Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Фармакогностическое изучение и стандартизация травы и экстракта сухого володушки золотистой (Bupleurum aurei Fisch.)

На правах рукописи

Каиунникова Юлия Сергеевна

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ И СТАНДАРТИЗАЦИЯ ТРАВЫ И ЭКСТРАКТА СУХОГО ВОЛОДУШКИ ЗОЛОТИСТОЙ (BUPLEURUMAUREI FISCH.). ,

14.04.02 — Фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

21 АВГ 2014

Москва 2014 г

005551802

005551802

Диссертационная работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений.

Научный руководитель:

Джавахян Марина Аркадьевна - кандидат фармацевтических наук, доцент, ведущий научный сотрудник научно-организационного отдела ГНУ ВИЛАР.

Официальные оппоненты:

Боковикова Татьяна Николаевна - доктор фармацевтических наук, начальник лаборатории химико-фармацевтических препаратов №1 Испытательного центра ФГБУ "Научный центр экспертизы средств медицинского применения" Минздрава РФ.

Терёшина Наталья Сергеевна - доктор фармацевтических наук, заведующая лабораторией фармакогнозии НИИ Фармации Первого Государственного Московского Университета им. И.М. Сеченова.

Ведущая организация: Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН

Защита состоится «06» октября 2014 года в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д. 006.070.01 при Государственном научном учреждении Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений (117216, г. Москва, ул. Грина, 7) по адресу: 123056, г. Москва, ул. Красина, д.2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВИЛАР по адресу:

117216, г. Москва, ул. Грина, 7

Автореферат разослан «с*/ггусгпс^. 2014 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор фармацевтических наук ^^ ХР°мак0Ва

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

В настоящее время наблюдается рост числа заболеваний гепатобилиарной системы среди населения. Это является следствием несбалансированного и нерегулярного питания, неблагоприятных факторов экологии, стрессов, а также бесконтрольного приема медикаментов.

В комплексной терапии и для профилактики данной группы заболеваний широко используется ряд лекарственных растений (расторопша пятнистая, солянка холмовая, артишок). В связи с увеличением числа заболеваемости поиск лекарственного растительного сырья, обладающего комплексным воздействием на пораженные ткани печени, высокой терапевтической активностью и низкой токсичностью является актуальным направлением фармацевтической науки.

Растения рода Володушка (Bupleurum) известны человечеству с древнейших времен и до нашего времени активно используются в медицине стран Юго-Восточной Азии (В. chinensis, B.falcatum) в качестве гепатопротекторных средств. На территории России также произрастают ряд видов рода Bupleurum. Володушка многожильчатая (ВФС 42-580-76) использовалась как сырье для получения препарата "Буплерин" обладающего Р-витаминной активностью. Самарскими учеными (Кривенчук П.Е. и др.) разрабатывалась технология производства препарата "Пеквокрин", сырьем для которого служила володушка круглолистная. В настоящее время также известны ряд Биологически активных веществ (БАД) гепатопротекторного действия на основе сырья володушки многожильчатой, такие как Гепато Транзит, Овесол (ЗАО "Эвалар") и др.

На основании информационно-аналитического анализа для детального изучения нами выбрана трава Володушки золотистой (В. аигеит), произрастающую на территории РФ и имеющую на сегодняшний день стабильную сырьевую базу в природе. Кроме того, на территории республики Башкортостан Мингажаевой A.M. проводились работы по введению володушки золотистой в культуру.

По данным автора Володушка золотистая более технологично вводится в культуру, чем многожильчатая, имеет большую (в четыре раза) наземную массу растений, что важно при создании промышленных запасов растения. Семена Володушки золотистой лучше, чем семена Володушки многожильчатой всходят при озимом посеве. Если ориентироваться на природные запасы этого растения, то Володушку золотистую заготавливать проще, так как Володушка многожильчатая произрастает в труднодоступных для заготовки горных районах.

Проводились фитохимическое изучение данного растения (из листьев был выделен гликозид флавоноловой группы) научно доказана фармакологическая активность как гепатопротекторного и желчегонного средства проведены работы по ботанико-ресурсным исследованиям.

Учитывая все представленные преимущества, Володушка золотистая выбрана перспективным видом, заслуживающим внимания и подлежащим детальному фармакогностическому изучению.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы является изучение Володушки золотистой травы и разработка современных методов стандартизации лекарственного растительного сырья (ЛРС) и экстракта сухого.

Для достижения цели работы поставлены следующие задачи:

1. Провести фармакогностическое изучение Володушки золотистой травы, установить диагностически значимые признаки в макро- и микроскопическом строении сырья.

2. Определить качественный состав и оценить содержание основных групп биологически активных веществ в сырье.

3. Разработать методики стандартизации сырья Володушки золотистой.

4. Установить закономерности экстракции биологически активных веществ (БАВ) Володушки золотистой травы; разработать технологическую схему получения экстракта сухого, обеспечивающую максимальный выход БАВ из сырья, в конечном итоге готового продукта со стабильными показателями качества.

5. Исследовать химический состав, технологические свойства и разработать показатели качества для Володушки золотистой экстракта сухого.

6. Разработать и оформить проект ФС на Володушки золотистой траву, ТУ на Володушки золотистой экстракт сухой, лабораторный регламент на производство Володушки золотистой экстракта сухого.

Научная новизна работы

Впервые проведено фармакогностическое изучение травы Володушки золотистой и выявлены диагностически значимые признаки в анатомическом строении: тонкополосатый стебель, листья трех типов, сизоватый налет на нижней стороне листа, обнаружены многоугольные клетки эпидермиса со слегка извилистыми стенками с четковидными утолщениями боковых стенок, секреторные ходы с коричневым содержимым по краю листа и вдоль крупных жилок.

Изучен качественный состав основных групп БАВ (флавоноидные соединения, фенолкарбоновые кислоты, дубильные вещества, сапонины, полисахариды) в ЛРС и экстракте сухом. Разработаны методики стандартизации Володушки золотистой травы и экстракта сухого с использованием комплекса физико-химических методов анализа. Разработан способ получения экстракта сухого.

Практическая значимость результатов исследования

Разработаны проект ФС на Володушки золотистой траву, ТУ на Володушки золотистой экстракт сухой, а также лабораторный регламент на производство Володушки золотистой экстракта сухого. Фрагменты диссертационного исследования внедрены в учебную и научно-исследовательскую работу кафедры общей фармацевтической и биомедицинской технологии РУДЫ.

Личный вклад автора

Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, постановки целей и задач, выбора объекта исследования, проведения экспериментальных исследований, обобщения полученных данных и их статистической обработки.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Научные положения диссертационной работы соответствуют формуле специальности 14.04.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведенного исследования соответствуют пунктам: 5. «Изучение вопросов рационального использования ресурсов лекарственного растительного сырья с учетом влияния различных факторов на накопление биологически активных веществ в сырье», 6. «Изучение химического состава лекарственного растительного сырья, установление строения, идентификация природных соединений, разработка методов выделения, стандартизации и контроля качества лекарственного растительного сырья и лекарственных форм на его основе».

Апробация работы

Основные положения работы докладывались и обсуждались на:

> Всероссийской научной конференции студентов и аспирантов с международным участием "Молодая фармация - потенциал будущего" (Санкт-Петербург, 2011);

> 76-й Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием "Молодежная наука и современность" (Курск, 2011);

> Конференции Пермской государственной фармацевтической академии (Пермь, 2011);

> Седьмой международной научной конференции "Современные проблемы гуманитарных и естественных наук" (Москва, 2011);

> Научно-практической конференции "Наука и современность - 2011" (Новосибирск, 2011);

> Международной научно-практическая конференции "В мире научных открытий" (Москва, 2011);

> 7-й Всероссийской научной конференции с международным участием "Химия и технология растительных веществ" (Сыктывкар, 2011);

> Международной конференции "Актуальные проблемы изучения растений", (Баку, 2011);

> Первой научно-практической конференции аспирантов и молодых ученых "Молодые ученые и фармация XXI века" (Москва, 2013);

> Второй Международной научно-практическая конференции "Актуальные вопросы медицины" (Баку, 2013);

> Международной научной конференции "Новые задачи современной медицины" (Санкт-Петербург, 2013);

> Всероссийской научно-практической конференции "Здравоохранение: образование, наука, инновации" (Рязань, 2013);

> 6-й Международной научной конференции "Традиционная медицина: пути интеграции с современным здравоохранением" (Улан-Удэ, 2013);

5

> 8-й Всероссийской научной конференции с международным участием и школе молодых ученых "Химия и технология растительных веществ" (Калининград, 2013);

> международной научно-практической конференции «От растения к препарату: традиции и современность» (к 95-летию со дня рождения проф. А. И. Шретера)

( Москва, 2014).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 19 научных работ, которые отражают основное содержание диссертационной работы, из них 4 в ведущих изданиях, рекомендуемых ВАК.

Основные положения, выносимые на защиту

1.Результаты фармакогностического изучения травы Володушки золотистой, установление макроскопических и микроскопических диагностических признаков.

2.Результаты фотохимического исследования Володушки золотистой травы.

3.Методики стандартизации Володушки золотистой травы.

4.Результаты исследований технологических характеристик Володушки золотистой травы и установление закономерностей выхода БАВ в зависимости от основных факторов, влияющих на процессы экстрагирования.

5.Разработка способа производства Володушки золотистой экстракта сухого, определение его физико-химических и технологических свойств.

6.Методики стандартизации Володушки золотистой экстракта сухого.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 181 страницах, содержит 50 таблиц и 58 рисунков. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, четырех глав, посвященных экспериментальным исследованиям, выводов, списка литературы и 6 приложений. Список литературы содержит 222 источников, в том числе 79 на иностранных языках.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследования

Объектами исследования служили образцы опытных партий сырья травы Володушки золотистой, заготовленные на территории Южного Урала (деревня Камышлы Уфимского района), Западной Сибири (село Сосновка Ордынского района Новосибирской области), Алтайского края (село Первомайское Первомайского района Алтайского края). Сырье заготовлено в период начала цветения (июнь) в фазе максимального накопления действующих веществ.

Для производства опытных партий сухого экстракта использовали траву Володушки золотистой, собранную на территории Алтайского края (ТУ 9185-08314721358-09) ООО "Компанией Хорст".

Отбор проб и анализ JIPC проводили по методикам ГФ XI и адаптированными нами методами качественного и количественного определения фенольных соединений.

Исследование морфологических признаков полученного сырья осуществляли в соответствии с требованиями статьи «Травы» (ГФ XI, вып. 1, С. 256). Макроскопический анализ проводили на бинокулярной лупе МБС—1 при увеличении х 2; х 4.

Микроскопический анализ анатомо - диагностических признаков травы володушки золотистой проводили в соответствии с указаниями статьи «Техника микроскопического и микрохимического исследования лекарственного растительного сырья» ГФ XI изд., вып. 1., С. 277. Микрофотографии сделаны на микроскопе "01¡mpys-SI-30" с цифровой насадкой. Фотографии обрабатывали на компьютере в программе "Adobe Photoshop CS 07,0".

Установление норм числовых показателей сырья проводилось в соответствии с указаниями ГФ XI, XII изд. Для экстракции БАВ и приготовления хроматографических систем использовали растворители марки «ч» и «хч». Приготовление реактивов, используемых в экспериментальной части работы осуществляли согласно ГФ XII, часть 1, С. 220. Концентрирование извлечений и отгонку растворителей осуществляли в вакуум-выпарном ротационном испарителе марки Heidolph Laborata.

Для хроматографии в тонком слое сорбента использовали пластины "Sorbfil", РФ. Хроматографирование выполняли при температуре (19-23) °С в герметически закрытых вертикальных стеклянных камерах. Нанесение исследуемых растворов на хроматографические пластинки осуществляли при помощи шприца Hamilton объемом 10 мкл.

Для тонкослойной хроматографии использовали следующие системы растворителей:

1. уксусная кислота : муравьиная кислота: вода в соотношении (10:2:3);

2. уксусная кислота: соляная кислота (конц): вода (15:3:82);

3. н-бутанол : ледяная уксусная кислота: вода (5:1:1);

4. н-бутанол : ледяная уксусная кислота: вода в соотношении (80:20:20);

5. н-бутанол : уксусную кислоту : воду в соотношении (4:1:2);

6. н-бутанол : уксусная кислота: вода в соотношении (4:1:5);

7. этилацетат: ледяная уксусная кислота в соотношении (80:20);

8. бутанол : этанол 96 % : аммиак в соотношении (7:2:5).

Соотношение растворителей учитывали в объемных частях. Все значения Rf обнаруженных соединений рассчитаны как средние из пяти измерений.

Обнаружение зон адсорбции производили после высушивания хроматограмм и обработки 10 % раствором алюминия хлорида (рутин, кверцетин, изорамнетин, изокверцетрин, изорамнетин-3-рутинозид), 1 % раствором железоамониевых квасцов, либо 1 % раствором ванилина в концентрированной хлористоводородной кислоте (дубильные вещества катехиновой природы), раствором 2,67

дихлорфенолиндофенолята натрия 0,001 моль/л (аскорбиновая кислота), 20 % раствором серной кислоты (сапонины), 0,2 % раствором нингидрина в ацетоне (аминокислоты).

Спектры поглощения снимали на спектрофотометрах СФ-103 и Sean Varían Сагу 100 в кювете с толщиной поглощающего слоя жидкости 10 мм. ВЭЖХ-анализ БАВ проводили на хроматографе Agilent 1100 Series HPLC. Agilent Technologies, 1999. Использовали колонку Phenomenex Luna C18(2), размер частиц 5 мкм. В качестве подвижной фазы использовали:

1.трихлоруксусная кислота : ацетонитрил (70:30), pH 2,5;

2.трифторуксусная кислота : ацетонитрил (60:40), pH 2,6;

3.0,2М фосфатный буфер, pH 2,2;

4-водный раствор трифторуксусной кислоты pH 2,5;

5.ацетонитрил.

Для качественного определения БАВ методом ВЭЖХ были использованы достоверные образцы и стандартные образцы: Гиперозид (кверцетин З-О-галактозид) CAS 482-36-0 - 83388F Sigma-Aldrich Chemie GmbH (>97,0 %), Рутин CAS 207671-50-9 - R5143 Sigma-Aldrich Chemie GmbH (>95,0 %), Астрагалин CAS 480-10-4 Sigma-Aldrich Chemie GmbH (>98,0 %), Кверцетин ICC Inc, USA Indofine, CAS: 117-39-5, Кемпферод ICC Indofine Chemical Company Ina, USA, CAS: 52018-3, Изорамнетин ICC Inc, USA Indofine, CAS: 480-19-3, Лютеолин ICC Inc, USA Indofme, CAS: 491-70-3, Аскорбиновая кислота Sigma-Aldrich Chemie GmbH, стандарты гидроксикоричных кислот фирмы Fluka.

Аминокислотный анализ проводили на приборе Sensitive and Reliable Amino Acid Analysis in Protein Hydrolysates using the Agilent 1100 Series HPLC. Agilent Technologies., 1999. Предел обнаружения 0,1 мг/кг. Исследовали свободные аминокислоты без предварительного гидролиза образца. Были использованы готовые стандарты аминокислот фирмы Fluka - смесь аминокислот в 0,1N HCL, концентрация аминокислот 0,1 нмоль/мл или 100 рм/мл.

Изучение технологических характеристик сырья и экстракта сухого проводили в соответствии с методиками, указанным в ГФ XI и XII.

Разработку технологии получения сухого экстракта проводили в условиях лабораторий фитохимии ВИЛАР и на кафедре Общей фармацевтической и биомедицинской технологии РУДН.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Фармакогностическое изучение сырья Володушки золотистой и разработка методов контроля качества

На основании макроскопического исследования выявлены значимые диагностические признаки сырья "Трава Володушки золотистой": тонкополосатый стебель, листья трех типов, на нижней стороне листьев имеется сизоватый налет. Выявлены возможные примеси (Володушка многожильчатая (Bupleurum multinervum Fisch), Володушка козелецелистная (Bupleurum

всог:опеп/о1шт ¡УШс!.). Проведен микроскопический анализ образцов сырья (рисунки 1-6). Выявлены диагностически значимые признаки в анатомическом строении травы Володушки золотистой, обнаружены многоугольные клетки эпидермиса со слегка извилистыми стенками с четковидными утолщениями боковых стенок, секреторные ходы с коричневым содержимым по краю листа и вдоль крупных жилок.

На основании проведенных исследований разработаны следующие числовые показатели для сырья трава Володушки золотистой.

Цельное сырье. Влажность не более 14 %, золы общей не более 10 %, золы, не растворимой в кислоте хлористоводородной 10 % не более 3 %, частей сырья, утративших естественную окраску (побуревшие, почерневшие, выцветшие) не более 1 %, других частей растения (фрагментов корневой системы) не более 1 %, органической примеси не более 1 %, минеральной примеси не более 1 %.

Измельченное сырье. Влажность не более 14 %, золы общей не более 10 %, золы, не растворимой в кислоте хлористоводородной 10 % не более 3 %, частей сырья, утративших естественную окраску (побуревшие, почерневшие, выцветшие) не более 1 %, других частей растения (фрагменты корневой системы) не более 1 %, частиц, не проходящих сквозь сито с отверстиями размером 7 мм не более 10 %, частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 0,5 мм не более 10 %, органической примеси не более 1 %, минеральной примеси не более 1%.

Порошок. Влажность не более 14 %, золы общей не более 10 %, золы, не растворимой в кислоте хлористоводородной 10 % не более 3 %, частей сырья, утративших естественную окраску (побуревшие, почерневшие, выцветшие) не более 1 %, других частей растения (фрагменты корневой системы) не более 1 %, частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 0,16 мм не более 1 %, органической примеси не более 1 %, минеральной примеси не более 1 %.

Наряду с этим для определения подлинности сырья нами предложено проведение качественных реакций на основные группы БАВ, а также разработаны методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин методом спектрофотометрии. Была использована реакция комплексообразования с раствором алюминия хлорида.

Содержание флавоноидов соединений в пересчете на Рутин, определяемое в траве Володушки золотистой предлагаемой методикой не менее 1,5 %. Вапидацию методики количественного определения суммы фенольных соединений в пересчете на рутин проводили по линейности, повторяемости, воспроизводимости и правильности.

Рисунок 1 - Володушки трава. Фрагмент розеточного листа (верхняя сторона). Клетки эпидермиса с слегка извилистыми стенками

[1], устьичный комплекс анизоцитного типа

[2]. Увел. 200х.

Рисунок 4 - Володушки трава. Фрагмент розеточного листа. Секреторные ходы с коричневым содержимым по краю листа [1] и вдоль крупных жилок [2]. Увел. 40х.

Рисунок 2 - Володушки трава. Фрагмент среднего листа (верхняя сторона). Клетки эпидермиса с утолщениями стенок [1], устьичный комплекс анизоцитного типа [2]. Увел. 200х.

~ ............. "

'.л 1 • ' • *

ЩШШ^ШШШШМ^^Ш

' Г71 " ^ -

... . • - ' ' • с - - ....

Рисунок 5 - Володушки трава. Фрагмент среднего листа. Секреторные ходы с коричневым содержимым вдоль жилок [1]. Увел. 200х.

/

тт

: -К / и

•Л

Рисунок 3 - Володушки трава. Фрагмент стеблевого листа (нижняя сторона). Секреторный ход с коричневым содержимым [1]. Увел. 200х.

Рисунок 6 - Володушки трава. Фрагмент стеблевого листа (верхняя сторона). Клетки эпидермиса со слабоизвилистыми стенками [1] и усгьичным комплексом анизоцитного типа [2]. Увел. 400х.

Для количественного определения Рутина в траве Володушки золотистой также предложен метод обратно-фазовой ВЭЖХ с фотометрическим детектированием. Стандартизацию проводили по содержанию Рутина в сырье, которое должно быть не менее 0,15 %. По результатам проведенного фармакогностического исследования нового вида лекарственного растительного сырья разработан проект ФС "Трава Володушки золотистой".

Фитохимическое изучение травы Володушки золотистой

В результате фитохимического анализа сырья трава Володушки золотистой установлены основные группы БАВ в сырье методом проведения качественных реакций на соответствующие группы веществ. Проведен детальный анализ качественного состава образцов сырья с использованием ТСХ. Проведена количественная оценка флавоноидов, фенолкарбоновых кислот, дубильных веществ, сапонинов, аскорбиновой кислоты методами спектрофотометрии и ВЭЖХ. Содержание суммы фенольных соединений в пересчете на Рутин, экстрагируемых 70 % спиртом этиловым составило 2,5±0,3 %. Определение проводилось методом спектрофотометрии. ВЭЖХ анализ флавоноидного состава травы Володушки золотистой показал содержание в образцах Володушки золотистой травы следующих флавоноидов - агликонов: Лютеолина (0,1±0,01 мг/г), Кверцетина (3,6±0,30 мг/г), Кемпферола (0,3±0,03 мг/г), Изорамнетина (2,1±0,10 мг/г). Также было оценено содержание в образцах Володушки золотистой травы гликозидов: Рутина (2,1±0,10 мг/г), Гиперозида (1,6±0,05 мг/г), Астрагалина (0,1±0,01 мг/г). Хроматограммы извлечения травы Володушки золотистой представлены на рисунках 7-8.

и

Рисунок 8. Хроматограмма Володушки золотистой травы (Лютеолин.Кверцетин, Кемпферол, Изорамнетин).

ВЭЖХ анализ фенолкарбоновых кислот показал наличие хлорогеновой -(148,4 мг/100г), феруловой (130 мг/100г), 4-кофеоилхинной (94 мг/100г), 1,5-дикофеоилхинной (33,2 мг/100 г), розмариновой (17,7 мг/100г) (рисунок 9).

ОАС1 А. &д=330.4 Яв»=оМ (СИОЭ13ЮЮИО«>в 0|

Рисунок 9. Хроматограмма травы Володушки золотистой (Хлорогеновая, Феруловая, 4-Кофеоилхинная, 1,5-Дикофеоилхинная, Розмариновая кислоты).

Содержание фенольных соединений в пересчете на (+)-катехин, определенное методом спектрофотометрии составило 1,8 %±0,3 %.

Сумма сапонинов идентифицированных в траве Володушки золотистой методом спектрофотометрии составляет 2,4% ± 0,3 % в пересчете на олеаноловую кислоту. |

Проведено изучение полисахаридного комплекса Володушки золотистой. В ходе проведенного исследования из травы Володушки золотистой выделены и изучены водорастворимые полисахариды (10,1 г), пектиновые вещества (5,7 г), гемицеллюлоза А (0,4 г) и В (0,25 г). Таким образом, в полисахаридном комплексе травы Володушки золотистой преобладает водорастворимая фракция полисахаридов. Также была проведена количественная оценка полисахаридного состава методом спектрофотометрии по реакции с

пикриновой кислотой в щелочной среде. Сумма полисахаридов в траве Володушки золотистой в пересчете на глюкозу составляет 0,25±0,15 %.

По результатам ВЭЖХ-анализа содержание аскорбиновой кислоты в исследуемых образцах составило ОД мг/г.

Для установления наличия аминокислот в траве Володушки золотистой мы использовали качественную реакцию на аминокислоты с раствором нингидрина. Количественное определение аминокислот проводили методом обратно-фазовой ВЭЖХ с предколоночной дериватизацией ортофталевым альдегидом в присутствии меркаптопропионовой кислота (ОРА-реагент) с использованием готовых стандартов аминокислот фирмы Fluka (смесь аминокислот в 0,1N HCL, концентрация аминокислот 0,1 нмоль/мл или 100 рм/мл.). Детектирование производных осуществляли фотометрически при длине волны 338 нм. Результаты определения представлены в таблице 1. Хроматограмма аминокислотного состава представлена на рисунке 10.

Определение макро- и микроэлементного состава, включая микроэлементы проводили методом эмиссионного спектрального анализа. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 1 - Результаты аминокислотного анализа Володушки золотистой травы

№ п/п Время удерживания Аминокислота Содержание, %

Незаменимые аминокислоты

1. 18,2 Валин 0,03

2. 27,7 Лизин 0,16

3. 5,3 Треонин 0,02

Заменимые аминокислоты

4. 7,9 Алании 0,14

5. 14,4 Цистеин 0,16

6. 4,5 Глицин 0,02

7. 3,2 Серин 0,02

DAD1 8. Se =338.8 Ref=390.8 (160313WMN0007.D)

i S

Рисунок 10 - Хроматограмма аминокислотного состава Володушки золотистой травы.

№ п/п Наименование элементов Количественное содержание элементов

Макроэлементы, %

1. Калий (К) 1,03

2. Натрий (Ыа) 0,21

3. Кальций (Са) 0,99

4. Фосфор (Р) 0,23

Микроэлементы, мг/кг

5. Цинк (2п) 72,07

6. Железо 352,48

7. Медь 4,32

8. Марганец 413,70

9. Иод 0,15

Разработка технологии производства сухого экстракта травы Володушки золотистой

В ходе работы были изучены технологические параметры сырья травы Володушки золотистой (таблица 3) и подобраны оптимальные экономически оправданные условия экстракции БАВ. Для их наиболее полного экстрагирования оптимальным является проведение трехкратной экстракции 50 % спиртом этиловым по 45 мин. при рабочей температуре 60±5 °С, с делением экстрагента на три равные части. Оптимальная степень измельчения сырья - 1 мм, соотношение сырье : экстрагент 1 : 10. На основании полученных данных проведены балансовые загрузки и разработан лабораторный регламент ЛР 04868244-01-2014 на производство сухого экстракта.

Разработана принципиальная схема получения сухого экстракта из травы Володушки золотистой, обеспечивающая максимальный выход БАВ. Также изучены физические свойства готового продукта и стабильность при хранении.

Таблица 3 - Технологические характеристика Володушки золотистой травы

№ п/п Показатель Результат

1. Удельная плотность, Ру, г/см3 1,452

2. Объемная масса, Ро, г/см3 0,625

3. Насыпная масса,Рп, г/см3 0,435

4. Пористость 0,570

5. Порозносгь 0,304

6. Свободный объем слоя, см3 0,700

7. Сыпучесть, г/сек 1,852

8. Угол естественного откоса, град 33

9. Коэффициент поглощения сырья 1,5

Изучение химического состава сухого экстракта и разработка показателей

качества

Исследован качественный состав БАВ сухого экстракта методами качественных реакций по методикам, изложенным в ГФ XI, а также методами ТСХ и ВЭЖХ. Установлено наличие и количественное содержание флавоноидов-агликонов Лютеолина (0,3±0,01 мг/г), Кверцетина (13,3±0,50 мг/г), Кемпферола (1,1±0,10 мг/г), (Изорамнетина 9,1±0,30 мг/г). Хроматограмма представлена на рисунке 11.

Кверцетин, Кемпферол, Изорамнетин)

Проведена оценка содержания в образцах Володушки золотистой экстракте сухом гликозидов Рутина (6,2±0,10 мг/г), Гиперозида (5,7±0,10 мг/г), Астрагалина (0,4±0,01 мг/г). Хроматограмма представлена на рисунке 12.

Рисунок 12 - Хроматограмма Володушки золотистой экстракта сухого (Рутин, Гиперозид, Астрагалин)

Методами качественных реакций и ТСХ идентифицирован состав фенолкарбоновых кислот сухого экстракта Володушки золотистой, с помощью ВЭЖХ определено содержание фенолкарбоновых кислот в субстанции, а также проведено определение компонентного состава (Феруловая кислота 657,4 мг/100, Кофейная кислота 83,9 мг/100, 4-Кофеоилхинная 592,2 мг/100, Розмариновая 130,2 мг/100). Хроматограмма представлена на рисунке 13.

0АР1 А, ад=330,4 Ие1=сЯ1 [04031ЭЮЮР0009.0)

0 __|__Ю _15 20__25__

Рисунок 13 - Хроматограмма Володушки золотистой экстракта сухого (фенолкарбоновые кислоты)

Содержание дубильных веществ, определенное методом спектрофотометрии в Володушки золотистой экстракте сухом в пересчете на (+)-катехин составляет 7,2 %±0,5 %. Содержание сапонинов в пересчете на олеаноловую кислоту методом спектрофотометрии составляет 8,4 %±0,3 %. Сумма полисахаридов в Володушки золотистой экстракте сухом по реакции с пикриновой кислотой в щелочной среде, определенное методом спектрофотометрии в пересчете на глюкозу составляет 1,80±0,15 %. По результатам ВЭЖХ анализа содержание аскорбиновой кислоты в исследуемых образцах составило 0,4 мг/г.

Изучен аминокислотный состав сухого экстракта Володушки золотистой на аминокислотном анализаторе, дана количественная оценка аминокислот в сухом экстракте. Результаты представлены в таблице 4 и на рисунке 14.

№ п/п Время удерживания Аминокислота Содержание, %

Незаменимые аминокислоты

1. 18,1 Валин 0,12

2. 27,6 Лизин 0,15

3. 5,4 Треонин 0,07

4. 3,8 Гистидин 0,30

5. 8,9 Аргинин 0,14

Заменимые аминокислоты

5. 4,5 Глицин 0,05

6. 7,9 Алании 0,15

7. 12,1 Тирозин 0,45

8. 14,3 Цистин 0,95

9. 3,2 Серин 0,04

10. 22,1 Изолейцин 0,05

Рисунок 14 - Хроматограмма аминокислотного состава Володушки золотистой экстракта сухого.

Проанализирован элементный состав сухого экстракта. Установлено, что в Володушки золотистой экстракте сухом из микроэлементов преобладает марганец, железо, цинк из макроэлементов - калий, кальций (таблица 5).

Для установления подлинности сухого экстракта предложен комплекс качественных реакций, устанавливающих наличие флавоноидов (цианидиновая проба), дубильных веществ катехиновой природы (реакция с железоаммониевыми квасцами), сапонинов (реакция пенообразования) и полисахаридов (реакция осаждения спиртом этиловым 96 %).

Стандартизацию сухого экстракта Володушки золотистой проводили по содержанию флавоноидов, экстрагируемых 50 % спиртом этиловым в

пересчете на Рутин по реакции комплексообразования с алюминия хлоридом методом спектрофотометрии, которых должно быть не менее 8,5 %. Валидацию методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин проводили по линейности, повторяемости, воспроизводимости и правильности.

Также предложена методика стандартизации по содержанию Рутина, определяемого методом обратно-фазовой ВЭЖХ с фотометрическим детектированием. Содержание Рутина в образцах сухого экстракта должно быть не менее 0,87 %.

Таблица 5 - Элементный состав сухого экстракта Володушки

№ п/п Наименование элементов Количественное содержание элементов

Макроэлементы, %

1. Калий (К) 5,23

2. Натрий (Ыа) 1,16

3. Кальций (Са) 5,09

4. Фосфор (Р) 1,28

Микроэлементы, мг/кг

5. Цинк (2.п) 403,59

6. Железо 1973,88

7. Медь 24,19

8. Марганец 2316,72

9. Иод 0,84

По результатам проведенных исследований разработаны ТУ 9369-18404868244-2014 "Володушки золотистой экстракт сухой".

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Проведено фармакогностнческое изучение Володушки золотистой травы, установлены диагностически значимые признаки сырья в макро- и микроскопическом строении сырья, установлены числовые показатели, даны качественная и количественная характеристика действующих веществ в сырье.

2. С применением различных физико-химических методов анализа определен качественный состав и количественная оценка содержания основных групп БАВ в сырье (флавоноидов, дубильных веществ, сапонинов, полисахаридов)

3. Разработаны методики стандартизации сырья Володушки золотистой методами спектрофотометрии и ВЭЖХ.

4. Установлены закономерности экстракции Володушки золотистой травы, позволяющие получить готовый продукт со стабильными показателями качества, на основании чего разработана технологическая схема получения экстракта сухого, позволяющая проводить максимальное извлечение БАВ.

5. С использованием качественных реакций, ТСХ, ВЭЖХ и спектрофотомерии изучен химический состав, установлено наличие основных групп БАВ в экстракте сухом, присущих исходному сырью.

6. Изучены технологические свойства Володушки золотистой экстракта сухого, разработаны показатели качества.

7. В результате проведенных исследований составлен проект ФС на "Володушки золотистой трава цельная, измельченная, порошок - упаковка "ангро", пачки, фильтр-пакеты" разработаны и оформлены технические условия ТУ 9369-18404868244-1014 "Володушки золотистой экстракт сухой", оформлен и утвержден лабораторный регламент ЛР 04868244-01-2014 на получение Володушки золотистой экстракта сухого. Фрагменты диссертационного исследования внедрены в учебную и научно-исследовательскую работу кафедры общей фармацевтической и биомедицинской технологии РУДН (акт внедрения от 01.06.2014)

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ю.С. Канунникова, М.А.Джавахян Микроскопическое изучение травы Володушки золотистой. // Материалы Всероссийской научной конференции студентов и аспирантов с международным участием "Молодая фармация — потенциал будущего", Санкт-Петербург, 2011.-С. 44—45.

2. Ю.С. Канунникова, М.А. Джавахян Анализ фармацевтического рынка гепатопротекторных средств. // Материалы 76-й Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием "Молодежная наука и современность", Курск, 2011. - С.237-238.

3. Ю.С. Канунникова, М.А.Джавахян Макроскопический анализ лекарственного растительного сырья трава Володушки золотистой (Herba Bupleuri aurei) // Вестник Пермской государственной фармацевтической академии, №8, 2011. — С.157-158.

4. Ю.С. Канунникова Растения рода Bupleurum - перспективный источник получения средств // Материалы седьмой международной научной конференции "Современные проблемы гуманитарных и естественных наук", Москва, 2011. - С. 268-273.

5. Ю.С. Канунникова Фитопрепараты гепатопротекторного действия.// Сборник материалов XII Научно-практической конференции "Наука и современность -2011", Новосибирск, 2011.-С.137-140.

6. Ю.С. Канунникова, МЛ. Джавахян, В.Ф. Охотникова Антиоксидантная активность флавоноидных соединений в терапии патологий печени. // Международная научно-практическая конференция "В мире научных открытий", Москва, 2011. - С.240-241.

7. Ю.С. Канунникова, М.А. Джавахян Идентификация Биологически активных веществ травы Володушки золотистой (Herba Bupleuri aurei). // Всероссийская научная конференция "Химия и технология растительных веществ", Сыктывкар, 2011.-С. 178.

8. Ю.С. Канунникова, М.А. Джавахян, В.Ф. Охотникова Фармакогностическое изучение травы Володушки золотистой (Herba Bupleuri aurei). // Международная конференция "Актуальные проблемы изучения растений", Институт ботаники Азербаджана, Баку, 2011. - С. 276-279.

9. Ю.С. Канунникова, М.А. Джавахян Анализ рынка современных средств гепатопротекторного действия. // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, №11,2012. - С. 63-65.

10. Ю.С. Канунникова, М.А. Джавахян, О.Б. Николаева Анатомо-диагностическое изучение травы Володушки золотистой (Herba Bupleuri aurei) микроскопическим методом. // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, №3,2012. - С. 22-27.

11. Ю.С. Канунникова, М.А. Джавахян Изучение параметров экстрагирования суммы биологически активных веществ травы Володушки золотистой. //

Первая Научно-Практическая конференция аспирантов и молодых ученых "Молодые ученые и фармация XXI века", Москва, 2013. - С. 70-73.

12. J. Kanunnikova, M. Dzhavakhan Definition flavonoids aglicon in a herba of bupleurum аигеишУ/ Вторая Международная Научно-Практическая Конференция "Актуальные вопросы медицины", Баку, 2013. - С. 117-118.

13. Ю.С. Канунникова, М.А. Джавахян Определение флавоноидов в траве Володушки золотистой (Herba Bupleuri aurei) методом ВЭЖХ. // Международная научная конференция "Новые задачи современной медицины", Санкт-Петербург, 2013 - С. 88-90.

14. Ю.С. Канунникова, М.А.Джавахян Актуальность и перспективы разработки активных субстанций на основе травы Володушки золотистой (Herba Bupleuri aurei). // Всероссийская научно-практическая конференция "Здравоохранение: образование, наука, инновации", Рязань, 2013. - С. 170-172.

15. Ю.С. Канунникова, М.А. Джавахян Разработка параметров экстрагирования суммы биологически активных веществ травы Володушки золотистой (Herba Bupleuri aurei).// Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, №5,2013. - С. 35.

16. J.Kanunnikova, M.Dzhavakhan Urgency and prospect of working out of active substances on the basis of a herba Bupleuri aurei. // 6-я Международная научная конференция "Традиционная медицина: пути интеграции с современным здравоохранением", Улан-Удэ, 2013. - С. 32-33.

17. Ю.С. Канунникова, М.А.Джавахян Определение флавоноидов агликонов в траве Володушки золотистой методом ВЭЖХ. // 8-я Всероссийская научная конференция с международным участием и школа молодых ученых "Химия и технология растительных веществ", Калининград,

2013.-С. 102.

18. Ю.С. Канунникова, М.А. Джавахян Разработка технологии изготовления володушки золотистой экстракта сухого. // Международная научно-практическая конференция «От растения к препарату: традиции и современность» (к 95-летию со дня рождения проф. А.И. Шретера), Москва,

2014.-С. 204-207.

19. Ю.С. Канунникова, М.А. Джавахян Разработка технологии изготовления володушки золотистой экстракта сухого и изучение его физико-химических и технологических свойств. // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, №7,2014. - С. 65-66.

Подписано в печать:

04.08.2014

Заказ № 10146 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru