Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Исследование по фармакогностическому изучению и стандартизации сырья и препаратов Ореха грецкого (Juglans regia L.)

На правах рукописи <0

Еникеева Римма Айратовна

ИССЛЕДОВАНИЕ ПО ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОМУ ИЗУЧЕНИЮ И СТАНДАРТИЗАЦИИ СЫРЬЯ И ПРЕПАРАТОВ ОРЕХА ГРЕЦКОГО (JÜGLANS REGIA L.)

15 00 02 фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Москва 2008

003170875

Диссертационная работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и

ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН

Научный руководитель:

доктор фармацевтических

наук, профессор Сокольская Татьяна Александровна

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук Давыдова Валентина Николаевна

доктор фармацевтических наук Баландина Ирина Анатольевна

Ведущая организация Научно-исследовательский Институт Фармации ММА И М Сеченова

Защита состоится « 2008 г в 14 часов на

заседании диссертационного совета Д 006 070 01 при Всероссийском научно-исследовательском институте

лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) по адресу 117216, Москва ул Грина, 7

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ВИЛАР РАСХН по адресу 117216, Москва ул Грина, 7

Автореферат разослан «_»_200 г

Ученый секретарь диссертационного совета Д006 070 01

доктор фарм наук ^^____^ И Громакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. В настоящее время, как в мировой, так и в отечественном фармацевтической практике достаточно широко используются фитопрепараты, в том числе гомеопатические, составляя около 40% от общего числа применяемых лекарственных средств (J1C) Следует отметить, что генофонд лекарственных растений, используемых в традиционной медицине, насчитывает более 1200 видов, тогда как к медицинскому применению в РФ разрешено 260 видов, что свидетельствует о целесообразности проведения комплексных исследований по выявлению и изучению перспективных растений, произрастающих на территории России К их числу следует отнести орех грецкий - Juglans Regia L, сем Ореховые - Juglandaceae

Листья и олиственные молодые побеги с цветками ореха грецкого широко используются в официнальной медицине многих зарубежных стран, в качестве противовоспалительного, ранозаживляющего, антимикробного средства В гомеопатической практике Германии, Франции, Великобритании, Индии применяется настойка гомеопатическая матричная (НГМ) ореха грецкого, получаемая из олиственных побегов, заготовленных в период цветения, и ее разведения, для получения гранул, капель, мазей, суппозиториев и д ругих лекарственных форм Выпуск препаратов на основе листьев ореха грецкого осуществляется на территории Украины (препарат Карион, настойка, суспензия и мазь Юглон) В России листья ореха грецкого находят применение только в народной медицине, а при использовании в гомеопатической практике делается ссылка на нормативные документы зарубежных стран

В связи с этим представляется актуальным фитохимическое изучение ореха грецкого листьев с использованием современных методов физико-химического анализа и разработка методик стандартизации сырья и препаратов на его основе Цель и задачи исследования.

Целью исследования является фармакогностическое изучение ореха грецкого листьев, получение настойки гомеопатической матричной Югланс на его основе и их стандартизация

Для достижения указанной цели необходимо решить следующие основные задачи

1 Провести фармакогностическое исследование свежих и высушенных ореха грецкого листьев, исследовать основные группы биологически активных веществ (БАВ) и разработать методики их качественного и количественного определения

2 Изучить динамику накопления БАВ с целью установления оптимальных сроков заготовки сырья, составить проекты фармакопейных статей (ФС) на свежее и высушенное сырье ореха грецкого, а также проект инструкции по заготовке сырья

3 Получить НГМ Югланс и изучить их компонентный состав

БАВ

4 Разработать методики стандартизации НГМ Югланс и составить проекты ФС на НГМ из свежего и высушенного сырья ореха грецкого

5 Провести предварительное фармакологическое исследование НГМ Югланс

Научная новизна.

На основании макро- и микроскопического анализа листьев ореха грецкого впервые установлены диагностические признаки сырья Проведено сравнительное фармакогностическое изучение ореха грецкого листьев свежезаготовленных и высушенных и установлено, что количественное содержание флавоноидов, дубильных веществ и производных нафтохинона в свежем сырье несколько выше, чем в высушенном

Подобраны условия качественного и количественного анализа БАВ в лекарственном растительном сырье (J1PC) с применением современных методов физико-химического анализа УФ-спектроскопии и различных видов хроматографии (ТСХ, ВЭЖХ) С использованием разработанных методик определен качественный состав и количественное содержание в ЛРС флавоноидов, дубильных веществ, нафтохинонов (юглона) Установлены различия в количественном содержании отдельных БАВ в зависимости от фазы вегетации ореха грецкого Предложена схема получения стандартного образца юглона

Разработаны методики стандартизации ореха грецкого листьев Определены оптимальные сроки заготовки ЛРС, предназначенного для гомеопатической практики, а также проведены исследования по изучению перспективности использования НГМ, полученной из свежего и высушенного J1PC Получены НГМ Югланс из двух видов ЛРС, разработаны основные показатели их качества При

этом установпено, что качественный состав насгоек идентичен, фармакологическая активность сопоставима

Практическая значимость

На основании проведенных исследований разработаны

® Инструкция по заготовке листьев ореха грецкого высушенных и свежих,

• проект ФС «Ореха грецкого листья свежие»,

• проект ФС «Ореха грецкого листья»,

• проект ФС «Jugions iegia (Jugions) Настойка матричная гомеопатическая»,

• проект ФС «Juglans regia (Jugions) Dl Настойка матричная гомеопатическая»

Положения, выносимые на защиту:

1 Результаты фармакогностического изучения ореха грецкого листьев свежезаготовленных и высушенных

2 Результаты фитохимического анали?а и разработки методик стандартизации сырья ореха грецкого, а также изучения динамики накопления БАВ

4 Результаты по разработке показателей качества НГМ

Югланс

5 Результаты определения основных видов фармакологической активности НГМ Югланс, включая острую токсичность

Апробация работы.

Материалы диссертационного исследования доложены на научно-практических конференциях XVI Московской

международной гомеопатической конференции (Москва, 2006), Региональной научно-практической конференции, посвященной 40-летию фармацевтического факультета КГМА (Курск, 2006), Конгрессе, посвященному 30-летию со дня открытия ЦНИИР «Традиционная медицина 2007г» (Москва, 2007), VIII Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики, лечение больных в многопрофильном лечебном учреждении» (Санкт-Петербург, 2007), III Всероссийском гомеопатическом съезде (Москва, 2007)

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ ВИЛАР

РАСХН по «Программе фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса РФ 2006-2010 гг » Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на страницах компьютерного

текста, содержит 3*9 рисунков, /У таблиц, состоит из обзора литературы, 4 глав экспериментальных исследований, выводов, приложений и списка литературы Список литературы включает 215 источников, из них 61 на иностранных языках

Глава I (обзор литературы) посвящена анализу данных литературы, содержащих сведения о ботанической характеристике и химическом составе, свойствах и применении Ореха грецкого Приведены данные о ЛС, в том числе гомеопатических, полученных на основе ореха грецкого листьев и методах оценки их качества, зарегистрированных в зарубежных странах

Раздел «Пояснения к эксперименту» посвящен характеристике объектов исследования свежезаготовленных и высушенных ореха грецкого листьев, а также используемым в работе приборам, методам и методикам,сорбентам и реактивам

Во второй главе приведены результаты экспериментальных исследований по изучению макро- и микродиагностических признаков ореха грецкого листьев, а также установлению числовых показателей, нормирующих качество ЛРС (влажность, зольность, измельченность, наличие примесей)

Третья глава посвящена фитохимическому изучению ореха грецкого листьев, определению основных групп БАВ, разработке методик их качественного и количественного анализа с использованием современных методов, включая ТСХ, ВЭЖХ, ЯМР-13С спектроскопию, выделению и установлению физико-химических характеристик юглона, как превалирующего компонента группы нафтохинонов Определены параметры стандартизации и оптимальные сроки заготовки и хранения ЛРС Оформлены инструкции по заготовке ореха грецкого листьев, ФС на ореха грецкого листья свежие и высушенные и НГМ Югланс на их основе

Глава IV посвящена получению и изучению химического состава НМГ ореха грецкого листьев, полученных из свежего и

высушенного сырья и разработке методик контроля их качества Приведены результаты анализа флавоноидов, фенолкарбоновых кислот и нафтохинонов в НГМ Югланс с использованием методов ТСХ, ВЭЖХ, УФ-спектрофотометрии Определены основные показатели качества настоек, условия и сроки их хранения

Глава V посвящена фармакологической оценке НГМ Югланс и ее основных биологически активных компонентов с использованием метода in \ч\о, а также биотестирования иг vitro

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Объекты, материалы и методы исследования Объектами исследования служили образцы опытных партий сырья ореха грецкого листьев свежих и ореха грецкого листьев высушенных, заготовленных в Краснодарском крае, окрестностях станицы Брюховецкая в 2005 - 2007г

Заготовку проводили в ореховых, смешанных лесах, на гребнях невысоких перевалов, а также на раздечительных лесополосах полей в течение вегетационного периода с периодичностью в 15-20 дней, в следующие фазы вегетации распускание листьев, бутонизация, начало цветения, цветение, конец цветения, начало плодоношения, плодоношение Изучали как свежее, так и высушенное сырье

При качественном анализе испотьзовали общие и специфические реактивы на группы действующих веществ, рекомендованные ГФ XI Хроматографнрование в тонком слое сорбента и на бумаге осуществляли согласно статье «Хроматография» ГФ XI Детектирование веществ на хроматограммах осуществляли в видимом и УФ - свете до и после их обработки специфическими реактивами

Для приготовления хроматографических систем, а также для экстракции БАВ использовали растворители марки «ч» и «хч» Приготовление реактивов, используемых в экспериментальной части работы осуществляв согласно ГФ XI Для проведения фитохимических исследований использовали свежевыжатый сок, а также водные и водно-спиртовые извлечения (1 10) из листьев ореха грецкого высушенных

Микроскопический анализ цельного и измельченного сырья проводили согласно статье "Техника микроскопического анализа" ГФ XI (выи 2, с 277) Подготовка свежих листьев грецкого ореха для микроскопического исследования проводилась путем

фиксирования сырья в смеси глицерин-спирт -хлоралгидрат (1 1 1), где выдерживают не мене 1-3 суток После соответствующей подготовки сырья из него готовят микропрепаратов из цельного сырья ГФ XI (выи 2, с 277)

Микрофотографии сделаны на приборе фирмы «Zeiss» с камерой «Canon» Микроскопическое исследование выполняли с использованием следующих красителей гематоксилин по Эрлиху в сочетании с антоциановым синим, а также сафранин по Картесу в сочетании с антоциановым синим

Наличие радионуклидов определяли на сцинтилляционном у-спектрометре МКГБ-01 по методике ОФС 42-0011-03

Испытания на микробиологическую чистоту проводились в соответствии с ГФ XI (вып 2), изменениями № 3 к ГФ XI от 19 03 03

УФ - спектры поглощения записывали на приборе «GELIOS - у» (США)

Анализ методом ВЭЖХ проводили на хроматографе марки «GILSON» (Франция), а также на хроматографе марки «SHIMADZU» (Япония) с последующей компьютерной обработкой результатов исследования с помощью программы «Мультихром для Windows»

Изучение производных нафтохинона осуществляли методом ЯМР-ПС спектроскопии на приборе АС-200 фирмы «Bruker», используя в качестве растворителей ацетон и метанол

В аналитических исследованиях применяли статистические расчеты принятые ГФ XI (вып 1, С 199) с использованием критерия Стьюдента

Настойки гомеопатические матричные, полученные из свежих и высушенных листьев ореха грецкого и их разведения (D4, D3, D2 и D1) исследовали методами in vivo и in vitro на молекулярных тест-системах каталаза (КАТ), глутатионпероксидаза (ГП) и глутатионредуктаза (ГР)

2.Фармакогностнческнй анализ ореха грецкого листьев свежих и высушенных

В ходе исследования определены макро- и

микродиагностические признаки J1PC, а также установлены нормативы таких числовых показателей как влажность, содержание тяжелых металлов, измельченность, содержание минеральной и

органической примеси, золы общей и нерастворимой в 10% растворе кислоты хлористоводородной, экстрактивных веществ, микробиологическая чистота и наличие радионуклидов

При определении морфолого-диагностических признаков сырья ореха грецкого листьев было установлено, что цельное сырье представляет собой цельные ичн частично измельченные листочки яйцевидной или обратнояйцевидной формы

непарноперистосчожного листа, сверху темно-зеленые, блестящие, сниз) более светлые и матовые, в углах жилок с бородками волосков Запах слабый, специфический Цвет темно-зеленый с сероватым оттенком Вкус водного извлечения горько-пряный

Измельченные листья ореха грецкого представляют собой кусочки цельнокраиних листочков различной формы, проходящие сквозь сито с отверстиями размером 2 мм сверху темно-зеленые, блестящие, снизу более светлые и матовые, в углах жилок с бородками волосков Цвет темно-зеленый с сероватым оттенком Запах слабый, специфический Вкус водного извлечения специфический, слегка вяжущий

К специфичным микродиагностическим признакам ореха грецкого листьев следует отнести наличие на эпидермисе листовой пластинки многоклеточных железистых волосков расположенных вдоль жилок, 6-8 клеточных железок, заполненных темно-окрашенным смолистым веществом, а также извилистостенность эпидермиса и наличие устьиц аномоцитного типа

Кроме того, определена микробиологическая чистота анализируемого сырья и содержание в нем радионуклидов

В результате проведенных исследований для ЛРС установлены пределы нормирования, представленные в таблице 1

Полученные показатели включены в проект ФС «Ореха грецкого лисгья свежие» и «Ореха грецкого листья»

Таблица 1

Числовые показатели качества сырья ореха грецкого листьев свежих и __высушенных_

Наименование показателя Норма по показателю, включенному в проект ФС, %

Свежее цельное сырье Высушенное цельное сырье Высушен Измепьчен сырье

Влажность (содержание сока), % не менее 60 % не более 13 % не более 13 %

Зола общая, % не более 8,2 % не более 14 % не более 14 %

Зо т, нерастворимая в соляной кислоте не ботее 2,1 % не более 3 % не более 3 %

Содержание экстрактивных веществ, % не менее 13 % не менее 13 % не менее 13 %

Органическая примесь, % не ботее 2 % не более 2 % не ботее 2 %

Минеральная примесь, % не более 1 % не ботее 1 % не более 1 %

Частиц, не прох сквозь сито с диам от в 7 мм, % не более 1 %

Частиц, прох Сквозь сито с диам отв 2 мм, % не менее 60%

Микробиоло! ичес чистота Категория 46 Категория 46 Категория 46

Радиационная чистота Соответ ОФС 42-001-03 Соответ ОФС 42-001-03 Соответ ОФС 42-001-03

3. Фотохимическое изучение и определение показателей качества ореха грецкого листьев све/ких и высушенных

Для изучения качественного состава БАВ и определения подлинности сырья использовали сок и водные или водно-спиртовые (спирт этиловый 70 %) извлечения из высушенных ореха грецкого листьев в соотношении (1 10) (Таблица 2)

Таблица 2

Результаты качественного фитохимического анализа_

№п/п Группа БАВ Листья ореха грецкого

свежие выс>шенные

1 Флавоноиды +++ +++

2 Фенолкарбоновые кислоты ++ +

3 Д>бильные вещества +++ +++

4 Нафтохиноны +++ ++

5 Апкалоиды - -

6 Сапонипы + +

7 Терпеноды + +

8 Кчмарины - -

9 Гликозиды - -

Усювные обозначения "+++" - высокое содержание БАВ,"++" - умеренное содержание БАВ,"+" - следы БАВ, "-" БАВ отсутствуют,

Полученные данные предварительного фитохимического анализа свидетельствуют о том, что основными группами БАВ ореха грецкого листьев как свежезаготовленных, так и высушенных являются фенольные соединения флавоноиды, дубильные

вещества, фенолкарбоновые кислоты, а также нафтохиноны Такие группы БАВ как кумарины, алкалоиды, терпеноиды, сапонины и сердечные гликозиды отсутствуют или представлены в следовых количествах и дальнейшего интереса для исследований не представляют

Изучение состава отдельных групп БАВ осуществляли методом ВЭЖХ на приборе LC-10AVP фирмы SHIMADZU, хроматографическая колонка ZORBAX 80А Extend-C 18, 5 [хм производства фирмы Agilent (США) длиной 250 мм

В качестве подвижной фазы - 0,1 % Н3Р04 метанол, скорость потока 1 мл/мин, температура термостата 30° С Детектирование проводилось с помощью УФ-детектора при длине волны 340 нм В хроматограф вводили по 20 мкл исследуемых растворов и растворов стандартных образцов (СО) Результаты исследований приведены на рисунке 1

Рис 1 - ВЭЖХ-хроматограмма фенольныч соединений сока листьев ореха грецкого свежих I - галловая кислота, 2 - хлорогеновая кистота, 3 - гиперозид, 4 - юглон

На хроматограмме идентифицированы пики галловой и хлорогеновой кислот, гиперозида и нафтохинона - юглона, которые совпадают с таковыми пиками стандартных образцов Приведенная методика включена в раздел «Подлинность» проекта ФС на ореха грецкого листья свежие и высушенные Поскольку для разработки методов количественного определения БАВ необходимы стандартные образцы, то представлялись актуальными исследования, связанные с изучением компонентного состава нафтохинонов листьев ореха грецкого и выделение преобладающего соединения, как возможного стандартного образца Использование метода ВЭЖХ позволило определить, что этим соединением является 5-гидрокси-1,4-нафтохинон - юглон Следующим этапом исследований явилась разработка схемы его выделения, очистки и установления структуры

Юглон

(5-окси-1,4-нафтохинон) альфа-гидроюглон бэта-гидроюглон

Выделенный комплекс нафтохинонов и очищенный юглон были исследованы методами ВЭЖХ, УФ- спектрофотометрии, ЯМР - С13 спектроскопии и определены его растворимость, температура плавления (Таблица 3)

Данные, представленные в таблице свидетельствуют о схожести физико-химических характеристик СО юглона (АЫпсЬ № Н 47003) и соединения (Ю1), выделенного из листьев ореха грецкого

Это подтверждает правильность разработанного способа выделения производных нафтохинона из ЛРС и эффективность способов их очистки

Таблица 3

Сравнительная характеристика юглона - стандартного образца и

юглона, выделенного их листьев ореха грецкого

Характеристика Данные анализов СО юпона Данные анализов юглона (соединение Ю1)

Описание порошок оранлчевого, или оранжево-коричневого цвета порошок оранжево-коричневого цвета

Раст воримость растворяется в оргапиче-скнч растворите тях, спирте этиловом, при растворении в 5 % хлороформе раствор становится светто-коричне-вым растворяется в органических растворитетях, спирте, при растворении в 5 % хлороформе раствор становиться светло-коричневым

Температура плавления 161-163° С 162-163°С

УФ-спек-тр 2 максимума 250нм±2 нм, 425±2 нм 2 максимума 250нм±2 нм, 425±2 нм

Спектры ЯМР- 13 С химические сдвиги ядер в стабом поле-191,3м д и 184,6 м д , С5 - в ацегоне-Дб -161,6 и 161,8 м д химические сдвиги ядер 'Зс совпадают с аналогичным сдвигом ядер 'Зс СО юглона

С использованием СО галловой кислоты, гиперозида и юглона методом ВЭЖХ идентифицированы и количественно определены суммы дубильных веществ в пересчете на галловую кислоту, суммы флавоноидов в пересчете на гиперознд и суммы нафтохинонов в пересчете на юглон Результаты представлены в таблице 4

Таблица 4

Результаты количественного определения содержания

основных групп БАВ в ореха грецкого листьях_

№ Содержание суммы Содержание суммы Содержание суммы

серии флавоноидов дубичьных веществ в нафтохинонов

в пересчете на пересчете на в пересчете на

гиперозид), % галловую кислоту, % юглон, %

Свежее СухоеЛРС Свежее Сухое Свежее Сухое

ЛРС ЛРС ЛРС ЛРС ЛРС

I 1,243 0,921 14,826 12,981 5,339 4,221

2 1,226 0,921 14,921 13,106 5,167 4,204

3 1,237 0,940 15,058 12,845 5,387 4,245

4 1,246 0,921 14,675 12,882 5 122 4,225

5 1,225 0,953 14,604 12,981 5,195 4,243

Хер 1,235 0,931 14,816 12,956 5,242 4,227

£,% ±2,6 ±2,6 ±3,3 ±0,97 ±3,3 ±0,57

Норма не менее не менее не менее не менее не менее не менее

, % 1% 0,9 % 14% 12 % 5 % 4,2 %

По результатам определения содержания БАВ предложены следующие нормы для проектов ФС содержание дубильных веществ (в пересчете на галловую кислоту) не менее 14 % - для свежего и не менее 12% для высушенного сырья, содержание флавоноидов (в пересчете на гиперозид) не менее 1 % - для свежего и не менее 0,9 % - для высушенного сырья, содержание нафтохинонов (в пересчете на юглон) не менее 5 % - для свежего и не менее 4,2% - для высушенного сырья,

С использованием разработанных методов качественного и количественного анализа определены оптимальные сроки заготовки сырья и срок годности листьев ореха грецкого свежих и высушенных

Динамика накопления БАВ была изучена на примере галловой кислоты и юглона в ореха грецкого листьях свежих в зависимости от фазы вегетации Исследование проводили методом ВЭЖХ, описанным ранее Полученные данные представлены на рисунке 2

[

30

и 25 <

2 20 £ 3

2. 15 | ю

1 5 0

распускание листьев апрель

цветение конец апреля-начало мая

начало плодоношения

конец плодоношения август-сентябрь

Фазы вегетации

Рис. 2. - Динамика накопления нафтохинонов (1) и дубильных веществ (2) в листьях ореха грецкого.

Согласно полученным данным максимальное содержание дубильных веществ и нафтохинонов в листьях ореха грецкого отмечено в фазу цветения. Именно в этот (июнь - июль) период и следует осуществлять заготовку сырья. На основании полученных данных составлены инструкции по заготовке листьев ореха грецкого свежих и высушенных.

Результаты комплексных исследований позволяют сделать вывод о том, что сырье листья ореха грецкого свежие необходимо хранить не более 24 часов при температуре не выше 4° С в холодильной камере, а высушенные листья - не более 3 лет в сухом, защищенном от света месте при температуре не выше 15 °С. Полученные данные вошли в раздел проекта ФС «Срок годности».

При определении содержания основных группы БАВ в свежем и высушенном сырье было установлено, что содержание дубильных веществ в обоих видах сырья находиться на одном уровне, однако содержание флавоноидных соединений и нафтохинонов в свежем сырье выше. Это обусловлено биохимическими процессами, протекающими в сырье при его сушки и, прежде всего, эти процессы оказывают влияние на нафтохиноны, структура которых достаточно лабильна, и, как отмечалось ранее, они легко трансформируются в гидроксиюглоны.

4.Получение настоек гомеопатических матричных Юглане и разработка методов их стандартизации

На основании данных проведенного анализа ЛРС и в соответствии с требованиями ОФС 42-0027-05 «Настойки гомеопатические матричные» для приготовления НМГ из свежего ЛРС использовали метод 2, так как влажность свежего ЛРС составляет менее 70 % и не установлено наличие в нем эфирных масел и слизей. Для получения НГМ из высушенного сырья использовали метод 4. Полученные НГМ Юглане подвергали анализу с целью выбора методик определения их качества.

Для подтверждения параметров качества НГМ из свежего и высушенного сырья был использован принцип сквозной стандартизации. Так, для характеристики подлинности НГМ Юглане предложена реакция Борнтрегера на наличие нафтохинонов. Представляется целесообразным включить эту реакцию в раздел «Подлинность» ФС на НГМ как из свежего, так и из высушенного сырья.

Дополнительно в НД на НГМ предложено проведение реакции с раствором йода для подтверждения наличия спирта этилового и спектрофотометрия в УФ- и видимой областях спектра с использованием разведения исходных НГМ спиртом этиловым 70 % в соотношении 1:75, с целью определения наличия фенольных соединений. Согласно полученным данным спектр поглощения исследованных НГМ Юглане имеет 2 максимума поглощения в интервале

Рис. 3. - УФ-спектр НГМ Юглане: 1 - из свежих листьев ореха грецкого; 2 - из высушенных листьев ореха грецкого

Для уточнения состава фенольных соединений были разработаны условия проведения ТСХ как J1PC, так и настоек на их основе с использованием в качестве неподвижной фазы хроматографнческич пластин «KISELGEL 60 F 254» размером 20x20 см, в качестве подвижной фазы смеси растворителей этилацетат-метипэтилкегон-муравьиная кислота-вода в

соотношении 10 6 2 2 Результаты исследования ТСХ НГМ Югланс на присутствие фенольных соединений представлены в таблице 5

Разработанная методика ВЭЖХ анализа фенольных соединений на хроматографе жидкостном с ультрафиолетовым детектором LC-10AVP производства фирмы SHIMADZU, колонка 70RBAX 80А Extend-C 18, 5 цм производства фирмы Agilent (США) позволила определить качественно и количественно содержание БАВ как в J1PC, так и в НГМ, попученных на их основе Результаты количественного определения основных БАВ в НГМ из свежего и высушенного сырья представлены в таблице 6

По результатам определения содержания БАВ предложены следующие нормы по этим показателям для проектов ФС содержание дубильных веществ (в пересчете на галловую кислоту) не менее 10 % - для НГМ из свежего и не менее 9% для высушенного сырья, содержание флавоноидов (в пересчете на гиперозид) не менее 0,7 % - для НГМ из свежего и не менее 0,6 % -для НГМ из высушенного сырья, содержание нафтохинонов (в пересчете на юглон) не менее 3,7 % - для НГМ из свежего и не менее 2,9 % - для НГМ из высушенного сырья

Таблица 5

Результаты исследования ТСХ НГМ на присутствии фенольных

соединений

№ Объект Номер Значения Rf Идентифициро-

п/п исследования зоны ванное вещество

ЛС1 0,29 рутин

НГМ ЛС2 0,78 кверцетин

1 из свежего лез 0,76 чютеолин

сырья ЛС4 0,86 галловая кислота

ЛС5 0,33 гиперозид

НГМ ЛВ1 0,29 рутин

ЛВ2 0,82 кверцетин

2 ного сырья ЛВЗ 0,76 лютеолин

ЛВ4 0,86 галловая кислота

ЛВ5 0,30 гиперозид

Таблица 6

Результаты количественного определения основных групп БАВ в НГМ Югланс

№ Содержание суммы Содержание суммы Содержание суммы

серии флавоноидов в дубильных веществ в пафгохинонов в

пересчете на пересчете на галловую пересчет на км тон, %

гиперозид, % кислоту, %

НГМ из НГМ из НГМ из НГМ из НГМ из НГМ из

свежего сухого свеже! о сухого свежего сухо] о

ЛРС ЛРС ЛРС ЛРС ЛРС ЛРС

1 0,731 0,604 11,385 9,221 3,767 3,042

2 0,722 0,625 11,223 9,103 3,766 3,042

3 0,733 0,667 10,829 9,164 3, 821 2,983

4 0,725 0,601 10,274 9,056 3,784 2,992

5 0,727 0,622 11,003 8,924 3,743 2,983

Хер 0,728 0,624 10,943 9,094 3,776 3,008

£.% 0,94 4,91 3,97 1,56 0,99 1,29

Норма не менее не менее не менее не менее не менее не менее

0,7% 0,6% 10% 9% 3,7% 2,9%

Также в настойках определены плотность, сухой остаток, содержание тяжелых металлов в соответствии с требованиями ГФ XI и установлены условия и сроки их хранения (таблицы стабильности) Норма по тотности НГМ предложена - от 0,951 до 0,980 для НГМ из свежего сырья и от 0,953 до 0,981 - из высушенного, по сухому остатку - не менее 3% и не менее 1% соответственно

Микробиологические испытания проводили с

предварительным снятием антимикробной активности путем разведения НГМ Определена категория чистоты - 3 2

Б.Исследовання основных видов фармакологической активности НГМ Югланс

В рамках фармакологических исследований на животных было проведено определение острой токсичности настоек гомеопатических матричных и установления наличия

противовоспалительной (антипролифератнвной, антиэкссудативной и антиалыеративной) активности

Антимикробное действие определялось методом биотесшрования, с использованием специфических ферментных тест-сисгем в опытах in vitro В результате проведенных исследований установлено, что настойки матричные гомеопатические из свежич и высушенных листьев ореха грецкого проявляют специфическое сродство к антиоксидантным ферментам, угнетая в разной степени активность ГП и КАТ, что создает условия для окислительного стресса в бактериальных клетках

Таким образом, в основе фармакологического действия НГМ Юг пане, полученных из свежих и высушенных листьев ореха грецкого, возможно, наряду с другими механизмами, лежит их способность yi нетать ферменты системы антиоксидантной защиты Снижение скорости КАТ и ГП - реакций приводит к накоплению активных форм кислорода в клетках микроорганизмов, создавая условия для усиления перекисного окисления полиненасыщенных жирных кислот клеточной мембраны, окислению белковых структур и нуклеиновых кислот В результате, образующиеся в матриксе клетки кислородные радикалы, окистительный стресс и недостаточная активность ферментов антиоксидантной защиты приводит к остановке роста и гибели микроорганизмов и свидетельствует о наличии выраженного антимикробного действия

Острую токсичность настойки гомеопатической матричной листьев 1рецкого ореха оценивали на белых нелинейных мышах-самцах массой тела 18-22 г Дтя определения средней летальной дозы (LD^o) использовали метод Миллера-Тейнтера Установлена низкая токсичность настоек

Сделан вывод о наличии выраженного противовоспалительного действия, близкого к диклофенаку, по проявляемым антиэкссудативным и антипролиферативным эффектам НГМ из листьев грецкого ореха, ее разведения D3 и С1 обладают антиульцерогенным действием, сравнимым по активности с гастропротектором - «Сукральфат» Таким образом, показана целесообразность использования исследованных гомеопатических растительных средств в качестве гастропротектора

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1 Впервые проведено морфолого-анатомическое изучение сырья ореха грецкого листьев свежих и высушенных, выявлены основные диагностические признаки и изготовлены микрофотографии Разработана номенклатура числовых показателей свежих и высушенных ореха грецкого листьев

2 Исследован химический состав ореха грецкого листьев (свежих и высушенных) и установлено наличие в них таких групп БАВ, как дубильные вещества, фенолкарбоновые кислоты, флавоноиды, нафтохиноны Разработаны методики качественного и количественного анализа изучаемого сырья по содержанию в нем флавоноидов (гиперозид), дубильных веществ (галловая кислота), нафтохинонов (юглон), а также разработана схема выделения юглона и определены его основные физико-химические характеристики

3 Изучена динамика накопления БАВ в ореха грецкого листьях, установлено, что максимум накопления действующих веществ приходится июнь - июль

4 Предложена технология получения НГМ Югланс их свежего и высушенного сырья и проведено изучение их химического состава с использованием методик химического и физико-химического анализа, разработаны методики контроля качества НГМ Югланс

5 Определены основные показатели качества настоек плотность, сухой остаток, подлинность, количественное содержание, содержание тяжелых металлов, определены условия их хранения и установлены сроки годности

6 Проведено определение фармакологической активности настойки гомеопатической матричной Югланс и ее основных фармакологически активных компонентов Установлено наличие противовоспалительных, ранозаживляющих, гастропротекторных и антимикробных свойств

7 Разработаны проекты ФС на «Ореха грецкого листья», «Ореха грецкого листья свежие», «Juglans regia (Juglans) настойка гомеопатическая матричная» «Juglans regia (Juglans) Dl Настойка гомеопатическая матричная» Разработан проект инструкции по заготовке листьев ореха грецкого

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Еникеева Р А , Даргаева Т Д , Сокольская Т А Разработка методов оценки качества настойки матричной гомеопатической «Юглон» / Материала региональной научно-практической конференции с международным участием, посвященной 40-летию фармацевтического факультета КГМУ «Достижения, перспективы фармацевтической науки п практике» - Курск, 2006 - С 285-288

2 Сокольская Т А, Еникеева Р А Настойка матричная гомеопатическая листьев грецкого ореха в гомеопатической практике / Тез докл XVI Московской международной гомеопатической конференции «Развитие гомеопатического метода в современной медицине» (27-29 января 2007г) - M , 2006 - С 118-119

3 Еникеева Р А , Сокольская Т А, Даргаева Т Д Фитохимический анализ гомеопатических матричных настоек из листьев ореха грецкого/ сборник научных трудов конгресса «Традиционная медицина - 2007» - M , 2007 -С 54-55

4 Некоторые гомеопатические препараты в отечественной медицинской практике / Саканян К M , Еникеева Р А , Гаккель В А , Сокольская ТА // Вестник Российской Военно-медицинской академии (приложение части I) - 2007, №1 (17) - С 480-481

5 РА Еникеева, Т А Сокольская, Т Д Даргаева «К характеристике микродиагностических признаков ореха грецкого листьев» / Сб научных трудов «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» - Пятигорск, 2007 - С 44-46

6 Еникеева Р А , «Орех грецкий Juglans tegia L и его применение в медицинской, в том числе гомеопатической практике» / Сб научных трудов «Российский гомеопатический съезд» -М , 2007 -С 216-217

7 Р А Еникеева, Т А Сокольская, Т Д Даргаева Орех грецкий и его препараты в современной гомеопатической практике // Вестник Бурятского Государственного Университета (серия «Медицина, физкультура, спорт») - 2007г - вып 8 - С 32-34

Подписано к печати 12 05 2008 г Ф А5 Бум офс Печать офсетная Тираж 100 экз Заказ № 176

Отпечатано в типографии ООО "Полиграфист" Ленинградская обл, г Шлиссельбург,

ул 1 Мая, д 20а тел (812)975-11-93,(81362)77-586

В последнее десятилетие во всем мире наблюдается постоянный рост спроса населения на эффективные и безопасные лекарственные средства природного происхождения в связи с увеличением числа хронических заболеваний, при которых необходима длительная терапия. В настоящее время как в мировой так и в отечественной фармацевтической практике достаточно широко используются фитопрепараты, в том числе гомеопатические, ассортимент которых постоянно пополняется за счет регистрации препаратов отечественного и зарубежного производства, составляя около 40% от общего числа применяемых лекарственных средств. Следует отметить, что генофонд лекарственных растений, активно используемых в народной медицине насчитывает около 1200 видов, однако в РФ перечень разрешенных к применению растительных объектов включает около 260 видов, что свидетельствует о целесообразности проведения комплексных исследований по выявлению и изучению перспективных растительных объектов, произрастающих на территории России. Поэтому существует необходимость разработки стандартов качества (ФС, ФСП, НД), в которых должны быть сформулированы требования, предъявляемые к качеству сырья, препаратов во всех лекарственных формах и стандартов. К числу таких объектов следует отнести орех грецкий Juglans regia L. сем. Ореховых Juglandaceae A.Rich ex Kunth.

Изучение номенклатуры лекарственных и лечебно-профилактических средств, представленных на отечественном фармацевтическом рынке и рекомендованных к применению в качестве антимикробных, противовоспалительных средств при заболеваниях пищеварительной, мочеполовой, лимфатической, а также кровеносной систем, свидетельствует о том, что они представлены преимущественно препаратами синтетического происхождения, а именно антибиотиками и сульфаниламидами. Вместе с тем листья, а также олиственные молодые побеги с цветками ореха грецкого широко используются в народной и официнальной медицине зарубежных стран, как в аллопатической так и в гомеопатической практике в качестве противовоспалительного, ранозаживляющего, антимикробного средства. В литературных источниках есть упоминание и об использовании незрелых плодов грецкого ореха, в ряде случаев, отмечено наличие у них цитостатической активности. Чаще всего используются спиртовые настойки и экстракты (сухие, жидкие), реже - водные вытяжки. При этом применение может быть как наружным (мази, компрессы, повязки и т.д.), так и внутренним (капли, микстуры и т.д.). Так листья ореха грецкого в форме порошка для присыпок, отвара для компрессов, примочек, полосканий или ванн применяются при таких заболеваниях как ревматизм, подагра, заболевания десен, кожные дерматиты или гнойные раны, лимфадениты и маститы. При заболеваниях желудочно-кишечного тракта, фурункулезе, туберкулезе, геморройе, глистной инвазии, заболеваниях женской половой системы, а также при детских рахитах используются различные вытяжки из листьев (настой, настойка, экстракт, сок). В гомеопатической практике целого ряда зарубежных стран (Германии, Франции, Великобритании, Индии и др.) применяется настойка гомеопатическая матричная ореха грецкого, получаемая из олиственных побегов в период цветения и ее разведения в качестве средства антропософского терапевтического направления лечения. Эта настойка используется для получения гранул, капель, мазей, суппозиториев и др. лекарственных форм. Выпуск препаратов на основе листьев ореха грецкого осуществляется на территории Украины (препарат Карион, настойка, суспензия и мазь Юглон). В России листья ореха грецкого находят применение только в народной медицине, НМГ из свежих и высушенных ореха грецкого листьев также находит применение, но нормативная документация на настойку и JIPC отсутствует.

В связи с этим представляется целесообразным изучение возможности получения настойки гомеопатической матричной на основе отечественного сырья листьев ореха грецкого (свежих и высушенных) и разработка нормативной документации на лекарственное растительное сырье и настойку.

Целью исследования является фармакогностическое изучение ореха грецкого листьев, получение настойки гомеопатической матричной Югланс на его основе и их стандартизация.

Для достижения указанной цели необходимо решить следующие основные задачи:

1. Провести фармакогностическое исследование свежих и высушенных ореха грецкого листьев, исследовать основные группы биологически активных веществ (БАВ) и разработать методики их качественного и количественного определения.

2. Изучить динамику накопления БАВ с целью установления оптимальных сроков заготовки сырья, составить проекты фармакопейных статей (ФС) на свежее и высушенное сырье ореха грецкого, а также проект инструкции по заготовке сырья.

3. Получить НГМ Югланс и изучить их компонентный состав БАВ.

4. Разработать методики стандартизации НГМ Югланс и составить проекты ФС на НГМ из свежего и высушенного сырья ореха грецкого

5. Провести предварительное фармакологическое исследование НГМ Югланс.

Научная новизна исследования заключается в том, что на основании макро- и микроскопического анализа листьев ореха грецкого впервые установлены диагностические признаки сырья. Проведено сравнительное фармакогностическое изучение ореха грецкого листьев свежих и высушенных и установлено, что количественное содержание флавоноидов, дубильных веществ и производных нафтохинона в свежем сырье несколько выше, чем в высушенном.

Подобраны условия качественного и количественного анализа БАВ в лекарственном растительном сырье (JIPC) с применением современных методов физико-химического анализа: УФ-спектроскопии и различных видов хроматографии (ТСХ, ВЭЖХ). С использованием разработанных методик определен качественный состав и количественное содержание в ЛРС флавоноидов, дубильных веществ, нафтохинонов (юглона). Установлены различия в количественном содержании отдельных БАВ в зависимости от фазы вегетации ореха грецкого. Предложена схема получения стандартного образца юглона.

Разработаны методики стандартизации ореха грецкого листьев Определены оптимальные сроки заготовки JIPC, предназначенного для гомеопатической практики, а также проведены исследования по изучению перспективности использования НГМ, полученной из свежего и высушенного JIPC. Получены НГМ Югланс из двух видов JIPC, разработаны основные показатели их качества. При этом установлено, что качественный состав настоек идентичен, фармакологическая активность сопоставима. Практическая значимость.

На основании проведенных исследований разработаны:

• Инструкция по заготовке листьев ореха грецкого высушенных и свежих; в проект ФС «Ореха грецкого листья свежие»;

• проект ФС «Ореха грецкого листья»;

• проект ФС «Juglans regia (Juglans). Настойка матричная гомеопатическая»;

• проект ФС «Juglans regia (Juglans) D1. Настойка матричная гомеопатическая».

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ

В ИЛ АР РАСХН по «Программе фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса РФ 2006-2010 гг.».

Апробация работы. Результаты экспериментальных исследований доложены на научно-практических конференциях: XVI Московской международной гомеопатической конференции (Москва, 2006), Региональной научно-практической конференции, посвященной 40-летию фармацевтического факультета КГМА (Курск, 2006), Конгрессе, посвященному 30-летию со дня открытия ЦНИИР «Традиционная медицина 2007г» (Москва, 2007), VIII Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики, лечение больных в многопрофильном лечебном учреждении» (СПб,2007), III Всероссийском гомеопатическом съезде (Москва, 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Положения, выносимые на защиту.

1.Результаты фармакогностического изучения ореха грецкого листьев свежезаготовленных и высушенных.

2.Результаты фитохимического анализа и разработки методик стандартизации сырья ореха грецкого, а также изучения динамики накопления БАВ.

4. Результаты по разработке показателей качества НГМ Югланс.

5.Результаты определения основных видов фармакологической активности НГМ Югланс, включая острую токсичность.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Впервые проведено морфолого-анатомическое изучение сырья ореха грецкого листьев свежих и высушенных, выявлены основные диагностические признаки и изготовлены микрофотографии. Разработана номенклатура числовых показателей свежих и высушенных ореха грецкого листьев.

2. Исследован химический состав ореха грецкого листьев (свежих и высушенных) и установлено наличие в них таких групп БАВ, как дубильные вещества, фенолкарбоновые кислоты, флавоноиды, нафтохиноны. Разработаны методики качественного и количественного анализа изучаемого сырья по содержанию в нем флавоноидов (гиперозид), дубильных веществ (галловая кислота), нафтохинонов (юглон), а также разработана схема выделения юглона и определены его основные физико-химические характеристики.

3. Изучена динамика накопления БАВ в ореха грецкого листьях, установлено, что максимум накопления действующих веществ приходится июнь — июль.

4. Предложена технология получения НГМ Югланс их свежего и высушенного сырья и проведено изучение их химического состава с использованием методик химического и физико-химического анализа, разработаны методики контроля качества НГМ Югланс.

5. Определены основные показатели качества настоек: плотность, сухой остаток, подлинность, количественное содержание, содержание тяжелых металлов, определены условия их хранения и установлены сроки годности

6. Проведено определение фармакологической активности настойки гомеопатической матричной Югланс и ее основных фармакологически активных компонентов. Установлено наличие противовоспалительных, ранозаживляющих, гастропротекторных и антимикробных свойств.

7. Разработаны проекты ФС на: «Ореха грецкого листья», «Ореха грецкого листья свежие», «Juglans regia (Juglans) настойка гомеопатическая матричная» «Juglans regia (Juglans) D1. Настойка гомеопатическая матричная». Разработан проект инструкции по заготовке листьев ореха грецкого.