Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Фармакогностическое исследование Сафлора красильного (Carthamus tinctorius L.)

На правах рукописи

Харисова Алина Владиславовна

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ САФЛОРА КРАСИЛЬНОГО (САКТНАМШ ТШСТОЫШ Ь.)

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

НИДЛ 1Щ

Самара-2014

005547729

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель: доктор фармацевтических наук, профессор Куркин Владимир Александрович

Официальные оппоненты:

Зилфикаров Ифрат Назимович, доктор фармацевтических наук, государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений, отдел фитохимии, главный научный сотрудник

Курбатова Светлана Викторовна, доктор химических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Самарский государственный университет», кафедра физической химии и хроматографии, профессор кафедры

Ведущая организация:

государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «06» июня 2014 г. в 12.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.085.06 при государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 443079, г. Самара, пр. К. Маркса, 165 Б.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО СамГМУ Минздрава России (г. Самара, ул. Арцыбушевская, 171) и на сайте ГБОУ ВПО СамГМУ (ЬКр://уууууу. загоэти ,ги/5с1епсе/геГега15/2014/Ьапзоуа1)

Автореферат разослан « 2014 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат фармацевтических наук, -_.

доцент

Петрухина Ирина Константиновна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Сегодня растения являются одним из важнейших источников получения лекарственных препаратов (ЛП), используемых в различных областях медицинской практики. Это объяснятся тем, что растительные препараты имеют широкий спектр фармакологической активности и, как правило, не вызывают побочных действий при рациональном применении. Совокупность биологически активных соединений (БАС), входящий в состав лекарственного растительного сырья (ЛРС) оказывает комплексное и взаимодополняющее действие, в связи с чем проявляется все больший интерес к новым источникам биологически активных веществ растительного происхождения (Киселева Т.Л., 2009; Куркин В.А., 2009; Самылина И.А. и др., 2003; 2010). В этой связи, изучение новых видов ЛРС и их внедрение в научную медицину является одной из актуальных задач современной фармакогнозии.

Перспективным источником получения новых БАС является сафлор красильный {СапИатш ИпсЮпш Ь.) семейство Астровые, или Сложноцветные (ЖГегасеае). В России сафлор появился в XVIII веке, а с 30-х годов XX в. осуществляются посевы и агротехническое изучение сафлора красильного на территории Самарской области (ГНУ Самарский НИИ сельского хозяйства им. Н.М. Тулайкова РАСХН, пгт. Безенчук и с. Пестравка).

На сегодняшний день отечественная официнальная медицина допускает использование сафлора только в качестве компонента для производства биологических активных добавок (БАД) и косметологических средств. В то же время сафлор красильный находится в списке лекарственных растений в Британской Травяной фармакопее, Европейской, Китайской и Французской фармакопеях. Согласно литературным данным, в мировой фармацевтической практике используются цветки и семена сафлора красильного. Сафлор используется в восточной народной медицине как ангиопротектор, нормализуя состояние артериального, венозного и микроциркуляторного русла, востребован в качестве средства, сокращающего матку, при послеродовых атонических кровотечениях. Известны также его контрацептивные и антисептические свойства. Растение позитивно влияет на лимфоток, способствуя выведению токсинов и уменьшению отечности. Цветки сафлора обладают мочегонным, слабительным, противовоспалительным и желчегонным действием.

Сафлоровое масло, полученное из очищенных семян, по наиболее важным показателям не уступает подсолнечному маслу и используется в кулинарии. В косметологии масло из семян сафлора входит в состав средств для сухих и поврежденных волос, солнцезащитных средств, для лечения и предупреждения купероза и для восстановления липидного слоя сухой и очень сухой кожи, в качестве антиоксиданта в антивозрастной косметике.

Таким образом, представляется актуальным фармакогностическое исследование сафлора красильного, культивируемого на территории Самарской области, с целью введения и обоснования его использования в научной медицине и фармации в качестве источника новых видов ЛРС. Значимой является и возможность расширения сырьевой базы сафлора красильного с учетом актуальности проблемы комплексного использования данного растения. Решение обозначенных проблем будет

способствовать реализации Стратегии лекарственного обеспечения населения Российской Федерации на период до 2025 г. Цели и задачи исследования.

Целью работы является фармакогностическое исследование сафлора красильного по обоснованию целесообразности использования его в качестве источника новых видов лекарственного растительного сырья.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Анатомо-гистологическое исследование различных органов сафлора красильного.

2. Сравнительное фитохимическое исследование различных органов сафлора красильного (трава, цветки, семена).

3. Изучение флавоноидного состава надземной части сафлора красильного, культивируемого в Самарской области.

4. Разработка методики качественного анализа цветков сафлора красильного.

5. Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в цветках сафлора красильного.

6. Изучение жирно-кислотного состава и физико-химических характеристик масла из семян сафлора красильного.

7. Разработка методик качественного и количественного анализа лекарственных препаратов сафлора красильного («Сафлора настойка», «Сафлоровое масло»).

8. Обоснование целесообразности создания лекарственных средств на основе цветков сафлора красильного.

9. Разработка проектов ФС «Сафлора цветки», «Сафлора настойка» и «Сафлоровое масло».

Научная новизна. Впервые проведенное анатомо-гистологическое исследование строения надземных и подземных органов сафлора красильного позволило выявить диагностические признаки сырья данного растения, в частности, наличие на всей протяженности трубки венчика окрашенных в темно-бурый цвет сегментированных млечников, простых одно-двух клеточных трихом, расположенных над центральной жилкой лепестков, густо опушенного мелкими простыми трихомами гинецея, опушенного многочисленными волосками рыльца, пигментированного слоя клеток и многочисленных капель жирного масла в семенах данного растения.

В результате изучения химического состава водно-спиртовых извлечений из цветков сафлора красильного, культивируемого в Самарской области, впервые выделены и охарактеризованы 5 индивидуальных флавоноидов. В их числе сафлорозид, который охарактеризован как доминирующий компонент данного растения и является новым природным соединением, для которого с использованием данных масс-спектрометрии, УФ-, 'Н-ЯМР-спектроскопии, и результатов химических реакций (ферментативный и кислотный гидролиз) описано строение: 7-О-р-О-глюкопиранозид 3,7,3'^'-тетрагидрокси-б-метоксифлавона. Кроме того, азалеатин (3,7,3'Д'-тетрагидрокси-З-метоксифлавон) и 5-метил-лютеолин впервые описаны для рода СшИатиз, а цинарозид и лютеолин впервые для сафлора красильного, культивируемого в Самарской области.

Показана целесообразность проведения стандартизации сырья сафлора красильного по ведущей группе биологически активных веществ растения -флавоноидам, а конкретно, по содержанию доминирующего соединения сафлорозида.

Подобраны оптимальные условия для проведения качественной и количественной оценки суммы флавоноидов в цветках сафлора красильного с использованием хроматографических и спектрофотометрических методов, позволяющих определить качество и подлинность ЛРС. Разработаны методики анализа сырья и лекарственных препаратов сафлора красильного, основанные на определении суммы флавоноидов в пересчете на сафлорозид с применением методов тонкослойной хроматографии (ТСХ) и УФ-спектроскопии.

С помощью метода газовой хроматографии впервые определен жирно-кислотный состав жирного масла из семян сафлора красильного, культивируемого в Самарской области, и определены его физико-химические характеристики. Определено, что доминирующим компонентом в сафлоровом масле является линолевая килота, содержание которой составляет 78,5±0,05 % - 79,6±0,03 %. Впервые в сафлоровом масле определены маргариновая, невроновая, лигноцериновая, эйкозодиеновая жирные кислоты кислоты.

Практическая значимость. На основе результатов исследования разработаны проекты фармакопейных статей (ФС) «Сафлора цветки», «Сафлора настойка» и «Сафлоровое масло». Разработаны состав, способ получения, определены показатели качества и методы их оценки для лекарственных препаратов на основе сафлора красильного: «Сафлора настойка», «Сафлоровое масло».

Предложены методики качественного и количественного анализа флавоноидов в сырье сафлора красильного, отвечающие принципам унификации, предъявляемым к современному фармацевтическому анализу (Самылина И.А. и др. 1994; 2006). Разработано рационализаторское предложение № 263 «ГБОУ ВПО СамГМУ» от 27.06.2013 г. «Методика определения кислотного числа в жирном масле сафлора красильного» на усовершенствование методики определения кислотного числа для жирного масла в лабораторных условиях.

Результаты диссертационных исследований используются в учебных процессах на кафедрах: фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии; фармацевтической технологии; химии фармацевтического факультета ГБОУ ВПО СамГМУ Минздрава России; ЗАО «Самаралектравы»; ГНУ Самарский НИИ сельского хозяйства им. Н.М. Тулайкова РАСХН (пгт. Безенчук); ГБУЗ «Центр контроля качества лекарственных средств Самарской области». Результаты проведенного фармакогностического исследования позволят расширить ассортимент отечественного лекарственного растительного сырья за счет нового вида «Сафлора цветки». Результаты анатомо-морфологических и фитохимических исследований нашли отражение в проектах ФС «Сафлора цветки», «Сафлора настойка» и «Сафлоровое масло», направленных на экспертизу в ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» с целью включения в Государственную Фармакопею Российской Федерации XII издания.

Связь задач исследования с проблемами фармацевтических наук.

Диссертационная работа исполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский

университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (№ Гос. регистрации 01200900658).

Положения, выдвигаемые на защиту:

1. Результаты анатомо-гистологических исследований различных органов сафлора красильного.

2. Результаты фитохимического исследования различных видов сырья сафлора красильного.

3. Результаты исследования флавоноидного состава из цветков сафлора красильного.

4. Результаты исследования жирно-кислотного состава масла из семян сафлора красильного.

5. Результаты исследований по изучению показателей качества сырья и лекарственных препаратов сафлора красильного «Сафлора цветки», «Сафлоровое масло» и разработке методик их качественного и количественного анализа.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы представлены и обсуждены на Всероссийской молодежной научной школе «Биоматериалы и нанобиоматериалы: актуальные проблемы и вопросы безопасности» (г. Казань, 2012 г.); XVII и XVIII Всероссийском конгрессе «Экология и здоровье человека» (г. Самара, 2012; 2013 г.); VI Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы использования и охраны природных ресурсов России» (г. Самара, 2012 г.); XI Международной конференции «Медико-социальная экология личности: состояние и перспективы» (г. Минск, 2013 г.); конференции дипломированных специалистов Аспирантские чтения «Молодые ученые - медицине» (г. Самара, 2012; 2013 г.); III Международной научной Интернет-конференции "Медицина в XXI веке: тенденции и перспективы" (г. Казань, 2014 г.).

Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 17 научных работах, из них 5 статей в журналах, включенных в Перечень изданий, рекомендуемых ВАК Министерства образования и науки РФ.

Личный вклад автора. Все экспериментальные результаты, приведенные в диссертации, получены самим автором. Автором выполнены исследования по изучению морфологических и анатомо-гистологических особенностей строения различных органов сафлора красильного, выявлены основные диагностические признаки. Подобраны и апробированы оптимальные условия экстракции флавоноидов из цветков сафлора красильного. Автором разработаны методики анализа исследуемых видов лекарственного растительного сырья сафлора красильного, предложены состав и технология получения препаратов «Сафлора настойка» и «Сафлоровое масло». Автором разработаны методики качественного и количественного анализа предложенных препаратов с применением методов ТСХ, ГЖХ и УФ-спектрофотометрии. Автор провел исследование жирно-кислотного состава и определение физико-химических характеристик масла из семян сафлора красильного. Автором разработаны проекты ФС «Сафлора цветки», «Сафлоровое масло» и «Сафлора настойка».

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 129 страницах машинописного текста, содержит 17 таблиц, 61 рисунок. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования,

собственных экспериментальных исследований и их обсуждение (главы 3-6), общих выводов, приложения и списка литературы, включающего 138 источников, из которых 48 - на иностранных языках.

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, отмечена новизна и практическая значимость полученных результатов, а также изложены положения, выносимые на защиту.

Глава 1 содержит аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы по современному состоянию исследований сафлора красильного, в котором обобщены и систематизированы сведения по изучению химического состава данного растения, фармакологической активности, применению в медицинской практике.

В главе 2 представлена характеристика объектов и методов исследования. Приведены методики анатомо-морфологического, химического и физико-химического изучения лекарственного сырья, индивидуальных веществ и препаратов, а также контроля качества ЛП на основе сырья сафлора красильного.

В главах 3-6 экспериментальной части приводятся результаты собственных исследований по изучению химического состава сафлора красильного, совершенствованию методик стандартизации данного сырья и ЛП на его основе, разработке новых препаратов, оценке их качества и обоснованию целесообразности внедрения в медицинскую практику.

В Приложения включены материалы по разработке НД (проекты ФС «Сафлора цветки», «Сафлоровое масло» и «Сафлора настойка»), акты внедрения, рационализаторское предложение.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Объекты и методы исследования

Объектами исследования служили образцы сырья - трава, цветки, семена и масло из семян сафлора красильного (СапИатиз Ипс1опш Ь.), собранные в период с 20112013 гг. Растение заготавливалось на территории Самарской области. Образцы сырья были собраны в различных фазах вегетации растения в период с июля по сентябрь. На этапе проведения физико-химических методов анализа объектами исследования служили лабораторные образцы • разрабатываемых галеновых экстракционных препаратов на основе сырья сафлора (Сафлора настойка) и жирное мало из семян сафлора красильного, а также Государственные стандартные образцы лютеолина, рутина, цинарозида, кверцетина.

Анатомо-морфологическое исследование микропрепаратов осуществляли с использованием цифрового микроскопа Моис БМШ (возможность увеличения прибора представлена двумя окулярами: 4x10; 10x10; 40x10; 100x10) и цифрового стереоскопического микроскопа МоНс 0М-39С-М900-А (возможность увеличения прибора представлена двумя окулярами: х 20; х 40).

Изучение химического состава цветков сафлора проводилось методом адсорбционной жидкостной колоночной хроматографии. Экстракция осуществлялась хлороформом (ТУ 2631-008-00207787-02, «Волга-реактив»), смесью хлороформ-спирт этиловый в различных соотношениях (3%, 5%, 7%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%). При работе методом колоночной хроматографии в качестве сорбентов нами были использованы: силикагель Ь 40/100 и полиамид марки «\Voelm» (Германия).

Для тонкослойно-хроматографического анализа извлечений из сырья, субстанций и выделенных соединений использовали пластинки «Сорбфил ПТСХ-ПА-А-УФ» (ТУ 26-11-17-89, зернение 5-17 мкм, тип сорбента - силикагель СТХ-1А, Россия), «Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ». При этом использована система растворителей хлороформ - этанол - вода (26:16:3). Спектральные исследования проводили на спектрофотометре «Specord 40» (Analytik Jena) в кюветах с толщиной слоя 10 мм. Раствором сравнения служил 40 %, 70 % , 95 % спирт этиловый и вода. Результаты измерений обрабатывались с помощью программы WinASPECT Excel. 'Н-ЯМР-спектры регистрировали на спектрометре «Bruker»AM 300 (300 МГц). Масс-спектры электронного удара регистрировали на приборе масс-спектрометр «Krator MS-30» при энергии ионизирующих электронов 70 эВ и варьировании температуры ионного источника от 30 до 250 °С.

Жирно-кислотный состав образцов сафлорового масла анализировали на газовом хроматографе «Кристалл 5000» с детектором по ионизации в пламени. Использовали хроматографическую капиллярную кварцевую колонку с привитой фазой HP - FFAP, длиной 50 м, внутренним диаметром 0,32 мм, толщиной фазы 0,32 мкм. Газ-носитель -азот, скорость потока - 1 мл/мин. Для компонентов жирного масла по времени удерживания использовали смесь метиловых эфиров высших жирных кислот производства фирмы «SUPERO (CATALOG №: 47885 - U), страна производитель -США. Плотность образцов масла определяли с использованием набора ареометров общего назначения ИСП.А1. Показатель преломления измеряли с помощью рефрактометра «RL-3». Величину pH измеряли при помощи электронного рН-метра «МР-225».

Сравнительное изучение диуретических свойств осуществляли с использованием различных субстанций (настои, настойка) цветков сафлора красильного.

2. Анатомо-гистологическое исследование различных органов сафлора красильного

В рамках диссертационных исследований проведены анатомо-гистологические исследования некоторых органов сафлора красильного. При этом изучены диагностические признаки для растения, культивируемого в Самарской области. Установлено, что диагностическими признаками семян сафлора являются пигментированный слой клеток за склеренхимой мезокарпия и наличие многочисленных капель жирного масла и мелкой зернистости в семядолях зародыша (рис. 1 - 2).

При проведении анатомо-гистологического исследования цветка сафлора красильного были определены следующие диагностические признаки (рис. 3 - 4):

1. На всей протяженности трубки венчика в толще основной паренхимы видны окрашенные в темно-бурый цвет сегментированные млечники.

2. Трихомы представленные простыми одно-двух клеточными толстостенными волосками расположены над центральной жилкой лепестков.

3. Выступающая часть гинецея густо опушена мелкими простыми трихомами в виде одноклеточных, остроконечных папилл, ориентированных к верхушке гинецея. Опушение рыльца представлено многочисленными тупыми мелкими одноклеточными волосками.

Рис. 3. Трубчатый цветок сафлора красильного (х20): А - фрагмент отгиба венчика; Б - фрагмент пыльников

Обозначения: 1 - рыльце пестика; 2 - теки пыльников; 3 - лепестковидные части отгиба; 4 - пигментированное вместилище;

венчика.

Рис. 4. Сегментированные вместилища

венчика (х400): А - фрагмент края лепестка венчика; Б - фрагмент вместилища

Обозначения: 1 - клетки эпидермы; 2 — членик млечника; 3 - клеточная стенка; 4 — сосочковидные выросты

Рнс. 5. Поперечный срез стебля сафлора красильного (х40): А - общий вид; Б - окраска 10% раствором сернокислого анилина

Обозначения: 1- сердцевина; 2 - армированный проводящий пучок; 3 - ткани первичной коры; 4 - эпидермис, 5 - перициклическая зона;

6 - ксилема. _

красильного (х400): А - общий вид; Б - эпидермис

Обозначения: 1 - эпидермис; 2 - пигментированные клетки; 3- клетка эпидермиса.

Рнс. 1. Морфология плода сафлора красильного (х20)

Рис. 2. Перикарпий с семенной кожурой на поперечном срезе (х 400); А - общий вид до окрашивания; Б - окраска раствором сернокислого анилина

Обозначения: 1 - проводящий пучок; 2 - пигментированный слой;

Анатомо-гистологический анализ стебля сафлора красильного позволил сделать вывод о следующих диагностических признаках (рис. 5 -6):

1. Стебель пучкового типа, пучки коллатеральные открытые, хорошо армированные, с мощным слоем обкладочной склеренхимы в перициклической зоне

2. Основная ткань сердцевины крупноклеточная, клетки изодиаметрические по форме, более мелкие в перимедулярной зоне. В ее клетках диагносцируется сферокристаллический инулин.

3. Перициклическая зона коровой части сложена мощными участками склеренхимы, локализованными над флоэмой в открытых коллатеральных пучках. Склеренхима с коллатеральными пучками образует комплекс сосудисто-волокнистых пучков, раположенных плотным кольцом. Наличие пигментированных клеток и небольшого количества устьиц в эпидермисе.

По результатам анатомо-гистологических исследований впервые в РФ разработан раздел «Микроскопия», включенный в проект ФС «Сафлора цветки».

3. Фитохимическое исследование сафлора красильного 3.1. Сравнительное исследование различных органов сафлора красильного

Методом ТСХ проведен фитохимический анализ образцов различных органов (надземная и подземная часть) сафлора красильного. Результаты качественного анализа методом ТСХ показали: на хроматограмме в надземных органах растения имеется богатый спектр биологически активных соединений фенольной природы, в том числе и флавоноидов. Доминирющие пятна с (1^=0,5) и (Яг=0,45), имеющие оранжевую и желтую окраску в видимом свете (рис. 7), имеют флавоноидную природу.

О

© о I® о ф

о о

V о о о

ь

1 © о о

Рис. 7. ТСХ-аналш 70 % спиртовых извлечений различных органов сафлора красильного (фармакопейный участок СамГМУ): система растворителей хлороформ - этанол - вода (26:16:3)

Обозначения: 1 - цветки; 2 - листья; 3 — стебель; 4 - корень; 5 - семена

Апробированный метод ТСХ-анализа для водно-спиртовых извлечений из сырья сафлора красильного является наиболее показательным, чувствительным, специфичным для обнаружения в объекте флавоноидов. Принимая во внимание

полученные данные о наличии доминирующего пятна на уровне ГСО цинарозида, на наш взгляд, целесообразной является стандартизация по преобладающему флавоноиду.

В результате спектрофотометрического анализа нами получены кривые поглощения в УФ-спектре спиртовых извлечений из различных органов сафлора красильного, которые свидетельствуют о различном химическом составе, с точки зрения содержания флавоноидов в наибольшей степени это выражено кривой поглощения раствора водно-спиртового извлечения из цветков сафлора красильного (рис. 8).

I

Рис. 8. УФ-спектры водно-спиртовых извлечений из различных органов сафлора красильного

3.2. Изучение флавоноидного состава надземной части сафлора красильного, культивируемого в Самарской области

С целью изучения флавоноидного состава исследовано извлечение из цветков сафлора красильного, полученное экстракцией 70% этиловым спиртом. Исследования показали, что соединения флавоноидной природы содержаться во всех анатомических органах растения, однако наибольшее их количество отмечено в цветках. Поэтому именно цветки использовались в качестве исходного сырья.

100 г воздушно-сухих цветков сафлора красильного измельченные (5-10 мм), заготовленные в августе 2013 г., экстрагировали 70 % этиловым спиртом, осуществляя вначале две экстракции при комнатной температуре в течение 24 ч, а затем при нагревании на кипящей водяной бане в течение 30 мин. Объединенное водно-спиртовое извлечение упаривали под вакуумом до объема 50 мл, смешивали с 30 г силикагеля Ь 40/100 и высушивали. Высушенный порошок (сухой экстракт + силикагель) наносили на слой силикагеля (диаметр - 8 см, высота - 5 см), сформированный в виде взвеси в хлороформе. Хроматографическую колонку элюировали хлороформом и смесью хлороформ-этанол в различных соотношениях (99:1; 98:2; 97:3; 95:5; 93:7; 90:10; 85:15; 80:20; 70:30, 60:40, 50:50). Контроль за разделением веществ осуществляли с помощью ТСХ-анализа на пластинках «Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ» в системах хлороформ-этанол (9:1), хлороформ-этанол-вода (26:16:3), а также н-бутанол-ледяная уксусная кислота-вода (4:1:2). Фракции, содержащие доминирующее вещество 1, были объединены, выпавший из них осадок

был отделен и перекристаллизован из спирта этилового. При этом получен флавоноид

1 с выходом 0,1 % от массы воздушно-сухого сырья. Фракции, содержащие соединения 2-5, наносили на полиамид «Wolem» с целью дальнейшей очистки. Сухой порошок (экстракт+полиамид) переносили в хроматографическую колонку (высота сорбента — 5,0 см, диаметр — 4 см). Соответствующую хроматографическую колонку элюировали водой и водным раствором спирта этилового (20%; 40%; 70%; 96%). В результате проведенной очистки на колонках с полиамидом были получены вещества

2 и 3 (элюент - 96% этиловый спирт), вещество 4 (элюент - 70% этиловый спирт) и вещество 5 (элюент - 40% этиловый спирт), дополнительную очистку которых удалось провести путем перекристаллизации из водного спирта.

Кислотный гидролиз соединения 1 осуществляли 2 % HCl при 100 °С в течение 30 мин, расщепление гликозида 5 проводили в более жестких условиях - в 10 % HCl при 100 °С в течение 2 ч. Осадки, полученные после охлаждения реакционной смеси, промывали водой очищенной и перекристаллизовывали из водного спирта. В результате из гликозидов 1 и 5 получены агликоны - соответственно соединения 2 и 4. В результате хроматографического разделения упаренного водно-спиртового извлечения из цветков сафлора красильного, последующей рехроматографии полученных фракций веществ выделили пять (1-5) соединений флавоноидной природы (табл. 1).

В ПМР-спектре соединения 1 (рис. 9) обнаруживаются сигналы ароматических протонов Н-21 при 7.78 м.д. (1Н, д, 2.5 Гц), Н-61 при 7.75 м.д. (1Н, дд, 2.5 и 9 Гц), Н-5' при 6.95 м.д. (Ш, д, 9 Гц), Н-8 при 6.86 м.д. (1Н, д, 2.5 Гц) и Н-6 при 6.43 м.д. (1Н, д, 2.5 Гц). Обнаружение трехпротонного синглетного сигнала при 3.83 м.д. свидетельствует о наличии в молекуле флавоноида 1 метоксигруппы, которая отнесена к кольцу А флавоноида на основании данных масс-спектра: пик иона с m/z 168, соответствующий фрагменту (А+Н)+. Данный вывод подтверждается и данными УФ-спектров. Выбор места метилирования в пользу 5-ОН группы сделан на основании отсутствия в ПМР-спектре сигнала данной группы как в случае соединения 1, так и агликона (2), полученного в условиях кислотного гидролиза, а также выделенного из цветков сафлора красильного в индивидуальном виде. Соединение 2 идентифицировано нами как 3,7,31,41-тетрагидрокси-5-метоксифлавон (азалеатин). ß-Конфигурация гликозидной связи соединения 1 подтверждается наличием в ПМР-спектре дублетного сигнала при 5.05 м.д. с КССВ 7 Гц, принадлежащего аномерному протону глюкозы. О гликозилировании 7-ОН-группы свидетельствуют данные УФ-спектров: отсутствие батохромного сдвига коротковолновой полосы электронного спектра в присутствии NaOAc и появление данного эффекта в случае агликона (2). В отличие от азалеатина (2) в ПМР-спектре соединения 3 при 6.04 м.д. содержится дополнительный однопротонный синглетный сигнал, принадлежащий протону при С-3, что в совокупности с данными УФ-спектров, а также масс-спектра, в котором присутствуют пик иона с m/z 300 и 168, соответствующие молекулярному иону и фрагменту (А+Н)+, позволяет идентифицировать данный флавоноид как 5-0-метиллютеолин. Соединения 4 и 5, идентифицированные как 5,7,3',4'-тетрагидроксифлавон (лютеолин) и 7-0-р-£>-глюкопиранозид 5,7,3',4'-тетрагидроксифлавона (цинарозид) (рис. 10), ранее были выделены из цветков сафлора красильного.

Таким образом, в результате изучения флавоноидного состава цветков сафлора красильного выделены и охарактеризованы с использованием ]Н-ЯМР -, УФ-спектроскопии и масс-спектрометрии пять флавоноидов, среди которых азалеатин (З^З'^'-тетрагидрокси-З-метоксифлавон) и 5-О-метиллютеолин впервые описаны для данного растения, а 7-0-р-1)-глюкопиранозид азалеатина, названный нами сафлорозидом, является новым природным соединением (табл. 1 и рис. 9).

Рис. 9. "Н-ЯМР-спектр сафлорозида в ДМБО-«!«

____^ у__

Рис. 10. 'Н-ЯМР-спектр цинарозида в ДМ80-«1б

Таблица 1

Физико-химические константы и спектральные характеристики соединений, выделенных из цветков сафлора красильного

№ п/п Название, состав Химическая формула Физико-химические характеристики

1. Сафлорозид СггНггО^ он | [Г он OCHj О масс-спектр (m/z): 316 (М+ агликона); т.пл. 230-233 °С (водный спирт); УФ-спектр: лтах 260, 274 пл, 371 нм;

2. Азалеатин С,бН|207 он /Ч^он OCH, 0 Х„т (EtOH) 260 нм, 274 нм (пл), 371 нм. т.пл. 282-285 "С

3. 5- метиллютеолин с,6н12о6 он ОСН, 0 Xmix (EtOH) 256 нм, 266 нм (пл), 350 нм. т.пл. 237-239 "С

4. Лютеолин С^НюОб он но о А.тах (EtOH) 256 нм, 268 нм (пл), 353 нм. т.пл. 330 С

5. Цинарозид С21Н20О11 он А^ОН но о масс-спектр (m/z): 286 (М+ агликона); т.пл. 237-239 С (водный спирт); УФ-спектр: Хтах 257, 266 пл, 352 нм;

4. Изучение жирно-кислотного состава жирного масла из семян сафлора красильного

Лабораторную пробу жидкого растительного масла тщательно перемешивают, отобранную навеску массой 0,1 г помещают в стеклянную пробирку и растворяют в 1,9 см3 гексана. В гексановый раствор вводят 0,1 см3 раствора метилата натрия в метаноле молярной концентрации 2 моль/дм 3. После интенсивного перемешивания в течение 2 мин реакционную смесь отстаивают 5 мин и центрифугируют в течение 10 мин. Отбирают для анализа верхний прозрачный слой - 1 мкл.

Определение жирно-кислотного состава масла осуществляли по времени выхода соответствующих метиловых эфиров при следующих хроматографических условиях: температура испарителя — 200 °С; детектора - 220 °С. начальная температура термостата 100 °С, затем колонку нагревали со скоростью 5 °С/мин до температуры 220 °С; общее время анализа — 2 ч. В результате проводимых исследований идентифицировано 15 жирных кислот, а именно: миристиновая, пальмитиновая, пальмитолеиновая, стеариновая, олеиновая, линолевая, линоленовая, арахидоновая, гондоиновая, бегеновая, пентадиеновая кислоты (рис. 11). Впервые в жирном масле сафлора красильного (с. Пестравка), определены марганриновая, невроновая, лигноцериновая, эйкозодиеновая кислоты.

Рис. 11. Хроматографический профиль гексановых экстрактов метиловых эфиров жирного масла семян сафлора красильного (с. Пестравка)

Особенностью анализируемого масла является значительное содержание линолевой кислоты (свыше 78%), которая относится к незаменимым и необходима для обеспечения процессов роста и воспроизводства, целостности плазматических мембран, физиологического функционирования кожи и других органов. Результаты проведенного газохроматографического исследования свидетельствуют о том, что жирно-кислотный состав жирного масла семян сафлора красильного соответствует требованиям, регламентируемым ГОСТом 30623-98.

5. Стандартизация сырья и препаратов сафлора красильного 5.1. Качественный анализ цветков сафлора красильного

Для определения подлинности сырья сафлора красильного предложен метод тонкослойной хроматографии, предусматривающий определение двух доминирующих компонентов - флавоноидов сафлорозида и цинарозида (рис. 12).

Рис. 12. ТСХ анализ водно-спирговых извлечений из цветков сафлора красильного

Обозначения: 1 - Водно-спиртовое извлечение из цветков сафлора красильного на 70% этиловом спирте; 2 - лютеолин; 3 - цинарозид; 4 - сафлорозид.

При просмотре хроматограммы в УФ-свете при длине волны 254 нм обнаруживаются пятна с желто-оранжевой флуоресценцией, в том числе на уровне пятна PCO сафлорозида (величина R,~0,5) и пятно на уровне ГСО цинарозида (величина Rf~0,4). Наличие доминирующеих пятен сафлорозида и цинарозида является аналитическим эффектом метода, позволяющим применять его в разделе «Качественные реакции». |

5.2. Количественное определение суммы флавоноидов в цветках сафлора красильного

В ходе разработки методики количественного определения суммы флавоноидов в цветках сафлора красильного изучены УФ-спектры водно-спиртовых извлечений из данного сырья, а также УФ-спектр водно-спиртового извлечения после реакции комплексообразования с раствором алюминия хлорида (рис. 13).

При разработке методики количественного определения суммы флавоноидов использовали реакцию комплексообразования с раствором алюминия хлорида для исключения вклада в значение оптической плотности других групп соединений. В этом случае наблюдается батохромный сдвиг длинноволновой полосы флавоноидов, который обнаруживается в УФ-спектре в виде максимума поглощения при длине волны 418-420 нм. Это находит подтверждение в условиях дифференциальной спектрофотометрии: максимум поглощения при 420 нм.

Рис. 13. УФ-спектры растворов извлечений из цветков сафлора красильного

Обозначения: 1 — раствор извлечения из цветков сафлора красильного 70%;

2 - раствор извлечения из цветков сафлора красильного с добавлением А1С13;

3 - раствор извлечения из цветков сафлора красильного с добавлением алюминия хлорида (дифференциальный спектр).

Изучение УФ-спектров PCO сафлорозида показало, что раствор данного стандарта в присутствии алюминия хлорида имеет тот же максимум поглощения (420 нм). Следовательно, может быть использован в методике анализа в качестве PCO (рис. 14). Количественное определение суммы флавоноидов в цветках сафлора красильного проводили с помощью спектрофотометрического метода. В качестве экстрагента использовали 70% этиловый спирт. Выбор экстрагента обусловлен тем, что 70% этиловый спирт является универсальным растворителем для фенольных соединений, принадлежащих к классу флавоноидов, как гликозидной, так и агликоновой природы. Экстрагирование проводили на кипящей водяной бане в течение 60 минут.

Рис. 14. УФ-спектр раствора PCO сафлорозида

Обозначения: 1- спектр раствора PCO сафлорозида; 2 - спектр раствора PCO сафлорозида с А1С13; 3 - дифференциальный спектр.

С целью разработки методики нами были определены оптимальные условия экстракции цветков сафлора красильного: эктрагент 70% этанол; соотношение сырье-экстрагент - 1:30; время экстракции - настаивание на водяной бане при температуре 85-90'С в течение 60 мин.

5.2.1. Методика количественного определения суммы флавоноидов в цветках сафлора красильного в пересчете на сафлорозид.

Методика: В колбу со шлифом вместимостью 100 мл помещают около 1 г (точная навеска) измельченного сырья (пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм), приливают 30 мл спирта 70% и взвешивают на тарирных весах с точностью до ±0,01. Колбу с содержимым присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 1 ч. После охлаждения до комнатной температуры колбу взвешивают, доводят ее содержимое спиртом 95 % до первоначальной массы, перемешивают и фильтруют через бумажный фильтр (красная полоса).

Содержимое колбы тщательно перемешивают (испытуемый раствор А). 1 мл извлечения А помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 2 мл 3% раствора хлорида алюминия в 95% спирте и доводят объем раствора 95% спиртом до метки (испытуемый раствор Б). В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 1 мл испытуемого раствора А, 1 капли разведенной уксусной кислоты, доведенной до метки 95% этиловым спиртом в мерной колбе, вместимостью 25 мл (раствор сравнения Б). Измерение оптической плотности проводят на спектрофотометре при длине волны 420 нм. Параллельно измеряют оптическую плотность раствора PCO сафлорозида при длине волны 420 нм, приготовленного по аналогии с испытуемым раствором.

Измерение оптической плотности проводят при длине волны 420 нм через 40 мин после приготовления всех растворов. Содержание суммы флавоноидов в пересчете на сафлорозид и абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле:

D*ma *30 »2*25 »100* 100

А'=---, где

D„*m « 25 * 1 * 25 * (100 -

D — оптическая плотность испытуемого раствора;

D„ - оптическая плотность раствора PCO сафлорозида;

т — масса сырья, г;

т„ — масса PCO сафлорозида, г;

W— влажность сырья, %.

Метрологические характеристики методики количественного определения флавоноидов в цветках сафлора красильного методом дифференциальной спектрофотометрии представлены в таблице 3.

Опыты с добавками PCO сафлорозида к навеске сырья показали, что ошибка анализа находится в пределах ошибки единичного определения, что свидетельствует об отсутствии систематической ошибки разработанной методики.

Таблица 3

Метрологические характеристики спектрофотометрической методики количественного определения суммы флавоноидов в цветках сафлора красильного

F X s р, % t(PJ) АХ Е, %

10 1,01 0,0016 95 2,23 0,04 ±3,96

Опыты с добавками PCO сафлорозида к навеске сырья показали, что ошибка анализа находится в пределах ошибки единичного определения, что свидетельствует об отсутствии систематической ошибки разработанной методики.

С использованием разработанной методики проанализирован ряд образцов сырья и показано, что содержание флавоноидов в цветках сафлора красильного варьирует в пределах от 2,25±0,04% до 2,78±0,07%. На наш взгляд, это дает основание предложить в качестве нижнего предела показатель содержания суммы флавоноидов не менее 2,0%.

5.3. Разработка методов стандартизации препарата «Сафлора настойка»

С целью унификации методов анализа сырья и готовой продукции за основу взяты подходы к стандартизации, рекомендованные при разработке методик качественного и количественного анализа цветков сафлора красильного, с использованием PCO сафлорозида. Разработаны методики химической стандартизации препарата «Сафлора настойка», основанные на определении доминирующих флавоноидов сафлорозида и цинарозида методами ТСХ и спектроскопии.

5.3.1. Качественный анализ препарата «Сафлора настойка» с использованием ТСХ-аналнза и УФ-спектроскопии.

При просмотре хроматограммы препарата «Сафлора настойка» в УФ-свете при длине волны 254 нм и 366 нм до и после обработки хроматограммы щелочным раствором диазобензолсульфокислоты (ДСК) на уровне пятен ГСО цинарозида обнаруживаются 2 пятна с величиной Rf около 0,5 (сафлорозид) и 0,4 (цинарозид), имеющих соответственно оранжевую и желтую окраску в видимом свете и ярко-оранжевую и ярко-желтую флуоресценцию при просмотре хроматограммы в УФ-свете при длине волны 366 нм, а также кирпично-красную и желтую окраску при проявлении щелочным раствором диазобензолсульфокислоты (ДСК). Допускается также наличие других пятен.

5.3.2. Количественное определение суммы флавоноидов в настойке сафлора красильного.

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на сафлорозид в различных образцах препарата находится в пределах от 0,45±0,06% до 0,90±0,03 %. В качестве нижнего предела содержания суммы флавоноидов в настойке сафлора рекомендован показатель не менее «0,4 %». В качестве аналитической выбрана длина волны 420 нм.

Метрологические характеристики разработанной методики количественного анализа суммы флавоноидов в настойке сафлора методом спектрофотометрии с использованием PCO сафлорозида представлены в таблице 4.

Таблица 4

Метрологические характеристики спектрофотометрической методики количественного определения суммы флавоноидов в настойке сафлора

F X S р, % t(PJ) АХ Е, %

10 0,9 0,0013 95 2,23 0,006 ±4,29

Опыты с добавками PCO сафлорозида в препарат показали, что ошибка анализа находится в пределах ошибки единичного определения, что свидетельствует об отсутствии систематической ошибки разработанной методики.

6. Обоснование целесообразности использования в медицинской практике сырья сафлора красильного и препаратов на его основе

Принимая во внимание, что для цветков сафлора красильного выявлено высокое содержание флавоноидов (до 2,78 %), данное сырье может быть использовано в качестве источника для создания импортозамещающих лекарственных препаратов с диуретическим эффектом. В рамках обоснования целесообразности создания ЛП на основе сырья сафлора красильного нами были разработаны ФС «Сафлора красильного цветки» и «Сафлоровое масло».

Изучение острой токсичности и специфической фармакологической (диуретической) активности было выполнено на базе кафедры фармакологии им. з.д.н. РФ A.A. Лебедева СамГМУ под руководством зав. кафедрой, профессора A.B. Дубищева. Определение острой токсичности масла семян сафлора красильного проводили на беспородных половозрелых животных обоего пола 20 белых крысах (массой 350-390 г), на базе вивария кафедры фармакологии СамГМУ и прошедших карантин в течение 14 суток. Животные были разделены на 2 группы по 5 крыс в каждой. Первая группа животных получала перорально через желудочный зонд однократно сафлоровое масло в дозе 5,7 г/кг - 7,7 г /кг в объемах 2,0 - 3,0 г. Общая продолжительность наблюдения за животными после введения исследуемого препарата составила 14 дней. В первый день крысы находились под непрерывным наблюдением. В процессе исследования все животные выжили. Было установлено стабильно хорошее общее состояние, отсутствие значимых изменений поведенческих реакций и нервно-мышечной возбудимости. Измеряя массу тела до введения изучаемого препарата и после окончания периода наблюдения, была замечена прибавка в весе в среднем 0,10 - 0,15 г. Исходя из полученных данных, можно сделать вывод, что исследуемые образцы масла по классификации К.К. Сидорова относятся к классу практически нетоксичных.

Изучение диуретической активности выполнялось в экспериментах на белых беспородных крысах обоего пола массой 200 - 240 г. Животные содержались в виварии на обычном рационе при свободном доступе к воде. За день до опыта крысы получали внутрижелудочно водную нагрузку в объеме 3% от массы тела. В день эксперимента животным контрольной группы повторно проводилась водная нагрузка, а опытным - при помощи внутрижелудочного зонда вводился лекарственный препарат в идентичном объеме. В собранных образцах мочи определялась экскреция воды,

регистрировалась концентрация натрия и калия методом пламенной фотометрии на ПАЖ-1, креатинина-колориметрическим методом на КФК-3,

Анализ диуретического действия водных извлечений позволил определить, что препарат «Настой цветков сафлора красильного» в дозировке 50 мг/кг оказывает медленный диуретический эффект и длительное продолжительное действие, а также мощный калий- и натрий-сберегающий эффект. В дозе 100 мг/кг настой цветков сафлора проявил себя как препарат с быстрым развитием диуретического эффекта и уменьшением диуреза в течение времени, т.е. продолжительным действием. Повышение дозы приводит к снижению диуретического эффекта, поэтому необходим подбор оптимальной терапевтической дозы для данного препарата. Опыты по определению диуретического действия водно-спиртовых извлечений сафлора красильного позволили определить, что препарат «Сафлора настойка» оказывает медленный, диуретический эффект, но длительное продолжительное действие. Диуретические свойства обусловлены флавоноидами - ведущей группой действующих веществ данного растения.

ВЫВОДЫ

1. В результате анатомо-морфологических и гистохимических исследований впервые выявлены диагностические признаки корня, стебля, цветка и семени сафлора красильного, заключающиеся в наличии на всей протяженности трубки венчика окрашенных в темно-бурый цвет сегментированных млечников, простых одно-двух клеточных трихом, расположенных, над центральной жилкой лепестков, густо опушенного мелкими простыми трихомами гинецея, опушенного многочисленными волосками рыльца. Обнаружено также наличие в семени сафлора пигментированного слоя клеток и многочисленных капель жирного масла в семядолях зародыша, пигментированных клеток в эпидермисе стебля и слой пигментированных клеток под пробкой корня.

2. В результате изучения химического состава водно-спиртовых извлечений из цветков сафлора красильного, культивируемого в Самарской области, с использованием колоночной хроматографии впервые выделены и охарактеризованы с использованием данных масс-спектрометрии, УФ-, 'Н-ЯМР-спектроскопии, и результатов химических реакций (ферментативный и кислотный гидролиз) пять индивидуальных флавоноидов (сафлорозид, лютеолин, цинарозид, азалеатин, 5-метил-лютеолин).

3. Сафлорозид (7-0-Р-В-глюкопиранозидЗ,7,31,4'-тетрагидрокси-5-метоксифла-вон) представляет собой новое природное соединение растения и является доминирующим флавоноидом сафлора красильного, для него впервые описаны физико-химические и спектральные характеристики. Кроме того, выделенные соединения азалеатин (3,7,3'^'-тетрагидрокси-З-метоксифлавон) и 5-метил-лютеолин впервые описаны для рода СапИатш, а цинарозид и лютеолин впервые для сафлора красильного, культивируемого в Самарской области.

4. Определен жирно-кислотный состав жирного масла из семян сафлора красильного, культивируемого в Самарской области, и показано, что доминирующим компонентом в сафлоровом масле является линолевая килота, содержание которой составляет (78,0±0,5% - 79,0±0,6%).

5. Идентифицированы 15 жирных кислот, среди которых впервые в жирном масле сафлора красильного определены и описаны маргариновая, невроновая, лигноцериновая, эйкозодиеновая кислоты.

6. Разработана мелодика качественного анализа флавоноидов в цветках сафлора красильного с использованием метода ТСХ в системе хлороформ-этанол-вода (26:16:3) в присутствии ГСО цинарозида. Разработаны методики количественного определения суммы флавоноидов в цветках сафлора красильного методом дифференциальной спектрофотометрии с использованием PCO сафлорозида.

7. Разработаны методики качественного и количественного анализа флавоноидов в препарате «Сафлора настойка» методом ТСХ-анализа и спектрофотометрии с использованием ГСО цинарозида и PCO сафлорозида.

8. Изучены показатели качества сырья «Сафлора цветки» (нижний предел содержания суммы флавоноидов - не менее 2,0 %); ЛП «Сафлора настойка» (нижний показатель содержания суммы флавоноидов - не менее 0,4 %); которые включены в соответствующие проекты ФС.

9. По опытам на определение диуретической активности установлено, что препарат «Настой цветков сафлора красильного» в дозировке 50 мг/кг оказывает медленный диуретический эффект и длительное продолжительное действие, а также мощный калий- и натрий-сберегающий эффект. В дозе 100 мг/кг настой цветков сафлора проявил себя как препарат с быстрым развитием диуретического эффекта и уменьшением диуреза в течение времени, т.е. продолжительным действием.

10. На основании химических, фармакогностических, аналитических, и фармакологических исследований обоснована целесообразность внедрения нового вида лекарственного растительного сырья «Сафлора цветки», а также лекарственных препаратов «Сафлора настойка» и «Сафлоровое масло».

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Харисова, A.B. Изучение состава и физико-химических констант жирного масла семян сафлора красильного / A.B. Харисова // Аспирантский вестник Поволжья. - Самара, 2013. - №1-2. - С. 219-222.

2. Харисова, A.B. Перспективы использования сафлора красильного в медицине и фармации / A.B. Харисова // Фундаментальные исследования. - № 10 (1). -2013.-С. 154-157.

3. Куркин, В.А. Жирно-кислотный состав масла семян сафлора красильного / В.А. Куркин, A.B. Харисова, И.А. Платонов, JI.B. Павлова, A.B. Милёхин, В.В. Зубков // Фармация. - 2013. - Т. 61, № 5. - С. 25-26.

4. Харисова, A.B. Фармакогностическое исследование сафлора красильного (Carthamus tinctorius L.) / A.B. Харисова // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2013. — № 5. - С. 46.

5. Харисова, A.B. Перспективы комплексного использования сафлора красильного (Carthamus tinctorius L.) / A.B. Харисова, В.А. Куркин, A.B. Михёхин // Известия Самарского научного центра РАН. - 2012. — Т. 14, № 1 (7). - С. 23102312.

6. Харисова, A.B. Перспективы использования сафлора красильного в медицинской практике / A.B. Харисова // Аспирантские чтения - 2012.: материалы Всероссийской конференции с международным участием «Молодые ученые — медицине». - Самара, 2012. - С. 226-229.

7. Харисова, A.B. Перспективы комплексного применения сафлора красильного (Carthamus tinctorius L.) / A.B. Харисова, В.А. Куркин // Современные проблемы отечественной медико-биологической и фармацевтической промышленности. Развитие инновационного и кадрового потенциала: материалы международной научно-практической конференции. - Пенза: Издательство Пен. ун-та, 2012.-С. 142-146.

8. Харисова, A.B. Применение сафлора красильного в медицинской практике (Carthamus tinctorius L.) / A.B. Харисова // Бюллетень Северного государственного медицинского университета №2 (выпуск XXIX). - Архангельск, 2012. — С. 72-73.

9. Харисова, A.B. Перспективы комплексного применения сафлора красильного (Carthamus tinctorius L.) / A.B. Харисова, В.А. Куркин // Современные проблемы отечественной медико-биологической и фармацевтической промышленности. Развитие инновационного и кадрового потенциала: материалы международной научно-практической конференции. - Пенза: Издательство Пен. ун-та,

2012.-С. 142-146.

10. Харисова, A.B. Химико-фармацевтическое исследование сафлорового масла / A.B. Харисова // Аспирантские чтения — 2013.: материалы Всероссийской конференции с международным участием «Молодые ученые - медицине». - Самара,

2013.-С. 302-305.

11. Харисова, A.B. Анатомо-гистологическое исследование подземной части сафлора красильного (Carthamus tinctorius L.) / В.А. Куркин, В.М. Рыжов, Т.В. Иософатова, М.К. Буцких // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сборник научных трудов. — Пятигорск, 2013. — Вып. 68.-С. 122-124.

12. Харисова, A.B. Перспективы применения масла семян сафлора красильного / A.B. Харисова, В.А. Куркин, И.А. Платонов, JI.B. Павлова, A.B. Милёхин, В.В. Зубков // Медицина в XXI веке: тенденции и перспективы: материалы международной интернет — конференции. — Казань: Издательство Альянс, 2013.-С. 130-133.

13. Харисова, A.B. Анатомо-морфологическое исследование подземной части сафлора красильного (Carthamus tinctorius L.) / A.B. Харисова, В.А. Куркин. // Лекарственное растениеводство: от опыта прошлого к современным технологиям: материалы научно-практической интернет - конференции. - Полтава: Издательство Полт. гос. аграрной, акад., 2013. — С.149-152.

14. Харисова, A.B. Изучение показателей качества жирного масла семян сафлора красильного / A.B. Харисова // Проблемы разработки новых лекарственных средств: сборник тезисов всерос. научно-практической конференции молодых ученых. — Москва: Издательство Рос. Акад. мед. наук., 2013. — С.129.

15. Харисова, A.B. Перспективы изучения масла из семян сафлора красильного (Carthamus tinctorius L.), культивируемого в Самарской области / A.B. Харисова. В.А. Куркин // Медико-социальная экология личности: состояние и перспективы: материалы международной конференции. - Минск: Изд. Центр БГУ,

2013. —С. 99-101.

16. Харисова, A.B. Изучение флавоноидов сафлора красильного (Carthamus tinctorius L.) / A.B. Харисова // Тез. докл. молод, научно - техн. конф. Москва, 1-2 ноября 2013 г.-Москва: Изд-во МИТХТ, 2013. -С. 83.

17. Харисова, A.B. Изучение влияния на выделительную функцию почек настоя цветков сафлора красильного (Carthamus tinctorius L.) / A.B. Харисова, O.E. Правдивцева, E.H. Зайцева // Медицина в XXI веке: тенденции и перспективы: материалы международной интернет — конференции. - Казань: Издательство Альянс,

2014.-С. 123-126.

Подписано в печать 04.04.2014 г. Формат 60x84/16. Бумага офсетная. Печать оперативная. Объем 1,4 усл. печ. л. Тираж 110 экз. Заказ № 521.

Отпечатано в типографии ООО «Офорт». 443080, г. Самара, ул. Революционная, 70, литера П. Тел.: 372-00-56, 372-00-57.