Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Фармакогностическое изучение лофанта анисового (Agastache foeniculum (Pursh.) O. Kuntze) сем. Яснотковые (Lamiaceae)

На правах рукописи

005538722 ^

%

ЧУМАКОВА ВЕРОНИКА ВАЛЕРЬЕВНА

фармакогиостическое изучение лофанта анисового (асавтасне роемситим (ріжбн.) о. kuntze) сем. -яснотковые (ьаміасеае)

14 ,04 .02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата фармацевтических наук

Пятигорск - 2013

21 НОЯ 2013

005538722

Работа выполнена в Пятигорском медико-фармацевтическом институте - филиале государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Попова Ольга Ивановна, доктор фармацевтических наук, профессор

Оганесян Эдуард Тоникович. доктор фармацевтических наук, профессор, Пятигорский медико-фармацевтический институт - филиал ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России, заведующий кафедрой органической химии •

Бубенчиков Роман Александрович, доктор фармацевтических наук, ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет» Минздрава России, ассистент кафедры фармакогнозии и ботаники

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Минздрава России

Защита состоится «11» декабря 2013 года в Ю00 часов на заседании Диссертационного совета Д 208.008.09 при ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России (357532, Пятигорск, пр. Калинина, И).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ПМФИ - филиала ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России (357532, Ставропольский край, г. ГЪгшгопск. пр. Калинина, 11). .

Автореферат разослан « /0» ноября 2013 года.

Учёный секретарь диссертационного совета

Ремезова Ирина Петровна

ОБЩЕЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Актуальность темы. Одним из важнейших приоритетов развития фармацевтической промышленности Российской Федерации является создание новых отечественных лекарственных препаратов, в том числе на основе веществ природного происхождения. В связи с этим возникает потребность в расширении сырьевой базы за счет поиска новых источников растительного сырья. Однако, использование дикорастущих видов лекарственного растительного сырья (JIPC) в будущем может быть существенно ограничено в связи с проблемой снижения биоразнообразия. Поэтому введение лекарственных растений в культуру может рассматриваться и как способ их сохранения в природе, и как возможность создания стабильной сырьевой базы для получения фитопрепаратов. Интродукционные исследования особенно актуальны для растений иноземной флоры в благоприятных почвенно-климатических условиях юга России. При этом возможно получение и качественного JIPC и необходимого количества семенного материала.

Одним из перспективных лекарственных растений является лофант анисовый (Agastache foeniculum (Pursh.) О. Kuntze) семейства яснотковые, который успешно возделывается в условиях юга России в качестве пряно-овощной, медоносной культуры. ■

Растения рода Agastache (A.rugosa, A. mexicana, A. foeniculum) широко используются в народной медицине Восточной Азии, Северной Америки для повышения иммунитета, восстановления сил после нервных расстройств, при воспалительных заболеваниях и спазмах желудочно-кишечного тракта. Но особенно популярны извлечения из травы лофанта анисового при выпадении волос, гнездовой плешивости, облысении.

Степень разработанности исследования

Рядом научных исследований ученых Украины и Белоруссии доказана высокая антиоксидантная активность извлечений из травы лофанта анисового, фунгицидная активность эфирного масла. В литературе имеются сведения о четырех хемотипах лофанта анисового на основании изучения компонентного состава

эфирного масла. Трава лофанта анисового входит в состав БАД "Сироп гибискуса с шиповником и лофантом", а также в чайный напиток «Лофантовый».

Несмотря на многогранность терапевтического действия и широкое применение в народной медицине лофант анисовый продолжает оставаться малоизученным. До настоящего" времени на траву лофанта анисового отсутствует нормативный документ, регламентирующий ее подлинность и качество.

Поэтому, фармакогностическое изучение лофанта анисового, широко используемого в народной медицине ряда стран, обоснование его применения в медицине и фармации России в качестве лекарственного растительного сырья и получения фитопрепаратов является весьма актуальным. Цель и задачи исследования

Цель работы заключается в фармакогностическом исследовании лофанта анисового, интродуцированного в условиях Ставропольского края, разработке методик его стандартизации и проведении фармакологического скрининга для обоснования возможности использования надземной части растения в качестве лекарственного растительного сырья.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

> провести фотохимический анализ надземной части лофанта анисового для выявления основных групп биологически активных соединений (БАС);

> выявить основные морфолого-анатомические диагностические признаки и установить числовые показатели качества для проведения стандартизации сырья ' травы лофанта анисового;

> провести фармакологический скрининг извлечений из травы лофанта анисового;

> дать оценку интродукционной способности лофанта анисового в условиях Ставропольского края;

> разработать на данный вид сырья проекты нормативных документов (ФСП) и инструкцию по его сбору и сушке.

Научная новизна

Проведены фотохимические исследования травы лофанта анисового, интродуцированного в условиях Ставропольского края, что позволило установить

наличие и определить количественное содержание эфирного масла, флавоноидов, фенолокислот, полисахаридов, органических кислот, дубильных веществ, тритерпеновых соединений.

Впервые подобраны оптимальные условия для количественного определения эфирного масла и фенольных соединений, изучена динамика накопления эфирного масла, галловой кислоты по фазам вегетации и органам растения, что позволило определить оптимальные сроки заготовки сырья.

Методом газожидкостной хроматографии-масс-спектрометрии установлен компонентный состав эфирного масла, выявлены основные компоненты (ментон, пулегон), что послужило обоснованием для стандартизации и выделения нового сорта лофанта анисового, созданного в условиях Ставропольского края, в отдельный хемотип (ментоно-пулегоновый).

Для стандартизации сырья разработаны методики, подобраны оптимальные условия для качественного и количественного определения галловой кислоты, позволяющие подтвердить подлинность сырья травы лофанта анисового.

Методом ВЭЖХ идентифицировано 21 соединение фенольной природы: танин, эпикатехин, эпигаллокатехин галлат (ЭГКГ), дигидрокверцетин, апигенин, лютеолин, гесперидин, кверцетин, рутин, кемпферол, о-метоксикумарин, генистеин, умбеллиферон; фенолкарбоновые кислоты: галловая, хлорогеновая, кофейная, феруловая, неохлорогеновая, коричная, п-кумаровая, цикориевая.

I

Методом спектрофотометрического анализа определено содержание флавоноидов и тритерпеновых кислот.

Впервые изучен состав аминокислот, определен набор макро- и микроэлементов, выделено и гравиметрически установлено количественное содержание 4 фракций полисахаридов (водорастворимые полисахариды, пектиновые вещества, гемицеллюлоза А и Б).

Совместно со Ставропольским НИИСХ создан новый сорт лофанта анисового Премьер, что подтверждено авторским свидетельством № 54922, зарегистрированным 12.07.2011 г. в Государственном реестре охраняемых селекционных достижений (по заявке № 8953635 с датой приоритета 10.11.2010 г.).

Выявлена возможность рентабельного культивирования нового сорта лофанта анисового и гарантированного получения качественного растительного сырья с высоким содержанием ценных БАС в почвенно-климатических условиях юга России.

Установлено отсутствие Острого токсического действия извлечений травы лофанта анисового. Доказана антимикробная активность эфирного масла, антиоксидантное и пилотропное действия водных и водно-спиртовых извлечений травы лофанта анисового.

Теоретическая и практическая значимости результатов исследования

Теоретическая значимость. Сорт лофанта анисового Премьер выделен в новый хемотип - ментоно-пулегоновый.

Установленный комплекс БАС лофанта анисового свидетельствуют о перспективности проведения дальнейших фармакологических исследований с целью создания эффективных лекарственных препаратов.

Практическая значимость. На основании проведенных исследований, с учетом современных требований, предъявляемых к определению подлинности и качества лекарственного растительного сырья, проведена стандартизация травы лофанта анисового. Разработаны оптимальные методики для качественного и количественного определения эфирного масла и галловой кислоты. Определены оптимальные сроки заготовки сырья. Разработаны проект ФСП «Лофанта анисового трава», апробированный в ООО НПО «Альпика», г. Ставрополь, инструкция по сбору и сушке сырья, апробированная ГНУ Ставропольским НИИ сельского хозяйства Россельхозакадемии и ГНУ «Северо-Кавказского научно-исследовательского института горного и предгорного сельского хозяйства», г. Владикавказ.

Методология и методы исследования

Методологической основой выполненного исследования является выбор объекта исследования на основе принципа филогенетического родства и системный подход к проведению фитохимического анализа и стандартизации нового вида растительного сырья - травы лофанта анисового. В процессе фармакогностического

б

исследования использованы макроскопический, микроскопический, фитохимический, товароведческий и полевой методы анализа, физико-химические и статистические методы анализа. Для выявления фармакологической активности использованы биологические методы анализа.

Основные положения, выносимые на защиту:

> результаты фитохимического изучения БАС травы лофанта анисового;

> методики анализа, показатели и нормы качества сырья лофанта анисового;

> результаты морфолого-анатомического и товароведческого анализа травы лофанта анисового;

> интродукционные исследования лофанта анисового в Ставропольском крае;

> результаты фармакологического скрининга эфирного масла и водно-спиртовых извлечений из травы лофанта анисового.

Степень достоверности и апробация результатов

Полученные результаты диссертационных исследований статистически обработаны. Разработанные методики количественного определения валидированы.

Основные положения работы доложены на 65-67 межрегиональных конференциях по фармации и фармакологии «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (г.Пятигорск, 2009-2011 гг.), межрегиональной конференции «Актуальные проблемы фармацевтической науки и практики» (г. Владикавказ, 2009 г.), научно-методической конференции «Гаммермановские чтения - 2011» (г. Санкт-Петербург, 2011 г.). Научная работа признана победителем межрегионального научно-инновационного конкурса молодых ученых «У.М.Н.И.К.» (г. Ставрополь, 2007 г.), удостоена диплома межрегионального научно-инновационного конкурса «Золотой век инноваций» (г.Ставрополь, 2010г.). По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 6 в журналах, рекомендуемых ВАК.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объект и методы исследования

Объект исследования - трава лофанта анисового (цветоносная верхняя олиственная часть стебля), собранная в фазу массового цветения в условиях

Ставропольского края. Динамику накопления основных групп БАС травы лофанта анисового изучали на образцах, собранных с апреля по сентябрь в 2006-2011гг. в различные фенологические фазы: стеблевания, бутонизации, цветения, плодоношения. При определении норм качества сырья использовали образцы, заготовленные в условиях Северо-Кавказского Федерального Округа (СКФО -Ставропольский край и Кабардино-Балкарская республика) и Южного Федерального Округа (ЮФО - Краснодарский край).

Все образцы сырья хранились в соответствии с требованиями ГОСТ 17768-90 [23] в условиях лаборатории кафедры фармакогнозии.

Для получения извлечений, содержащих различные группы БАС, использовали воду очищенную (ФС 42-2619-97), спирт этиловый в различных концентрациях (ГОСТ 18300-82), хлороформ (ГОСТ 20015-88).

В ходе исследования травы лофанта анисового были использованы химические и физико-химические методы анализа: весо-объемный, титриметрия, гравиметрия, УФ-спектрофотометрия, хроматография (бумажная, тонкослойная, ВЭЖХ, ГЖХ-МС, планарная, с денситометрическим детектированием).

Фитохимическое исследование травы лофанта анисового

Определение эфирного масла в сырье проводили методом перегонки с водяным паром по ГФ XI. Процесс интенсивности отгонки эфирного масла из сырья лофанта анисового (1:20) при использовании прибора Гинзберга достаточно высок в первые 30 минут диффузии и заканчивается через 2 часа. Таким образом, отгонку эфирного масла из сырья лофанта анисового следует проводить не более 2 часов.

Для идентификации компонентов эфирного масла в сырье использовали метод ТСХ на пластинках «БогЬШ ПТСХ-АФ-А-УФ» в системе толуол-этилацетат (19:1).

Изучение динамики накопления эфирного масла проводилось в различные фазы вегетации: стеблевания, бутонизации, массового цветения и плодоношения. Установлено, что в фазу бутонизации содержание масла в траве лофанта анисового составляет 1,23%, что почти в 2 раза меньше, чем в фазу массового цветения. В фазу массового цветения растения накапливают максимальное количество эфирного масла (2,38%). В фазу плодоношения, количество эфирного масла уменьшается до

1,70%. В период с 2008 до 2011 г.г. была исследована динамика накопления эфирного масла по органам растения в фазу массового цветения (таблица 1).

Экспериментальные исследования динамики накопления эфирного масла в лофанте анисовом позволили установить закономерность увеличения количества масла с возрастом растения, причем наибольшим уровнем его содержания характеризуются соцветия (до 3,18-3,20%) (таблица 1).

Таблица 1 - Динамика накопления эфирного масла в вегетативных органах и образцах сырья лофанта анисового в зависимости от возраста растений (2-5 гг. жизни)

Год Массовая доля эфирного масла, в % от абсолютно сухого сырья

Соцветия Листья Стебли Незрелые плоды Трава

2008 3,00-3,03 1,32-1,34 0,20-0,21 0,50-0,52 2,15-2,18

2009 3,13-3,16 1,34-1,38 0,20-0,22 0,49-0,50 2,18-2,25

2010 3,17-3,18 1,35-1,38 0,21-0,23 0,51-0,53 2,20-2,27

2011 3,18-3,20 1,37-1,42 0,22-0,23 0,51-0,52 2,25-2,30

Изучено влияние сушки на количественное содержание и компонентный состав эфирного масла в траве лофанта анисового. Установлено, что содержание эфирного масла под влиянием сушки уменьшается. В свежесобранном сырье лофанта анисового оно составляет 2,65 ±0,28%, а в высушенном - 2,21 ±0,14%.

Детальное' изучение компонентного состава эфирного масла лофанта анисового проведено на газовом хроматографе — масс-спектрометре (ГХ-МС) АТ5973 SMART фирмы Agillent Technologies (США) (рисунок 1).

По результатам исследований в эфирном масле лофанта анисового идентифицировано 22 компонента: винилкарбинол, декан, 2,6-диметил-1,3,5,7-октатетраен, лимонен, линалоол, октенол-ацетат, п-2,8-ментадиенол, п-2,8-ментадиенол, изоментон, ментон, изопулегон, n-аллиланизол (эстрагон), 2Н-инденон, пулегон, пиперитон, 2-гидрокси-пиперитон, минт-фуранон, диметилнафталин декагидро, бензин 1,2-диметокси-4-(2-пропенил), спатуленол, кариофиллен оксид. Основными являются - пулегон и ментон, содержание которых

в образце из свежего сырья составляет 42,54% и 19,90%, а из сухого - 26,60% и 41,69% соответственно.

ту

3000000 2600000 2200000 1800000 »00000 1000000 «00000 гаоооо

.«Л И

II

Іиіл!^,

• оо іо.ов іго» ы.оо 16.00 18 00 їиЬ» г?ос

їді

2ЄСОО0О 2200000 ігооооо нооооо

1СЮОСОО ЄООООО 2ЭОООО

■ ■ Л 1.

Уш

Лш

8 00 МЛО ІбТоО 18.00 20.00 22.00 ¿«.«а

2

Рисунок 1 - Хроматограммы образцов масла из свежесобранного (1) и высушенного (2) сырья лофанта анисового

Результаты исследований показали, что изменение соотношения содержания пулегона и изоментона в эфирном масле лофанта анисового характеризуется по типу «ножниц», т.е. увеличение содержания одного компонента ведет к уменьшению содержания другого.

В научной литературе выделено четыре хемотипа, в которых основными являются компоненты: (метилхавикол (80%); пулегон (40%) и изоментон (29%); изоментон (45%) и пулегон (23%); изоментон (46%) и лимонен (23%).

Учитывая тот факт, что ментон и пулегон - преобладающие компоненты и определение подлинности эфирного масла лофанта анисового планируется рекомендовать по вышеупомянутым компонентам, то целесообразно выделить лофант анисовый сорт Премьер в новый хемотип «ментоно-пулегоновый».

ю

Предварительно фенольный состав изучен с помощью восходящей бумажной хроматографии в различных системах растворителей. Выявлено наличие лютеолина, рутина, кверцетина; кислот: ферулловой, кофейной, галловой, хлорогеновой.

Более детально состав фенольных соединений изучен с помощью ВЭЖХ с использованием нескольких хроматографических приборов «Стайер» (Аквилон, Россия-США-Чехия) и «СІЬЗТОК», модель 305 (Франция), отличающихся условиями хроматографирования. Наибольшее количество веществ идентифицировано с использованием хроматографа «вИ^ТСЖ», модель 305 (Франция), с детектированием при длине волны 254 нм (рисунок 2).

Идентифицировано 21 соединение: танин, эпикатехин, эпигаллокатехин галлат (ЭГКХ), дигидрокверцетин, апигенин, лютеолин, гесперидин, кверцетин, рутин, кемпферол, о-метоксикумарин, генистеин, умбеллиферон; фенолкарбоновые кислоты: галловая, хлорогеновая, кофейная, феруловая, неохлорогеновая, коричная, п-кумаровая, цикориевая.

Рисунок 2- Хроматограмма фенольных соединений травы лофанта анисового (А.=254 нм)

Количественное определение суммы флавоноидов в траве лофанта анисового проведено методом дифференциальной УФ-спектрофотометрии. При выборе вещества стандарта руководствовались тем, что спектральные характеристики продуктов реакции суммы флавоноидов с комштексообразующим реактивом совпадали с максимумом поглощения продуктов реакции стандартного образца лютеолина с тем же реактивом. Максимум светопоглощения комплексов флавоноидов спиртового извлечения из травы лофанта анисового и лютеолина с алюминия хлоридом находился при длине волны 393±3 нм. Расчет содержания суммы флавоноидов проводили по удельному показателю поглощения комплекса лютеолина. Сумма флавоноидов в траве лофанта анисового в пересчете на лютеолин составила 2,06±0,04%.

Для количественного определения дубильных веществ в траве лофанта использован классический метод перманганатометрического титрования, включенный в Государственную фармакопею XI и комплексонометрический метод. Экспериментальные исследования показали, что содержание дубильных веществ в траве лофанта анисового находится в интервале 6,93 - 8,30% независимо от метода определения.

Содержание дубильных веществ в вегетативных органах растения представлено в таблице 2.

Таблица 2 - Содержание дубильных веществ в вегетативных органах и образцах сырья лофанта анисового с учетом возраста растений

Время заготовки сырья Содержание дубильных веществ, %

Соцветия Листья Стебли Трава

2007 1,27-1,30 7,30-7,60 9,82-12,11 6,14-7,75

2008 1,28-1,35 7,42-7,58 9,94-12,30 6,80-7,28

2009 1,25-1,29 6,98-7,48 9,45-11,74 7,48-7,82

2010 1,25-1,30 7,20-7,55 9,80-12,33 7,64-7,82

Проведенные исследования позволили установить, что наиболее высоким содержанием дубильных веществ отличаются стебли лофанта анисового. При этом содержание дубильных веществ с возрастом растения изменяется несущественно.

Учитывая значимость полифенольных соединений в проявлении многих видов фармакологической активности проведено исследование по определению галловой кислоты в траве лофанта анисового методом планарной хроматографии (ТСХ) с последующей денситометрической обработкой.

При разработке методики идентификации и! количественного определения галловой кислоты полученное спиртовое извлечение из травы лофанта анисового микрошприцем наносили на пластинки марки «БогЬШ ПТСХ-АФ-А-УФ». В качестве подвижной фазы использовали подобранную нами систему п-бутанол -кислота уксусная ледяная - вода (4:1:1). Высота подъема фронта, достаточная для полного разделения - 12 см. В качестве стандарта использовали раствор стандартного образца кислоты галловой. Детектирование проводили 1% водным раствором железоаммониевых квасцов. ЯГ = 0,90±0,04.

На оцифрованной хроматограмме (рисунок 3) галловой кислоте соответствует пик №4. На рисунке 4 представлена оцифрованная хроматограмма СО галловой кислоты. Разработанная методика определения галловой кислоты методом планарной хроматографии (ТСХ) специфична, имеет достаточно высокую чувствительность и эффективность.

т;:

0,0 0,1

0,5 0,7 0,9 Иг

Рисунок 3 - Хроматограмма извлечения лофанта анисового (пик№4)

0,0 0,1 0,3 0,5 0,7 0,9 Ш

Рисунок 4 - Хроматограмма СО травы галловой кислоты (пик №1)

Для дальнейшего количественного определения галловой кислоты пластинки сканировали с помощью планшетного сканера.

Для цифровой обработки хроматограмм использовали компьютерную программу «Видеоденситометр БогМИ». Количественное определение галловой кислоты проводилось методом абсолютной калибровки (внешнего стандарта) с использованием градуировочной функции в координатах площадь пятна (Б) - масса (т) (линейная аппроксимация).

Таблица 3 - Содержание галловой кислоты в траве лофанта анисового по фазам вегетации

Номер определения Количество галловой кислоты в траве лофанта по фазам вегетации, %

Фаза стеблевания Фаза цветения Фаза плодоношения

1 0,68 2,20 0,42

2 0,65 2,22 0,50

л 0,69 2,44 0,45

4 0,68 2,15 0,47

5 0,62 2,30 0,58

6 0,66 2,50 0,48

Метрологические характеристики Хер =0,66 ■5= 0,011 Б, = 0,026 ДХ =0,03 є = ±4,08% Хср = 2,30 5= 0,057 5Х = 0,140 ДХ = 0,15 £ = ±6,40% Хср = 0,48 0,055 5Х= 0,022 ДХ = 0,05 £ = ±11,86%

Таким образом, денситометрическим методом изучена динамика накопления галловой кислоты по фазам вегетации. Установлено, что наибольшее количество галловой кислоты, накапливается в фазу цветения (2,30±0,!5%).

Учитывая этот факт, исследование по изучению динамики накопления галловой кислоты по органам растения проведено в фазу цветения. Наибольшее количество галловой кислоты концентрируется в листьях растения (1,98%), что вдвое превышает ее концентрацию в стеблях (1,02%) и цветках (0,71%).

Проведенные исследования позволили определить содержание галловой кислоты в надземной части лофанта анисового, рекомендовав оптимальный срок сбора растения - фазу массового цветения (что совпадает с наибольшим выходом эфирного масла).

Проведена валидационная оценка денситометрического метода количественного определения галловой кислоты по таким показателям как линейность (коэффициеут корреляции г= 0,990), правильность и воспроизводимость (таблица 3).

В хлороформном и спиртовом извлечениях травы лофанта анисового методом тонкослойной хроматографии идентифицированы урсоловая и олеаноловая кислоты. С использованием метода прямой спектрофотометрии установлено, что сумма тритерпеновых кислот (в пересчете на урсоловую кислоту) в траве лофанта анисового составляет 5,09±0,09%.

Количественное определение кислот аскорбиновой и свободных органических проведено по методике ГФ XI. Содержание свободных органических кислот в траве лофанта анисового 0,77±0,01%, аскорбиновой кислоты 0,11±0,08%.

Из травы лофанта анисового были выделены и охарактеризованы фракции полисахаридов, по методике предложенной Н.К. Кочетковым и М.Бтпег. Установлено, что сырье содержит ВРПС 7,50-8,22%, пектиновых веществ - 3,973,99%, гемицеллюлозы А - 11,20-14,00%, гемицеллюлозы Б - 7,98-7,99%.

Определение макро- и микроэлементного состава проводили в лаборатории спектрального анализа ЦИЛ ФГУП «Кавказгеолсъемка» методом испарения на приборе ДФС-8-1. В золе лофанта анисового обнаружено 20 элементов. В значительных количествах накапливаются макроэлементы - кальций (20%), калий (20%), фосфор (3%), магний (3%), натрий (0,8%), микроэлементы - кремний (2%), алюминий (1%), железо (0,3%). По степени значимости для организма человека обнаруженные макроэлементы (Са, К, Р, М& Ыа) и некоторые микроэлементы (Сг, Си, Ре, Мо, Ре, Тп) являются жизненно необходимыми, т.е. эссенциальными.

Установлено, что содержание тяжелых металлов в траве лофанта анисового ниже предела обнаружения и соответствует требованиям допустимого содержания тяжелых металлов, регламентированным СанПин 2.3.2.1078-01, что позволяет сделать вывод о безопасности данного вида сырья с точки зрения содержания токсичных элементов.

В траве лофанта анисового обнаружено 15 аминокислот, из которых 7 относятся к незаменимым аминокислотам: треонин, валин, метеонин, изолейцин, лейцин, фенилаланин, лизин. Преобладающие аминокислоты: глютаминовая кислота, глицин, аланин.

Интродукция лофанта анисового в Ставропольском крае Интродукционные исследования проводились 'на базе экспериментального участка лаборатории лекарственных растений Ставропольского НИИ сельского хозяйства Россельхозакадемии и ботанического сада Пятигорского медико-фармацевтического института — филиала ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава.

По итогам интродукционных исследований выявлено, что лофант анисовый (А§а51асЬе Яэешси1ит (РигеИ) О. Кш^ге) может успешно произрастать в условиях Ставропольского края и обладает рядом полезных свойств: высокой урожайностью (свежесобранного сырья - 3,20-3,80 кг/м2, сухого - 0,80-0,95 кг/ м2, семян 0,030-0,045 кг/ м2), продолжительным периодом цветения (до 60 дней), высотой (до 165 см), высокой кустистостью, облиственностью, декоративностью.

В условиях Ставропольского края лофант анисовый может размножаться семенами, делением куста, черенками, отводками и рассадой. Установлено, что вне зависимости от способов размножения (семена, деление куста, черенки, отводки и рассада) и времени сбора (укоса) сырья количественное содержание и качественный состав эфирного масла лофанта анисового практически не меняется. Более высоким содержанием эфирного масла характеризуются образцы сырья, выращенные методом черенкования и семенным размножением. При этом максимальное количество эфирного масла получено в сырье с первого укоса.

Разработка показателей и норм качества сырья лофанта анисового Установлен комплекс морфолого-анатомических признаков. Внешние признаки: смесь листьев, стеблей, цветков, незрелых плодов. Край листовой пластины редкозубчатый. Цвет стеблей светло-зеленый, листьев - зеленый, чашечки - светло-зеленый, венчиков - сине-фиолётовый.

Микроскопические признаки: лист амфистоматический. Устьица погруженные, диацитного типа (окружены двумя клетками), форма чечевичная,

расположены часто. Стенки клеток нижнего эпидермиса более извилистые. Эфиромасличные железки большого размера, с восьмью выделительными клетками, особенно густо расположены на нижней стороне листа (рисунок 5). Трихомы представлены тремя типами, встречающиеся на обеих сторонах листа. Простые волоски остроконусовидные, слегка наклоненные к поверхности листа. Головчатые волоски на короткой одноклеточной ножке с шаровидной головкой, содержит секрет желтого цвета. Коленчатосогнутые волоски 3-7 клеточные с бородавчатой поверхностью. У основания волоска образуется розетка из 8 клеток эпидермиса (рисунок 6). Край листовой пластины равномерно опушен, тремя видами волосков (рисункок 7).

На основании проведенных исследований нормирование качества травы лофанта анисового предложено проводить по показателям содержания БАС эфирного масла, галловой кислоты и экстрактивных веществ. Анализ проводили в образцах сырья, заготовленных в условиях СКФО (Ставропольский край - образцы 1,2 и Кабардино-Балкарская республика - образец 5) и ЮФО (Краснодарский край -образцы 3,4) (таблица 4).

(1 - восьмиклеточная розетка у основания трихомы 2 - клетки эпидермиса, 3- устьица диацитного типа, 4-эфиромасличная железка, 5 - головчатый волосок, 6 - простой многоклеточный волосок)

Рисунок 5 - Фрагменты верхнего и нижнего (слева направо) эпидермиса листа лофанта анисового

Ї г,-. •

(1 - коленчатосогнутый, 2 - головчатый, 3 - простой) Рисунок 6 - Трихомы лофанта анисового

і

(три типа трихом: головчатый, простые, коленчатосогнутый) Рисунок 7 - Край листовой пластины

Таблица 4 - Результаты количественного определения БАС в траве лофанта анисового, заготовленной в условиях СКФО (Ставропольский край и Кабардино-

Балкарская республика) и ЮФО (Краснодарский край)

Показатели Образцы сырья

1 2 3 4 5

Содержание эфирного масла, % 2,30±0,11 2,21 ±0,14 2,22±0,07 2,20±0,15 2,32±0,11

Содержание ментона в эфирном масле, % 48,27±0,09 41,69±0,05 42,90±0,12 40,88±0,03 43,39±0,12

Содержание пулегона в эфирном масле, % 26,30±0,12 26,60±0,10 27,05±0,09 24,57±0,09 25,90±0,13

Содержание галловой кислоты,% 2,20±0,10 2,30±0,05 2,26±0,06 2,32±0,09 2,50±0,03

Содержание экстрактивных веществ, извлекаемых спиртом этиловым 70%, % 26,90*1,05 28,40±1,12 20,09±0,08 25,82±0,08 27,40±1,01

Обоснованы нормы содержания БАС в траве лофанта анисового по значениям, не превышающим минимальные, полученные в исследовании (выделены жирным шрифтом в таблице 4). Установлен срок годности сырья травы лофанта анисового, хранившегося в течение 3 лет, в сухом, проветриваемом помещении, в защищенном от прямых солнечных лучей месте, в бумажных мешках по ГОСТу 6077-80 (составляет 2 года, таблица 5).

Таблица 5 - Нормы качества сырья травы лофанта анисового (сорт Премьер)

Показатели Методы Нормы

Внешние признаки Визуально Соответствие морфологическим признакам

Микроскопия Микроскопия Соответствие анатомическим признакам

Подлинность: Эфирное масло .1 Галловая кислота ТСХ в системе толуол-этил ацетат (19:1) ПКХ-масс-спектрометрия ТСХ в системе п-бутанол - кислота уксусная ледяная - вода (4:1:1). ЯГ = 0,61 ±0,02 соответствует СО ментона ЯГ =0,42±0,03 соответствует СО пулегона Площадь пика ментона в 2 раза превышает площадь пика пулегона ЯГ = 0,90±0,04 соответствует СО галловой кислоты

Количественное определение: - Эфирное масло - Галловая кислота -Экстрактивные вещества, извлекаемые спиртом этиловым 70% -Дистилляция в аппарате A.C. Гинзберга -Денситометр ия -ГФХ1, вып. I.e. 295 Не менее 2,0 % Не менее 2,0 % Не менее 20,0 %

Влажность ГФ XI, вып. 1, с. 285 Не более 12%

Зола общая ГФХИ, Ч.1,с. 115 Не более 10%

Зола, нерастворимая в 10% р-ре кислоты хлористоводородной ГФ XI, вып. 2, с.25 Не более 3 %

Органические примеси ГФХ1, вып. 1,с. 276 Не более 1,0 %

Минеральные примеси ГФ XI, вып. 1,с. 276 Не более 1,0%

Частицы, проходящие свозь сито с отверстиями диаметром 7 мм ГФ XI, вып. 1, с. 275 Не более 1,0%

Микробиологическая чистота ГФХН, Ч. 1,с. 194 Категория 4 Б

Масса содержимого упаковки - В соответствии с ФСП- 50,0

Упаковка - В соответствии с ФСП

Маркировка - В соответствии с ФСП

Срок годности ГФХН, Ч. 1, с.488 2 года

Условия хранения - В сухом, защищенном от света месте

Фармакологический скрининг эфирного масла и водно-спиртовых извлечений из травы лофанта анисового

Острая токсичность водных извлечений травы лофанта анисового определялась методом Кербера на белых мышах обоих полов. Установлено отсутствие острого токсического действия (LD5o>100 мл/кг).

Исследования антимикробной активности эфирного масла и извлечений из травы лофанта анисового проводили на восьми тест-культурах. Установлено, что эфирное масло лофанта анисового проявляет бактериостатическое действие в отношении Staphyloccocus aurues 209-р, Staphyloccocus epidermalis Wood-46, E. coli 675, Salmonella typhimurim, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Вас. subtilis L2. Водные извлечения лофанта (настой, отвар) обладают бактериостатическим действием в отношении Staphyloccocus aureus 209-р, Shigella sonnei, Вас. subtilis L2, Pseudomonas aeruginosa. Извлечение, приготовленное с использованием спирта этилового 40%, обладает бактериостатическим действием в отношении Staphyloccocus epidermalis Wood-46, а с использованием спирта этилового 20% - в отношении Staphyloccocus aureus 209-р.

Наличие флавоноидов, галловой кислоты и других органических кислот послужило основанием для проведения исследований их антиоксид антной активности. На приборе «ЦветЯуза-01-AA» с амперометрическим детектором экспериментально установлено, что водные и спиртовые извлечения травы лофанта анисового обладают антиоксидантной активностью. Извлечение, полученное с помощью спирта этилового 70%, проявило наибольшую антиоксидантную активность (суммарная концентрация антиоксидантов, в пересчете на галловую кислоту 28,35±1,5 мг/г).

В современной дерматологии проблема профилактики и лечения алопеции занимает одно из ведущих мест. Лечение алопеции носит, как правило, комплексный характер. Специфика заболевания, частота и особенность проявления обуславливает необходимость создания лекарственных препаратов местного применения с пилотропным действием (т.е. укрепление, предотвращение выпадения волос). В наших исследованиях установлено пилотропное действие водного и

спиртового извлечений травы лофанта анисового. в результате эксперимента у испытуемых групп белых мышей выявлено удлинение остевых волос, выраженность волосяных луковиц, достаточная кератинированность, повышение густоты пушковых волос (рисунок 8). Это свидетельствует об улучшении обменных процессов в эпидермисе и стимулировании густоты и роста волос.

количество остевых волос, см

длина остевых волос, см

наличие луковиц у основных волос, шт.

количество пушковых волос

■ исходное состояние Я спиртовое извлечение Я настой контрольная группа

Рисунок 8 - Динамика состояния волосяного покрова животных в ходе эксперимента Полученные данные биологической активности извлечений травы лофанта анисового позволяют рекомендовать их для дальнейшего углубленного доклинического исследования с целью создания эффективных лекарственных средств для лечения и профилактики алопеции.

заключение

Основные итоги выполненной работы сводятся к следующим положениям: 1. Фотохимическими исследованиями установлен комплекс биологически активных соединений травы лофанта анисового: эфирное масло (2,21±0,14%), галловая кислота (2,30±0,15%), флавоноиды, в пересчете на лютеолин (2,06±0,04%)' дубильные вещества, в пересчете на танин (8,55±1,7%), тритерпеновые кислоты, в пересчете на урсоловую кислоту (5,09±0,09%), органические кислоты, в пересчете на яблочную кислоту 0,77±0,01%, в том числе аскорбиновая кислота 0,11±0,08%.

2. Из идентифицированных 22 компонентов эфирного масла, основными являются ментон (41,7%) и пулегон (26,6%), что позволяет вь,делить сорт лофанта анисового Премьер в новый хемотип - ментоно-пулегоновый.

3. Идентифицировано 21 соединение фенольной природы: танин, эпикатехин, эпигаллокатехин галлат (ЭГКГ), дигидрокверцетин, апигенин, лютеолин,

гесперидин, кверцетин, рутин, • кемпферол, дигидрокверцетин, о-метоксикумарин, генистеин, умбеллиферон; фенолкарбоновые кислоты: галловая, хлорогеновая, кофейная, феруловая, неохлорогеновая, коричная, п-кумаровая, цикоревая.

4. В траве лофанта анисового определено содержание 15 аминокислот, из которых 7 относятся к незаменимьм. Обнаружено 20 макро- и микроэлементов, из которых в золе преобладают кальций (20%), калий-(20%), фосфор (3%), магний (3%), натрий (0,8%), микроэлементы - кремний (2%), алюминий (1%), железо (0,3%). Выделены фракции полисахаридов (ВРПС - 7,5-8,2%, пектиновых веществ -4%, Гемицеллюлозы А - 11-14%, Гемицеллюлозы Б - 8%).

5. На основании морфолого-анатомического анализа установлены диагностические признаки травы лофанта анисового, которые позволяют идентифицировать сырье.

6. Теоретически обоснованы и экспериментально разработаны методики анализа и нормы качества травы лофанта анисового по основным действующим веществам (эфирное масло, галловая кислота, экстрактивные вещества, извлекаемые спиртом этиловым 70%). На основании выполненных исследований разработан проект ФСП «Лофанта анисового трава».

7. В 2011 году в Государственном реестре селекционных достижений РФ зарегестрирован новый сорт лофанта анисового Премьер, с допуском использования по всей территории РФ (авторство 10%).

8. Фармакологическими исследованиями установлена возможность применения лофанта анисового (эфирное масло, водные и спиртовые извлечения травы) в качестве источника сырья для применения в фармации и медицине как антимикробного, антиоксидантного и пилотропного средств.

Дальнейшие изучение биологически активных веществ травы лофанта анисового и их фармакологической активности позволят открыть большие перспективы использования данного растения в фармации и медицине. Полученные данные биологической активности лофанта анисового позволяют рекомендовать его для углубленного доклинического исследования с целью создания эффективных лекарственных средств.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 .Чумакова, В.В. Определение содержания дубильных веществ в траве лофанта анисового/В.В. Чумакова, О.И. Попова//Актуальные проблемы фармацевтической науки и практикихб.науч. тр.Всерос.науч-практ. конф.-Владикавказ, 2009 - С 70-73

2. Чумаком, В.В. Количественное определение галловой кислоты в траве лофанта анисового/В В. Чумакова, Т.Д. Мезенова, О.И. Попова//Медицинский Вестник Северного Кавказа-2010.-№4,- С.75-76.

3. Чумакова, В.В. Изучение влияния экстрагента при определении суммы дубильных веществ в траве лофанта анисового (Lophanthus anisatus Benth)/ В В Чумакова, О.И. Попова// Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. трудов,- Пятигорск, 2010. - Вып. 65. - С 148-149.

4. Чумакова, В.В. Определение галловой кислоты методом планарной хроматографии в траве лофанта анисового/ В.В. Чумакова, Т.Д. Мезенова, О И Попова// Медицинский Акад. журнал.-2010.-Т. 10, №5. -С. 177-178.

5. Чумакова, В.В. Определение галловой кислоты в траве лофанта анисового методом планарной хроматографии/ В.В. Чумакова, Т.Д. Мезенова, О.И. Попова// Химия растительного сырья. - 2011. - №4, 4.2. - С. 269-271

6 Чумакова, В В Изучение фенольньк соединений травы лофанта анисового/ В.В. Чумакова, О.И. Попова// Фармация. - 2011. - №3,- С.20-22.

7. Чумакова, В.В. Обоснование возможности использования лофанта анисового травы/ В.В. Чумакова [и др.]// Гаммермановские чтения: сб.науч.тр.научн-метод конф. 1 -3 февр.2011г. — СПб., 2011. — С. 59-61.

8. Чумакова, В.В. Сравнительный анализ образцов сырья лофанта анисового (Lophanthus anisatus Benth.) по содержанию эфирного масла и его компонентою состав а/В.В. Чумакова, О.И. Попова// Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр.- Пятигорск, 2011.-Вып. 66 - С 217-219

9. Чумакова, В.В. Опыт интродукции некоторых видов Agastache (Lamiaceae) в Ставропольском крае/ В.В. Чумакова, О.И. Попова, В.Вл. Чумакова// Растгельные ресурсы. -2011. -¡-Т. 47, №1. - С. 51-55.

10. Чумакова, В.В. Биохимические особенности лофанта анисового итродуцируемого в условиях Ставропольского края/ В.В. Чумакова, О.И. Попова,' Л.С. Ушакова/ /Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр.- Пятигорск, 2012. - Вып. 67. - С. 138-140.

11. Чумакова, В.В. Изучение антиоксидантной активности извлечений травы лофанта анисового/ В.В. Чумакова, О.И. Попова, М.И. Кодониди// Вопр. биол мед ифармац. химии, 2012.-№12.-С.30-33. "

12. Чумакова, В.В. Анатомо-диагностическое изучение травы лофанта анисового/ В.В. Чумакова, О.И. Попова//Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2013,-Вып. 68,-С. 137-139

13. Чумакова, В.В. Тритерпеновые кислоты в траве лофанта анисового/ В В Чумакова [и др.]//Фармация. - 2013. - №4. -С. 18-19.

14. Чумакова, В.В. Лофант анисовый (Agastache foeniculum L.) -перспективный источник получения лекарственных средств/ В.В. Чумакова, О.И. Попова//Фармация и фармакология. - 2013. - №1. - С. 39-44.

ЧУМАКОВА ВЕРОНИКА ВАЛЕРЬЕВНА

ФАРМАКОГ ностическое изучение лофанта анисового (асавтасш: коЕмсиьим (РикБн.) о. кштгЕ) сем. яснотковые

(ьам1асеае)

14.04.02 -- фармацевтическая химия, фармакогнозия

автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата фармацевтических наук

Подписано к печати «08» ноября 2013 г. Формат бумаги 60x84 1/16 Бумага книжно-журнальная. Печать ротапринтная. Уел, печ. л. 1,0 Тираж 100 экз. Заказ Л?

ПЯТИГОРСКИЙ МЕДИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ - ФИЛИАЛ ГОСУДАРСТВЕННОГО БЮДЖЕТНОГО ОБРАЗОВАТЕЛЬНОГО УЧРЕЖДЕНИЯ

ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ВОЛГОГРАДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

(357532, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11)