Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Фармакогностическое исследование плодов бархата амурского с целью контроля качества и стандартизации сырья

На правах рукописи

Наумова Ольга Анатольевна

Фармакогностическое исследование плодов бархата амурского с целью контроля качества и стандартизации сырья

14.04.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

24 АПР 2014

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Москва - 2014г.

005547678

005547678

Диссертационная работа выполнена в ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства Здравоохранения Российской Федерации.

Научный руководитель:

Попов Дмитрий Матвеевич - доктор фармацевтических наук, профессор, главный научный сотрудник лаборатории фармакогнозии НИИ Фармации ГБОУ ВПО ПМГМУ имени И.М. Сеченова Министерства Здравоохранения Российской Федерации.

Официальные оппоненты:

Патудин Александр Васильевич - доктор фармацевтических наук, профессор, вице-президент Российского гомеопатического общества

Копытько Янина Фёдоровна - кандидат фармацевтических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории аналитической химии отдела стандартизации ГНУ ВИЛАР РАСХН

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Ярославская государственная медицинская академия» Министерства Здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «28» мая 2014 г. в 14-00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.040.09 при ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства Здравоохранения Российской Федерации по адресу: 119019, г. Москва, Никитский бульвар, д. 13

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова (ЦНМБ) по адресу: 117997, г. Москва, Нахимовский проспект, д. 49 и на сайте ГБОУ ВПО ПМГМУ им. И.М. Сеченова www.mma.ru

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета Д 208.040.09

доктор фармацевтических наук, профессор

Демина Наталья Борисовна

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Перед современной фармацевтической наукой поставлена задача создания новых и совершенствования существующих препаратов, обладающих высокой фармакологической активностью, малой токсичностью и наиболее полным обеспечением населения эффективными лекарственными средствами. Разрабатываются новые фитопрепараты как в виде лекарственных средств, так и в виде биологически активных добавок. Нами в качестве объекта исследования были взяты плоды бархата амурского. В ВИЛАРе в 60-х годах проводили исследования коры и луба бархата амурского, в 90-е -листьев. Были разработаны препараты «Берберин» - для лечения болезней печени и препарат «Флакозид» для лечения вируса герпеса. На это лекарственное растительное сырье была создана нормативная документация.

Однако плоды бархата амурского так подробно не исследовались. Нормативная документация на них отсутствует. Данные о химическом составе недостаточны. Эти проблемы требуют изыскания и исследования новых источников для создания нормативной документации и получения новых фитопрепаратов и биологически активных добавок.

В народной медицине эти плоды используют при сахарном диабете второго типа, как противовоспалительное средство. В 2000-х годах была разработана биологически активная добавка (БАД) в виде жидкого экстракта, основное внимание которой было акцентировано на гипогликемическом действии и доступности растительного сырья. Его основой стал экстракт из плодов бархата амурского. БАД утверждена институтом питания. Используется с основными лекарственными средствами как вспомогательное средство при лечении заболевания сахарным диабетом II типа.

Все изложенное выше позволяет заключить, что углубленное фарма-когностическое исследование данного растительного сырья — плодов бархата амурского является актуальной задачей для использования его в качестве лекарственного средства.

Степень разработанности темы исследования. Несмотря на то, что луб

и листья бархата амурского активно изучались, плодам не было уделено должного внимания. Отсутствуют литературные данные о подробном химическом составе плодов и методах их анализа. Не был установлен количественный состав биологически активных веществ плодов.

Цель настоящего исследования. Целью данной работы является углубленное фармакогностическое изучение сырья, определение морфолога - анатомических признаков и химического состава плодов бархата амурского; разработка методик контроля качества и стандартизации плодов бархата амурского с использованием физических, химических и физико - химических методов анализа. Внедрение нормативного документа на плоды бархата амурского для последующего создания препаратов.

Постановка задач и выбор средств для их решения. Для осуществления поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить литературу по фармакогностическим признакам, фармакологии, химическому составу, методам анализа основных действующих веществ плодов бархата амурского.

2. Исследовать морфологические и анатомо - диагностические признаки плодов бархата амурского.

3. С помощью цветных реакций и метода хроматографии в тонком слое сорбента установить качественный состав плодов бархата амурского.

4. Разработать методики идентификации и количественного определения флавоноидов в плодах бархата амурского.

5. С помощью современных физико - химических методов анализа исследовать качественный состав и количественное содержание аминокислот, свободных и связанных углеводов, эфирного масла.

6. Разработать методики идентификации и количественного определения аскорбиновой, галловой кислот и галлотанинов методом ВЭЖХ, а так же для качественного и количественного определения сапонинов и алкалоидов.

7. На основе полученных результатов разработать проект фармакопейной статьи на плоды бархата амурского для включения в ГФ XII издания.

Решение задач осуществлялось путем обобщения данных литературы и проведения экспериментальных исследований.

Научная новизна. Впервые в результате проведенных исследований методом ВЭЖХ получены новые данные о качественном составе биологически активных веществ в плодах бархата амурского (флавоноиды, аскорбиновая и галловая кислоты, галлотанины, кумарины, сапонины и эфирные масла). Полученные результаты согласуются с нашими исследованиями с использованием метода хроматографии в тонком слое сорбента. Разработаны методики и подобраны условия количественного определения с использованием метода ВЭЖХ в плодах бархата амурского: флавоноидов, аскорбиновой кислоты, галловой кислоты, галлотанинов. Разработана методика количественного определения флавоноидов спектрофотометрическим методом в плодах. Полученные результаты согласуются с данными, полученными методом ВЭЖХ. С помощью аминокислотного анализатора выявлен качественный и количественный состав аминокислот плодов бархата амурского. Обнаружено 19 аминокислот. В процессе исследования качественного и количественного состава углеводов плодов бархата амурского методом ВЭЖХ установлено, что в качестве свободных Сахаров присутствуют фруктоза и глюкоза, а в качестве связанных Сахаров - глюкоза и ксилоза. В плодах определено количественное содержание алкалоидов. Выявлены диагностически значимые анатомические признаки, позволяющие проводить диагностику ЛРС плодов бархата амурского.

Теоретическая значимость работы. Использование физико - химических исследований позволяет установить оптимальные технологические параметры производственного процесса для экстракции биологически активных веществ из плодов бархата амурского. Представленный в работе экспериментально - практический материал может служить теоретической базой для исследования и создания лекарственных препаратов на основе лекарственного растительного сырья «Бархата амурского плоды». Использование предложенных физико-химических методов анализа в контрольно-аналитических лабораториях позволит систематизировать контроль качества и стандартизацию плодов бархата амурского.

Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований разработаны и внедрены:

- методики идентификации флавоноидов в плодах бархата амурского (проект ФС «Бархата амурского плоды»).

- методики количественного определения флавоноидов в плодах бархата амурского (проект ФС «Бархата амурского плоды).

Разработан и составлен проект ФС «Бархата амурского плоды» для включения в ГФ ХП издания (письмо ФГБУ «НЦ ЭСМП» Минздрава РФ № 16453 от 07.11.2013). Материалы исследования внедрены в учебный процесс кафедры фармакогнозии Первого МГМУ им. И.М. Сеченова в разделе «Лекарственные растения, содержащие флавоноиды и ксантоны» (Акт внедрения).

Методология и методы исследования. Объектами исследования служили плоды, собранные в стадии полного созревания, высушенные в соответствии с требованиями сборника «Методические указания по сбору, сушке и хранению сырья». При выполнении работы были использованы методы хроматографии в тонком слое сорбента, спектрофотометрии, ВЭЖХ. Статистическую обработку результатов исследований проводили в соответствии с ГФ XI. Микроскопический анализ сырья проводили в соответствии с техникой и требованиями, описанными в ГФ XI изд.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 научных статей, полностью отражающих содержание диссертации; из них 4 статьи в журналах, включенных в перечень ведущих периодических изданий ВАК РФ.

Степень достоверности результатов. Для получения результатов по качественному и количественному содержанию основных БАВ были проведены исследования по анализу семи серий лекарственного растительного сырья. Сравнение полученных результатов с применением методов статистической обработки позволяет считать их достоверными.

Апробация диссертации. Основное положение диссертации доложено на четырех научных конференциях НИИ фармации: на научно - практической конференции «Стандартизация готовых лекарственных средств», Москва, 27.05.2011г; на конференции молодых ученых НИИ фармации, Москва, ноябрь

2012г; на научно - практической конференции «Современные аспекты использования растительного сырья и сырья природного происхождения в медицине», Москва, 28.02.2013г; на Всероссийском научном симпозиуме «Медицинская антропология в России и за её пределами», Москва, 03.07.2013г. Апробация диссертации прошла на конференции ученых НИИ фармации ГБОУ ВПО ПМГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава РФ, 23.04.2013.

Личный вклад автора. При непосредственном участии автора были определены цели и задачи работы, разработаны методические подходы к их вывыполнению; был проведен сбор, обобщение и анализ литературных данных. Диссертант принимал непосредственное участие при разработке методик идентификации и количественного содержания основных БАВ в исследуемом объекте. Автору принадлежит ведущая роль при проведении экспериментальных исследований, статистической обработке и анализе полученных результатов, написании публикаций и нормативной документации. Диссертация и автореферат написаны лично автором.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 -«Фармацевтическая химия, фармакогнозия». Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 2,3 паспорта фармацевтическая химия, фармакогнозия.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематикой и планом: «Развитие научных и научно-методических основ, базовых и инновационных подходов при разработке, внедрении и применении лекарственных средств». № 01201261653.

Основные положения, выносимые на защиту:

- Разработаны методики качественного и количественного определения флавоноидов, сапонинов, аскорбиновой, галловой кислот, галлотанинов и алкалоидов для стандартизации изучаемого растительного сырья.

-Определен и уточнен качественный состав биологически активных веществ в плодах бархата амурского, позволяющий рассматривать их в качестве лекарственного сырья.

- Получены результаты по химическому и количественному содержанию свободных и связанных углеводов и аминокислот в плодах бархата амурского.

-Установлены морфолого-анатомические признаки плодов бархата амурского, позволяющие проводить идентификацию растительного сырья.

-Получены результаты по количественному содержанию БАВ в плодах.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 154 страницах машинописного текста, содержит 31 таблицу и 37 рисунков, приложение 1,2.

Работа состоит из введения, обзора литературы, четырех экспериментальных глав. Библиография из 219 наименований, из которых 46 на иностранных языках. Во введении раскрыта актуальность темы, определены цели и задачи исследования, сформированы научная новизна и практическая значимость.

В первой главе на основании данных литературы рассмотрены сведения о фармакогностическом описании, химическом составе, фармакологии и методах анализа основных действующих веществ плодов бархата амурского.

Во второй главе рассмотрены результаты исследования морфологических и анатомо-диагностических признаков плодов бархата амурского.

Третья глава посвящена исследованию качественного состава и количественного содержания углеводов, аминокислот и эфирного масла в плодах бархата амурского.

В четвертой главе излагаются результаты исследований по установлению качественного состава и количественному содержанию аскорбиновой кислоты, галлотанинов и флавоноидов в плодах бархата амурского методом ВЭЖХ.

В пятой главе приводятся результаты по качественному и количественному определению флавоноидов, сапонинов и алкалоидов в плодах бархата амурского. Результаты, полученные при проведении исследований, обработаны статистически и представлены в таблицах на рисунках, выражены в соответствующих формулах, которые приведены в тексте работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объектом исследования служили собранные в период полного созревания и высушенные плоды дикорастущего многолетнего растения бархат амурский (РЬе11ос1епс1гоп amuren.se), сем. рутовые (КШасеае). Плоды имеют шаровидную форму до 7-8 мм в поперечнике, черный цвет, ароматный запах и жгучий вкус.

Данные об анатомическом строении плодов отсутствуют. С целью разработки нормативной документации необходимо было изучить морфологическое строение и анатомические признаки плодов. Для микроскопического исследования готовили поперечные срезы цельных плодов. Готовые препараты изучали под микроскопом МБИ - 3. Результаты документировали микрофотографиями с помощью фотоаппарата «Зенит» с микронасадкой МФН - 12.

При изучении анатомического строения были установлены диагностические признаки плодов бархата амурского в цельном и измельченном сырье: эпидермис окончатой структуры с трех - шестиугольными клетками, с утолщенными стенками и с устьицами аномоцидного типа или с чечевичками; округлые или овальные эфирномасличные вместилища; коллатеральные пучки со спиральными, сетчатыми и пористыми сосудами; каменистые клетки и крупные призматические кристаллы неправильной формы и сростки кристаллов оксалата кальция около проводящих пучков; группы сильноутолщенных волокон, расположенных в разных направлениях, с друзами, призматическими кристаллами и каменистыми клетками вытянутой формы; волоски с бородавчатой кутикулой.

Рис. 1 Эпидермис плодов с устьицами, полуразрушенными устьицами, чечевичками; (ув. х 125)

Рис. 2 Каменистые клетки (слева), призматические кристаллы и их сростки (справа) в мезокарпии ( ув. х 200).

В связи с недостаточной изученностью химического состава плодов бархата амурского, а также необходимостью разработки методик количественного определения действующих веществ, было проведено изучение качественного состава данного вида лекарственного растительного сырья.

Результаты исследований использованы при разработке проекта фармакопейной статьи «Бархата амурского плоды».

Исследование качественного состава плодов бархата амурского проводили в несколько этапов: приготовление спирто-водного извлечения, фракционирование природных соединений, качественная идентификация веществ. Извлечение из плодов бархата амурского получали с помощью нагревания на кипящей водяной бане с обратным холодильником с 70 % этанолом. Фракционирование природных соединений проводили последовательной обработкой извлечения хлороформом, этилацетатом и бутанолом. Качественный состав природных соединений определяли цветными реакциями и с помощью метода хроматографии в тонком слое сорбента. Использовали качественные реакции приведенные в ГФ XI и XII изд., а также приведенные в литературе. При использовании метода ТСХ в качестве сорбента применяли «Сорбфил», в качестве систем растворителей и детектирующих реагентов были использованы системы, соответствующие классу исследуемых соединений.

На основании проведенных исследований в плодах бархата амурского установлено содержание флавоноидов, свободных и связанных Сахаров, амино-

кислот, фитостеролов, стероидов, тритерпеноидов, дубильных веществ, аскорбиновой кислоты, в небольшом количестве иридоидов и алкалоида берберина.

Идентифицировать все зоны на хроматограммах ТСХ затруднительно, т.к. часто отсутствуют вещества «свидетели». Поэтому для более глубокого изучения химического состава плодов бархата амурского дальнейшее исследование проводили с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), метода аминокислотного анализа, спектрофотометрии и др.

Определение аминокислот и углеводов. Исследование аминокислотного состава проводили с использованием аминокислотного анализатора «Хитачи» модель 835 по стандартной методике. Результаты качественного и количественного определения аминокислот в пло-

Рис. 3. Хроматограмма извлечения из плодов бархата амурского.

На рис. 3 видно, что в плодах содержится 19 аминокислот. Общая сумма равна 4,92 %. Преобладают глютаминовая кислота (20,73 %), аспарагиновая кислота (10,77 %) и аргинин (9,15 %), сумма которых составляет примерно 40 % от общего содержания аминокислот.

Методом прямофазной ВЭЖХ исследован не только качественный состав углеводов, но и показано их количественное содержание. Результаты определения представлены на рис. 4, 5 и в табл. 1.

41Г

тг

I тг

Е

пг

Т5~ юг

гЕезот.

V

Рис. 4. Анализ смеси стандартов 10 г/л методом ВЭЖХ.

Рис. 5 Анализ водного экстракта из плодов Бархата амурского (30 г/л).

На рис. 5 видно, что в качестве свободных Сахаров в плодах бархата присутствуют глюкоза и фруктоза. Определение связанных Сахаров проводили после кислотного гидролиза методом ВЭЖХ используя обратнофазный анализ и капиллярный электрофорез. Полученные результаты представлены на рис. 6, 7 и табл. 1.

ГЕ5ТШ 1 2лзр

33 ЗО 25" 20

=> I «-» т => -¿и аи

Рис. 6. Анализ смеси стандартов 1 г/л методом ВЭЖХ

Рис. 7. Анализ гидролизата из плодов Бархата амурского методом ВЭЖХ.

Из рис. 7 следует, что связанные сахара представлены глюкозой и ксилозой.

Таблица 1

Содержание углеводов в плодах бархата амурского (п = 3)

Свободные сахара, % Сумма свободных и связанных Сахаров, % Связанные сахара, %

N образца фруктоза глюкоза глюкоза ксилоза глюкоза ксилоза

1. 15,70 17,20 18,30 0,83 1,10 0,83

2. 16,10 18,30 19,50 0,95 1,20 0,95

3. 15,90 15,10 16,90 0,89 1,80 0,89

Из данных табл. 1 следует, что в плодах бархата в качестве свободных Сахаров присутствуют фруктоза и глюкоза. Содержание фруктозы колеблется от 15,70 до 16,10 %; глюкозы от 15,10 до 18,30 %. Связанные сахара представлены глюкозой и ксилозой. Содержание глюкозы колеблется от 1,10 до 1,80 %; ксилозы от 0,83 до 0,95 %.

Определение флавоноидов.

Нами предложено стандартизацию плодов бархата амурского проводить по флавоноидам.

Определение флавоноидов с использованием метода ВЭЖХ.

Хроматографирование проводили на жидкостном хроматографе высокого давления, укомплектованном системой градиентной подачи элюента, УФ диод-номатричным детектором или с перестраиваемой длиной волны, а также компьютерной системой сбора и обработки данных в следующих условиях: колонка 250 □ 4,6 мм, сорбент КгопюбП 100 - 5С^ с размером частиц 5 мкм; температура термостата 38° С; подвижная фаза: ацетонитрил (А); 0,01 % раствора фосфорной кислоты (В).

Режим элюирования:

Этап, Продолжительность Раствор А, % Раствор В,% Режим

№ этапа, мин

0 10 5 95 изократ

1 40 85 15 К=1

2 5 85 15 изократ

Скорость элюирования 1 мл/мин.

На рис. 8 хроматограмма модельного PCO, на рис. 9 представлены хрома-тограммы извлечения из плодов бархата амурского.

з -__ / 1 ^ 2 ^ __ —- 4

i ' ' ' 1 □ ' ' 1в ' ' ' ' 20 ' 1—1 2в ' ' ' з'о ' ' ' з'в 1—1 ч'о 1—1 ' V«

Рис. 8. Хроматограмма модельного раствора PCO. 1- аскорбиновая кислота, 2- галловая кислота, 3- флакозид, 4-фелламурин.

Рис. 9. Хроматограмма экстракта плодов Бархата амурского. Градиент ацето-нитрила от 5 до 85 % за 40 мин, 5 мин - 85 % ацетонитрила. Длина волны детектирования 220 нм (верхняя) и 290 нм (нижняя).

Идентификация компонентов проведена по характеру спектров поглощения каждого хроматографического пика. Выделены следующие группы компонентов извлечения - витамины, танины, флавоноиды, агликоны и ароматические масла. Идентификацию компонентов осуществляли по времени выхода стандартных соединений и по совместимости их спектров поглощения.

Разработка методик количественного определения основных действующих веществ.

Важнейшими группами БАВ плодов являются флавоноиды, аскорбиновая кислота, галловая кислота, галлотанины, спаонины.

На первом этапе была разработана методика количественного определения флавоноидов методом ВЭЖХ. Хроматографирование спирто - водного извлечения из плодов бархата амурского и растворов стандартных веществ проводили при условиях описанных выше. Хроматограммы представлены на рис. 10.

Рис. 10. 1 - Извлечение из плодов бархата амурского; 2 - PCO флакозида и диоксина.

Для установления воспроизводимости и точности методики были проверены образцы бархата амурского и проведена статистическая обработка результатов. Ошибка определения не более 4 %, что соответствует точности метода ВЭЖХ.

Методика была использована для анализа 4 образцов сырья бархата амурского на содержание флавоноидов. Полученные результаты представлены в табл. 2.

Таблица 2.

Содержание флавоноидов в плодах бархата амурского определенные методом ВЭЖХ. (п = 3)

N образца Площадь пика. Содержание флавоноидов, %

1 4889082 2,57

2 2682337 1,41

3 2111627 1,11

4 2644289 1,39

Из табл. 2 видно, что содержание флавоноидов в плодах бархата амурского колеблется от 1,11 до 2,57 %.

Для создания нормативной документации необходимы легковоспроизво-димые, доступные и точные методики. Идентификацию флавоноидов в плодах бархата амурского проводили с использованием метода ТСХ на пластинках «Сорбфил» в системе растворителей: н-бутанол — кислота уксусная ледяная — вода (5:1:4). Проявитель - 2 % спиртовой раствор алюминия хлорида. На хро-матограмме испытуемого раствора должно быть три зоны адсорбции с Яэ около 1,22; Яб 1,0 и Яб около 0,08 относительно флакозида. Допускается наличие других зон адсорбции.

Для количественного определения флавоноидов в плодах бархата амурского предложен хромато - спектрофотометрическая метод, основанный на выделении флавоноидов с помощью колоночной хроматографии с полиамидным сорбентом, на проведении гидролиза с помощью кислоты хлористоводородной и измерении оптической плотности с помощью спектрофотометра.

Нами за основу методики количественного определения флавоноидов в плодах бархата амурского была взята методика из фармакопейной статьи на листья бархата амурского.

Для извлечения флавоноидов нами использован 95 % этанол подкисленный кислотой хлористоводородной концентрированной. Полученное извлечение наносили на хроматографическую колонку с полиамидным сорбентом,

промывали водой и элюировали 40 % этанолом. Был снят спектр поглощения полученного элюата. В качестве стандарта использован ГСО флакозид (ВФС 42 -1658 - 81).

Для снятия спектра поглощения и для расчета удельного показателя поглощения был приготовлен раствор стандарта флакозида. Спектры поглощения раствора флакозида и извлечения из плодов бархата совпадают и находятся при длине волны 283 ± 3 нм.

В связи с тем, что стандарт флакозида недоступен всем контрольно - аналитическим лабораториям, рассчитан удельный показатель поглощения, равный 307,2 (среднее 10 определений).

Для установления оптимальных условий экстракции флавоноидов из сырья бархата амурского были изучены: степень измельченности сырья, экстра-гент, соотношение сырья и экстрагента, температура. В результате проведенных исследований были установлены оптимальные условия извлечения флавоноидов плодов бархата амурского: измельченность сырья 2 мм, концентрация экстрагента этанола - 95 %, подкисленного хлористоводородной кислотой конц., оптимальное соотношение сырья и экстрагента 1:50, экстракция на водяной бане при 100° С, время экстракции 60 мин (двукратно: 45 мин и 15 мин).

Спектры поглощения

Рис. 11. 1. - извлечения из плодов бархата амурского 2. - спектр поглощения раствора флакозида.

Все выше перечисленные факторы были использованы при составлении методики количественного определения флавоноидов в плодах бархата амурского. Для установления точности и воспроизводимости методика апробирована на образцах бархата амурского. Полученные результаты представлены в табл.3

Таблица 3

Метрологические характеристики методики количественного определе-

ния флавоноидов в плодах бархата амурского.

f Х,г Sx- Р,% T(p,f) Ах- А ± %

7 2,55 0,044 95 2,78 0,122 4,80

Относительная ошибка единичного определения при доверительной вероятности 0,95 % не превышает ± 5,0 %. Для определения систематической ошибки был использован метод добавок стандарта. Результаты представлены в табл. 4

Таблица 4

Результаты количественного определения флавоноидов в плодах бархата __амурского с использованием метода добавок._

№ об- Найдено Добав- Должно быть Найдено Относи-

разца флавонои- лено найдено фла- флакозида и тельная

дов г/100 г флако- козида и фла- флавонои- ошибка,

сырья зида воноидов дов г/100 г %

г/100 г сырья сырья

1 2,55 0,64 3,19 3,25 + 1,9

2 1,72 0,86 2,58 2,66 + 3,1

3 1,60 1,20 2,80 2,74 -2,1

Из табл. 4 видно, что систематическая ошибка отсутствует, т.к. относительная ошибка метода добавок меньше относительной ошибки единичного определения.

Образцы плодов бархата амурского были проанализированы с помощью разработанной методики на содержание флавоноидов. Полученные результаты представлены в табл. 5

Таблица 5

Содержание флавоноидов в плодах бархата амурского, полученное с по-

мощью спектрофотометрического метода, (п = 5)

№ образца Содержание флавоноидов, %

Хромато-спектрометрический метод

1 2,55

2 2,19

3 1,93

4 1,66

5 2,06

6 2,01

7 1,86

Как показывают результаты табл. 5 содержание флавоноидов в плодах бархата амурского колеблется от 1,66 до 2,55 %. На основании полученных результатов рекомендуем установить содержание флавоноидов в плодах бархата амурского не менее 1,0 %.

На следующем этапе была разработана методика количественного определения аскорбиновой кислоты методом ВЭЖХ на том же приборе при условиях описанных выше.

Ошибка определения аскорбиновой кислоты укладывается в пределы, допустимые для метода ВЭЖХ.

С помощью разработанной методики были проанализированы 3 партии плодов бархата амурского. Полученные результаты представлены в табл. 6.

Таблица 6.

Количественное определение аскорбиновой кислоты, (п = 3)

N партии Площадь пика. Содержание аскорбиновой кислоты, мг/%

1 93344 22,50

2 195490 47,10

3 267709 64,50

Из табл. 6 следует, что содержание аскорбиновой кислоты в плодах бархата амурского колеблется от 22,50 до 64,50 мг/%.

Количественное содержание галловой кислоты и галлотанинов в плодах бархата амурского не установлено. В связи с этим по разработанной ранее методике проведено их количественное определение методом ВЭЖХ. С помощью

разработанной методики были проанализированы 4 партии плодов бархата амурского на содержание галловой кислоты и галлотанинов. Полученные результаты представлены в табл. 7.

Таблица 7.

Количественное определение галловой кислоты и галлотанинов в плодах _бархата амурского, (п = 3)__

N пар- Площадь пиков гал- Содержание Площадь пи- Содержание

тии ловой кислоты галловой ков галлота- галлотанинов,

кислоты, нинов мг/%.

мг/%

1 172057 66,0 306319 118,0

2 153808 59,0 319298 123,0

3 252812 97,0 407560 157,0

4 283633 108,0 417944 161,0

Из табл. 7 видно, что содержание галловой кислоты в плодах бархата амурского колеблется от 59,0 до 108,0 мг/%, галлотанинов - от 118,0 мг/% до 161,0 мг/%.

Анализ алкалоидов в плодах бархата амурского проводили титриметриче-ским методом. Содержание алкалоидов в плодах бархата колеблется от 0,2 % до 0,3 %.

Выделение эфирного масла из сырья проводили перегонкой с водяным паром. Полученное масло растворимо в эфире, хлороформе, петролейном эфире, бензоле, этаноле. Выделенное эфирное масло анализировали хроматомас-спектрометрическим методом.

60-

щ

я 4053 ZU

20-

g5

I 1 1 1 5 10

Г) М>

с5_ КЗ

i i iii i | i i1 rv утН 'i i | i iii в 20 25 30 35

tirre(rrin)

f® I ^

fkmh

111—п—111

40 45

Рис. 12. Хроматограмма хромато - масс спектрофотометрии.

На хроматограмме эфирного масла плодов бархата амурского присутствуют 10 соединений. Основными являются: пинен, изоледин, кариофиллен. Содержание эфирного масла в плодах бархата амурского 0,35 % - 0,50 %.

В литературных источниках упоминается о наличии сапонинов в плодах бархата амурского. Для идентификации сапонинов использовали метод ТСХ на пластинках «Сорбфил» в системе растворителей: н-бутанол - кислота уксусная - вода (5:1:4). Проявитель 10 % раствор серной кислоты в 40 % этаноле.

На хроматограмме испытуемого раствора должно обнаружиться не менее 5 зон адсорбции с Яб = 4,05 Ыв = 3,16 Яя = 2,39 Яв = 1,79 Яя = 1,0 относительно зоны адсорбции эсцина, с Ыв принятой за 1.

Для количественного определения сапонинов нами был выбран хромато-спектрофотометрический метод. В его основе лежит свойство сапонинов давать окрашивание при взаимодействии с кислотой серной концентрированной.

В качестве стандарта был выбран эсцин. Далее был снят спектр поглощения реакции взаимодействия эсцина с кислотой серной концентрированной и спектр реакции взаимодействия извлечения из плодов бархата амурского. Измерения проводили на регистрирующем спектрофотометре Сагу 50. Спектры поглощения стандартного раствора и извлечения плодов бархата представлены на рис. 13.

Спектры поглощения продуктов реакции сапонинов с кислотой серной

концентрированной.

Рис. 13 1 - 0,015 % раствора эсцина в 95 % этаноле.

2 - извлечения из плодов бархата амурского.

Система растворителей: н-бутанол - кислота уксусная ледяная - вода (5:1:4) проявитель: 10 % раствор кислоты серной в 40 % этаноле

На графике видно, что максимумы раствора эсцина и извлечения из плодов бархата амурского совпадают и находятся при длине волны 325 + 3 нм.

При изучении зависимости оптической плотности от концентрации эсцина установлено, что калибровочная кривая зависимости между оптической плотностью и концентрацией раствора эсцина носит линейный характер в интервале концентраций от 0,0005 до 0,004 %. Наименьшее определяемое количество эсцина 0,05 мг/мл.

Для расчета содержания сапонинов был использован удельный показатель 222,45, взятый из литературы.

Для максимального извлечения сапонинов из сырья нами были изучены условия экстракции.

В результате проведенных исследований были установлены оптимальные условия извлечения сапонинов из плодов бархата амурского: измельченность сырья 2 мм, экстрагента 70 % этанол, соотношение сырье - экстрагент 1:50, экстракция на водяной бане при 100° С, время экстракции 60 мин (двукратно: 45 мин и 15 мин).

Полученные данные были использованы для создания методики определения сапонинов в плодах бархата амурского.

Для установления точности и воспроизводимости методики были проанализированы образцы бархата амурского и проведена статистическая обработка результатов. Полученные результаты представлены в табл. 8, 9.

Таблица 8

Метрологические характеристики методики количественного определе-

ния сапонинов в плодах бархата амурского

Х",г Р,% Т(р,0 Ах- А ± %

9 2,01 0,039 95 2,26 0,088 4,39

Из табл. 8 видно, что с помощью разработанной методики возможно определять сапонины в плодах бархата амурского с достаточной точностью.

Относительная ошибка единичного определения при доверительной вероятности 0,95 не превышает ± 4,5 %.

Для определения систематической ошибки разработанной методики был использован метод добавок стандарта эсцина. Полученные результаты представлены в таблице 9.

Таблица 9

Результаты количественного определения сапонинов в плодах бархата амурского с использованием метода добавок_

№/№ Найдено Добав- Должно быть Найдено Относи-

образца сапонинов лено найдено эсцина и тельная

г/100 г сы- эсцина эсцина и са- сапонинов ошибка, %

рья понинов г/100 г сырья г/100 г сырья

1 1,69 1,69 3,38 3,32 - 1,78

2 1,96 1,47 3,43 3,48 + 1,45

3 2,01 1,01 3,02 3,12 + 13,31

4 2,44 0,61 3,05 2,98 -2,29

Систематическая ошибка отсутствует, т.к. относительная ошибка метода добавок меньше относительной ошибки единичного определения. Разработанная методика обладает достаточной точностью и воспроизводимостью. В образцах плодов с помощью разработанной методики было определено содержание сапонинов. Полученные результаты представлены в табл. 10.

Таблица 10

Содержание сапонинов в плодах бархата амурского (п = 5)

№/№ образца Содержание сапонинов, %

1 2,71

2 1,96

3 1,69

4 2,44

5 2,01

6 2,84

7 2,90

Содержание сапонинов в плодах бархата амурского колеблется от 1,69 % до 2,90 %.

ВЫВОДЫ

1. Анализ литературных источников показал, что сырье бархата амурского является перспективным, широко используемым в официнальной и народной медицине средством. Это является основанием для изучения его химического состава и разработки методик анализа основных действующих веществ.

2. Установлены и выделены анатомо - диагностические признаки плодов бархата амурского в цельном сырье и измельченном до размера, проходящим сквозь сито с диаметром отверстий 2мм. Все признаки зафиксированы на микрофотографиях.

3. С помощью цветных реакций и хроматографии в тонком слое сорбента в плодах бархата амурского установлено содержание флавоноидов, углеводов, аминокислот, стероидов, тритерпеноидов, аскорбиновой кислоты, дубильных веществ и в небольшом количестве иридоидов и алкалоидов.

4. Разработана методика количественного определения флавоноидов методом ВЭЖХ при следующих условиях: колонка 250 х 4,6 мм, сорбент Кгопкш1 100 - 5 С18 с размером частиц 5 мкм, температура термостата 38° С, длина волны детектирования 280 нм, подвижная фаза: ацетонитрил, 0,01 % раствор фосфорной кислоты, градиентный режим элюирования, скорость элюирования 1000 мкл/мин. Содержание флавоноидов, установленное методом ВЭЖХ - от 1,11 до 2,57%. Содержание флавоноидов, определенное спектрофотометриче-ским методом, составляет 1,66 - 2,55 %.

5. С помощью аминокислотного анализатора изучен качественный и количественный состав аминокислот плодов бархата амурского. Обнаружено 19 аминокислот. Установлен качественный и количественный состав углеводов в плодах бархата амурского. С помощью метода прямофазной ВЭЖХ в стандартных условиях определены свободные сахара: глюкоза и фруктоза. Для определения связанных Сахаров применили метод ВЭЖХ, используя обратнофазный анализ и капиллярный электрофорез. Связанные сахара содержат глюкозу и ксилозу. Хроматомасс - спектрометрическим методом выделено эфирное масло плодов бархата амурского и дан химический состав 10 соединений.

6. Подобраны условия и разработаны методики идентификации и количественного определения в плодах бархата амурского аскорбиновой кислоты, галловой кислоты и галлотанинов методом ВЭЖХ. Разработана методика количественного определения сапонинов, основанная на выделении сапонинов с помощью колоночной хроматографии, на реакции сапонинов с кислотой серной концентрированной и измерении оптической плотности с помощью спектрофотометра при длине волны 325 + 4 нм. Количественное содержание алкалоидов в плодах определено титриметрическим методом.

7. Разработан и составлен проект ФС «Бархата амурского плоды» для включения в ГФ XII издания, который направлен на рассмотрение в ФГБУ «НЦ ЭСМП» (письмо ФГБУ «НЦ ЭСМП» Минздрава РФ № 16453 от 07.11.2013).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Потанина О.Г., Наумова O.A., Попов Д.М. Исследование анатомо -диагностических признаков плодов бархата амурского // Вестник Пермской государственной фармацевтической академии, Пермь, - 2007, - № 2, с. 277-280.

2. Наумова O.A., Попов Д.М. Определение аминокислот в плодах бархата амурского. // В сб. Современные вопросы теории и практики лекарствоведения. Ярославль, - 2007, - с. 251 - 253.

3. Наумова O.A. Исследование плодов бархата амурского методом ВЭЖХ // Фармация, -2010, - № 8, с. 12 - 14

4. Наумова O.A., Попов Д.М. Качественное и количественное определение углеводов в плодах бархата амурского // Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии, - 2011, - № 8, - с. 29 - 32.

5. Наумова O.A., Попов Д.М. Изучение химического состава плодов бархата амурского // Фармация, - 2011, - JV» 8, с. - 3 - 5.

6. Наумова O.A., Попов Д.М.. Количественное определение аскорбиновой кислоты в плодах бархата амурского методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) // Вестник Пермской государственной фармацевтической академии, Пермь, - 2012, - № 7, - с. 132 - 136.

7. Наумова O.A., Попов Д.М. Дубильные вещества в плодах бархата амурского // Фармация, - 2012, - № 8, - с. 12 -14.