Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Фармакогностическое изучение некоторых видов растительного сырья, содержащих подофиллотоксин.

04201455008

пятигорским медико-фармацевтический институт -филиал государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «волгоградский государственный медицинский университет» министерства здравоохранения

российской федераци:

На правах рукописи

МУРАДХАНОВ РУСЛАН РАДЖАБАЛИЕВИЧ

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ НЕКОТОРЫХ ВИДОВ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ, СОДЕРЖАЩИХ

ПОДОФИЛЛОТОКСИН

14.04.02 Фармацевтическая химия, фармакогнозия

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Научный руководитель: Коновалов Дмитрий Алексеевич доктор фармацевтических наук

профессор

Пятигорск 2013 год

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.............................................................................................................6

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.........................................................................................12

ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ИССЛЕДОВАНИЙ ПО ИЗУЧЕНИЮ НЕКОТОРЫХ ВИДОВ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ, СОДЕРЖАЩЕГО ПОДОФИЛЛОТОКСИН......................................................13

1.1. Лигнаны, общая характеристика класса биологически активных соединений...........................................................................................13

1.2. Подофиллотоксин, общая характеристика, история изучения...........14

1.3. Пути получения подофиллотоксина......................................................18

1.4. Поиск подофиллотоксина в растениях..................................................18

1.5. Методы выделения лигнанов группы подофиллотоксина из растительного сырья.............................................................................................22

1.6. Методы идентификации и количественного определения подофиллотоксина и его производных в растительном сырье........................24

1.7. Применение подофиллотоксина в медицине. Лекарственные средства на основе подофиллотоксина...............................................................28

ВЫВОДЫ ПО ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ............................................................31

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.....................................................................33

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ..................................34

2.1. Объекты исследования, образцы растительного сырья и их фармакогностическая идентификация................................................................34

2.1.1. Подофилл щитовидный. Описание вида..................................................35

2.1.2. Подофилл гималайский. Описание вида..................................................38

2.1.3. Можжевельник виргинский. Описание вида...........................................41

2.2. Методы выделения, очистки и идентификации подофиллотоксина

в сырье исследуемых видов.................................................................................43

2.2.1. Выделение подофиллотоксина..................................................................43

2.2.2. Идентификация и количественное определение подофиллотоксина методом тонкослойной (планарной) хроматографии......................................................................................................45

2.2.3. Определение числовых показателей исследуемого сырья.....................46

2.2.4. Изучение элементного состава..................................................................46

2.3. Биологические методы исследования..........................................................47

2.3.1. Морфолого-анатомическое изучение исследуемых видов растительного сырья.............................................................................................47

2.3.2. Интродукционные исследования. Определение урожайности сырья.......................................................................................................................48

2.4. Статистическая обработка данных...............................................................49

ГЛАВА 3. МОРФОЛОГО-АНАТОМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЛИСТЬЕВ ПОДОФИЛЛОВ ЩИТОВИДНОГО И ГИМАЛАЙСКОГО И ПОБЕГОВ МОЖЖЕВЕЛЬНИКА ВИРГИНСКОГО.....................................50

3.1. Макроскопическое изучение исследуемых растительных объектов........50

3.1.1. Макроскопическое изучение листьев подофилла щитовидного...........50

3.1.2. Макроскопическое изучение подофилла гималайского листьев...........51

3.1.3. Макроскопическое изучение можжевельника виргинского побегов...................................................................................................................51

3.2. Микроскопическое изучение исследуемых растительных объектов.......52

3.2.1 Микроскопическое изучение листьев подофилла щитовидного..... .......52

3.2.2. Микроскопическое изучение подофилла гималайского листьев..... ......55

3.2.3. Микроскопическое изучение можжевельника виргинского побегов...................................................................................................................58

ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ........................................................................................71

ГЛАВА 4. ИЗУЧЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ПОДОФИЛЛОТОКСИНА И ДИНАМИКИ ЕГО НАКОПЛЕНИЯ В ПОБЕГАХ МОЖЖЕВЕЛЬНИКА ВИРГИНСКОГО, ЛИСТЬЯХ ПОДОФИЛЛА ГИМАЛАЙСКОГО И ПОДОФИЛЛА ЩИТОВИДНОГО................................73

4.1. Подбор оптимальных условий экстрагирования подофиллотоксина из растительного сырья.......................................................73

4.2. Изучение содержания подофиллотоксина в растительном сырье методом тонкослойной хроматографии..............................................................84

4.3. Динамика накопления подофиллотоксина в сырье можжевельника виргинского, подофилла щитовидного и подофилла гималайского...............86

4.4. Результаты интродукционных исследований. Определение урожайности исследуемого сырья.......................................................................88

4.5. Изучение элементного состава исследуемых видов сырья.......................91

ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ..........................................................................................95

ГЛАВА 5. РАЗРАБОТКА НОРМ КАЧЕСТВА СЫРЬЯ МОЖЖЕВЕЛЬНИКА ВИРГИНСКОГО И ВИДОВ ПОДОФИЛЛА...............97

5.1. Показатели доброкачественности сырья можжевельника виргинского и видов рода подофилл..................................................................97

5.1.1. Анатомо-диагностические признаки сырья.............................................97

5.1.2. Показатели доброкачественности исследуемых видов растительного сырья...........................................................................................100

5.2. Стандартизация изучаемых видов растительного сырья........... ...............101

5.2.1. Методика экстракции подофиллотоксина из растительного сырья.....................................................................................................................101

5.2.2. Разработка экспресс - методики качественного определения подофиллотоксина в растительном сырье........................................................102

5.2.3. Разработка методики количественного определения подофиллотоксина в растительном сырье........................................................104

ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ........................................................................................111

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................................114

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Одной из острых проблем современной российской фармации остаётся производство отечественных лекарственных препаратов на основе отечественных субстанций, полученных из лекарственного сырья или же путем синтеза.

В настоящее время российская фармацевтика использует около 8 тыс. условных тонн субстанций в год, из которых лишь 1-2 тонны поставляют российские производители. Остальной объем востребованных компонентов лекарственных средств наша страна закупает за рубежом (Китай, Индия, ЕС и др.), что не может не отразиться на конечной цене продукта.

Зависимость от зарубежных поставок сырья, на которые оказывают влияние многие макроэкономические и политические факторы, отрицательно сказывается на перспективах роста и возможностях развития отечественной Фарминдустрии. Необходимость создания производства фармацевтических субстанций, лекарственных средств и медицинской техники не раз озвучивалась первыми лицами государства, как одна из стратегических задач госбезопасности страны в будущем (Стратегия ФАРМА-2020).

Онкологические заболевания занимают одно из первых мест в мире по причине смертности. Известно, что более 70% препаратов, применяемых для лечения онкологических патологий, составляют лекарственные средства природного происхождения.

Одними из таких клинически важных препаратов для лечения онкозаболеваний различной локализации являются препараты на основе подофиллотоксина. За рубежом производится множество лекарственных препаратов действующими веществами, которых является либо сам подофиллотоксин, либо его полусинтетические производные. Многие из них являются препаратами выбора при лечении различных опухолевых заболеваний. Так, например, препарат этопозид используется при лечении

рака легкого, препараты тенипозид и этопофос - при комплексной терапии рака мозга, желудка, яичек и др. В нашей стране ранее производился растительный препарат подофиллин, применяемый при воспалительных и инфекционных заболеваниях мочеполовой системы. Однако в настоящее время, ввиду отсутствия сырьевой базы данный препарат не производится.

В последние годы потребность мировой фармацевтической промышленности в подофиллотоксине заметно возросла. Это связано с ростом числа опухолевых заболеваний и с активно ведущимися научными исследованиями, направленными на создание новых полусинтетических лекарственных препаратов подофиллотоксина. В настоящее время Россия закупает препараты подофиллотоксина производства стран Европы, США, Индии и Китая.

Существует несколько, описанных в научной литературе, способов получения подофиллотоксина. Биотехнологический способ основан на выращивании на искусственных питательных средах культуры клеток производящих лигнаны данной группы подофиллотоксина. Данный метод предъявляет высокие требования к оборудованию и устройству технологического процесса, но, не смотря на это, пока не позволяет получать высокий выход целевого компонента. Химический синтез фармакологически активных изомеров подофиллотоксина затруднителен в силу присутствия в молекуле четырех хиральных центров. Поэтому основным источником субстанции подофиллотоксина для фармацевтической промышленности в ближайшей перспективе остаётся растительное сырьё.

Официнальным источником подофиллотоксина в России ранее являлись корневища с корнями подофилла, однако данный вид сырья в силу низкой рентабельности отечественной культуры в настоящее время неконкурентоспособен.

Степень разработанности темы.

В СССР в 60-80-х годах XX века проводились масштабные

интродукционные исследования представителей рода Podophyllum, имелись промышленные плантации в Ленинградской, Московской, Львовской областях, в Крыму. С фитохимической точки зрения изучены корневища и корни подофилла (ФС 42-1475-89 «Подофилла корневища с корнями»). Исследованием данных видов занимались такие ученые как Е.А. Селиванова-Городкова, Н.А.Громова, И.Ф. Сацыперова, В.П. Богданова. Однако в работах этих авторов не было дано детального изучения накопления подофиллотоксина в надземной части растений.

Можжевельник виргинский в фитохимическом аспекте в нашей стране не изучался, несмотря на достаточно широкое распространение данного вида в качестве декоративного и градоозеленительного растения.

Цель исследования

Фармакогностическое изучение листьев некоторых представителей рода подофилл (семейство Berberidaceae) и побегов можжевельника виргинского (семейство Cupressaceae), в качестве возможных дополнительных источников подофиллотоксина.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

провести анализ литературных данных по объектам диссертационного исследования;

установить анатомо-диагностические признаки изучаемого сырья, содержащего подофиллотоксин;

провести интродукционные исследования представителей рода Podophyllum на территории Кавказских Минеральных Вод (КМВ); разработать методику выделения подофиллотоксина из растительного сырья;

разработать методики качественного и количественного определения подофиллотоксина в изучаемых видах растительного сырья для их стандартизации;

изучить динамику накопления подофиллотоксина в побегах можжевельника виргинского, листьях подофилла гималайского и подофилла щитовидного в процессе их роста и развития; разработать нормы качества на исследуемое растительное сырьё.

Новизна диссертационного исследования заключается в том, что впервые исследовано содержание подофиллотоксина в побегах можжевельника виргинского и листьях некоторых представителей рода Podophyllum, интродуцируемых на территории КМВ.

Предложена новая методика экстракции подофиллотоксина из растительного сырья.

Разработана методика ТСХ-денситометрического определения подофиллотоксина в растительном сырье.

Впервые установлены анатомо-диагностические признаки побегов можжевельника виргинского и листьев подофила гималайского и щитовидного.

Теоретическая значимость работы. Полученные данные могут являться фундаментом для дальнейших фармакотехнологических исследований с целью создания отечественных противоопухолевых и противовирусных лекарственных препаратов на основе подофиллотоксина и других лигнанов его группы.

Практическая значимость работы. Предложен новый, более экологичный и экономичный способ выделения подофиллотоксина из растительного сырья. Установлены нормы качества сырья можжевельника виргинского и видов подофилла, на основе которых разработан проект ФС «Подофилла гималайского листья». В результате проведенных исследований показана перспективность использования нового вида сырья, заготавливаемого от представителей рода Podophyllum, а также от можжевельника виргинского в качестве источника подофиллотоксина. Разработанная методика определения подофиллотоксина в растительном

сырье апробирована в лаборатории Отдела контроля качества фармацевтического предприятия ЗАО «Вифитех» (акт внедрения от 14.06.2013 г.), и внедрена в учебный процесс кафедры фармакогнозии и ботаники ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет» Минздрава России (акт внедрения от 01.07.2013 г.).

Методология и методы исследования. В ходе исследования использовались все виды фармакогностического анализа растительного сырья: морфолого-анатомический, биологические, химические, физико-химические (хроматографические) методы. Положения, выносимые на защиту:

1. Краткие результаты научно-информационного анализа современного состояния исследований видов растений, содержащих подофиллотоксин.

2. Результаты морфолого-анатомического изучения исследуемых видов растительного сырья.

3. Разработка новой методики выделения подофиллотоксина из растительного сырья.

4. Разработка методик качественного и количественного определения содержания подофиллотоксина в сырье.

5. Результаты исследования растительных объектов на содержание подофиллотоксина и динамики его накопления в процессе их годового роста и развития.

6. Результаты интродукционных исследований.

Степень достоверности и апробация работы. В работе в ходе изучения образцов растительного сырья были использованы современные методы фармакогностического анализа. Все экспериментальные данные были статистически обработаны и являются достоверными.

Фрагменты диссертационного исследования были доложены на 65-68 Региональных конференциях «Разработка, исследования и маркетинг новой фармацевтической продукции», в г.Пятигорске (2010-2013 гг.); II, III и IV

I

1, ^

ä I

Международных научно-практических конференциях «Молодые ученые в решении актуальных проблем науки», г. Владикавказ (2011-2013 гг.); региональной конференции «Инновационные идеи молодежи Ставропольского края - развитию экономики России», в г. Ставрополе (октябрь 2012 г); XIX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство». Доклад был отмечен дипломом II степени на конкурсе работ молодых ученых в номинации «Провизор», проводимом в рамках конгресса (апрель 2012 г.). Работа была представлена на краевом конкурсе научно-инновационных работ молодых ученых «У.М.Н.И.К. - 2012». По итогам конкурса заключен договор о выполнении НИОКР с ООО «Эпоха инноваций»

По теме работы опубликовано 10 научных работ, отражающих основное содержание диссертации, из них 3 в журналах рекомендованных ВАК.

Экспериментальные исследования по теме диссертации выполнялись на кафедрах фармакогнозии, ботаники и аналитической химии Пятигорского медико-фармацевтического института - филиала ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России, а также на Эколого-ботанической станции Ботанического института им. Комарова РАН в г. Пятигорске.

Исследования по теме диссертации выполнены при поддержке гранта Фонда содействия развитию малых форм предпринимательства в научно-технической сфере (ГК № 7/НИОКР от 1 февраля 2013 года).

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ИССЛЕДОВАНИЙ ПО ИЗУЧЕНИЮ НЕКОТОРЫХ ВИДОВ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ, СОДЕРЖАЩЕГО ПОДОФИЛЛОТОКСИН

1.1. Лигнаны, общая характеристика класса биологически активных соединений

Лигнаны - класс вторичных растительных метаболитов, образующихся в результате окислительной димеризации двух фенилпропаноидных единиц (рис.1). Термин «лигнаны» был впервые предложен Р.Д. Хаувордом (Я-Б. НошаЛИ) в 1936 году. В настоящее время известно более 200 представителей этой группы. С химической точки зрения лигнаны показывают огромное структурное разнообразие, хотя их молекулярная основа состоит только из двух фенилпропановых (С6-СЗ) единиц. Это оптически активные соединения, которые широко распространены в царстве растений и были обнаружены в видах, относящихся более чем к 70 семействам [1].

6 7 9

4