной.

Определена острая и хроническая токсичность сырья ариземы единокровной, изучена фармакологическая активность и установлено противовоспалительное, седативное и антидепрессивное действие. Определены числовые показатели: влажность, зола общая, зола не растворимая в 10 % растворе хлористоводородной кислоты, сумма экстрактивных веществ, извлекаемых водой, сумма флавоноидов в пересчете на шафтозид (апигенин 8-С-а-Ь-арабинозид б-С-Р-Б-глюкозид).

Теоретическая значимость работы. Представленный в работе экспериментально - практический материал может служить теоретической базой для исследования и создания лекарственных препаратов на основе лекарственного растительного сырья «Клубнелуковицы ариземы единокровной». Использование

предложенных физико-химических методов анализа позволит систематизировать контроль качества и стандартизацию клубнелуковиц ариземы единокровной.'

Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований разработаны:

- методики идентификации и количественного определения флавоноидов в клубнелуковицах ариземы единокровной.

- получены экспериментальные данные, подтверждающие эффективность применения изучаемого вида ариземы во Вьетнамской традиционной медицине в качестве противовоспалительного, седативного и антидепрессивного средства.

- результаты исследования внедрены в учебный процесс кафедры фармакогнозии Первого МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России по теме «Лекарственное растительное сырье, содержащее флавоноиды».

- разработан проект нормативного документа на сырье «Клубнелуковицы ариземы единокровной» для ГФ СРВ с учетом гармонизации требований к качеству сырья, предъявляемых в фармакопеях различных стран и представлен на рассмотрение для включения его в ГФ СРВ.

Методология и методы исследования. Объектами исследования служили клубнелуковицы ариземы единокровной, собранные в стадии цветения, высушенные в естественных условиях (теневая сушка). Методология исследования заключалась в изучении и обобщении литературных данных по теме исследования, оценке степени разработанности и актуальности темы, постановке цели и задач исследования по разработке методик анализа, идентификации и определении содержания сапонинов, флавоноидов и других БАВ ЛРС, формулировании выводов, определяющих теоретическое и практическое значение результатов работы. При выполнении работы были использованы методы хроматографии в тонком слое сорбента, спектрофотометрии, ВЭЖХ, ГХ/МС. Статистическую обработку результатов исследований проводили в соответствии с ГФ XII изд. (ОФС 42-0111-09). Морфолого-анатомический анализ сырья проводили в соответствии с техникой и требованиями, описанными в ГФ СССР XI изд., для изучения фармакологической активности ариземы единокровной использовали общепринятые методики.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 научных статей, полностью отражающих содержание диссертации; из них 5 статей в изданиях, включенных в «Перечень рецензируемых научных журналов» рекомендованных ВАК РФ.

Степень достоверности результатов. Для получения результатов по качественному и количественному содержанию основных биологически активных веществ (БАВ) были проведены исследования по анализу трех серий лекарственного растительного сырья (в достаточном числе повторностей от 6). Сравнение полученных результатов с применением методов статистической обработки и выборов критериев при фармакологических исследованиях позволяют считать их достоверными.

Апробация диссертации. Основные положения диссертации доложены на пяти научных конференциях: на конференции «V Международный молодежной медицинский конгресс» Санкт-Петербург, 06.12.2013 г; на II научно - практической конференции «Современные аспекты использования растительного сырья и сырья природного происхождения в медицине» Москва, 27.02.2014 г; на «II Всероссийской научной интернет - конференции с международным участием» Казань, 16.12.2014 г; на XXV Московской международной гомеопатической конференции: «Развитие гомеопатического метода в современной медицине» Москва, 23.01.2015 г; на III Научно - практической конференции «Современные аспекты использования растительного сырья и сырья природного происхождения в медицине» Москва, 19.02.2015 г. Апробация диссертации прошла на научной межкафедральной конференции кафедр фармакогнозии, фармацевтической и токсической химии фармацевтического факультета ГБОУ ВПО Первого МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава РФ, и лаборатории НИИ Фармации Первого МГМУ им. И.М. Сеченова.

Личный вклад автора. При непосредственном участии автора были определены цели и задачи работы, разработаны методические подходы к их выполнению; был проведен сбор, обобщение и анализ литературных данных. Диссертант принимал непосредственное участие при разработке методик идентификации и количественного определения содержания основных групп БАВ в исследуемом объекте. Автору принадлежит ведущая роль при проведении

экспериментальных исследований, статистической обработке и анализе полученных результатов, написании публикаций, докладов и проекта нормативного документа на сырье ариземы единокровной. Диссертация и автореферат написаны лично автором.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 -«Фармацевтическая химия, фармакогнозия». Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 2,3 паспорта фармацевтическая химия, фармакогнозия.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематикой и планом научно - исследовательских работ ГБОУ ВПО Первого МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава РФ (№ государственной регистрации: 01201168237) по научной проблеме «Совершенствование образовательных технологий додипломного и последипломного медицинского и фармацевтического образования». Основные положения, выносимые на защиту:

- Результаты изучения качественного состава и определения количественного содержания биологически активных веществ (органических кислот, свободных и связанных Сахаров, дубильных веществ, флавоноидов, сапонинов, полисахаридов, аминокислот) в сырье ариземы единокровной.

- Результаты изучения фармакологическиой активности сырья ариземы единокровной.

- Результаты морфолого-анатомического изучения сырья ариземы единокровной.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 150 страницах компьютерного текста, содержит 38 таблиц и 37 рисунков. Работа состоит из введения, обзора литературы, 6 экспериментальных глав, выводов, библиографии из 107 наименований, из которых 23 на иностранных языках, интернет - ресурсов, и приложения.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объектом исследования является аризема единокровная (Arisaema consangiiineum Schott.,), распространенная на территории СРВ и в Индии, Китае, Таиланде.

Исследования проводили на образцах, заготовленных в национальном парке Ханг Лиен (окрестности г. Шапа, провинция Лаокай, Вьетнам). Сырьем служили высушенные клубнелуковицы ариземы единокровной, собранные в июле - августе 2012 - 2013 гг., в период цветения растения и в конце вегетации. Лекарственное растительное сырье сушили в тени, в хорошо проветриваемом помещении или в сушилке при температуре 50°С.

При проведении анализа нами использованы классические и современные методы исследований: хроматография в тонком слое (ТСХ), капиллярный электрофорез (прибор Applied Biosystem 273 Т, США), газовая хромато-масс-спектрометрия (ГХ/МС) с использованием газового хроматографа 7890 с масс-сел ективным детектором 5975 фирмы Agilent Technologies (США), высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) на хроматографе Waters Acquility с тандемным квадрупольным MC-детектором TQD (Waters) (США), спектрофотометрия Сагу 50 scan (США), титриметрия, гравиметрия, современные методики фармакологических исследований, макроскопический и микроскопический анализ. В процессе исследований использованы реактивы, стандарты, растворители, отвечающие требованиям соответствующей нормативной документации. Статистическую обработку экспериментальных данных проводили по общепринятым методикам.

Определение основных групп БАВ

С помощь качественных реакций доказано наличие в сырье ариземы единокровной: сапонинов, флавоноидов, полисахаридов, дубильных веществ.

Определение состава липофилыюй фракции

Для исследования состава липофильной фракции было получено извлечение спиртовое (спирт 96 %) из клубнелуковиц ариземы единокровной, которое изучали посредством метода газовой хромато-масс-спектрометрии.

10

В результате проведенных исследований в спиртовом извлечении клубнелуковиц ариземы единокровной идентифицированы 16 соединений липофильного характера: спирты, эфиры, фенолы, терпеноиды и др. По относительному количественному содержанию (%) преобладающими (мажорными) компонентами оказались: этиловой эфир пальмитиновой кислоты (41,85), и-цимол (10,41), ментон (9,14), бутановая кислота (5,70), н-цетиловый спирт (5,01), и-мент-3-ен (4,72), ментол (4,32) и камфора (3,54).

Определение количественного содержания дубильных веществ

Содержание дубильных веществ определяли методом перманганатометрии по методике ГФ XI.

Полученные данные свидетельствуют о том, что содержание дубильных веществ в пересчете на танин в клубнелуковицах ариземы единокровной составляет в среднем 1,14 % ±0,01 %.

Определение содержания полисахаридов

Количественное определение содержания полисахаридов проводили по методике статьи 20 «Листья подорожника большого», ГФ XI.

Установлено, что в клубнелуковицах ариземы единокровной содержание полисахаридов составляет 12,00 ± 0,46 %.

Определение содержания свободных органических кислот

Количественное определение содержания свободных органических кислот в пересчете на кислоту яблочную проводили по методике статьи 38 «Плоды шиповника», ГФ XI.

Таким образом, в ходе исследования установлено, что подземные органы ариземы единокровной содержат 4,43±0,06 % органических кислот в пересчете на кислоту яблочную и абсолютно сухое сырье.

Определение содержания суммы свободных и связанных Сахаров

Качественный и количественный состав Сахаров в сырье ариземы единокровной устанавливали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Проведено определение содержания свободных и связанных Сахаров. Свободные сахара представлены глюкозой (0,34%) и фруктозой (0,30%) (Рис. 1,2.).

Рис. 1. Хроматограмма смеси стандартов 10 г/л. Рис.2. Хроматограмма водного извлечения из

клубнелуковиц ариземы единокровной.

В составе связанных Сахаров присутствуют: глюкоза (13,67%), манноза (0,46%), ксилоза (0,42%), галактоза (0,42%) и арабиноза (0,09%) (Рис.3,4.). Общая сумма свободных Сахаров в сырье составляет 0,67 %, связанных 15,06%.

900 800 Н 700 -600 -500 -400 300 200 100

_ш1

О, а о. л

а 4оо

320 2-Ю 160

dadlA.ch CL £ й

E

ь \

CL 2 <b l Ii ^ s К i i 4SI

Ш mj

Retention Time (min) Retention Time (min)

Рис.3. Хроматограмма смеси стандартов (1г/л). Рис.4. Хроматограмма продуктов гидролиза

водного извлечения из клубнелуковиц ариземы единокровной.

Определение содержания флавоноидов

Идентификации флавоноидов в сырье ариземы единокровной методом ТСХ и ВЭЖХ/МС. Методом ТСХ в исследуемом сырье было обнаружено не менее 5 соединений, одно из которых по хроматографическому поведению было идентифицировано с шафтозидом.

На основании проведенных исследований с помощью метода ВЭЖХ/МС в клубнелуковицах ариземы единокровной установлено наличие более 11 -ти соединений флавоноидной природы (шафтозид, изошафтозид, неошафтозид, виценин 2, хризоериол 6-С-глюкозид-8-С-арабинопиранозид, кемферид и тд.) и глюкозамина.

ап С5ВА127 25-РеЬ-2014 19:26:40

ОМР-260214-3 1766(1 471) Ст (1747:1778-1869 1922) 2 Окх)е Аггау

21980 2.7276-1 ап

I 338 80 МеоБсЬаЯоаае ОМР-260214-3

2 0е-1

100

42

299 89 «1 , В7266 "Г

5.00 6.00

2 Оюое Аггау Яэпде 3 573е+1

1200 1400

0 00 1 00 2 00 3 00 4 00 5 00 6 00

Рис.5. ВЭЖХ/МС извлечения (70 % спирт) из клубнелуковиц ариземы единокровной

Количественное определение суммы флавоноидов спектрофотометрическим методом Для разработки методики количественного определения флавоноидов были сняты спектры поглощения продуктов реакции шафтозида с алюминия хлоридом и извлечения из клубнелуковиц ариземы единокровной с концентрированной хлористоводородной кислотой на регистрирующем спектрофотометре Сагу 50.

1 - 0,02 % раствора шафтозида в подкисленном спирте 95 %;

2 - продукт реакции спиртового извлечения (спирт 95 %) из сырья с 2 % раствором алюминия хлорида в спирте 95% .

зео зео аоо

Рис.6. Спектр поглощения продуктов реакции извлечения из клубнелуковиц ариземы единокровной с 2 % раствором алюминия хлорида в спирте 95 %

Спектр раствора шафтозида имеет максимум поглощения при длине волны 392 нм. Спектр поглощения продуктов реакции флавоноидов извлечения из клубнелуковиц ариземы единокровной с 2 % раствором алюминия хлорида в спирте 95 % совпадает со спектром поглощения шафтозида. Максимум окраски достигается через 30 мин после чего она сохраняется неизменной в течение 20 мин.

Был построен калибровочный график. Установлено, что калибровочная кривая зависимости оптической плотности, измеренной при длине волны 392 нм, и концентрацией раствора шафтозида носит линейный характер в интервале концентраций от 0,005% до 0,06%. Наименьшее определяемое количество шафтозида 0,5 мг/мл. Был рассчитан удельный показатель поглощения продуктов реакции шафтозида с 2% спиртовым раствором алюминия хлорида равный 166,13.

Оптимальными условиями извлечения флавоноидов из сырья ариземы единокровной являются: экстрагент - спирт 95 %, подкисленный HCl, соотношение сырья и экстрагента 1:20, измельченность сырья - 1-2 мм, нагревание на кипящей водной бане в течение 60 мин, двукратная экстракция .

С помощью разработанной методики проведено количественное определение содержание флавоноидов в клубнелуковицах ариземы единокровной. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Результаты определения содержания флавоноидов в клубнелуковицах ариземы __единокровной__

Партия Партия 1 Партия 2 Партия 3

0,21 0,20 0,20

0,22 0,18 0,21

Содержание 0,23 0,19 0,20

флавоноидов, % 0,24 0,20 0,19

0,25 0,21 0,20

0,23 0,21 0,20

Метрологическая характеристика. х =0,23 Ss =0,004 Дх =0.01 А = 4,3 Р = 95 % х =0,20 S* =0,004 Дх =0,01 А = 5,0 Р = 95 % х = 0,20 S* = 0,002 Д* =0,005 А = 2,5 Р = 95 %

Содержание флавоноидов в клубнелуковицах ариземы единокровной колеблется от 0,18 % до 0,25 %.

Определение содержания сапонинов

Определение сапонинов методом ТСХ.

Методом ТСХ в исследуемом сырье было обнаружено не менее 4 соединений, одно из которых по хроматографическому поведению было идентифицировано с эсцином.

Количественное определение суммы сапонинов спектрофотометрическим методом

В основу разработанной методики была положена работа Борисовой Д.А., в которой была установлена зависимость оптической плотности от концентрации эсцина, определена устойчивость оптической плотности во времени и рассчитан удельный показатель поглощения продуктов взаимодействия эсцина с концентрированной серной кислотой. Удельный показатель поглощения равен 222,45.

Для разработки методики количественного определения сапонинов были сняты спектры поглощения продуктов реакции эсцина и извлечения из клубнелуковиц ариземы единокровной с концентрированной серной кислотой на регистрирующем спектрофотометре Сагу 50.

1 - 0,015 % раствора эсцина в 70 % спирте;

2-95 % спиртовое извлечение из сырья ариземы единокровной.

Рис.7. Спектр поглощения продуктов реакции извлечения из клубнелуковиц ариземы единокровной с кислотой серной концентрированной

Спектр спиртового раствора эсцина имеет максимум поглощения при длине волны 328 нм. Спектр поглощения продуктов реакции сапонинов извлечения из клубнелуковиц ариземы единокровной (спирт 95 %) с концентрированной серной кислотой совпадает со спектром поглощения продуктов реакции эсцина с концентрированной серной кислотой.

Оптимальными условиями извлечения сапонинов из сырья ариземы единокровной являются: экстрагент - 95 % спирт, соотношение сырья и экстрагента 1:100, измельченность сырья - 1-2 мм, нагревание на кипящей водной бане 60 мин, двухкратная экстракция.

С помощью разработанной методики проведено определение

количественного содержания сапонинов в клубнелуковицах ариземы единокровной. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2.

Результаты определения содержания сапонинов в сырье ариземы единокровной

Партия Партия 1 Партия 2 Партия 3

1,07 1,16 0,87

1,05 1,15 0,84

Содержание 1,06 1,15 0,88

сапонинов, % 1,08 1,16 0,88

1,05 1,15 0,85

1,06 1,14 0,84

Метрологическая характеристика. х = 1,06 = 0,02 Д* = 0,05 А = 4,71 % Р = 95 % х = 1,15 Б* = 0,02 Д* = 0.05 А = 4,46 % Р = 95 % х = 0,86 = 0,008 Д^ = 0,02 А = 2,39 % Р = 95 %

Из таблицы видно, что содержание сапонинов в клубнелуковицах ариземы единокровной колеблется от 0,84 % до 1,16 %.

Определение содержания аминокислот

Определение аминокислот проводили на аминокислотном анализаторе . Результаты качественного и количественного определения аминокислот в клубнелуковицах ариземы единокровной представлены на рис 8.

Рис.8. Хроматограмма спиртового извлечения (70% спирт) из клубнелуковиц ариземы

единокровной.

Согласно полученным данным (рис.8), в клубнелуковицах ариземы единокровной содержится 19 аминокислот (OH-Pro, Asp, Ser, Glu, Pro, Gly, Ala, Cys, Tyr, OH-Lys ) из них 9 незаменимых (Thr, Val, Met, Ile, Leu, Phe, Lys, His, Arg). Суммарное аминокислот в сырье составляет 5,2 %. Преобладающими в сумме свободных и связанных аминокислот являются аргинин 16,32 %, глутаминовая кислота 16,0 %, аспарагиновая кислота 11,62 % , лейцин 7,45 %, валин 5,6 %, глицин 5,48 %.

Изучение фармакологической активности сырья ариземы единокровной

При изучении острой и хронической токсичности водных настоев и растворов сухих экстрактов (экстрагент 70 %, 50 % и 40 % спирт) из сырья ариземы единокровной было установлено, что по классификации Сидорова К. К., водные настои клубнелуковиц относятся к классу относительно безвредных веществ, растворы сухих экстрактов из сырья ариземы единокровной относятся к классу малотоксичных веществ. Доказана низкая токсичность исследованных препаратов при их курсовом применении.

Изучение противовоспалительной активности Проводилось на модели «острого воспалительного отека лапы крысы, вызванного введением формалина».

1

i i i !

См

0,35

0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05

I),02 0,03

Рис.9. Изменение динамики воспалительной реакции под Рис.10. Изменение динамики воспалительной реакции под влиянием исследуемых препаратов и анальгина (через 4 влиянием исследуемых препаратов и анальгина (через 8

часов)

часа)

■ Контроль (дистиллированная вода)

■ Настой клубнелуковиц ГФ IX

■ Раствор сухого экстракта клубнелуковиц экстрагент 40% спирт 8 Раствор сухого экстракта клубнелуковиц экстрагент 70% спирт

Раствор сухого экстракта травы экстрагент 50% спирт

■ Раствор анальгина

■ Настой клубнелуковиц холодным способом

■ Раствор сухого экстракта клубнелуковиц экстрагент 50% спирт

■ Раствор сухого экстракта травы экстрагент 40% спирт

■ Раствор сухого экстракта травы экстрагент 70% спирт

Результаты представлены на рис.9 и рис.10. Установлена противовоспалительная активность исследуемых препаратов из сырья ариземы единокровной. Максимальное снижение отека лапы отмечалось при использовании раствора сухого экстракта клубнелуковиц (экстрагент 70 % спирт) - 6,25 % и раствора сухого экстракта травы (экстрагент 40 % спирт) - 9,37 % (% прироста отека по сравнению с контролем).

Изучение седаптвной активности Определяли на модели «Открытое поле». Полученные результаты представлены в табл.3.

Таблица 3.

Влияние водных настоев, растворов сухого экстракта сырья ариземы единокровной на двигательную активность животных._

№ Вариант опыта Уменьшение двигательной активности животных, %

1 Экстракт валерианы 43

2 Настой клубнелуковиц ГФ IX 43

3 Настой клубнелуковиц холодным способом 28

4 Раствор сухого экстракта клубнелуковиц экстрагент 40 % спирт 71

5 Раствор сухого экстракта клубнелуковиц экстрагент 50 % спирт 43

6 Раствор сухого экстракта клубнелуковиц экстрагент 70 % спирт 43

7 Раствор сухого экстракта травы экстрагент 40 % спирт 57

8 Раствор сухого экстракта травы экстрагент 50 % спирт 28

9 Раствор сухого экстракта травы экстрагент 70 % спирт 57

Согласно результатам всех серий эксперимента (табл.3.), все образцы

тестируемого ЛРС вызывали снижение двигательной активности животных. В

группе животных, получавших раствор сухого экстракта клубнелуковиц (экстрагент

40 % спирт) установлено максимальное снижение двигательной активности - 71 %.

В группе животных, получавших настой клубнелуковиц холодным способом и

раствор сухого экстракта травы (экстрагент 50 % спирт) отмечалось минимальное

снижение двигательной активности - 28 %.

Следует отметить, что полученный нами препарат сухого экстракта

клубнелуковиц (экстрагент 40 % спирт) обладает более выраженной седативной

активностью по сравнению с экстрактом валерианы.

18

Изучение антидепрессивной активности ЛРС оценивали на крысах с использованием теста «Отчаяние», изучая поведенческую беспомощность животных, т.е. естественную реакцию животных при попадании в угрожающие жизни условия.

Таблица 4.

Влияние водного настоя, растворов сухих экстрактов сырья ариземы единокровной _на поведение животных в тесте «Отчаяние»

№ Вариант опыта Количество активных попыток Количество пассивных попыток Количество попыток выбраться из воды

1 Контроль (вода) 8,5±0,27 5,3±0,14 0,5±0,02

2 Деприм 27,6±0,32 0,6±0,02 2,4±0,04

3 Настой клубнелуковиц ГФ IX 15,4±0,22 2,4±0,07 2,6±0,05

4 Настой клубнелуковиц (холодным способом) 14,0±0,28 2,4±0,06 1,0±0,04

5 Раствор сухого экстракта (клубнелуковиц экстрагент 40 % спирт) 35,5±0,33 0 3,2±0,08

6 Раствор сухого экстракта (клубнелуковиц экстрагент 50 % спирт) 26,8±0,28 0 2,4±0,07

7 Раствор сухого экстракта (клубнелуковиц экстрагент 70 % спирт) 33,0±0,32 0 4,2±0,08

8 Раствор сухого экстракта (травы экстрагент 40 % спирт) 36,2±0,34 0 4,8±0,11

9 Раствор сухого экстракта (травы экстрагент 50 % спирт) 34,2±0,31 0 3,6±0,06

10 Раствор сухого экстракта (травы экстрагент 70 % спирт) 36,2±0,34 0 2,4±0,04

Как видно из полученных данных (табл.4.), под действием исследуемых препаратов существенно увеличивалось время активных попыток животных выбраться из воды. Так, сухие экстракты клубнелуковиц и травы (экстрагент 70 %, 50 % и 40 % спирт) увеличивали антидепрессивный эффект почти в 4 раза по сравнению с контролем и настои из клубнелуковиц увеличивали почти в 2 раза по сравнению с контролем, т.е настои из клубнелуковиц и сухие экстракты клубнелуковиц и травы ариземы единокровной (экстрагент 70 %, 50 % и 40 % спирт) обладали антидепрессивным эффектом. Действие сухих экстрактов было сопоставимо с действием препарата «Деприм», настои из клубнелуковиц несколько уступали по антидепрессивному действию препарату « Деприм».

Морфолого-анатомическое изучение и определение числовых показателей сырья

Проведено изучение внешних признаков сырья и установлено, что наиболее характерными являются следующие признаки: клубнелуковицы шаровидной, слегка приплюснутой формы диаметром 5-10 см. В верхней части имеется углубление с чешуевидными остатками листьев, нижняя часть выпуклая, места прикрепления корней и их остатки располагаются по кругу выше периметра клубнелуковицы. Цвет снаружи светло-коричневый, на изломе - беловато-кремовый. Запах слабый, специфический. Вкус жгучий, раздражающий.

Микроскопический анализ выявил общие признаки, характеризующие клубнелуковицы ариземы единокровной: наличие пучкового строения, гиподермы, игольчатых кристаллов оксалата кальция в виде рафид, сферокристаллов часто шаровидной формы, крахмальных зерен и клеток - идиобластов со слизью.

Рис.11. Поперечный срез клубнелуковицы ариземы Рис.12. Поперечный срез клубнелуковицы ариземы единокровной. Гиподерма. Реакция с единокровной. Гиподерма с маслянистыми каплями .

--------------г_------срез клубнелуковицы ариземы

единокровной. Крахмальные зерна и сферокристалл. Реакция с р-вом Люголя. Ув.х400.

единокровной. Клетки со слизью. Реакция с тушью. Ув.хЮО.

Рис.15. Поперечный срез клубнелуковицы ариземы Рис.16. Поперечный срез клубнелуковицы ариземы единокровной. Рафиды оксалата кальция. Ув.х400 единокровной. Сосуды ксилемы проводящих пучков

Ув.х400

Проведено определение влажности сырья ариземы единокровной, золы общей, золы нерастворимой в 10 % растворе хлористоводородной кислоты и экстрактивных веществ, извлекаемых водой, спиртом 40 %, спиртом 70 %, спиртом 95 %.

Результаты проведенных исследований позволяют рекомендовать в качестве числовых показателей для сырья ариземы единокровной: влажность не более 10 %, общая зола не более 5 %, зола, нерастворимая в 10 % растворе хлористоводородной кислоты, не более 1 %, экстрактивных веществ, извлекаемых водой не менее 25 %.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Анализ литературных источников показал, что сырье ариземы единокровной широко используется в народной медицине Вьетнама и является актуальной проблемой для изучения фармакологических свойств и химического состава, разработки методик анализа основных действующих веществ с использованием современных методов и последующего внедрением их в нормативную документацию.

2. С помощь качественных реакций доказано наличие в сырье ариземы единокровной сапонинов, флавоноидов, полисахаридов, дубильных веществ.

3. В результате проведенных исследований липофильной фракции сырья посредством метода газовой хромато-масс-спектрометрии в спиртовом экстракте

клубнелуковиц ариземы единокровной идентифицированы 16 соединений липофильного характера: спирты, эфиры, фенолы, терпеноиды и др. Найдено, что доминирующими компонентами липофильной фракции являются этиловый эфир пальмитиновой кислоты (41,85 %), и-цимол (10,41 %) и ментон (9,14 %).

4. Методом ВЭЖХ в клубнелуковицах ариземы единокровной установлено наличие 11 флавоноидных соединений, с помощью масс - спектрометрии определено их химическое строение (шафтозид, изошафтозид, неошафтозид, виценин 2, и др.). Разработана методика количественного определения суммы флавоноидов методом спектрофотометрии. В клубнелуковицах ариземы единокровной сумма флавоноидов в пересчете на шафтозид колеблется от 0,18 % до 0,25 %.

5. В клубнелуковицах ариземы единокровной установлено наличие 19 аминокислот из них 9 незаменимых. В количественном отношении аминокислоты в клубнелуковицах составляют 5,2 %. Преобладающими в сумме свободных аминокислот являются аргинин 16,32 %, глутаминовая кислота 16,0 %, аспарагиновая кислота 11,62 % , лейцин 7,45 %, валин 5,6 %, глицин 5,48 %. Проведено определение содержания свободных и связанных Сахаров. Общая сумма свободных Сахаров в сырье составляет 0,67 %, связанных 15,06%. Установлено, что в клубнелуковицах ариземы единокровной содержатся 1,14 ± 0,01 % дубильных веществ в пересчете на танин; 12,00 ± 0,46 % полисахаридов и 4,53 ± 0,06 % суммы органических кислот в пересчете на кислоту яблочную.

6. Проведена идентификация сапонинов в сырье методом ТСХ. Подобраны условия и разработана методика количественного определения сапонинов, в основу которой положен спектрофотометрический метод после проведения реакции с серной кислотой концентрированной. В качестве стандарта использован эсцин. Сравнительными исследованиями установлено количественное содержание сапонинов в сырье ариземы единокровной: от 0,84 % до 1,16 %.

7. При изучении острой и хронической токсичности водных настоев и растворов сухих экстрактов (экстрагент 70 %, 50 % и 40 % спирт) сырья ариземы единокровной было установлено, что по классификации Сидорова К. К., водные

настои клубнелуковиц относятся к классу относительно безвредных веществ (ЛД50 более 5000 мг/кг), растворы сухих экстрактов из сырья ариземы единокровной относятся к классу малотоксичных веществ (ЛД50 101-1000 мг/кг). Доказана низкая токсичность исследованных препаратов при их курсовом применении.

8. Установлена противовоспалительная активность клубнелуковиц и травы ариземы единокровной. Доказано, что раствор сухого экстракта клубнелуковиц (экстрагент 70 % спирт) и раствор сухого экстракта травы (экстрагент 40 % спирт) обладают максимальным противовоспалительным действием. Экспериментально показано, что раствор сухого экстракта клубнелуковиц (экстрагент 40 % спирт) в дозе 300 мг/кг, вызывают максимальный седативный эффект у подопытных животных (71 %). Наибольший интерес для разработки суммарного экстракционного препарата клубнелуковиц ариземы единокровной представляет сухой экстракт клубнелуковиц (экстрагент 40 % спирт), проявляющий антидепрессивную и седативную активность, а также обладающий противовоспалительным действием.

9. Проведено изучение внешних признаков сырья и установлено, что наиболее характерными являются следующие признаки: приплюснутая форма клубнелуковиц, наличие на верхушке чешуевидных остатков листьев и кольцеобразно расположенных мест прикрепления корней.

Определены анатомо-диагностические признаки клубнелуковиц ариземы единокровной с применением гистохимических реакций и биометрических характеристик. Выявлены и визуализированы диагностические признаки: строение проводящих пучков, клеток паренхимы, наличие игольчатых кристаллов оксалата кальция в виде рафид, сферокристаллов, форма и размер крахмальных зерен, а так же наличие клеток - идиобласт со слизью.

10. Проведено определение влажности сырья ариземы единокровной, золы общей, золы нерастворимой в 10 % растворе хлористоводородной кислоты и экстрактивных веществ, извлекаемых водой, спиртом 40 %, спиртом 70 %, спиртом 95 %. Результаты проведенных исследований позволяют рекомендовать в качестве числовых показателей для сырья ариземы единокровной: суммы

флавоноидов не менее 0,18 %, экстрактивных веществ, извлекаемых водой не менее 25 %, влажность не более 10 %, содержание общей золы не более 5 %, содержание золы, нерастворимой в 10 % растворе хлористоводородной кислоты, не более 1 %.

11. Разработан гармонизированный проект Фармакопейной статьи на клубнелуковицы ариземы единокровной, который направлен на рассмотрение для включения его в ГФ СРВ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Нгуен Тхи Ким Нган. Род Arisaema - перспективный источник новых фитопрепаратов // Тезисы V международного молодежного медицинского конгресса. - Санкт-Петербург. - 2013. - С. 359.

2. Нгуен Тхи Ким Нган, Морохина С.Л., Ермакова В.А. Определение острой и хронической токсичности ариземы единокровной //Сеченовский вестник-2014.-№ 1.-С. 135- 136.

3. Нгуен Тхи Ким Нган, В.А. Ермакова. Аминокислотный состав ариземы единокровной // Фармация. - 2014. - № 8. - С. 14 - 15.

4. В.А. Ермакова, Нгуен Тхи Ким Нган, Т.Ю. Ковалева, Н.В. Бобкова Растения рода аризема - перспективные источники лекарственного сырья // Традиционная медицина. -№2,-2014. - С.43 - 53.

5. Нгуен Тхи Ким Нган, В.А. Ермакова. Определение качественного состава и количественного содержания углеводов в корневищах ариземы единокровной // Состояние и перспективы оптимизации и эффективности в фармакогнозии, технологии, клинике. Ярославль. - 2014. - С. 148-151.

6. Нгуен Тхн Ким Нган, Д.В. Курилов, В.А. Ермакова, И.А. Самылина.Состав липофильной фракции корневищ ариземы единокровной // Воронежского государственного университета вестник. Сер. Химия. Биология. Фармация. -2014.-№ 4.-С. 131 - 134.

7. Nguyen Thi Kim Ngan, D.M Popov, V.A. Ermakova, I.A. Samylina.Analysis of saponins in the rhizomes arisaema consanguineum // Journal of practical medicine Viet Nam.-2014.-№ 10.-P.70-72.

8. Нгуен Тхи Ким Нган, Морохина С.Л., Ермакова В.А. Изучение седативного эффекта корневищ ариземы единокровной // Сборник материалов XXV Московской международной гомеопатической конференции «Развитие гомеопатического метода в современной медицине». - М: Московский гомеопатический центр. - 2015. - С. 71 - 72.

9. Бобкова Н.В., Нгуен К.Н., Ермакова В.А. Микроскопическое исследование клубнелуковиц ариземы единокровной (Arisaema consanguineum (1.) Schott.) //Ботаника и природное многообразие растительного мира «II Всероссийская научная Интернет - конференция с международным участием». - Казань, -2015. - С.24 - 28.

10. Нгуен Тхи Ким Нган, Морохина С.Л., Ермакова В.А. Фармакологическая активность извлечений из сырья ариземы единокровной // Фармация. -2015. -№3. С. 43-46.

11. Нгуен Тхи Ким Нган, Морохина С.Л., Ермакова В.А. Изучение противовоспалительной активности ариземы единоковной // Сеченовский вестник.-2015.-№ 1.-С. 116-117.

12. Нгуен Тхи Ким Нган, Н.В. Бобкова, Ермакова В.А. Определение характеристик подлинности клубнелуковиц ариземы единокровной // Фармация.-2015,-№5.-С. 11-14.

Подписано в печать 16.09.2015 г. Формат А5 Бумага офсетная. Печать цифровая. Тираж 100 Экз. Заказ № 41614-15-КЦ Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-кт, д.28 Тел. 8-495-782-88-39