Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Фармакогностическое изучение и стандартизация каштана конского обыкновенного листьев (aesculus hippocastanum l.) и экстракта сухого на его основе

На правах рукописи

Постоюк Наталья Александровна

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ И СТАНДАРТИЗАЦИЯ КАШТАНА КОНСКОГО ОБЫКНОВЕННОГО ЛИСТЬЕВ (AESCULUS HIPPOCASTANUM L.) И ЭКСТРАКТА СУХОГО НА ЕГО ОСНОВЕ

14.04.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

з 1 ОКТ 2013

Москва - 2013 г.

005536580

Диссертационная работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России

Научный руководитель:

Маркарян Артем Александрович - доктор фармацевтических наук, профессор, заведующей кафедрой фармации Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Официальные онионенты:

Скачилова София Яковлевна - доктор химических наук, профессор, руководитель отдела химии и технологии синтетических лекарственных средств ОАО «Всероссийский научный центр по безопасности биологически активных веществ»

Лякина Марина Николаевна - доктор фармацевтических наук, заместитель начальника управления №3 экспертизы лекарственных средств ФГБУ НЦЭСМП МЗ РФ

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится « » 2013 года в часов на заседании

Диссертационного совета Д 006.070.01 при Государственном научном учреждении «Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений Российской академии сельскохозяйственных наук» (117216, г. Москва, ул. Грина, 7) по адресу: 123056, г. Москва, ул. Красина, д.2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВИЛАР Россельхозакадемии по адресу: 117216, г. Москва, ул. Грина, 7

Автореферат разослан СкХ^рЯ201Ъ г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор фармацевтических наук Громакова А.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В нашей стране и за рубежом постоянно растет интерес врачей и пациентов к использованию лекарственных средств растительного происхождения. Возрастающая популярность и эффективность во многом объясняется содержанием в них биологически активных веществ, которые воздействуют на организм человека комплексно, легко включаются в обменные процессы и практически не проявляют негативных побочных реакций при длительном применении.

Лекарственные препараты растительного происхождения используются для профилактики и лечения различных заболеваний человека.

Хроническая венозная недостаточность (ХВН) нижних конечностей -одно из наиболее часто встречаемых в повседневной медицинской практике патологических состояний, характеризующихся прогрессивным и часто осложненным течением, имеющее социально-экономическое значение.

Хроническая венозная недостаточность представляет серьезную проблему для современного общества. Заболевание определяется широкой распространенностью, наблюдающейся тенденцией к росту и регистрируется у 15-40 % взрослого населения. Патология сопровождается уменьшением пропускной способности венозного русла, перегрузкой венозной системы и нарушением лимфатического оттока. Тяжелое протекание хронической формы и частая инвалидизация позволяют смело называть ХВН «болезнью цивилизации». Актуальность исследования заболевания и поиск возможных путей повышения эффективности фармакотерапии в общей структуре заболеваемости делают необходимым разработку и внедрение в медицинскую практику новых, эффективных растительных лекарственных средств. В настоящее время на фармацевтическом рынке России представлено большое количество лекарственных средств, обладающих противовоспалительной и венотонизирующей активностью. Однако значительная часть этих препаратов синтетического и полусинтетического происхождения.

К числу важнейших задач медицинской и фармацевтической науки относится поиск эффективных лекарственных средств на основе природных биологически активных веществ (БАВ) из растений.

В настоящее время номенклатура венотонизирующих средств включает препараты растительного происхождения, в основном каштана конского обыкновенного семян и его сочетаний с другими компонентами.

В СССР выпускался лекарственный препарат «Эсфлазид», содержавший сумму флавоноловых гликозидов и сапонинов, извлекаемых из листьев каштана конского обыкновенного; однако в данный момент средств, содержащих в своем составе биологически активные соединения, выделяемые из листьев каштана, в России не зарегистрировано. Одним из возможных подходов для решения создавшейся проблемы является поиск и фармакогностическое изучение лекарственных растений для расширения ассортимента венотонизирующих средств.

Таким образом, актуальным и перспективным является углубленное фармакогностическое изучение растительного сырья - листьев каштана конского обыкновенного {Aesculus hippocastanum L.) - и создания на его основе эффективного отечественного фитопрепарата для профилактики и лечения венозной недостаточности.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы является фармакогностическое изучение листьев каштана конского обыкновенного, разработка экстракта сухого и их стандартизация.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

изучить макро- и микроскопические признаки цельных и измельченных листьев каштана конского обыкновенного и выявить диагностически значимые признаки;

- провести фотохимическое изучение листьев каштана конского обыкновенного на присутствие основных групп БАВ, а также разработать методики их качественного и количественного анализа;

- разработать способ получения экстракта сухого из листьев каштана конского обыкновенного и провести его стандартизацию;

- оформить проекты нормативной документации на сырье и экстракт сухой из листьев каштана конского обыкновенного.

Научная новизна работы

На основании макро- и микроскопического анализа выявлены диагностически значимые признаки в морфологическом и анатомическом строении листьев каштана конского обыкновенного.

Изучен качественный состав основных групп биологически активных веществ (тритерпеновых сапонинов, флавоноидов, поли- и моносахаридов, аминокислот и микроэлементов), подобраны оптимальные условия проведения их качественного анализа методами ТСХ, ВЭЖХ и спектрофотометрии. Разработаны и унифицированы методики количественного анализа с применением физико-химических методов исследования сырья и экстракта сухого.

Разработан способ получения экстракта сухого из листьев каштана конского обыкновенного.

С учетом современных требований к стандартизации лекарственного растительного сырья и экстрактов сухих разработаны критерии подлинности и нормы содержания действующих веществ.

Практическая значимость работы

На основании проведенных исследований разработаны и внедрены: > технические условия ТУ 9363-178-04868244-2013 «Каштана конского

обыкновенного листья»;

> проект ФС «Экстракт сухой из листьев каштана конского обыкновенного»;

> технологическая инструкция на получения экстракта сухого из листьев каштана конского обыкновенного;

> методика микроскопического анализа листьев каштана конского обыкновенного (акт о внедрении в научно-исследовательский и учебный процесс студентов и аспирантов ГБОУ ВПО КГМУ Минздрава России)

> методика количественного определения суммы тритерпеновых сапонинов в экстракте сухом из листьев каштана конского обыкновенного (акт внедрения в Государственном бюджетном учреждении здравоохранения «Центр лекарственного обеспечения и контроля качества Департамента здравоохранения г. Москвы» (ГБУЗ «ЦЛО и КК ДЗ г. Москвы»),

Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, постановке задач исследования, выборе объектов исследования, проведении экспериментальных исследований, теоретических изысканиях, обобщении полученных данных. Автор изучил лекарственное растительное сырье, разработал и предложил методики стандартизации по действующим веществам, разработал способ получения сухого экстракта и показатели качества для него. Автором проведена аналитическая и статистическая обработка полученных данных и результатов экспериментов.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности.

Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 - «фармацевтическая химия, фармакогнозия». Результаты проведенного исследования соответствуют пунктам 3, 5, 6 паспорта «фармацевтическая химия, фармакогнозия».

Связь задач и исследования с проблемным планом фармацевтической науки

Работа выполнена в рамках комплексной темы ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Минздрава России «Разработка современных технологий подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием на основе достижений медико-биологических исследований» (per. № 01.2.006 06 352).

Апробация работы

Основные результаты исследования докладывались и обсуждались на:

> XVIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2011,2012);

> XXII Московской международной гомеопатической конференции (Москва, 2012);

> научно-практической конференции «Актуальные научные вопросы: реальность и перспективы» (Тамбов, 2012);

> II Международной научно-практической конференции «Современная медицина и фармацевтика: анализ и перспективы развития» (Москва, 2012);

> международной заочной научной конференции «Новые задачи современной медицины» (Пермь, 2012);

> первой Всероссийской научной конференции молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине XXI века» (Москва, 2012);

> первой научно-практической конференции молодых ученых и аспирантов «Молодые ученые и фармация XXI века» (Москва, 2013).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 18 научных работ, 7 из них - в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 165 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы (глава 1), четырех глав экспериментальной части, выводов, библиографии, включающей 154 источника, в том числе иностранных, приложений 7. Работа содержит 42 рисунка и 55 таблиц.

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цели и задачи исследования, представлены научная новизна и практическая значимость работы.

В первой главе на основании данных литературы дана общая характеристика рода Конский каштан (Aesculus L.), описаны причины хронической венозной недостаточности и фармакологическое действия препаратов различных групп. Дана краткая характеристика номенклатуры лекарственных средств растительного происхождения, применяемых при хронической венозной недостаточности. Обоснована рациональность использования листьев каштана конского обыкновенного в качестве сырья для создания венотонизирующего лекарственного средства. Отражены современные способы производства экстрактов сухих из растительного сырья.

В разделе «Объекты и методы исследования» приведены сведения об объектах изучения, о методах и приборах, используемых в экспериментах.

Вторая глава посвящена фармакогностическому исследованию листьев каштана конского обыкновенного, установлению показателей, позволяющих идентифицировать данное сырье и контролировать его качество.

В третьей главе представлены результаты разработки методик количественного анализа суммы групп биологически активных веществ (флавоноидов, тритерпеновых сапонинов, аминокислот, фенольных

соединений, органических кислот, полисахаридов) на лекарственное растительное сырье листьев каштана конского обыкновенного с использованием современных физико-химических методов анализа.

В четвертой главе изложены результаты по разработке рациональной технологии получения экстракта сухого из листьев каштана конского обыкновенного.

Пятая глава содержит результаты по изучению химического состава и установлению показателей качества экстракта сухого из листьев каштана конского обыкновенного.

Основные положения, выносимые на защиту:

> результаты исследования химического состава листьев каштана конского обыкновенного и экстракта сухого, получаемого на его основе, в сравнительном аспекте;

> обоснование способа получения экстракта сухого из исследуемого сырья;

> разработка методик качественного и количественного анализа БАВ в сырье и экстракте сухом;

> разработка проектов нормативной документации на листья каштана конского обыкновенного и экстракт сухой, получаемый на его основе.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования

Объектами исследования служили образцы опытных партий листьев конского каштана обыкновенного - Aesculus hippocastanum L., собранные в разное время года с 2010-2013 гг. в Москве и Московской области.

Отбор проб и анализ J1PC проводили по методикам ГФ XI, XII и разработанными нами методами качественного и количественного определения тритерпеновых сапонинов и флавоноидов.

Микроскопический анализ цельного и измельченного сырья проводили согласно статье «Техника микроскопического анализа» ГФ XI изд., вып.1., с. 277-285, на микроскопе МБИ-3 (при увеличении *40, х200, *400).

При качественном анализе использовали общие и специфические реактивы на группы действующих веществ, рекомендованные ГФ XII. Хроматографирование в тонком слое сорбента проводили согласно статье «Хроматография» ГФ XI. Детектирование веществ на хроматограммах осуществляли в УФ-свете и видимой области до и после их обработки специфическими реактивами.

Для приготовления хроматографических систем, а также для экстракции БАВ использовали растворители марки «ч» и «хч». Приготовление реактивов, используемых в экспериментальной части работы согласно ГФ XI и ГФ XII. Для проведения фитохимических исследований использовали водные и водно-спиртовые извлечения различных соотношений из листьев каштана конского обыкновенного.

Концентрирование извлечений и отгонку растворителей осуществляли в вакуум-выпарном ротационном испарителе марки ИР-1М.

Исследование качественного состава изучаемых объектов проводили методом тонкослойной хроматографии на пластинках: «Kieselgel», «Kieselgel 60 F 254», «Kieselgel 40 F254», «Сорбфил», «Сорбфил» УФ-254 с использованием следующих систем растворителей:

1. этилацетат-уксусная кислота-вода (50:10:10).

2. //-пропанол-этилацетат-вода-уксусная кислота (40:30:30:1).

3. вода-этанол-уксусная кислота концентрированная-хлористый этилен (10:15:25:50).

4. н-бутанол-ледяная уксусная кислота-вода (40:10:10). Хроматографирование образцов выполняли при температуре (19-23)°С

в герметически закрытых вертикальных стеклянных камерах. Детектирование пятен веществ производили после высушивания хроматограмм, путем просматривания в УФ-свете до и после обработки.

Для обработки хроматограмм использовали следующие реагенты:

1. раствор и-диметиламинобензальдегида в кислоте серной конц.;

2. тимол-кислота серная конц.-спирт 95% (0,5:5:95);

3. 0,2 % раствор нингидрина в 95 % спирте (1,0 г нингидрина, 2,5 г ацетата кадмия, 10 мл кислоты уксусной ледяной, растворяют в 500 мл спирта);

4. 5 % раствор фосфорно-молибденовой кислоты в спирте с последующим нагреванием при температуре 100-105С0 в сушильном шкафу в течение 5-10 минут. Количество растворителя учитывали в объемных частях. Все значения Rf обнаруженных соединений рассчитаны как средние из пяти измерений.

Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре «ГЕЛИОС (USU)» США, в кювете с толщиной слоя 10 мм. Спектр поглощения полученного раствора снимали в диапазоне длин волн 220-450 нм и 350-600 нм.

Исследование методом высокоэффективной жидкостной хроматографии осуществляли на приборе GILSTON (Франция) с металлической колонкой 7,8x300 мм REZEX ROA Organic Acids; 6,5x300 мм ALTECH OA-1000 Organic Acids; 4,6x250 мм Kromasil C18 размер частиц 5 микрон; с последующей компьютерной обработкой результатов анализа с помощью программы «Мультихром для Windows».

В качестве подвижной фазы использовали:

1. метанол-вода-фосфорная кислота концентрированная (400:600:5);

2. 0,005 М раствор серной кислоты;

3. 0,01 М раствор серной кислоты;

4. ацетонитрил-фосфорная кислота 0,1 М (20:80).

При разработке методик качественного и количественного определения БАВ использованы хроматографически чистые вещества и стандарты фирмы

Sigma, Fluka и отвечающие требованиям ФС - лютеолин, лютеолин-7-глюкозид, рутин.

Разработанные методики количественного определения суммы тритерпеновых сапонинов методом спектрофотометрии валидированы. Проведено экспериментально-обоснованное доказательство их пригодности для получения результатов, имеющих достаточную точность, прецизионность (воспроизводимость), линейность и специфичность в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002 и проектом ОФС «Валидация фармакопейных методов». Статистическая обработка результатов количественного определения проводилась в соответствии с требованиями ГФ XI изд.

1. Товароведческий анализ листьев каштана конского обыкновенного

На основании изучения морфологических характеристик сырья 11 опытных партий нами составлено описание внешних признаков листьев каштана конского обыкновенного.

При микроскопическом исследовании в цельном сырье при рассмотрении листа каштана конского обыкновенного с поверхности с верхней стороны видны толстостенные клетки эпидермиса с извилистыми стенками и складчатой кутикулой (рис. 1а), с нижней стороны - клетки эпидермиса с извилистыми стенками. Устьица овальные, окружены 3-5 околоустьичными клетками (аномоцитного типа) и расположены преимущественно на нижней стороне (рис. 16), на верхней стороне встречаются реже. По жилкам нижнего эпидермиса видны одиночные простые одноклеточные и 2-4-клеточные волоски с грубо-бородавчатой кутикулой (рис. 1в), также и у основания листа наблюдается скопление простых одноклеточных, 2-4-клеточных волосков с грубо-бородавчатой кутикулой. С верхней стороны листа аналогичные волоски попадаются крайне редко. В мезофилле встречаются друзы и иногда призматические кристаллы оксалата кальция, расположенные чаще всего вблизи жилок в виде цепочек (рис. 1г), а также клетки губчатой паренхимы с крупными межклетниками (аэренхима).

Микропрепараты порошкованного лекарственного сырья под микроскопом представляют собой смесь из обрывков эпидермиса листа с сильно извилистыми стенками (рис. 1д). Устьица овальные, окружены 3-5 околоустьичными клетками (аномоцитного тип). На некоторых фрагментах листа встречаются волоски, характерные для данного сырья: простые одноклеточные и многоклеточные с грубобородавчатой кутикулой (рис. 1е). В мезофилле фрагментов встречаются жилки с расположенными вдоль них цепочками друз оксалата кальция (рис. 1ж) и клетки губчатой паренхимы с крупными межклетниками (аэренхима) (рис. 1з). Анатомо-диагностические признаки листьев каштана конского обыкновенного легли в основу определения подлинности рассматриваемого вида лекарственного сырья.

Рисунок 1 - Микропрепараты из цельных и измельченных листьев а - толстостенные клетки эпидермиса с извилистыми стенками и складчатой кутикулой (ув. х400); б - клетки эпидермиса с извилистыми стенками и устьичный комплекс аномоцитного типа (ув. х200); в - простой одноклеточный грубобородавчатый волосок, (ув. *200); г - друзы и призматический кристалл оксалата кальция (ув. х200); д - толстостенные клетки эпидермиса листа с извилистыми стенками и складчатой кутикулой

(порошок) (ув. х200); е - простой одноклеточный грубобородавчатый волосок (порошок) (ув. х200); ж - друзы оксалата кальция (порошок) (ув. х400); з - клетки губчатой паренхимы с крупными межклетниками (порошок) (аэренхима) (ув. х200).

2. Изучение качественного состава биологически активных веществ в листьях каштана конского обыкновенного На основании данных литературы и предварительного фитохимического анализа нами установлено наличие следующих групп БАВ: флавоноидов, сапонинов, моно- и полисахаридов, фенольных соединений, свободных аминокислот, органических кислот, каротиноидов и фитостеринов.

Нами предложено с помощью качественных реакций и методов ТСХ и ВЭЖХ установить подлинность листьев каштана конского обыкновенного.

Методом ТСХ установлено наличие рутина ~ 0,43), лютеолин-7-глюкозида ~ 0,48); гиперозида ~ 0,57), галловой кислоты ~ 0,77), хлорогеновой кислоты ~ 0,90 ); кофейной кислоты = 0,94); кверцетине (Яг — 0,97) - подвижная фаза 1 (ПФ 1).

Проведено изучение БАВ методом ВЭЖХ в ПФ 1 и идентифицировано 18 веществ, доминирующими из них являются кемпферол, кверцетин, эпикатехин галлат, галловая кислота, хлорогеновая кислота, кофейная кислота, лютеолин-7-глюкозид, гиперозид (рис. 2).

Рисунок 2 - ВЭЖХ-хроматограмма извлечения из листьев каштана конского

обыкновенного на обнаружения фенольных соединений: 1 - танин; 2 - галловая кислота; 3 - ЭКГгалат; 4 - цикориевая кислота; 5 - хлорогеновая кислота; 6 - катехин; 7 - эскулетин; 8 - кофейная кислота; 9 - феруловая кислота; 10 - неохлорогеновая кислота; 11 - эпикатехин; 12 - лютеолин-7-гликозид; 13 - гиперозид.

Определение сапонинов проводили методом ТСХ на хроматограмме обнаружено не менее 8 зон: (Rf= 0,15) розовое; (Rf ~ 0,35) розовое; (Rf ~ 0,41) серое; (Rf ~ 0,52) серо-фиолетовое; (Rf ~ 0,57) розовое; (Rf « 0,65) серое -эсцин, расположенное на уровне зоны PCO эсцина; (Rf ~ 0,75) серое; (Rf ~ 0,85) серое - ПФ 2.

Для подтверждения полученных результатов проведен ВЭЖХ-анализ в ПФ 2 (рис. 3).

тУ

0 І,|,7 і-1—і І Г—і-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1

О 5 10 15 20 25 ЗО 35 4 0 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 тик

Рисунок 3 - ВЭЖХ-хроматограмма водного извлечения из листьев каштана конского обыкновенного на идентификацию 1 - эсцин.

Определение свободных Сахаров проводили методом ТСХ на

хроматограмме обнаружено 3 красно-фиолетовые зоны ~ 0,40) галактоза; (Я,-= 0,45) глюкоза; (Яг ~ 0,48) фруктоза - ПФ 3.

Присутствие свободных Сахаров подтверждено методом ВЭЖХ и идентифицированы: глюкоза, фруктоза в ПФ 3 (рис. 4).

Рисунок 4 - ВЭЖХ-хроматограмма Сахаров в водном извлечении из листьев каштана конского обыкновенного, идентифицированы :1 - глюкоза; 2 - фруктоза.

Методом ВЭЖХ в сырье идентифицированы органические кислоты: лимонная, винная, яблочная, аскорбиновая, щавелевая, молочная кислоты в ПФ 3 (рис. 5).

Рисунок 5 - ВЭЖХ-хроматограмма извлечения из листьев каштана конского

обыкновенного на идентификацию органических кислот: 1 - щавелевой кислоты; 2 - лимонной кислоты; 3 - винной кислоты; 4 - яблочной кислоты;

5 - аскорбиновой кислоты; 6 - молочной кислоты.

Исследование по составу свободных аминокислот проводят методом ТСХ с применением в качестве подвижной фазы 4, установлено наличие аргинина (Я{ ~ 0,06), аспарагиновой кислоты ~ 0,14); глицина = 0,17), серина ~ 0,18), глутаминовой кислоты (Яг а~ 0,26), треонина (Яг = 0,26), валина (И^ ~ 0,32), метионина ~ 0,36), триптофана ~ 0,47), фенилаланина (1^ ~ 0,64).

3. Количественное определение биологически активных веществ в сырье Для количественного определения использовали метод спектрофотометрии для следующих групп БАВ: суммы моносахаридов, полученных после гидролиза в пересчете на глюкозу, аминокислот в пересчете на глютаминовую кислоту, фенольных соединений в пересчете на галловую кислоту; определения эсцина проводили методом ВЭЖХ. Результаты исследований и данные статистической обработки приведены в таблице 1.

Таблица 1 - Результаты количественного определения БАВ в сырье

БАВ п Г Р% Х% 8 ДХ Е%

Полисахариды 5 4 95 2,78 2,89 0,0133 0,115 0,143 4,95

Аминокислоты 5 4 95 2,78 0,77 0,00055 0,023 0,0292 3,79

Фенольные соединения 5 4 95 2,78 2,40 0,00327 0,057 0,071 5,02

Эсцин 5 4 95 2,78 0,024 1*10(-6) 0,001 0,00124 4,87

Как следует из выше представленной таблицы, содержание аминокислот в сырье составляет - 0,77 %; полисахаридов - 2,89 %; фенольных соединений — 2,40 %, эсцина - 0,024 %.

4. Разработка методик количественного определения Разработка методик количественного определения флавоноидов в сырье

В ходе исследований нами подобраны оптимальные условия экстракции суммы флавоноидов такие как: тип экстрагента, температурный режим, степень измельченное™ и кратность экстракции.

Разработана методика определения суммы флавоноидов, основанная на способности образовывать окрашенный комплекс с раствором алюминия хлорида, который вызывает батохромный сдвиг в сторону интенсивных длин волн. В качестве стандартного образца выбран рутин, поскольку максимум его дифференциального спектра (415 нм) совпадает с максимумом поглощения испытуемого раствора (рис. 6).

Метрологические характеристики разработанной методики свидетельствуют об удовлетворительной воспроизводимости (табл. 2).

Таблица 2 - Метрологические характеристики методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин в листьях каштана конского обыкновенного

п Ї Р% 1(Р,0 Х% 8і 8 ДХ Х%

5 4 95 2,78 0,54 0,0004 0,02 0,0248 4,59

Для проверки отсутствия систематической ошибки методики были поставлены эксперименты с добавками рутина непосредственно в навеску сырья пред началом экстракции. Полученные результаты приведены в таблице 3.

Таблица 3 - Результаты опытов с добавками рутина в навеску сырья

Взято в Добавлено Должно Найдено, мг Ошибка

сырье, рутина, быть, Абсолютная, Относительная

мг мг мг мг %

0,85 0,1 0,95 0,94 -0,01 -1,06

0,85 0,2 1,05 1,04 -0,01 -0,96

0,85 0,3 1,15 1,14 +0,01 +0,87

Относительная ошибка методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин с 95 % вероятностью составляет ± 4,59 %. Результаты опытов с добавками свидетельствуют об отсутствии систематической ошибки в разработанной методике.

Scan Graph

№«у*1«пд№<п>п)

-СусйЛ!

Рисунок 6 - 1 - спектр поглощения комплекса раствора стандартного образца рутина с алюминия хлоридом; 2 - спектр поглощения комплекса исследуемого из листьев каштана конского обыкновенного с алюминия

хлоридом.

Разработка методики определения суммы тритерпеновых сапонинов

По данным литературы, одним из основных действующих веществ в листьях каштана конского обыкновенного являются тритерпеновые сапонины.

В ходе исследований нами подобраны оптимальные условия экстракции суммы тритерпеновых сапонинов.

Расчет содержания суммы тритерпеновых сапонинов осуществляли с использованием стандартного образца эсцина. В основе методики лежит измерение оптической плотности окрашенного комплекса, образующегося при взаимодействии тритерпеновых сапонинов с раствором железа (III) хлорида

При сравнении УФ-спектров спиртового раствора эсцина и извлечения из сырья каштана конского обыкновенного видно, что при длине волны 477 нм наблюдается интенсивный максимум поглощения (рис. 7). Эти данные позволяют использовать в качестве аналитической длины волны 477 нм и проводить количественное определение суммы тритерпеновых сапонинов в пересчете на эсцин.

Метрологические характеристики разработанной методики свидетельствуют об удовлетворительной ее воспроизводимости (табл. 4).

Таблица 4 - Метрологические характеристики методики количественного определения суммы тритерпенових сапонинов в пересчете на эсцин в листьях каштана конского обыкновенного

п f Р% t(P,f) Х% S* S ДХ Х%

5 4 95 2,78 4,24 0,0245 0,156 0,194 4,58

Для проверки отсутствия систематической ошибки методики были поставлены эксперименты с добавками эсцина непосредственно в навеску сырья пред началом экстракции. Полученные результаты приведены в таблице 5.

Таблица 5 - Результаты опытов с добавками эсцина в навеску сырья

Взято в сырье, мг Добавлено эсцина, мг Должно быть, мг Найдено, мг Ошибка

Абсолютная, мг Относительная, %

0,25 0,15 0,40 0,386 -0,014 -3,5

0,25 0,2 0,45 0,383 -0,017 -3,78

0,25 0,3 0,55 0,564 +0,014 +2,55

Относительная ошибка методики количественного определения суммы тритерпеновых сапонинов в пересчете на эсцин с 95 % вероятностью составляет ± 4,58 %. Результаты опытов с добавками свидетельствуют об отсутствии систематической ошибки в разработанной методике.

Scan Graph

440 450 475 500 525 550 575 600 625 640

Wavelength(nm)

........- СусїеОІ

Рисунок 7 — 1 - спектр поглощения комплекса СО эсцина с железа (III)

хлоридом и извлечения из сырья; 2 - спектр поглощения комплекса исследуемого из листе каштана конского обыкновенного с железа (III)

хлорида 16

5. Определение макро- и микроэлементного состава листьев каштагю конского обыкновенного Нами проведено определение минерального состава листьев каштана конского обыкновенного. Объектом исследования являлась зола, полученная по методике ГФ XII изд. вып. 1. Результаты проведенного эксперимента представлены в таблице 6.

Таблица 6 - Макро- и микро элементарный состав листьев каштана конского обыкновенного

Элемент Содержание, % Элемент Содержание, %

Бг 29.4 ± 0.9 V 0,467 ±0,015

Ш> 7.76 ± 0.29 Ьа 1,83 ±0,04

Вг 10,45 ±0,36 Ті 10,83 ±0,11

Бе 0.056 ± 0.006 Ва 46.44 ±0.11

ВІ 0,063 ± 0,006 8с 0.01

РЬ 1.34 ±0.06 Са 10416.64 ±339.8

Аб 0,21 ±0,01 ЭЪ 0,01

НЙ 0,027 ± 0,006 8п 0,11

гп 31.11 ± 1.17 С<1 0.35 ± 0.01

Си 2.52 ±0,06 Ае 0,087 ± 0.006

N1 0.753 ±0.021 Мо 2,99 ± 0,07

Со 0,063 ± 0,006 № 0,853 ±0,015

Мп 124,7 ±4,5 (120*1 Ъх 1.46 ±0,03

Бе 544,1 ± 18,6 (730*1 Съ 0,077 ± 0,006

Сг 0,91 ±0,03 ме 2300*

Преобладающими элементами в листьях каштана конского, являются: Са, Мй, Ре, 2п, Мп.

6. Изучение динамики накопления в сырье тритерпеновых сапонинов в зависимости от фазы вегетации растения.

При изучении динамики накопления тритерпеновых сапонинов в зависимости от фазы вегетации растения установлено, что наибольший уровень их в сырье отмечается в фазу плодоношения и увядания растения, поэтому заготовку сырья следует проводить осенью. В связи с этим норму показателя в нормативном документе на сырье предлагается установить не менее 4 % на основании данных анализа метода спектрофотометрией.

7. Разработка нормативной документации на сырье каштана конского

обыкновенного

На основании проведенных исследований оформлены и утверждены технические условия ТУ 9363-178-04868244-2013 на лекарственное сырье «Каштана конского обыкновенного листья». В данном НД установлены следующие показатели: содержание суммы тритерпеновых сапонинов в

пересчете на эсцин не менее 4 %; влажность не более 11 %; содержание золы общей не более 9 %; содержание золы, нерастворимой в 10 % растворе кислоты хлористоводородной, не более 2 %; потемневших и побуревших листьев, не более 5 %, частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 0,5 мм не более 10 %, содержание органической примеси не более 2 % и минеральной примеси не более 2 %.

Установлен срок годности сырья - 2 года в упаковке, предусмотренной в нормативной документации на сырье (ТУ).

8. Разработка способа получения экстракта сухого из листьев каштана конского обыкновенного

Экстракты сухие являются одним из наиболее рациональных способов переработки ЛРС, обеспечивающих максимальное извлечение действующих веществ и возможность создания стандартизованного фитопрепарата.

В связи с этим предложено получение экстракта сухого из листьев каштана конского обыкновенного как субстанции для создания готовых лекарственных форм.

Технологическая схема получения экстракта сухого из листьев каштана конского обыкновенного предусматривает стадии измельчения сырья, экстракции комплекса БАВ, упаривания полученного извлечения, сушки и измельчение экстракта (рис. 8).

Установлены оптимальные параметры экстракции: влияние экстрагента, температурного режима, соотношения массы сырья к объему экстрагента, времени и кратности экстракции на выхода БАВ.

Таким образом, экспериментально установлено, что оптимальными технологическими параметрами процесса являются проведение трехкратной экстракции сырья в течение 2 ч со степенью измельчения 2 мм в соотношении сырья и экстрагента 1:5 при использовании в качестве экстрагента 50 % спирта и нагревании (60±5) °С. Подобранные оптимальные параметры экстракции БАВ из сырья позволили разработать рациональную схему получения сухого экстракта. Анализ полупродуктов и готового продукта, а также отходов производства (шрота, осадка балластных веществ) осуществляли по сумме тритерпеновых сапонинов в пересчете на эсцин.

На основании данных оформлена и утверждена технологическая инструкция на получение экстракта сухого из листьев каштана конского обыкновенного.

Готовый продукт - экстракт сухой из листьев каштана конского обыкновенного представляет собой аморфный порошок от светло-коричневого до коричневого цвета со специфическим запахом. Для характеристики экстракта сухого из листьев каштана конского обыкновенного как технологической субстанции изучены его свойства: насыпная масса при свободном падении 0,48 г/см3, насыпная масса при уплотнении 0,76 г/см3, сыпучесть - 1,90 г/с. Угол естественного откоса 3537°. Гигроскопичен, комкуется.

Спирт этиловый

ТП. 2.1

ТП. 2.3

ТП. 2.4

ТП. 2.5

ТП. 2.6

Вода

ВР.1 Подготовка персонала к работе

і

ВР.2 Подготовка производственных помещении

1

1 ВР.З Подготовка оборудования

і

ВР.4 Получение воды очищенной

Приготовление 50 % спирта этилового и

ТП. 2 Получение

готового

ТП. экстракция измельченного продукта - сухого экстракта

2.2 сырья

Фильтрация экстракта

Концентрирование экстракта

Сушка очищенного экстракта

Измельчение сухого экстракта

ТП.1 Просмотр и

измельчение

растительного

сырья

Потери

В сборник на выброс

гЕ

Шрот

В сборник на выброс

Отгон спирта

Осадок балластных веществ

В сборник на выброс

УМОЗ Фасовка,

упаковка,

маркировка

сухого

экстракта

Потери

В сборник на выброс

Рисунок 8 - Технологическая схема производства экстракта сухого из листьев каштана конского обыкновенного

9. Изучение качественного состава биологически активных веществ

экстракта сухого В ходе исследования состава БАВ в экстракте сухом с применением качественных реакций, ТСХ и ВЭЖХ установлено наличие тритерпенових сапонов, флавоноидов, свободных аминокислот, свободных Сахаров, органических кислот, дубильных веществ.

Таким образом, изучение сухого экстракта показало, что состав БАВ экстракта близок составу исходного сырья.

10. Установление показателей подлинности и разработка методики

количественного определения в экстракте сухом Нами разработаны критерии подлинности экстракта сухого: качественная реакция на присутствие флавоноидов и сапонинов; ТСХ и ВЭЖХ для подтверждения эсцина и фенольных соединений. В ходе исследований разработаны методики количественного определения суммы тритерпеновых сапонинов в пересчёте на эсцин и суммы флаваноидов в пересчете на рутин методом спектрофотометрии.

Количественное определение суммы полисахаридов после гидролиза в пересчете на глюкозу, аминокислот в пересчете на глютаминовую кислоту, фенольных соединений в пересчете на галловую кислоту проводили с использованием метода спектрофотометрии; эсцин определяли методом ВЭЖХ. Результаты исследований и данные статистической обработки приведены в таблице 7.

Таблица 7 - Содержание биологически активных веществ в экстракте сухом

БАВ п і Р% 1(РД) Х% Б ДХ Е%

Флаваноиды 5 4 95 2,78 1,14 0,04 0,2 0,246 4,04

Полисахариды 5 4 95 2,78 4,4 1,96 1,4 1,72 3,59

Эсцин 5 4 95 2,78 0,11 8*10(-6) 0,0009 0,00174 4,01

Тритерпенове сапонины 5 4 95 2,78 19,2 1,21 1,1 1,343 4,45

Аминокислоты 5 4 95 2,78 0,47 0,0001 0,01 0,0124 2,64

Фенольные соединения 5 4 95 2,78 7,40 0,49 0,7 0,86 4,95

Как следует из выше представленной таблицы, содержание аминокислот в экстракте сухом составляет - 0,47 %, полисахаридов - 4,4 %, фенольных соединений - 7,40 %, эсцина - 0,11 %, флавоноидов - 1,14 %, тритерпеновых сапонинов - 19,2 %.

Установлен срок годности экстракта сухого - 2 года в упаковке, предусмотренной в нормативной документации на экстракт сухой из листьев каштана конского обыкновенного (проект ФС).

11. Разработка нормативной документации на экстракт сухой На основании проведенных экспериментов разработан и оформлен проект фармакопейной статьи (ФС) «Экстракт сухой из листьев каштана конского обыкновенного». ФС включает следующие разделы: описание, подлинность, потеря в массе при высушивании, тяжелые металлы, микробиологическая чистота, количественное определение суммы тритерпеновых сапонинов в пересчете на эсцин, упаковка, маркировка, хранение, срок годности.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Проведено фармакогностическое изучение листьев каштана конского обыкновенного. Установлены диагностически значимые признаки, числовые показатели, даны качественная и количественная характеристика действующих веществ в сырье.

2. С применением различных физико-химических методов анализа подтверждено наличие в листьях каштана конского обыкновенного тритерпеновых сапонинов, фенольных соединений, свободных Сахаров, органических кислот, свободных аминокислот, дубильных веществ, каротиноидов, микро- и макроэлементов.

3. Разработаны методики количественного определения в сырье: суммы тритерпеновых сапонинов в пересчете на эсцин; фенольных соединений в пересчете на галловую кислоту, флаваноидов в пересчете на рутин; полисахаридов после гидролиза в пересчете на глюкозу методом спектрофотометрии, методом ВЭЖХ определен эсцин. Относительная ошибка методик определения не превышает ± 5,0 %.

4. Определены основные параметры экстракции БАВ из растительного сырья, позволяющие получить готовый продукт со стабильными показателями качества, на основании чего разработана рациональная схема получения экстракта сухого.

5. С использованием качественных реакций, ТСХ, ВЭЖХ и спектрофотометрии установлено наличие основных групп БАВ в экстракте сухом, присущих исходному сырью.

6. Определены критерии подлинности экстракта сухого из листьев каштана конского обыкновенного; разработаны методики количественного определения суммы тритерпеновых сапонинов в пересчете на эсцин методом спектрофотометрии, оформлены протоколы валидации методик анализа.

7. В результате проведенных исследований разработаны и оформлены технические условия 9363-178-04868244-2013 «Каштана конского обыкновенного листья», составлен проект ФС «Экстракт сухой из листьев каштана конского обыкновенного», оформлена и утверждена технологическая инструкция на получение экстракта сухого из листьев каштана конского обыкновенного.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Постоюк H.A., Маркарян A.A., Даргаева Т.Д. ВЭЖХ-Анализ листа каштана конского обыкновенного // «Традиционная медицина» 2011. - №5. -С.261-265.

2. Постоюк H.A., Маркарян A.A., Даргаева Т.Д., Сокольская Т.А. Методика количественного определения суммы флавоноидов в листе каштана конского обыкновенного (aesculus hippocastanum L.) // «Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии» 2012. - №1. - С. 135-138.

3. Постоюк H.A., Маркарян A.A., Даргаева Т.Д., Сокольская Т.А., Джавахян М.А. Анатомо-диагностические признаки листьев каштана конского обыкновенного (aesculus hippocastanum L.) // «Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии» 2012. - №2. - С. 19-22.

4. Шемерянкина Т.Б., Жарова О.Г., Сокольская Т.А., Даргаева Т.Д., Постоюк H.A. Совершенствование методов контроля и критериев стандартизации качества семян и сухого очищенного экстракта из семян конского каштана обыкновенного (Aesculus hippocastanum L.) // Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии» 2012. -№3. - С. 3 -11.

5. Постоюк H.A., Маркарян A.A., Даргаева Т.Д., Сокольская Т.А. Изучение стадии экстрагирования при получении сухого экстракта каштана конского // «Фармация» 2012. - №4. - С.32-33.

6. Постоюк H.A., Маркарян A.A., Шемерянкина Т.Б., Даргаева Т.Д., Сокольская Т.А. Определение суммы тритерпеновых сапонинов в листьях каштана конского обыкновенного «Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии» 2013. - №5. — С. 42.

7. Postoyuk N.A., Markaryan A.A., Dargaeva T.D. Study of Biologically Active Substances of Dry Extract from the Leaves of Ordinary Horse Chestnut with High-Performance Liquid Chromatography «Global Journal of Pharmacology» 2013. -№3

8. Постоюк H.A., Маркарян A.A. Листья каштана конского обыкновенного как перспективный источник лекарственного растительного сырья // Матер. XVIII Росс. нац. конгресс «Человек и лекарство». - М., 2011. -С.628.

9. Постоюк H.A., Маркарян A.A., Даргаева Т.Д., Сокольская Т.А. Исследование дубильных веществ в листе каштана конского обыкновенного // Матер. XIX Росс. нац. конгресс «Человек и лекарство» - М., - 2012. - С. 416

10. Постоюк H.A., Маркарян A.A., Даргаева Т.Д., Сокольская Т.А. Изучение свободных Сахаров в листе каштана конского обыкновенного // Матер. XIX Росс. нац. конгресс «Человек и лекарство» - М., - 2012. - С. 416

11. Постоюк H.A., Маркарян A.A., Даргаева Т.Д., Сокольская Т.А. Исследование состава органических кислот листьев каштана конского обыкновенного // «Гомеопатический ежегодник» - М., - 2012. - С. 225

12. Постоюк H.A., Маркарян A.A., Даргаева Т.Д., Сокольская Т.А. Оценка содержания эсцина в листьях каштана конского обыкновенного // «Гомеопатический ежегодник» - М., - 2012. - С. 225

13. Постоюк H.A., Маркарян A.A. Изучение фенольных соединений листа каштана конского обыкновенного методом тонкослойной хроматографии // Мат. научно-практической конференции «Актуальные научные вопросы: реальность и перспективы» - Тамбов, - 2012. Часть 6. - С. 114-115

14. Постоюк H.A., Маркарян A.A., Даргаева Т.Д., Сокольская Т.А. Изучение аминокислот листа каштана конского обыкновенного методом тонкослойной хроматографии // Материалы II Международной научно-практической конференции «Современная медицина и фармацевтика: анализ и перспективы развития» - М., - 2012. - С. 141-143

15. Постоюк H.A., Маркарян A.A., Даргаева Т.Д., Сокольская Т.А. Методика количественного определения суммы аминокислот в листе каштана конского обыкновенного // Материалы международной заочной научной конференции «Новые задачи современной медицины» - Пермь, -

2012.-С.139-141

16. Постоюк H.A., Маркарян A.A. Информационно-аналитический обзор использования листьев каштана конского обыкновенного в медицинской практике // Материалы Первой Всероссийской научной конференции молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине XXI века» - М., - 2012. - С. 186-187

17. Постоюк H.A., Маркарян A.A. Каштан конский обыкновенный как источник биологически активных веществ // Материалы Первой Всероссийской научной конференции молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине XXI века» - М., - 2012. - С.187-189

18. Постоюк H.A., Маркарян A.A., Шемерянкина Т.Б., Даргаева Т.Д., Сокольская Т.А. Определение суммы тритерпеновых сапонинов в листьях каштана конского обыкновенного // Сборник материалов первой научно-практической конференции «Молодые ученые и фармация XXI века» - М.,

2013.-С. 144-147