Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Фармакогностическое изучение прозанника крапчатого

На правах рукописи Малютина Анастасия Юрьевна

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ПРОЗАННИКА КРАПЧАТОГО

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

2 8 НОЯ 2013

Курск-2013

005541139

005541139

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научный руководитель: доктор фармацевтических наук, профессор Бубенчикова Валентина Николаевна

Официальные оппоненты:

Шорманов Владимир Комбулатович - доктор фармацевтических наук, профессор, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Коновалов Дмитрий Алексеевич - доктор фармацевтических наук, профессор, Пятигорский медико-фармацевтический институт - филиал государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующий кафедрой фармакогнозии, заместитель директора по научной работе

Ведущая организация:

Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН

Защита состоится «.19» 0€£&Ь/Ъ<Я~ 2013 г. в Ц > ОО часов на заседании диссертационного с<№ета Д 208.039.03 при ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (305041, г. Курск, ул. К. Маркса, д. 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО КГМУ Минздрава России.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета

Овод Алла Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы.

Современная медицина располагает огромным арсеналом новейших средств и методов терапии самых различных патологий. Однако сегодня, излечившись от одного заболевания, человек все чаще приобретает несколько других, связанных с побочными эффектами используемых им лекарств. Препараты растительного происхождения перед синтетическими лекарственными средствами имеют то преимущество, что при их употреблении в организм поступает целый комплекс родственных ему биологически активных веществ. В связи с этим фитокомплексы действуют мягче и лучше переносятся больными, сводя к минимуму риск возникновения побочных явлений и аллергических реакций. Интерес ученых к опыту народной медицины и фитотерапии постоянно поддерживается благодаря еще и тому, что, согласно литературным данным, около 80% населения планеты предпочитает использовать для лечения преимущественно препараты растительного происхождения.

Среди богатейшей флоры России значительный интерес вызывают представители семейства Астровые, и в частности прозанник крапчатый (АсЬугорЬогаз тасикив Ь.). Данное растение широко распространено на территории европейской части России и районах Сибири. В традиционной медицине прозанник крапчатый применяется, прежде всего, в качестве антисептического и ранозаживляющего средства. Известно его противовоспалительное и мягчительное действие. Растение имеет достаточную сырьевую базу и широко используется в арсенале народной медицины. Сведения о его химическом составе носят фрагментальный характер, фармакологическая активность растения до настоящего момента практически не изучена. Это подчеркивает актуальность всестороннего изучения прозанника крапчатого.

Степень разработанности темы исследования.

Растения рода Прозанник уже обращали на себя внимание ученых. Группой исследователей под руководством X. Вейс-Щнивейс был установлен хромосомный состав травы прозанника крапчатого, произрастающего в Южной Америке. Европейскими учеными проводилось масштабное изучение влияния радиации на различные виды растений, в результате прозанник крапчатый был признан радиационноустойчивым. Л.С. Мусиной был подробно описан онтогенез растения. В 1991 году Дж.Л. Фиассоном проведен сравнительный анализ флавоноидных

3

соединений восьми видов рода Прозанник, в рамках которого в листьях прозанника крапчатого были идентифицированы флавоноиды: лютеолин 7-О-глюкозид, лютеолин 7-О-рутинозид, изоэтин 2-О-ксилозид, изоэтин 2'-0-(4-0-ацетил)-ксилозид, изоэтин 7-0-глюкозид-2'-0-ксилозид и изоэтин 7-0-глюкозид-2'-0-(4-0-адетил)-ксилозид. Однако другие классы биологически активных веществ не рассматривались, не были установлены группы действующих веществ, показатели качества и характеристики подлинности.

Цель и задачи исследования.

Цель настоящей работы заключалась в фармакогностическом изучении травы прозанника крапчатого, в выборе методов стандартизации и диагностики сырья. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

• проведение фотохимического анализа травы прозанника крапчатого;

• выделение и исследование полисахаридных комплексов;

• проведение морфолого-анатомических исследований прозанника крапчатого с целью выявления диагностических признаков;

• разработка методик количественного определения основных групп биологически активных веществ (полисахаридов, флавоноидов, гидроксикоричных кислот);

• разработка числовых показателей качества сырья;

• изучение динамики накопления основных групп действующих веществ по фазам вегетации с целью установления сроков заготовки сырья;

• проведение фармакологического скрининга фитокомплексов травы прозанника крапчатого.

Научная новизна.

В результате проведенных исследований установлен состав биологически активных веществ травы прозанника крапчатого. Установлено, что в изучаемом растительном сырье содержатся углеводы, азотсодержащие соединения, органические кислоты, тритерпеновые соединения, каротиноиды, фенольные соединения.

Впервые изучен аминокислотный и минеральный состав травы прозанника крапчатого.

Изучен состав фенольных соединений прозанника крапчатого. Методами бумажной, тонкослойной и высокоэффективной жидкостной хроматографии обнаружено 24 соединения фенольной природы, среди которых впервые идентифицированы: флавоноиды - витексин, изовитексин, гесперидин, гиперозид; 4

дубильные вещества - танин, эпикатехин, катехин; кумарины - умбеллиферон, дикумарин, дигидрокумарин; фенолкарбоновые кислоты - галловая кислота, ЭГКгаллат, цикориевая кислота, хлорогеновая кислота, кофейная кислота, феруловая кислота.

Методом ВЭЖХ в траве прозанника крапчатого впервые определено количественное содержание основных флавоноидных соединений: цинарозида, гесперидина и фенолкарбоновых кислот: хлорогеновой и цикориевой.

Впервые из травы прозанника крапчатого выделены полисахариды по фракциям: водорастворимый полисахаридный комплекс, пектиновые вещества, гемицеллюлозы А и Б. Изучен их качественный и количественный моносахаридный состав. Количественно определены функциональные группы пектиновых веществ.

Впервые проведено морфолого-анатомическое изучение травы (стебля, листа, венчика, обертки) прозанника крапчатого; установлены диагностические признаки сырья.

Проведены исследования по стандартизации травы прозанника крапчатого, в результате чего разработаны методики спектрофотометрического определения суммы флавоноидов и суммы фенолкарбоновых кислот и методика гравиметрического определения суммы полисахаридов. На основании полученных данных установлены нормы содержания указанных групп биологически активных веществ. Разработанные методики валидированы по показателям: линейности, повторяемости, воспроизводимости и правильности.

Скрининговые фармакологические исследования фитокомплексов травы прозанника крапчатого показали наличие у исследуемого растения антисептической, отхаркивающей, противовоспалительной и ранозаживляющей активности.

Теоретическая и практическая значимость.

Результаты фармакогностического изучения травы прозанника крапчатого расширяют знания о его химическом составе. Данные, полученные при проведении фармакологического скрининга, обусловливают перспективность углубленного изучения прозанника крапчатого с целью внедрения его в научную медицину и последующей разработки на его основе современных лекарственных препаратов.

Для оценки качества сырья предложены методики стандартизации травы прозанника крапчатого. На основании проведенных исследований разработана,

апробирована и внедрена методика количественного определения суммы флавоноидов в траве прозанника крапчатого (Акт внедрения в работу ОКК ЗАО фирма «Здоровье» от 16.01.2012), результаты диссертационного исследования используются в учебном и научно-исследовательском процессе фармацевтического факультета ФГБОУ ВПО «Северо-Осетинский государственный университет им. K.JI. Хетагурова» от 10.03.2012 и фармацевтического факультета Пятигорского филиала ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» от 14.03.2013.

Методология и методы исследования.

Методологической основой явились статьи ГФ XI изданий, труды отечественных и зарубежных ученых [Мусина JI.C., 1993; Фиассон Дж.Л., 1991].

В настоящем диссертационном исследовании использованы физико-химические (гравиметрия, титрометрия, фотоэлектроколориметрия,

спектрофотометрия, денситометрия, высокоэффективная жидкостная хроматография), технологические и фармакологические методы исследования фитокомплексов прозанника крапчатого.

В работе использовано следующее оборудование: спектрофотометр СФ-2000, весы электронные AR-2140, колориметр фотоэлектрический концентрационный 8801611 КФК-2, аминокислотный анализатор марки LKB 4151 «Альфа Плюс», высокоэффективный жидкостный хроматограф фирмы "GILSON" (Франция) (модель 305) с ручным инжектором PHEODYNE-7125 (USA), денситометр ERi фирмы «Карл Цейес Йена» (Германия), дифракционный спектрофотометр ДФС 8-1 (Россия), прибор Квант 2AT (Россия), сушильный шкаф, муфельная печь, аквадистиллятор ДЭ-25 (модель 784), центрифуга лабораторная медицинская ОПн-8, термостат электрический суховоздушный ТС-80м, лабораторный микроскоп «Биолам С-11», микроскоп бинокулярный «Микромед-1», мерная стеклянная посуда, бюретки (1, 2 класса точности). Химические реактивы соответствовали квалификации ХЧ (содержание основного вещества более 99%), стандартные образцы веществ -требованиям, предъявляемым к PCO.

Положения, выносимые на защиту:

• результаты фитохимического исследования травы прозанника крапчатого;

• результаты по изучению полисахаридных комплексов;

• результаты морфолого-анатомических исследований с установлением диагностических признаков сырья;

• результаты разработки методик количественного определения суммы флавоноидов, фенолкарбоновых кислот и полисахаридов и их валидационные характеристики;

• выбор оптимальных сроков заготовки сырья прозанника крапчатого;

• результаты фармакологического скрининга фитокомплексов травы прозанника крапчатого.

Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность полученных результатов достигается посредством использования современных методов исследования. Объем проведенной работы подтверждается наличием значительного количества графического материала (таблицы, графики, рисунки). Достоверность разработанных методик количественного определения действующих веществ подчеркивается посредством их валидации. Статистическая обработка результатов проводилась согласно требованиям ГФ XI с использованием функций программы Microsoft Excel 7.0 и «Биостатистика».

Основные положения диссертации апробированы и представлены на 74 межвузовской итоговой научной конференции студентов и молодых ученых «Молодежная наука и современность» (Курск, 2009); 75 Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежная наука и современность» (Курск, 2010); итоговой научной конференции сотрудников КГМУ, Центрально-Черноземного научного центра РАМН и отделения РАЕН, посвященной 76-летию Курского государственного медицинского университета (Курск, 2011); научно-методической конференции «Гаммермановские чтения-2011» (Санкт-Петербург, 2011); Всероссийской научно-практической интернет-конференции с международным участием «Современные аспекты разработки и совершенствования состава и технологии лекарственных форм» (Курск, 2011); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 45-летию фармацевтического факультета КГМУ (Курск, 2011); X Международной конференции «Медико-социальная экология личности. Состояние и перспективы» (Минск, 2012); 77 Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежная наука и современность» (Курск, 2012); II Международном конгрессе «Физическое и духовное здоровье: традиции и инновации» (Москва, 2012); III Международной научно-практической конференции «Молодые ученые в решении актуальных проблем науки»

7

(Владикавказ, 2012); итоговой научной конференции сотрудников КГМУ, Центрально-Черноземного научного центра РАМН и отделения РАЕН, посвященной 78-летию Курского государственного медицинского университета и 90-летию со дня рождения профессора Н.Ф. Крутько (Курск, 2013); 78 Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежная наука и современность» (Курск, 2013); IV Международной научно-практической конференции «Молодые ученые в решении актуальных проблем науки» (Владикавказ, 2013).

Личный вклад автора. Автором самостоятельно определен выбор направления исследования, осуществлены сбор и анализ литературных данных. Автор непосредственно участвовал в постановке задач, всех этапах фармакогностического анализа травы прозанника крапчатого, разработке методик количественного определения основных классов действующих веществ, установлении показателей качества и диагностических признаков сырья, а также изучении фармакологической активности фитокомплексов растения. Более 85% исследований выполнено лично автором.

Связь задач исследования с проблемами фармацевтических наук.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Курского государственного медицинского университета (номер государственной регистрации 01201161124).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 28 печатных работ, из них 6 - в изданиях, рекомендуемых ВАК для опубликования материала диссертационных исследований.

Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа изложена на 166 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы (1 глава), главы «Объекты и методы исследования», экспериментальной части (3 главы), общих выводов, списка литературы, приложения. В тексте содержится 46 таблиц, 86 рисунков. Список цитируемой литературы включает 344 источника, из них - 76 на иностранных языках.

В приложении содержатся материалы, подтверждающие практическую значимость проведенных исследований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объектом нашего исследования явилась трава прозанника крапчатого (АсЬугорЬогш тасиШиБ Ь.), заготовленная на территории Курской области в 20088

2012 гг. в различные фазы вегетации (побеги первого года, фаза бутонизации, фаза цветения, фаза плодоношения).

Изучение качественного и количественного состава биологически активных веществ травы прозанника крапчатого

В ходе фотохимического изучения было установлено, что в изучаемом растительном сырье содержатся углеводы, азотсодержащие соединения, органические кислоты, тритерпеновые соединения, каротиноиды, фенольные соединения (дубильные вещества, кумарины, флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты), аминокислоты, макро- и микроэлементы.

При изучение количественного состава биологически активных веществ установлено содержание суммы азотистых оснований 0,34±0,006%, в том числе холина - 0,09±0,004%; дубильных веществ - 10,77±0,53%; свободных органических кислот - 4,89±0,24%, аскорбиновой кислоты - 0,14±0,005%; тритерпеновых соединений - 0,058±0,002%; каротиноидов - 7,52±0,10 мг%.

Методом бумажной хроматографии и на аминокислотном анализаторе марки ЬКВ 4151 «Альфа Плюс» впервые исследован аминокислотный состав травы прозанника крапчатого. Компонентный состав аминокислот представлен тирозином, аргинином, валином, гистидином, лейцином, кислотой аспарагиновой, серином, треонином. Содержание свободных аминокислот составляет в сумме 0,96 мг/100мг, связанных аминокислот - 7,32 мг/100 мг.

Методом эмиссионного спектрального анализа исследован минеральный состав травы прозанника крапчатого. В изученном образце обнаружены макро- и микроэлементы.

Методами бумажной, тонкослойной и высокоэффективной жидкостной хроматографии обнаружено 24 соединения фенольной природы. В результате идентифицировано 17 веществ, 16 из которых в исследуемом сырье обнаружены впервые (таблица 1). Флавоноидный состав представлен пятью соединениями, преобладающими среди них являются гесперидин и цинарозид; кумарины - тремя, среди которых преобладает дикумарин, дубильные вещества - четырьмя соединениями (преобладает танин), фелкарбоновые кислоты - пятью соединениями (преобладает цикориевая кислота).

Методом ВЭЖХ в траве прозанника крапчатого определено количественное содержание основных флавоноидных веществ: цинарозида (0,22%), гесперидина

9

(0,70%) и фенолкарбоновых кислот: хлорогеновой кислоты (0,17%) и цикориевой кислоты (0,30%).

Таблица 1 - Фенольные соединения травы прозанника крапчатого, _идентифицированные методом ВЭЖХ_

Группа БАВ Идентифицированные вещества Содержание веществ в выделенной смеси, %

Дубильные вещества Танин 5,78

ЭГКгаллат 3,53

Эпикатехин 4,11

Катехин 0,50

Кумарины Умбеллиферон 2,19

Дикумарин 2,84

Дигидрокумарин 1,17

Флавоноиды Витексин 1,19

Изовитексин 4,12

Гесперидин 18,40

Гиперозид 1,89

Цинарозид 6,05

Фенолкарбоновые кислоты Галловая кислота 3,64

Цикориевая кислота 9,13

Хлорогеновая кислота 5,15

Кофейная кислота 1,90

Феруловая кислота 5,33

Из травы прозанника крапчатого выделены полисахариды по фракциям, выход их составил: водорастворимых полисахаридов (ВРПС) - 8,94%, пектиновых веществ (ПВ) - 13,42%, гемицеллюлозы А и Б (ГЦ А и ГЦ Б) - 9,64% и 8,89% соответственно.

Для установления моносахаридного состава полисахаридных комплексов осуществляли их гидролиз 2н раствором кислоты серной. Разделение и идентификацию веществ проводили методом хроматографии на бумаге в системе растворителей н-бутанол - пиридин - вода очищенная (6:4:3) и этилацетат — кислота уксусная - кислота муравьиная - вода очищенная (18:3:1:4). С достоверными образцами идентифицировали: в ВРПС - галактозу, арабинозу, ксилозу, рамнозу, глюкуроновую кислоту; в ПВ - галактуроновую кислоту и глюкозу, ксилозу, рамнозу; в ГЦ А - ксилозу и глюкозу; в ГЦ Б - ксилозу и галактозу, глюкозу, арабинозу. Денситометрически после хроматографии гидролизатов в тонких слоях сорбента в

системе растворителей: н-бутанол - кислота уксусная - вода очищенная (3:1:1) определили количественное содержание моносахаридов. Согласно полученным результатам в водорастворимом полисахаридном комплексе преобладают арабиноза (6,8%) и галактоза (7,2%). Основу пектиновых веществ составляет галактуроновая кислота (84,5%). В гемицеллюлозах А и Б преобладающим моносахаридом является ксилоза (6,4% и 6,9%). Для качественной характеристики выделенных пектиновых веществ проводили количественное определение функциональных групп титрометрическим методом. Содержание свободных карбоксильных групп в исследуемых пектиновых веществах составляет 10,19%, метоксилированных карбоксильных групп - 1,29%, метоксильных групп - 0,89%. Пектиновые вещества травы прозанника крапчатого характеризуются невысокой (А.<50%) степенью этерификации.

Исследование подлинности н показателей качества травы прозанника крапчатого

Возможность введения травы прозанника крапчатого в медицинскую практику обусловливает необходимость установления показателей качества и характеристики подлинности для данного вида сырья.

Установлено, что трава прозанника крапчатого представляет смесь цельных или частично измельченных листьев, соцветий и верхушек стеблей толщиной до 4 мм. Стебли ветвистые, покрытые оттопыренными волосками. Листья продолговато-эллиптические, сужающиеся к основанию, на верхушке большей частью тупые, по краю выемчато-зубчатые, реже цельнокрайние, нередко с красновато-бурыми пятнами и красноватой центральной жилкой, опушены белыми жесткими прижатыми волосками или голые. Длина листьев до 25 см, ширина до 7 см. В сырье встречаются также мелкие листья длиной до 7 см, шириной до 1,5 см, сидячие, ланцетные, острые, к основанию суженные, выемчато-зубчатые, щетинисто-волосистые. Цветки язычковые, собраны в соцветие корзинка. Обертка корзинки двурядная. Листочки обертки линейно-ланцетные, опушенные длинными волосками. Цвет стеблей и листьев серовато-зеленый, цветков - золотисто-желтый. Запах слабый. Вкус водного извлечения сладковатый.

Рисунок 1 - Поперечный срез стебля (Увел. \24)

1 - ребра: 2 - межреберье; 3 - проводящие пучки: 4 -

сердцевина

Рисунок 2 - Фрагмент верхнего эпидермиса листа (Увел. х80) I - клетки эпидермиса; 2 - длинный тонкостенный многоклеточный волосок с притуплённой верхушкой; 3 -фрагмент многорядного волоска на многоклеточном пьедестале

Рисунок 3 - Фрагмент нижнего эпидермиса листа (Увел.

х56)

I - основание многорядного волоска. 2 - клетки эпидермиса: 3 - .многорядные волоски на многоклеточном пьедестале

Рисунок 4 - Фрагмент нижнего (наружнего) эпидермиса по краю венчика на границе его отгиба и трубки (Увел. ч140) I - простые тонкостенные многоклеточные длинные волоски со слегка заостренной верхушкой, с зернистым содержи мы м и часто со спадающимися стенками; 2 -простые волоски с многорядным основанием и многорядной верхушкой; 3 - простые волоски с многорядным основанием и с однорядной верхушкой

Рисунок 5 - Фрагмент верхнего эпидермиса по краю наружной обертки (Увел. х200)

I - многоклеточные тонкостенные гуееницеобразные волоски с тупой верхушкой: 2 - клетки эпидермиса

Рисунок 6 - Фрагмент края внутренней обертки с волосками (Увел. хЗОО)

1 - простые одноклеточные тонкостенные длинные извилистые волоски с тупой верхушкой

В результате микроскопического анализа было установлено, что стебель прозанника крапчатого в поперечном сечении округлой формы с выступающими ребрами, пучкового типа строения (рисунок 1). Клетки эпидермиса прямоугольные с толстым слоем крупнозубчатой кутикулы. Устьичный аппарат аномоцитного типа. Стебель опушен многорядными и однорядными многоклеточными волосками.

Клетки эпидермиса с обеих сторон листовой пластинки извилистые. Степень извилистости варьирует и более выражена на нижнем эпидермисе. Погруженные устьица встречаются как на верхнем, так и на нижнем эпидермисе. Устьичный аппарат аномоцитного типа. Волоски простые двух типов: многорядные на многоклеточном пьедестале и длинные тонкостенные многоклеточные волоски с притуплённой верхушкой (рисунок 2, 3).

По краю зубчиков венчика эпидермис сосочковидный с мелкозубчатой кутикулой. На границе отгиба и трубки по краю встречаются три типа волосков: простые тонкостенные многоклеточные длинные волоски со слегка заостренной верхушкой, с зернистым содержимым и часто со спадающимися стенками; простые волоски с многорядным основанием и с однорядной верхушкой; простые волоски с многорядным основанием и многорядной верхушкой (рисунок 4). На конце зубчиков венчика расположены тонкостенные одноклеточные пузыревидные волоски. На верхнем эпидермисе отгиба венчика многочисленны одноклеточные простые волоски с заостренной верхушкой, ближе к краю, у основания - многорядные волоски и длинные одноклеточные волоски с утолщенными стенками.

Вдоль жилок наружной обертки встречаются клетки эпидермиса с бурым содержимым и устьицами. У верхушки обертки и по краю многочисленные простые тонкостенные многоклеточные и одноклеточные волоски с притуплённой верхушкой. По центральной жилке - многоклеточные многорядные волоски. Многоклеточные тонкостенные гусеницеобразные волоски с тупой верхушкой расположены на верхнем эпидермисе в основном по жилкам и краю (рисунок 5).

У края внутренней обертки многочисленные простые одноклеточные тонкостенные длинные и извилистые волоски с тупой верхушкой (рисунок 6), ближе к основанию - простые одноклеточные волоски с заостренной верхушкой. На верхнем эпидермисе залегает сосочковидный эпидермис с многочисленными простыми тонкостенными волосками с притуплённой верхушкой.

Для определения качества травы прозанника крапчатого установлены следующие числовые показатели: влажность не более 12%, содержание общей золы не более 11%, золы нерастворимой в 10% растворе кислоты хлористоводородной -не более 4%. Установлена норма содержания экстрактивных веществ, извлекаемых спиртом этиловым 30-50%, - не менее 32%.

Для стандартизации сырья прозанника крапчатого были разработаны методики количественного определения основных классов действующих веществ и установлены нормы их содержания.

Одной из групп действующих веществ прозанника крапчатого являются флавоноиды, в связи с чем для установления их содержания разработана методика спетрофотометрического определения. Для увеличения избирательности методики определяли оптическую плотность окрашенных, устойчивых во времени продуктов взаимодействия флавоноидов прозанника крапчатого с алюминия хлоридом. Расчет содержания суммы флавоноидов вели в пересчете на цинарозид по удельному показателю поглощения цинарозида с алюминия хлоридом. Согласно полученным результатам наиболее полное извлечение суммы флавоноидов достигается при использовании спирта этилового 70%, степени измельченности сырья 2 мм, при соотношении сырья и экстрагента 1:100; экстракцию вели до наступления равновесия, которое наступает через 30 минут. При этом установлено, что наиболее полно реакция комплексообразования протекает при взаимодействии с 2 мл 1% раствора алюминия хлорида в течение 30 минут. Содержание суммы флавоноидов в траве прозанника крапчатого колеблется от 1,65% до 2,12%, на основании чего установлена норма содержания не менее 1,6%. Разработанная методика была валидирована по показателям: линейности, повторяемости, воспроизводимости и правильности, в результате чего она была признана прецизионной в данных условиях.

Для количественного определения суммы фенолкарбоновых кислот нами выбран метод прямой спектрофотометрии спиртового извлечения. Расчет содержания суммы фенолкарбоновых кислот вели по удельному показателю поглощения кислоты хлорогеновой в области максимума поглощения (А=325 им). Было установлено, что наиболее полное извлечение фенолкарбоновых кислот из травы прозанника крапчатого достигается при экстрагировании сырья степенью измельченности 1 мм, спиртом этиловым 40% в течение 45 минут. В качестве раствора сравнения

использовали спирт этиловый 40%. Содержание суммы фенолкарбоновых кислот в исследуемых образцах травы прозанника крапчатого колеблется от 5,82% до 7,11%. Установлена норма содержания не менее 5,5%. Проведена валидация методики по показателям линейности, правильности, воспроизводимости и повторяемости, в результате чего методика признана прецизионной в данных условиях.

Количественное содержание суммы полисахаридов устанавливали гравиметрически. В основу данной весовой методики положена экстракция суммы полисахаридов из сырья с последующим осаждением их спиртом этиловым 96%. Наиболее полное извлечение полисахаридов из травы прозанника крапчатого достигается при использовании сырья степенью измельченности 1 мм путем его трехкратной экстракции по 30 минут горячей водой очищенной. Водные извлечения объединяли, центрифугировали и переносили в мерную колбу вместимостью 500 мл. Осаждение полисахаридов из аликвоты осуществляли трехкратным количеством спирта этилового 96%. Фильтр с осадком высушивали сначала на воздухе, затем при температуре 100-105°С до постоянной массы. Содержание суммы полисахаридов в траве прозанника крапчатого колеблется от 8,43% до 10,94%. Установлена норма содержания суммы полисахаридов не менее 8%. Методика валидирована по показателям: линейности, повторяемости и воспроизводимости, в результате чего она была признана прецизионной в данных условиях.

Для оптимизации сроков заготовки травы прозанника крапчатого проведено изучение динамики накопления основных групп действующих веществ по фазам вегетации (рисунок 7). В результате установлено, что максимальное накопление флавоноидов в траве прозанника крапчатого происходит в период цветения (1,93±0,05%). Максимальное содержание полисахаридов также наблюдается в фазу цветения (10,94±0,48%). Наибольшее количество фенолкарбоновых кислот содержится в побегах первого года (8,24±0,20%), но, тем не менее в фазу цветения находится на достаточно высоком уровне (6,94±0,23%). В связи с этим траву прозанника крапчатого целесообразно заготавливать в период цветения.

Изучение фармакологической активности прозанника крапчатого

Основываясь на литературных данных и результатах фитохимического анализа, проведенного нами, были определены основные направления фармакологических исследований: изучение острой токсичности, антибактериальной активности,

отхаркивающей активности, противовоспалительной активности, ранозаживляющеи активности.

Определение острой токсичности проводили по методике Штабского. Исходя из полученных результатов, настой и ВРПС прозанника крапчатого по классификации К.К. Сидорова относятся к классу практически нетоксичных.

□ Побеги первого года И Фаза бутонизации

□ Фаза цветения

□ Фаза плодоношения

Содержание суммы флавоноидов, %

Содержание суммы полисахаридов, %

Содержание суммы фенолкарбновых кислот, %

Рисунок 7 - Содержание основных групп действующих веществ травы прозанника крапчатого в зависимости от фазы вегетации.

Антибактериальную активность устанавливали в опытах in vitro посредством культивирования тест-штаммов микроорганизмов на питательной среде с добавлением исследуемого фитокомплекса. Наиболее выраженную антимикробную активность фитокомплексы прозанника крапчатого проявили в отношении следующих культур: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus cereus, Candida albicans, Proteus vulgaris.

Отхаркивающее действие определяли на модели изучения моторной функции мерцательного эпителия пищевода лягушки. Установлено, что настой прозанника крапчатого повышает двигательную активность мерцательного эпителия на 36,99+3,79% и не уступает по действию препарату сравнения мукалтину (38,33±1,35%).

Противовоспалительную активность фитокомплексов прозанника крапчатого оценивали по общепринятой схеме с учетом влияния на разные стадии

воспалительного процесса. Антиэкссудативный эффект настоя составил 27,03%, а ВРГТС - 34,75%, что сопоставимо по действию препарату сравнения -ацетилсалициловой кислоте (25,43%). Наиболее выраженная антипролиферативная активность наблюдалась при введении ВРПС (развитие гранулемы угнетается на 57,55%, что близко по эффективности препарату сраинения - индометацину (68,50%)). Было также установлено, что настой травы прозанника обладает капилляроукрепляющим действием (латентный период появления пятен у кроликов составил 4,98+0,29 мин, а их диаметр - 1,29±0,04 см).

С целью изучения ранозаживляющей активности фитокомплексы прозанника крапчатого вводили в состав геля в виде густого экстракта, оценку качества которого проводили по внешнему виду, влажности и содержанию биологически активных веществ: суммы флавоноидов (не менее 6%) и суммы фенолкарбоновых кислот (не менее 23%).

Было установлено, что 15% гель на основе густого экстракта травы прозанника крапчатого обладает широким спектром антимикробной активности и способствует уменьшению площади ран к десятым суткам более чем на 96%. Микробная обсемененность ран снижается в 14,65 раза по сравнению с контролем. Эффективность лечения подтверждают также гистологические исследования срезов кожи и подкожной клетчатки.

Таким образом, 15% гель на основе густого экстракта травы прозанника крапчатого оказывает комплексное антибактериальное, противовоспалительное и репаративное воздействие.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В рамках настоящей диссертационной работы проведено фармакогностическое изучение травы прозанника крапчатого, разработаны методики количественного определения суммы флавоноидов, суммы фенолкарбоновых кислот и суммы полисахаридов, установлены числовые показатели и диагностические признаки сырья. Доказано, что фитокомплексы прозанника крапчатого- обладают ранозаживляющей, противовоспалительной, антисептической и отхаркивающей активностью.

Основные результаты диссертационного исследования сводятся к следующим положениям:

1. Проведено фитохимическое изучение травы прозанника крапчатого. Установлен качественный и количественный состав биологически активных веществ.

В изучаемом растительном сырье содержатся углеводы, азотсодержащие соединения (в том числе холин); органические кислоты (в том числе аскорбиновая кислота); тритерпеновые соединения; каротиноиды; фенольные соединения (флавоноиды, дубильные вещества, гидроксикоричные кислоты, кумарины); аминокислоты; макро-и микроэлементы.

2. В результате изучения фенольных соединений методами бумажной, тонкослойной и высокоэффективной жидкостной хроматографии в траве прозанника крапчатого было обнаружено 24 соединения фенольной природы, которые в основном представлены флавоноидами, дубильными веществами, кумаринами, фенолкарбоновыми кислотами; 16 из них: флавоноиды: витексин, изовитексин, гесперидин, гиперозид, дубильные вещества: танин, эпикатехин, катехин, ЭГКгаллат, кумарины: умбеллиферон, дикумарин, дигидрокумарин и фенолкарбоновые кислоты: галловая кислота, цикориевая кислота, хлорогеновая кислота, кофейная кислота, феруловая кислота в данном растении идентифицированы впервые.

3. Методом ВЭЖХ в траве прозанника крапчатого впервые определено

г

количественное содержание цинарозида (0,22%), гесперидина (0,70%), кислот хлорогеновой (0,17%) и цикориевой (0,30%).

4. Впервые выделены полисахариды по фракциям: выход водорастворимого полисахаридного комплекса составил 8,94%, пектиновых веществ - 13,42%, гемицеллюлозы А и Б - 9,64% и 8,89% соответственно. Установлен качественный и количественный моносахаридный состав полисахаридных комплексов. Количественно определены функциональные группы пектиновых веществ.

5. Впервые проведено морфолого-анатомическое изучение травы (стебля, листа, венчика, обертки) прозанника крапчатого. Выявлены диагностические признаки: стебель в поперечном сечении округлой формы, ребристый, пучкового типа строения; контуры клеток эпидермиса с обеих сторон листовой пластинки извилистые, степень извилистости варьирует: на нижней стороне листа извилистость более выражена, чем на верхней, устьичный аппарат анамоцитного типа; эпидермис венчика и обертки представлен клетками различной формы и размеров. Наиболее важными микродиагностическими признаками травы прозанника крапчатого служит многообразие и расположение волосков.

6. Впервые разработаны методики спектрофотометрического определения суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид и суммы фенолкарбоновых кислот в пересчете на хлорогеновую кислоту в траве прозанника крапчатого. На основании полученных данных установлена норма содержания суммы флавоноидов в траве 18

прозанника не менее 1,6%, суммы фенолкарбоновых кислот не менее 5,5%. Разработанные методики валидированы по показателям: линейности, повторяемости, воспроизводимости и правильности.

7. Впервые разработана методика количественного определения суммы полисахаридов в траве прозанника крапчатого. Содержание суммы полисахаридов колеблется от 8,43% до 10,94%. Установлена норма содержания полисахаридов не менее 8%. Проведена валидация разработанной методики по показателям: линейности, повторяемости и воспроизводимости.

8. Установлены числовые показатели, характеризующие качество сырья: влажность не более 12%, содержание общей золы не более 11%, золы нерастворимой в 10% растворе кислоты хлористоводородной - не более 4%; экстрактивных веществ, извлекаемых спиртом этиловым 30-50%, - не менее 32%.

9. Проведены скрининговые фармакологические исследования фитокомплексов, полученных из травы прозанника крапчатого. В результате были установлены противовоспалительная активность настоя и полисахаридных комплексов травы прозанника крапчатого и отхаркивающее действие настоя. Настой и пектиновые вещества обладают антимикробными свойствами. Доказана ранозаживляющая активность 15% геля на основе густого экстракта травы прозанника крапчатого.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Малютина, А.Ю. Изучение каротиноидов травы прозанника крапчатого / А.Ю. Малютина // Молодежная наука и современность : материалы 74-й Всерос. науч. конф. студентов и молодых ученых-медиков с междунар. участием, посвящ. Году молодежи в России. - Курск : Изд-во КГМУ, 2009. - Ч. 2. - С. 191.

2. Малютина, А.Ю. Содержание дубильных веществ в траве прозанника крапчатого (АсЬугорЬогиз шаЫаШэ Ь.) / А.Ю. Малютина, М.Н. Крутоверцев // Молодежная наука и современность : материалы 75-й Всерос. науч. конф. студентов и молодых ученых-медиков с междунар. участием, посвящ. 75-летию КГМУ. - Курск : Изд-во КГМУ, 2010. - Ч. 2. - С. 292.

3. Кондратова, Ю.А. Азотистые основания прозанника крапчатого / Ю.А. Кондратова, А.Ю. Малютина // Молодые ученые в решении актуальных проблем науки : материалы Междунар. науч.-практ. конф. - Владикавказ, 2010. -С. 113-114.

4. Малютина, А.Ю. Тритерпеновые соединения прозанника крапчатого / А.Ю. Малютина // Экология России и сопредельных территорий : материалы XV Междунар. эколог, студенческой конф. - Новосибирск : Изд-во НГУ, 2010. - С. 318.

5. Бубенчикова, В.Н. Изучение пектиновых веществ травы прозанника крапчатого (Achyrophorus maculatus L.) / В.Н. Бубенчикова, А.Ю. Малютина, С.С Субботина // Университетская наука: взгляд в будущее : материалы итог. науч. конф. сотрудников КГМУ, Центр.-Чернозем. науч. центра РАМН и отд-ния РАЕН, посвящ. 76-летию КГМУ : в 3 т. - Курск : Изд-во КГМУ, 2011. - Т. 2. - С. 204-206.

6. Бубенчикова, В.Н. Исследование дубильных веществ прозанника крапчатого и девясила иволистного / В.Н. Бубенчикова, А.Ю. Малютина, A.B. Азарова // Человек и лекарство : сб. материалов XVIII Рос. нац. конгр. -М., 2011.-С. 584.

7. Лекарственные растения Центрального Черноземья и перспективы их практического использования / В.Н. Бубенчикова, Ю.А. Кондратова, C.B. Логутев,

A.Ю. Малютина // Гаммермановские чтения-2011 : сб. науч. тр. науч.-метод. конф. -СПб.: Изд-во СПХВА, 2011.-С. 14-16.

8. Малютина, А.Ю. Изучение органических кислот травы прозанника крапчатого (Achyrophorus maculatus L.) / А.Ю. Малютина // Молодежная наука и современность : материалы 76-й Всерос. науч. конф. студентов и молодых ученых : в 3 ч. - Курск : Изд-во КГМУ, 2011. - Ч. 2. - С. 254-255.

9. Бубенчикова, В.Н. Изучение флавоноидов прозанника крапчатого /

B.Н. Бубенчикова, А.Ю. Малютина // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции : сб. науч. тр. / под ред. М.В. Гаврилина. - Пятигорск : Изд-во Пятигор. ГФА, 2011. - Вып. 66. - С. 31-32.

10. Бубенчикова, В.Н. Исследование дубильных веществ бородавника обыкновенного и прозанника крапчатого / В.Н. Бубенчикова, C.B. Логутев, А.Ю. Малютина // Современные аспекты разработки и совершенствования состава и технологии лекарственных форм : материалы Всерос. науч.-практ. интернет-конф. с междунар. участием / редкол.: Т.А. Панкрушева [и др.]; Курск, гос. мед. ун-т. - Курск: Изд-во КГМУ, 2011. - С. 301-303.

11. Печенин, О.Д. Изучение антибактериальной активности травы бородавника обыкновенного и прозанника крапчатого / О.Д. Печенин, C.B. Логутев, А.Ю. Малютина // Молодые ученые в решении актуальных проблем науки : материалы II Междунар. науч.-практ. конф. - Владикавказ, 2011. - С. 251-252.

12. Бубенчикова, В.Н. Изучение органических кислот травы прозанника крапчатого (Achyrophorus maculatus L.) по фазам вегетации / В.Н. Бубенчикова, А.Ю. Малютина // Традиции и инновации фармацевтической науки и практики : материалы Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием, посвящ. 45-летию 20

13. Бубенчнкова, В.Н. Стандартизация некоторых видов семейства Asteraceae по содержанию флавоноидов / В.Н. Бубенчикова, C.B. Логутев, А.Ю. Малютина // Традиционная медицина. - 2011. -№ 5. - С. 171-173.

14. Бубенчикова, В.Н. Сравнительная оценка макро- и микроэлементного состава некоторых видов растений семейств Asteraceae и Rosaccae / В.Н. Бубенчикова, C.B. Логутев, Ю.А. Сухомлинов, А.Ю. Малютина // Вести. ВГУ. Сер.: «Химия. Биология. Фармация». - Воронеж, 2011 - № 2. -С. 181-184.

15. Аминокислоты бородавника обыкновенного (Lapsana communis L.) и прозанника крапчатого (Achyrophorus maculatus L.) / В.Н. Бубенчикова, C.B. Логутев, А.Ю. Малютина, С.С. Субботина // Медико-социальная экология личности: состояние и перспективы : материалы X Междунар. конф. / отв. ред В.А. Прокашева. - Минск : Изд. центр БГУ, 2012. - С. 349-352.

16. Изучение фенолкарбоновых кислот травы бородавника обыкновенного, девясила иволистного и прозанника крапчатого / В.Н. Бубенчикова, C.B. Логутев,

A.Ю. Малютина, A.B. Азарова // Человек и лекарство : сб. материалов XIX Рос. нац. конгр. - М., 2012. - С. 358-359.

17. Печенин, О.Д. Пектиновый комплекс травы прозанника крапчатого (Achyrophorus maculatus L.) и его антибактериальная активность / О.Д. Печенин.

B.Н. Бубенчикова, А.Ю. Малютина // Кластерные подходы фармацевтического союза: образование, наука и бизнес : сб. материалов II Междунар. науч.-практ. конф. / под ред. И.В. Спичак. - Белгород : Изд-во «БелГУ», 2012. - С. 126-128.

18. Малютина, А.Ю. Изучение каротиноидов травы прозанника крапчатого по фазам вегетации / А.Ю. Малютина, О.С. Замараева // Молодежная наука и современность : материалы 77-й Всерос. науч. конф. студентов и молодых ученых : в 3 ч. - Курск : Изд-во КГМУ, 2012. - Ч. 2. - С. 338-339.

19. Малютина, А.Ю. Исследование дубильных веществ прозанника крапчатого (Achyrophorus maculatus L.) по фазам вегетации / А.Ю. Малютина, Л.В. Никитина // Молодые ученые в решении актуальных проблем науки : материалы III Междунар. науч.-практ. конф. - Владикавказ, 2012. - С. 222-224.

20. Бубенчикова, В.Н. Стандартизация сырья прозанника крапчатого (Achyrophorus maculatus L.) по содержанию гидроксикоричных кислот / В.Н. Бубенчикова, А.Ю. Малютина // Современные проблемы отечественной медико-биологической и фармацевтической промышленности. Развитие инновационного и кадрового потенциала Пензенской области : материалы II Междунар. науч.-практ. конф. [Электронный ресурс]. - Пенза, 2012. - № гос регистрации 28769. - Режим доступа: http://medic.pnzgu.ru/conf/thesis.html, свободный.

21. Бубенчикова, В.Н. Изучение анатомических признаков листа прозанника крапчатого (Achyrophorus maculatus L.) / В.Н. Бубенчикова, А.Ю. Малютина, Л.И. Прокошева // Медична наука: нові ідеї та концепції: збірник матеріалів міжнародної науко-практичноі конференції. - Дніпропетровськ: Організація наукових медичних досліджень «Salutem», 2012. - С. 106-109.

22. Бубенчикова, В.Н. Изучение полисахаридов травы прозанника крапчатого и их противовоспалительной активности / В.Н. Бубенчикова, А.Ю. Малютина // Традиционная медицина. - 2012. - № 5. - С. 198-200.

23. Бубенчикова, В.Н. Изучение анатомического строения травы прозанника крапчатого (Achyrophorus maculatus L.) / В.Н. Бубенчикова, А.Ю. Малютина, Л.И. Прокошева // Фундаментальные исследования. - 2012. -

№11,ч. 6.-С. 1487-1491.

24. Бубенчикова, В.Н. Стандартизация сырья прозанника крапчатого (Achyrophorus maculatus L.) по содержанию полисахаридов / В.Н. Бубенчикова,

A.Ю. Малютина // Университетская наука: Взгляд в будущее : материалы итоговой науч. конф. сотрудников КГМУ, Центр.-Чернозем. науч. центра РАМН и отд-ния РАЕН, посвящ. 78-летию КГМУ : в 2 т. - Курск : Изд-во КГМУ, 2013. - Т. 2. -С. 37-40.

25. Малютина, А.Ю. Приготовление густого экстракта травы прозанника крапчатого / А.Ю. Малютина, Л.В. Никитина // Молодежная наука и современность : материалы 77-й Всерос. науч. конф. студентов и молодых ученых, посвящ. 78-летию КГМУ и 80-летию со дня рождения чл.-корр. РАМН, проф. A.B. Завьялова. : в 3 ч. -Курск : Изд-во КГМУ, 2013. - Ч. 2. - С. 233-234.

26. Бубенчикова, В.Н. Морфологическая характеристика течения раневого процесса при лечении экспериментальной инфицированной раны гелем на основе густого экстракта травы прозанника крапчатого /

B.Н. Бубенчикова, А.Ю. Малютина, М.А. Затолокина, А.Ю. Григорьян, Л.С. Новикова // Современные проблемы науки и образования [Электронный ресурс|. - 2013. - № 3. - Режим доступа: http://www.science-education.ru/109, свободный.

27. Малютина, А.Ю. Определение показателей качества сырья «Прозанника трава» / А.Ю. Малютина, Л.В. Никитина // Молодые ученые в решении актуальных проблем науки : материалы IV Междунар. науч.-пракг. конф. : в 2 ч. - Владикавказ, 2013.-Ч. 1. - С. 231-233.

28. Бубенчикова, В.Н. Ранозаживляющая активность геля на основе густого экстракта травы прозанника крапчатого / В.Н. Бубенчикова, А.Ю. Малютина, Л.С. Новикова, А.Ю. Григорьян, М.А. Затолокина, Л.В. Жиляева // Фундаментальные исследования. - 2013. - № 8, ч. 1. - С. 123-127.

Лицензия JIP № 020862 от 30.04.99 г. Сдано в набор 13.11.2013 г. Подписано в печать 15.11.2013 г. Формат 30x42'/8 Бумага офсетная. Гарнитура Times New Rom. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 262"А". Издательство Курского государственного медицинского университета 305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3.