Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Фармакогностическое изучение морозника абхазского (Helleborus abchasicus A.Br.) и морозника кавказского (Helleborus caucasicus A.Br.)

На право- рукописи

005535560

ИЩЕНКО ЗАЛИНА ВАСИЛЬЕВНА

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ МОРОЗНИКА АБХАЗСКОГО HELLEBORUS ABCHASICUS A.BR. И МОРОЗНИКА КАВКАЗСКОГО HELLEBORUS CAUCASICUS A.BR.

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

г 4 ОКТ 2013

Пятигорск - 2013

005535560

Диссертация выполнена в Пятигорском медико-фармацевтическом институте - филиале ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации и Институте органической химии Уфимского научного центра РАН

Научный руководитель: ДЕНИСЕНКО ОЛЕГ НИКОЛАЕВИЧ

доктор фармацевтических наук, профессор

Официальные оппоненты: СТЕПАНОВА ЭЛЕОНОРА ФЕДОРОВНА

доктор фармацевтических наук, профессор, Пятигорский медико-фармацевтический институт -филиал ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России, профессор кафедры технологии лекарств

КОЗЛОВА ВИКТОРИЯ ВЯЧЕСЛАВОВНА

кандидат фармацевтических наук,

ФГБУ «Пятигорский государственный НИИ курортологии Федерального медико-биологического агентства», старший научный сотрудник отдела изучения механизмов действия физических факторов

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия

Росздрава» Минздрава России

Зашита состоится «06» ноября 2013 года в 900 часов на заседании Диссертационного совета Д.208.008.09. при ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздрава России

(357532, Ставропольский край, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Пятигорского медико-фармацевтического института - филиала ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздрава России

(357532, Ставропольский край, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11).

Автореферат разослан «ОН » РКТ&£рк 2013 г.

Ученый секретарь ^ ^ Компанцева Евгения Владимировна

Диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Интерес к изучению липидов и разработке лекарственных препаратов на их основе связан с тем, что они выполняют защитную, энергетическую, иммуномодулирующую, барьерную функции, обеспечивают механическую плотность клеток и принимают участие в важнейших биохимических процессах. Основными компонентами липидов, отвечающими за их биологическую активность, являются жирные кислоты, в числе которых наибольший интерес представляют так называемые эссенциальные семейств ю-3, со-6, со-7 и ю-9.

Среди растительных источников липидов флоры Северного Кавказа несомненный практический и научный интерес представляют виды рода морозник: морозник абхазский {НеНеЬогш аЬс1ш^1ст А. Вг.) и морозник кавказский (НеИеЬогш саисазгсиз А. Вг.) семейства лютиковых (Яапипси1асеае). Данные виды являются многолетними травянистыми вечнозелеными декоративными растениями и накапливают жирное масло не только в семенах в количестве около 30%, но и в корнях и корневищах (до 18%), что является нехарактерным для высших растений.

Изучение грузинскими учеными (Э.П. Кемертелидзе, Ц.М. Далакашвили и др.) липидов семян и корней морозника кавказского (м. кавказского) и морозника абхазского (м. абхазского) показало, что нейтральные липиды семян морозника отличаются от липидов семян высших растений высоким содержанием свободных жирных кислот (около 70%) и низким - триацилглицеридов (4-6%), а липиды корневищ с корнями представляют интерес, т.к. характеризуются специфической противоопухолевой активностью. На основе липидов корней и корневищ разработан препарат Геллипол для лечения раковых опухолей; в гомеопатии используется тинктура и масло корней морозника. Подземные органы морозника содержат буфадиенолиды и ранее использовались в качестве сырья для получения препарата Коге1Ьопп К кардиотонического действия.

В настоящее время численность видов рода морозник сокращается в результате вырубки лесов, сбора цветов на букеты, и, главное, выкопки корневищ

для использования их в качестве лекарственного средства. Одним из способов уменьшения нагрузки на природные сообщества является введение данных видов в культуру. Именно поэтому интродукция, изучение биологических особенностей развития м. кавказского и м. абхазского в условия Ставропольского края, исследование липидов корневищ с корнями и семян для обоснования возможности комплексного рационального использования сырья являются актуальной задачей для фармацевтической науки и практики.

Степень разработанности темы. В результате исследований, проведенных учеными института фармакохимии им. И. Кутателадзе и Пятигорской фармацевтической академии, был установлен буфадиенолидный, стероидный, микроэлементный, аминокислотный и полисахаридный составы м. кавказского и м. абхазского. Из экстракта листьев м. кавказского было выделено 9 фуростаноловых гликозидов, названных кавказозидами Е-М. При извлечении сердечных гликозидов из корней и корневищ м. абхазского в институте Фармакохимии им. И. Кутателадзе в качестве побочного продукта было получено жирное масло в количестве 15-18%, мажорными жирными кислотами которого явились линолевая, пальмитиновая, олеиновая и стеариновая.

Интродукционных исследований и изучения фитохимического состава морозников в условиях интродукции не проводилось.

Цель и задачи работы. Цель работы - введение в культуру морозника кавказского и морозника абхазского в условиях Ставропольского края и экспериментальное обоснование применения семян и корней интродуцированных видов как сырьевых источников масла, содержащего эссенциапьные жирные кислоты семейства со-З и со-6; проведение фитохимических исследований надземной части для определения возможности рационального использования сырья.

Задачи исследования:

1. Провести иитродукционные исследования морозника кавказского и морозника абхазского на базе ботанического сада Пятигорского медико-

фармацевтического института - филиала ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России;

2. Провести подробное сравнительное изучение липидов семян и корневищ с корнями дикорастущих и интродуцированных видов;

3. Провести сравнительное фотохимическое исследование надземной части морозника кавказского и морозника абхазского;

4. Установить диагностические признаки и определить товароведческие показатели сырья;

5. Создать космецевтическое средство (олеогель) на основе масла исследуемых видов.

6. Провести определение острой токсичности и противовоспалительного действия выделенного масла и разработанного олеогеля.

Научная новизна. Впервые проведены исследования по интродукции морозника

кавказского и морозника абхазского в условиях Ставропольского края: изучены

особенности развития видов и урожайность. Впервые установлен состав БАС

репродуктивных и вегетативных органов интродуцированных видов морозника.

Подробно изучен состав нейтральных и полярных липидов корневищ с корнями и

семян м. кавказского и м. абхазского. В траве интродуцированных видов определено

количественное содержание фенольных соединений и выявлен их компонентный состав.

Проведено морфолого-анатомическое изучение корневищ с корнями исследуемых видов морозника, установлены их диагностические признаки и товароведческие показатели.

На основе масла корневищ с корнями м. кавказского разработано космецевтическое средство (олеогель).

Теоретическая и практическая значимость работы.

Теоретическая значимость. В результате проведенных экспериментальных исследований химического состава липидов семян и корней интродуцированных м.

кавказского и м. абхазского доказана целесообразность их применения как источников жирного масла, содержащего ш-3 и ш-6 эссенциальные жирные кислоты для применения в космецевтике. Изучение химического состава извлечений из травы свидетельствуют о перспективности их дальнейших фармакологических исследований.

Практическая значимость. Методики анализа масла морозника, включенные в проект ФСП «Масло морозника для наружного применения», апробированы в ГБУЗ «Республиканский центр контроля качества и сертификации лекарственных средств» Министерства Здравоохранения РСО-Алания (акт апробации от 07.05.2013г.).

Методология и методы исследования. Методология фармакогностического исследования подразумевает научно обоснованную и целесообразно организованную последовательность действий и включает несколько блоков: информационно-исследовательский, фитохимический, технологический, стандартизационный и фармакологический. При проведении работы использовались следующие методы исследований: биологические, химические, физико-химические (ГЖХ, УФ-спектрофотометрия, ВЭЖХ, жидкостная хроматография, масс-спектроскопия и др.), микробиологические, технологические и фармакологические. Положения, выносимые на защиту:

1. Обоснование применения корневищ с корнями и семян морозника абхазского и морозника кавказского в качестве сырья для получения жирного масла, богатого эссенциальными жирными кислотами.

2. Результаты изучения липидов семян и корней м. абхазского и м. кавказского.

3. Результаты фитохимического изучения травы исследуемых видов.

4. Результаты интродукционных исследований морозника кавказского и морозника абхазского.

5. Результаты определения анатомо-диагностических признаков корней исследуемых видов.

6. Результаты технологических исследований по разработке космецевтического средства - олеогеля.

Степень достоверности „ апробация результатов. Достоверность полученных результатов достигается благодаря использованию современных химических, физико-химических, технологических, биологических и фармакологических методов, позволяющих получать воспроизводимые и однозначные результаты. Результаты измерений статистически обработаны. Апробация методик анализа липидов в условиях ГБУЗ «Республиканский центр контроля качества и сертификации лекарственных средств» МЗ РСО-Алания показала их воспроизводимость, что также подтверждает достоверность полученных данных. Основные положения диссертационной работы доложены на VII Всероссийской конференции с молодежной научной школой «Химия и медицина, 0рхимед-2009» в июле 2009 года (г. Уфа); научной конференции Пятигорского филиала ГБОУ ВПО ВолгГМУ «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» в январе 2013 г. (г. Пятигорск). По материалам диссертации опубликовано 15 работ, в т.ч. 2 - в журналах, рекомендованных ВАК.

Основное содержание работы

Объектами исследования явились семена, подземные органы (корневища с

корнями) м. кавказского и м. абхазского, собранные как в дикорастущей флоре (на

территории республики Абхазия, Гульрипшского района, с. Цебельда) (м.

абхазский) и на территории Карачаево-Черкесской республики (ст. Зеленчукская)

(м. кавказский)), так и с растений, интродуцированных в условиях ботанического

сада ПМФИ - филиала ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России и трава, образцы

которой представляли собой надземную часть (трава, листья, стебель) растений,

заготовленные в фазу созревания семян с опытных делянок.

Изучение химического состава вегетативньис и репродуктивных органов

морозника кавказского и морозника абхазского Изучение липилов семян и корневищ с конями м. кавказского и ц. абхазского

Масличность обоих видов морозника составила около 13% для корневищ с корнями и около 35% для семян, что позволяет отнести корни и корневища к среднемасличным, семена - к высокомасличным.

Для выделения нейтральных липидов (НЛ) измельченные воздушно-сухие семена и корневища с корнями экстрагировали гексаном исчерпывающе методом настаивания при комнатной температуре. Используя препаративную тонкослойную хроматографию (ПТСХ) в системе растворителей гексан:эфир диэтиловый 7:3, НЛ, полученные из обоих образцов, разделили на составляющие классы соединений. Из шрота, оставшегося после отделения НЛ, смесью хлороформ-метанол (2:1) выделили полярные липиды (ПЛ), которые методом ПТСХ в ацетоне разделили на фосфолипиды (ФЛ) и гликолипиды (ГЛ) (табл. 1, 2).

Было установлено, что содержание НЛ в семенах м. кавказского и м. абхазского существенно не отличалось (30,0 и 32,5 % соответственно). В подземных органах содержание НЛ варьировало от 8,0% (корневища с корнями дикорастущего м. кавказского) до 12,0% (корневища с корнями дикорастущего м. абхазского). Наивысшее содержание ПЛ установлено в подземных органах дикорастущего м. абхазского (5,7%).

Основным в количественном отношении классом НЛ явились свободные жирные кислоты, содержание которых варьировало от 56% в НЛ корневищ с корнями интродуцированного м. кавказского до 64% в корневищах с корнями дикорастущего м. кавказского; содержание диацилглицеридов (ДАГ) и моноацилглицеридов (МАГ) было примерно одинаковым и составляло от 11 до 14% в корневищах с корнями интродуцированного морозника абхазского, и около 3% в корневищах с корнями интродуцированного м. кавказского. Количественный состав классов НЛ интродуцированных и дикорастущих видов практически не различался. Суммарное содержание ПЛ в корневищах с корнями обоих дикорастущих видов выше, чем в интродуцированных (5,3 и 4,0% у м. абхазского и 3,9 и 1,5 % у м. кавказского) в основном за счет ГЛ. В семенах обоих видов содержание ПЛ

незначительное (около 1%). В составе ПЛ преобладали ГЛ, содержание которых колебалось от 0,05% от массы сырья (семена м. кавказского) до 5,0% от массы сырья (подземные органы дикорастущего м. абхазского).

Таблица 1 - Содержание НЛ и ПЛ семян, корневищ с корнями видов морозника

Группы липидов Исследуемые объекты, % на абсолютно сухое сырье

Корневища с корнями Семена

М. абхазский М. кавказский М. кавказский

Дикораст. Интродуц. Дикораст. Интродуц. М.абхазский

НЛ 13,2±0,5 12,4±0,4 8,8±0,3 11,6±0,4 35,6±1,0 33,4±1,1

ПЛ 6,3±0,2 4,6±0,2 4,2±0,2 1,9±0,1 1,0±0,03 1,0±0,03

Таблица 2 - Состав НЛ и ПЛ корневищ с корнями м. абхазского и м. кавказского

Классы липидов Содержание, % (от суммы НЛ или ПЛ)

Интродуцированные образцы Дикорастущие образцы

М. абхазский М. кавказскшТ М. абхазский М. кавказский

Нейтральные липиды

Сложные эфиры тритерпеновых соединений + метиловые эфиры (СЭТС +МЭ) 4,9±0,2 12,7±0,4 5,5±0,2 6,8±0,2

Триацилглицериды (ТАГ) 9,0±0,3 24,7±1 8,7±0,3 4,5±0,1

Свободные жирные кислоты СЖК) 60,4±2,3 56,0±1,8 62,1±2,3 64,1 ±2,8

Дианилглицериды (ДАГ) 11,3±0,4 3,1±0,1 11,1±0,4 15,9±0,6

Моноацилглицериды (МАГ) 14,4±0,6 3,5±0,1 12,6±0,5 8,7±0,2

Полярные липиды

Гликолипиды (ГЛ) 4,0±0,2 1,5±0,1 5,3±0,2 3,9±0,1

Фосфолипиды (ФЛ) 0,60±0,02 0,40±0,02 1,00±0,03 0,30±0,01

Поскольку основным компонентом липидов, отвечающим за биологическую активность, являются жирные кислоты, методом ГЖХ на хроматографе «СС-2014» (БЫггЫги) (капиллярная колонка «Оп^а\уах 250» длиной 30,0 м, диаметром 0,25 мм, сорбент - полиэтиленгликоль, I колонки - 205°С, I испарителя - 250°С, I детектора - 260°С, газ-носитель - гелий, скорость подачи газа - ЗОмл/мин) нами был определен жирнокислотный состав нейтральных и полярных липидов исследуемых образцов (табл. 3, 4, 5).

Таблица 3 - Состав жирных кислот НЛ семян, корневищ с корнями м. абхазского и

м. кавказского

Жирные кислоты Содержание, % от суммы жирных кислот

Корневища с корнями Семена

Морозник абхазский Морозник кавказский

дикорастущ. интродуц. дикорастущ. интродуц. М. абхазский М. кавказский

14:0 0,5 0,2

15:0 0,7 0,4 1,2 1,8 0,6

16:0 11,1 13,3 14,2 14,6 10,1 11,7

16:1 0,8

17:0 1,5 0,8 0,3 0,1

18:0 1,3 1,3 1,5 1,5 2,5 2,2

18:1 7,7 8,3 9,2 3,8 8,6 8,4

18:2 72,9 74,2 66,7 72,6 22,9 21,9

18:3 2,1 1,2 4,8 2,4 45,9 43,4

19:1

20:0 1,5 1,3 7,6 0,4

20:1 8,7

20:2 1,1 1,6 1,9

21:0 1,2 0,5 0,5

21:1

22:0

22:1 0,3

23:0 2,2

82,7 83,7 81,8 79,6 79,3 84,3

у ■^насыш. 17,3 16,3 18,2 20,4 20,7 15,7

Таблица 4 - Состав жирных кислот ГЛ семян, корневищ с корнями исследуемых

видов морозника

Жирные кислоты Содержание, % от суммы жирных кислот

Корневища с корнями Семена

М. абхазский М. кавказский

дикорастущ. интродуц. дикорастущ. интродуц. М. абхазский М. кавказский

14:0 4,0 6,0 4,7 1,9 2,0

14:1 3,3

15:0 22,1 27,4 9,9 6,1 1,9 1,3

16:0 13,4 16,7 15,9 24,5 20,3 20,6

16:1 2,4 2,7 2,6 0,8 1,1

16:2 3,1 5,2 9,4 5,5

17:0 0,8 0,9 3,7 9,6 0,6

18:0 2,1 3,7 2,7 3,8 6,6 5,3

18:1 7,5 6,3 9,1 4,8 9,7 8,6

18:2 40,5 49,6 44,7 15,6 20,2

18:3 0,9 3,8 24,6 28,1

19:0 2.0 25,8 0,8 1,8

20:0 6,2 6,8

20:1 2,1 2,0 0,9 1,2 1.8

2-ненас. 55,6 19,5 63,1 54,1 61,6 64,2

2-насыш 44,4 80,5 36,9 45,9 38,4 35,8

Таблица 5 - Состав жирных кислот ФЛ семян, корневищ с корнями

Жирные кислоты Содержание, % от суммы жирных кислот

Корневища с корнями Семена

М. абхазский М. кавказский М. абхазский М. кавказский

дикорастущ интродуц. дикорастущ. интродуц.

12:0 1,5

14:0 4,2 5,4 7,6 1,1

14:1 2,8

15:0 13,5 1,9 10,7 1,8

16:0 20,6 32,4 19,8 36,7 25,5 24,5

16:1 3,7 4,5 0,6

17:0 4,3 1 7,6 2,1

18:0 3,0 22,1 3,9 3,9 4,8 3,1

18:1 6,5 0,9 7,7 4,7 11,7 10,1

18:2 33,8 14,5 32,2 46,8 31,4 35,3

18:3 2,6 1,7 2,3 14,1 15,9

19:0 0,8 0,7

20:0 1,9 9,2 0,7 10,2 8,1

20:1 2,5 1,4 1,5 1,5

20:2 0,7

21:0 4,3 2,9 0,3

22:0 3,0 0,3

22:1 3,0 0,2

^кеняс 48,2 22,1 48,2 54,4 59,5 63,0

у 51,8 77,9 51,8 45,6 40,5 37,0

Установлено, что масла обоих видов являются высоконенасыщенными

(содержание ненасыщенных жирных кислот в общей сумме жирных кислот выше 80%). Мажорной жирной кислотой НЛ корневищ с корнями м. кавказского и м. абхазского явилась ю-6 линолевая (18:2) кислота, содержание которой колебалось от 66,7 % (корневища с корнями дикорастущего м. кавказского) до 74,2 % (корневища с корнями интродуцированного м. абхазского). Главной жирной кислотой липидов семян явилась линоленовая кислота (более 40%). По результатам ГЖХ анализа установлено, что мажорными жирными кислотами ГЛ корневищ с корнями являлись ш-6 линолевая кислота (18:2) и насыщенная пентадекановая кислота (15:0). В ГЛ семян в составе жирных кислот преобладала а-линоленовая кислота (18:3) (от 24,6 до 29,9%). В составе ФЛ корневищ с корнями и семян исследуемых видов наибольшей в количественном отношении жирной кислотой явилась линолевая кислота. Следует отметить, что в составе ФЛ меньше суммарное количество ненасыщенных жирных кислот (от 27,3 до 63,2%) в сравнении с ГЛ и НЛ,

суммарное содержание ненасыщенных жирных кислот в которых было не менее 79,3%- В липидах корневищ с корнями исследуемых видов морозника накапливается значимое количество каротиноидов (от 3,78±0,05 мг% в масле, выделенном из корневищ с корнями дикорастущего м. абхазского до 4,52±0,08 мг% в масле, выделенном из корневищ с корнями интродуцированного м. кавказского). В масле, выделенном из семян, содержание пигментов выше и составляет около 4,0 мг% хлорофиллов и 5,0 мг% каротиноидов. Исследования по изменению органолептических показателей и состава жирных кислот позволили установить срок хранения масла - 2 года.

Изучение химического состава травы м. кавказского и м. абхазского Поскольку м. кавказский и м. абхазский обладают значительной биомассой,

было целесообразно изучить фитохимический состав их надземной части с целью

обоснования возможности рационального комплексного использования ценного

сырья. В траве исследуемых видов морозника обнаружили и определили

количественное содержание фенольных соединений (флавоноидов и гидролизуемых

дубильных веществ), аминокислот и полисахаридов (табл. 6).

Таблица 6 - Количественное содержание основных групп биологически активных соединений травы м. кавказского и м. абхазского

Биологически активные соединения Содержание, % (на абсолютно сухое сырье)

М. кавказский М. абхазский

Фенольные соединения -флавоноиды (в пересчете на рутин) -дубильные вещества 0,74±0,02 1,58±0,05 0,76±0,02 1,82±0,06

Полисахариды 3,20±0,09 2,92±0,10

Аминокислоты 3,75 3,33

Методом ВЭЖХ определили компонентный состав фенольных соединений (табл. 7,8).

Таблица 7 - Состав фенольных соединений надземной части м. абхазского

Время, мин Высота пика, гпУ Площадь пика, тУ'сек Содержание, % (метод внутренней нормализации) Название соединения

3,738 259,51 2152,11 11,85 Танин

3,936 1028,36 8031.20 44,23 Галловая кислота

6,105 2,77 41,54 0,23 Цикориевая кислота

6,601 17.22 289,57 1,60 Кофейная кислота

14,45 87,73 4500,57 24,79 Лютеолин-7-гликозид

Таблица 8 - Состав фенольных соединений надземной части м. кавказского

Время, мин Высота пика, mV Площадь пика, шУ*сек Содержание, % (метод внутренней нормализации) Название соединения

3,69 308,932 2700,08 15,65 Танин

3,915 903,67 6743,67 39,09 Галлловая кислота

5,556 8,46 255,99 1,48 Хлорогеновая кислота

6,562 6,37 263,84 1,53 Цикориевая кислота

9,356 4,00 33,67 0,20 Неохлорогеновая кислота

14,08 71,74 3183,28 18,45 Лютеолин-7-гликозид

Фенольные соединения надземной части исследуемых видов морозника представлены в основном дубильными веществами (танин, галловая кислота) и фенолокислотами (хлорогеновая, цикориевая, неохлорогеновая и кофейная кислоты). Качественный состав фенольных соединений видов отличался незначительно: в траве м. абхазского была идентифицирована кофейная кислота в количестве 1,6% от суммы фенольных соединений, которую не обнаружили в траве м. кавказского; в траве м. кавказского в следовых количествах (0,2%) была обнаружена неохлорогеновая кислота, отсутствующая в траве м. абхазского. Основным фенольным соединением травы м. кавказского и м. абхазского явилась галловая кислота (44,23 % и 39,90% соответственно), следующими в количественном отношении были лютеолин-7-гликозид (24,79% и 18,45% соответственно) и танин (11,85% и 15,65%).

На аминокислотном анализаторе Amino acid analyzer Т339М в траве м. кавказского идентифицировано 15 аминокислот, из которых 28,2% составляют незаменимые. В числе незаменимых аминокислот преобладают фенилаланин (3,48 г/кг), лизин (2,18 г/кг) и валик (1,65 г/кг), в числе заменимых - глютамин (3,62 г/кг), глицин (2,4 г/кг) и аланин (1,76 г/кг). Мажорной аминокислотой явилась моноаминодикарбоновая заменимая глютаминовая кислота (6,29 г/кг).

В траве м. абхазского идентифицировано также 15 аминокислот, из которых 32,4% составляют незаменимые. В числе незаменимых аминокислот преобладают треонин (3,73 г/кг), фенилаланин (2,48 г/кг) и лизин (1,78 г/кг), в числе заменимых-

аланин (6,19 г/кг), глютамин (4,12 г/кг) и глицин (2,47 г/кг). Мажорной аминокислотой явилась моноаминомонокарбоновая заменимая аминокислота аланин (6,19 г/кг).

Результаты эмиссионного спектрального анализа показали, что элементный состав исследуемых видов морозника практически не отличался. Основными в количественном отношении макроэлементами являлись калий, кальций и кремний; микроэлементами - железо и барий. В следовых количествах было представлено серебро, скандий, хром и олово.

Интродукция м. кавказского и м. абхазского на Северном Кавказе В результате проведенных интродукционных исследований в онтогенезе исследуемых видов морозника выделили следующие периоды и возрастные состояния: виргинильный период (проростки, ювенильное, имматурное и виргинильное возрастные состояния); генеративный период (молодое, средневозрастное и старое генеративное возрастные состояния). Фенологические наблюдения показали, что онтогенез м. кавказского и м. абхазского практически не различается.

Данные по семенной продуктивности и урожайности корневищ с корнями исследуемых видов морозника в условиях интродукции представлены в таблице 9.

Таблица 9 - Урожайность корневищ с корнями и семян м. кавказского и м. абхазского

Сроки посева Семенная продуктивность фактическая Урожайность корневищ с корнями (г/м2)

г/м2 свежей биомассы Биомассы, высушенной до воздушно-сухого состояния

М. кавказский 43±1,5 1570±28 726±13

М. абхазский 39±1,0 1610±40 688±21

Таким образом, урожайность семян составляет около 40 г/м2, урожайность свежей биомассы корневище корнями - более 1,5 кг/м2.

Морфолого-аиатомическое исследование м. кавказского и м. абхазского и установление норм качества предлагаемых видов сырья

Одним из основных этапов стандартизации сырья является определение его подлинности на основании анатомо-диагностических признаков.

Для корня диагностическими признаками являются: первичное строение: у м. абхазского проводящий пучок корня тетрархного типа, а у м. кавказского -гексархного типа (рис.1). Корневище и стебли пучкового типа строения. Тип стели -эустель. У м. абхазского в корневище 8-12 проводящих пучков, в стебле 12, у м. кавказского в корневище 28 - 30, в стебле 16 - 20. Трахеиды пористые, располагаются неравномерными рядами (м. абхазский), чередуясь с крупными многогранными клетками паренхимы (м. кавказский) (рис. 2, 3).

Для листа: листья дорзовентрального типа, устьица имеются только в нижней эпидерме, устьичные аппараты аномоцитного типа, антиклинальные стенки эпидермы извилистые; более извилистые у м. кавказского (рис. 5,6). Трихомы булавовидной формы (рис.7).

Рисунок 1 - Поперечный срез корня м. кавказского (А) и м. абхазского (Б)

Рисунок 3 - Анатомическое строение корня м. абхазского (А) и м. кавказского (Б) на

поперечном срезе (ув.х40): 1 - покровная ткань; 2 - паренхима коры; 3 - центральный цилиндр

Рисунок 5 - Нижняя эпидерма листовой пластинки: А - м. абхазского (ув.х 10); Б - м. кавказского (ув.*40); 1- устьица, 2 - утолщение клеточной стенки

Рисунок 4 - Поперечный срез стебля: А - м. кавказского (ув.* 10); Б - м. абхазского (ув.х 10)

Рисунок 6- Верхняя эпидерма листовой пластинки (ув.х40): А - м. абхазского; Б - м. кавказского

Рисунок 7 - Виды волосков. А - волоски эпидермы черешка листа м. абхазского (ув.хЮ); Б - волоски эпидермы черешка листа м. кавказского (ув.х40); В - волоски верхней эпидермы листа м. абхазского (ув.х40)

Нормативная документация на ЛРС предусматривает обязательное определение числовых показателей, регламентирующих качество сырья. В связи с этим нами на 6 сериях проведены товароведческие исследования и разработаны нормы качества (числовые показатели) для сырья исследуемых видов морозника (табл. 10).

Таблица 10 - Товароведческие показатели сырья м. кавказского и м. абхазского

Товароведческий показатель /результаты определения Корневища с корнями Семена

М. кавказский М абхазский М. кавказский М. абхазский

Влажность Не более 10% Не более 10% Не более 11% Не более 11%

Содержание золы общей Не более 10% Не более 10% Не более 7% Не более 7%

Содержание золы нераствори мой в растворе кислоты хлористоводородной 10% Не более 10% Не более 10% Не более 1% Не более 1%

Масличность Не менее 11 % Не менее 11% Не менее 33% Не менее 33%

Органической примеси Не более 2% 11е более 2% Не более 2% Не более 2%

Минеральной примеси Не более 2% Не более 2% Не более 1% Не более 1%

Разработка состава и технологии косметического олеогеля с маслом морозника кавказского Нами были приготовлены 8 композиций основ для мази с маслом морозника, представленные в таблице 11.

Таблица 11 - Составы мазевых композиций

Компоненты мазевой композиции Номер мазевой композиции

1 2 3 4 5 6 7 8

Масло морозника кавказского 10,0 10,0 10,0 10,0 10,0 10,0 10,0 10,0

Аэросил 5,0 8,0 10,0

МЦ 2,5

Ма-КМЦ 2,5

Карбопол 940 1,0 1,0

Вазелин 15,0

Твин 80 2,5

Кремофор С0-40 3,0 2,0 3,5

Натрия гидроксид 0,8 0,8

Масло льняное 85,0 82,0 80,0

Вода очищенная до 100,0 до 100,0 - до 100,0 до 100,0 - до 100,0 -

Выбор оптимальной мазевой основы был осуществлен с помощью биофармацевтических исследований «in vitro». В результате исследований нами был разработан состав (табл. 12), предложена технологическая схема производства олеогеля косметического с маслом морозника кавказского и выбрана рациональная упаковка - полиэтиленовые тубы.

Таблица 12 - Состав геля косметического с маслом м. кавказского

Наименование компонента Массовая доля, %

Аэросил 8,0

Масло морозника кавказского 10,0

Нипагин, нипазол (1:3) 0,5

Масло льняное -——------- До 100,0

Фармакологические исследования масла и олеогеля с маслом ли кавказского

В результате исследований установлено, что масло м. кавказского по

классификации К.К. Сидорова и в соответствии с ГОСТом 12.1.007 - 76 при перроральном введении является веществом 4 класса опасности, т.е. малоопасным.

Изучение противовоспалительной активности на модели каолинового отека показало, что величина отека на фоне олеогеля через 5 часов наблюдения была достоверно ниже (на 51%) контроля и 12,2% ниже, чем на фоне мази календулы, выбранной в качестве препарата сравнения. К окончанию опыта (через 48 часов) величина отека на фоне олеогеля была недостоверно (на 8,3%) ниже по сравнению с мазью календулы и на 40,6% достоверно ниже по сравнению с контролем. Таким образом, олеогель с маслом м. кавказского обладает противовоспалительной активностью, сопоставимой с активностью мази календулы.

Заключение

Основные итоги выполненной диссертационной работы сводятся к следующим основным положениям:

1. Изучен качественный состав нейтральных и полярных липидов корневищ с корнями и семян интродуцированных и дикорастущих м. кавказского и м. абхазского. Установлено, что масла обоих видов являются высоконенасыщенными (содержание ненасыщенных жирных кислот в общей сумме жирных кислот колеблется от 84,5 % (корневища с корнями интродуцированного м. абхазского) до 86,9% (семена м. абхазского)).

2. Выявлено, что мажорным компонентом жирных кислот нейтральных липидов всех изученных образцов корневищ с корнями является со-6 линолевая (от 66% до 73%), а семян - со-3 а-линоленовая кислота (43%-45%) кислоты. Среди насыщенных жирных кислот и в корневищах с корнями и в семенах лидирующее положение занимает пальмитиновая кислота.

3. В траве м. кавказского и м. абхазского установлено присутствие флавоноидов (0,74±0,02% и 0,76±0,02% соответственно), гидролизуемых дубильных веществ (1,58±0,05% и 1,82±0,07% соответственно), полисахаридов (3,2±0,1% и 2,9±0,1% соответственно), аминокислот (3,75% и 3,3% соответственно). Мажорными фенольньши соединениями травы м. кавказского и м. абхазского явились галловая кислота, лютеолин-7-гликозид и танин; элементами - калий, кальций и кремний.

4. Проведены исследования биологических особенностей развития и доказана перспективность интродукции м. кавказского и м. абхазского в условиях Ставропольского края. Установлено, что урожайность семян м. кавказского и м. абхазского в условиях интродукции составляет около 40 г/м2, урожайность корневищ с корнями - более 1,5 кг/м2.

5. Обоснован оптимальный состав косметического геля: масло морозника кавказского - 10%, масло льняное - 81,5 %, аэросил - 8 %, нипагин-нипазол (3:1) - 0,5%. Разработана технологическая схема производства косметического олеогеля и выбрана рациональная упаковка -полиэтиленовые тубы.

6. Установлено, что масло морозника кавказского является малотоксичным; олеогель с маслом кавказского проявляет высокую противовоспалительную активность, сопоставимую с активностью мази календулы.

7. Разработан проект ФСП «Масло морозника для наружного применения».

Таким образом, проведенные исследования липидного состава семян и подземных органов интродуцированных и дикорастущих видов морозника кавказского и абхазского показали их идентичность и возможность применения в качестве растительных источников эссенциальных жирных кислот семейств со-3 и ш-6 и перспективу дальнейшего изучения для разработки лекарственных и космецевтических средств на их основе.

Богатый фитохимический состав травы исследуемых видов морозника представляет интерес для проведения исследований с целью выявления фармакологической активности и возможности рационального комплексного использования сырья.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Сравнительное морфолого-анатомическое исследование двух видов морозника (Helleborus) семейства лютиковые (Ranunculaceae) / З.В. Ищенко [и др.] // Современные проблемы науки и образования. - 2012. -№ 6. — 6с.

2. Изучение жирнокислотного состава полярных липидов некоторых представителей флоры Кавказа (Helleborus abchasicus А.Вг. и Helleborus caucasicus A.Br., Borago officinalis L., Oenothera biennis L.) / З.В. Ищенко [и др.] // Вопр. биологич., мед. и фармац. химии. - 2013. - № 3. - С. 52-56.

3. Ищенко, З.В. Биофармацевтические исследования с целью обоснования состава косметического геля с маслом морозника кавказского / З.В. Ищенко, С.С. Ляшенко, О.Н. Денисенко // Проблемы фармацевтической науки и практики. Сб. материалов 3 Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием. - Владикавказ, 2013. - С. 158-161.

4. Поиск перспективных растительных источников липидов флоры Северного Кавказа / З.В. Ищенко [и др.] // Молодые ученые в решении актуальных проблем науки. Сб. работ молодых ученых 2 Международной научн.-практ. конф. - Владикавказ, 2011. - С. 208-211.

5. Определение содержания пигментов в жирных маслах некоторых представителей флоры Северного Кавказа / З.В. Ищенко [и др.] // Актуальные проблемы науки фармацевтических и медицинских вузов: от разработки до коммерциализации: Материалы науч.-практ. конф. с междунар. участием, посвященной 75-летию Пермской государственной

фармацевтической академии (7-9 декабря 2011 г.). - С. 207-208.

6. Ляшенко, С.С. Анатомо-диагностические признаки некоторых представителей семейств Лютиковые и Бурачниковые флоры Северного Кавказа / С.С. Ляшенко, З.В. Ищенко, О.Н. Денисенко // Вопросы образования и науки: теоретический и методический аспекты. Сборник науч. трудов по материалам Междунар. научн.-практ. конф. 30 апреля 2012. Часть 6. - Тамбов, 2012.Изд-во: ТРОО «Бизнес-Наука-Общество» -С. 74-76.

7. Ищенко, З.В. Аминокислотный состав надземной части магнолии суланжа (Magnolia soulangeana), магнолии кобус (Magnolia kobus) и морозника кавказского (Helleborus caucasicus) / З.В. Ищенко, М.И. Филонова // Вестн. Перм. гос. фармац. акад. - 2010. - № 7. - С. 81-83.

8. Ищенко, З.В. Изучение жирного масла корневищ с корнями морозника кавказского / З.В. Ищенко, С.Г. Юнусова, О.Н. Денисенко // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2009. - Вып. 64. - С. 57-58.

9. Ищенко, З.В. Жирнокислотный состав масла морозника кавказского / З.В. Ищенко, С.Г. Юнусова, О.Н. Денисенко // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2010,- Вып.65.-С. 68-69.

Ю.Ищенко, З.В. Интродукция морозника абхазского в условиях ботанического сада Пятигорской ГФА / З.В. Ищенко, О.Н. Денисенко // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2012. - Вып. 67. - С. 46-47.

11.Ищенко, З.В. Липиды корней и корневищ морозника кавказского / З.В. Ищенко, С.Г. Юнусова, О.Н. Денисенко // Химия и медицина, Орхимед-2009: тез. докл. VII Всерос. конф. с молодеж. науч. школой 1-5 июля 2009 г. - Уфа, 2009. - С. 200.

12.Ищенко, З.В. Флавоноидный состав надземной части морозника абхазского (Helleborus abhasicus A.Br.) и морозника кавказского (Helleborus caucasicus A.Br.) / З.В. Ищенко, М.И. Кодониди, О.Н. Денисенко // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2011. - Вып. 66. -С. 103-104.

13.Иванов, В.В. Микроэлементный состав рейноутрии сахалинской (Rheynoutria sachalinensis) и морозника кавказского (Helleborus caucasicus A.Br.) / В.В. Иванов, З.В. Ищенко, О.Н. Денисенко // Актуальные проблемы фармацевтической науки и практики. - 2009. - С. 42-45.

14.Изменение жирнокислотного состава масел энотеры двухлетней (Oenothera biennis L.) и морозника кавказского (Helleborus caucasicus A.Br.) в процессе хранения / Е.В. Чернова, З.В. Ищенко [и др.] // Молодые ученые в решении актуальных проблем науки: сб. работ молодых ученых 4 междунар. научн.-практ. конф. - Владикавказ, 2013. - С.261 -263.

15.Идентификация некоторых фенольных соединений 4 видов лекарственных растений (бурачника лекарственного, энотеры двухлетней, морозника кавказского, морозника абхазского) методом ВЭЖХ / С.С. Ляшенко, Е.В. Чернова, З.В. Ищенко [и др.] // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2013. -Вып. 68. - С. 65-67.

Приносим благодарность старшему научному сотруднику, канд. хим. наук Юнусовой С.Г. и директору Института органической химии Уфимского научного центра РАН, действительному члену РАН Юнусову М.С.

ИЩЕНКО ЗАЛИНА ВАСИЛЬЕВНА

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ МОРОЗНИКА АБХАЗСКОГО НЕЬЬЕВОКиБ АВСНАвКТив А.В1*. И МОРОЗНИКА КАВ1САЗСКОГО НЕ1ХЕВО!Ш8 САиСА81Си8 А.В&

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Подписано к печати 2013 г., формат 60x84 1/16

Бумага книжно-журнальная. Печать - ротапринтная. Усл. печат. л. 1,0 Тираж 100 экз. Заказ №

ПЯТИГОРСКИЙ МЕДИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ - ФИЛИАЛ ВОЛГОГРАДСКОГО МЕДИЦИНСКОГО УНИВЕРСИТЕТА МИНЗДРАВА РОССИИ (357532, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11)