Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Фармакогностическое изучение чистеца крупноцветкового

На правах рукописи

ТАМКОВИЧ ТАТЬЯНА ВИТАЛЬЕВНА

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЧИСТЕЦА КРУПНОЦВЕТКОВОГО

15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

0031648 10

Пятигорск - 2008

003164810

Работа выполнена в государственном образовательном учрежден высшего профессионального образования «Пятигорская государственн фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранен и социальному развитию»

Научный руководитель

Официальные оппоненты

Ведущая организация

доктор фармацевтических наук, профессор Челомбитько Вячеслав Александрович

доктор фармацевтических ьаук, профессор

Денисенко Олег Николаевич

ГОУ ВПО Пятигорская ГФА Росздрава

кандидат фармацевтических наук, доцент Кичев Дмитрий Геннадьевич ГОУ ВПО «Северо-Кавказский государстве ный технологический университет»

ГОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится «13» марта 2008 г. в_часов на заседании Диссерта

онного совета Д 208 069 01 в ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава (357532, Пятигорск, пр Калинина, 11)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Пятигорско ГФА Росздрава (357532, г Пятигорск, пр. Калинина, 11)

Автореферат разослан «_»_2008 г

/-1

Ученый секрегаоь диссертационного совета /Я/^'

доктор фармацевтических наук, профессор Е В Компанцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы Перед современной фармацевтической наукой стоит задача - увеличить поисковую работу по созданию новых эффективных растительных лекарственных препаратов В настоящее время в России, как и в большинстве других стран, большой процент взрослого населения страдает острой и хронической патологиями печени и желчевыводящих путей В связи со значительным распространением этих заболеваний, тяжестью их течения, наличием гепатотоксических свойств широко применяющихся синтетических препаратов, в настоящее время предпочтение отдается лекарственным средствам растительного происхождения

Отмеченная в последние годы тенденция к росту патологий желчевыводящих путей и постепенное истощение природных ресурсов традиционных желчегонных лекарственных растений (бессмертник песчаный, пижма обыкновенная, барбарис обыкновенный и др ) делают актуальным поиск новых сырьевых источников лекарственных средств для лечения заболеваний печени и желчевыводящих путей По литературным данным некоторые растения рода чистец (ч лекарственный - Stachys officinalis L., ч буквицецветный - S betonicaeflora Rupr и ч болотный - S palustris L ), сем яснотковые (Lamiaceae) в традиционной медицине многих стран, используются в качестве желчегонных средств и проявляют фармакологическую активность схожую с известным препаратом «Фламин» В конце 70-х годов на Украине из травы ч вздутого (S mflata Benth.) был предложен препарат «Стахихол», отнесенный к группе истинных холеретиков. Однако, из-за отсутствия достаточной сырьевой базы некоторых видов рода чистец и вследствие геополитических изменений, произошедших в последние годы, поиск новых растительных источников желчегонных средств продолжает оставаться актуальным

В этой связи наше внимание привлек интерес чистец крупноцветковый (Stachys macrantha С Koch), известный также как буквица крупноцветковая (Betónica macrantha С Koch) Наличие значительной надземной фитомассы по сравнению с другими випами чистепа и достаточная распространенность "а территории Северного Кавказа, прогнозируют перспективность его использования в качестве нового сы-

з

рья для получения лекарственных средств Однако, для внедрения в медицинску практику необходимы исследования по изучению химического состава его биолог чески активных соединений и разработке методов стандартизации сырья Поэто фармакогностическое изучение чистеца крупноцветкового является актуальной пр блемой для фармацевтической науки и практики Цель и задачи исследования Цель настоящего исследования - фармакогностическое изучение травы чис ца крупноцветкового, разработка нормативной документации на сырьё (трава), ка потенциального источника получения БАВ, обладающих желчегонным и против воспалительным действием.

Для досчижения поставленной, цели необходимо было решить следующие з

дачи

1. Выявить характерные места произрастания и определить ориентировочны запасы сырья чистеца крупноцветкового в некоторых регионах Северног Кавказа, в Ставропольском крае и в Карачаево-Черкесской Республике

2 Изучить возможность интродукции чистеца крупноцветкового в ботаническо саду Пятигорской ГФА

3 Провести фитохимическое изучение травы чистеца крупноцветкового (поли фенольных соединений, иридоидов, эфирного масла, полисахаридов, органи ческих кислот, аминокислот, макро- и микроэлементного состава).

4 Изучить оптимальные условия извлечения флавоноидов из травы чистеца крупноцветкового и разработать методику их количественного определения

5. Выявить анатомо-диагностические признаки сырья (травы) чистеца крупноцветкового

6 Провести стандартизацию травы чистеца крупноцветкового, разработать нормативную документацию на данный вид сырья

7 Провести фармакологические исследования экстракта чистеца крупноцветкового

Научная новизна исследования Впервые были определены места произрастания и ориентировочные ресурсы травы чистеца крупноцветкового на Северном Кавказе (в Предгорном районе Ставропольского края и в Карачаевском районе Карачаево-Черкесской Республики) В Ставропольском фае (Предгорный район) эксплуатационный запас травы чистеца крупноцветкового составил 4,07 т воздушно-сухого сырья, а в Карэтаевском районе Карачаево-Черкесской Республики - 3,52 т воздушно сухого сьрья

В результате проведенных фитохимических исследований установлено содержание в траве ч крупноцветкового основных групп биологически активных соединений. эфирное масло, флавоноиды, дубильные вещества, оксиюричные кислоты, 1$'марины, иридоиды, полисахариды, аминокислоты, ранее в литературе не описанные для этого вида.

Методом ВЭЖХ в сырье чистеца крупноцветною го впервые идентифицированы и количественно определены шесть фенольных соединений флавоноиды (ги-перозид, дигидрокверцетан и изосалипурпозид), фенолокислоты (галловая кислота), кумарины (дикумарин и умбеллиферон) Методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) в траве чистеца крупноцветкового идентифицированы иридоиды гарпагид, гарпагидацетаг, аюгозид и аюгол

Впфвые изучен фракционный состав полисахаридного комплекса травы чистеца кру пноцветкового Обнаружены водорастворимые полисахариды (0,78-0,83%), пектиновые вещества(036-0,55%), гемицеллюпоза А (3/30-3,21%), гемицеллюлозаБ (2,45-3^6%).

Охарактеризованы свободные органические кислоты, которые представлены винной,лимонной и аскорбиновой кислотами

Методом газовой хромато-масс-спектроснопии (ГЖХ-МС) изучен состав эфирного масла чистеца крупноцветкового. Впервые идентифицировали 56 соединений, преобладающими компонентами эфирного масла чистеца кру пноцветкового являются сесквитерпеноиды, из которых доминирующими являются - <;-кадинен, Ь-

■ MiT.nm.nt /и 1 Г с О ~ •_____п.____Г 1 Т1 п П ЛПГ 1 1 Г»М 11 ---^ ------ГП 1 1

каламсьсь, 1 гч.-^! 1п^-^-икьсишцикии и]дидек<1-

3,7-диен, диэпицедрен-1-оксид, т-кадинол, а -кадинол, оксид кариофиллена, цио-£-а-бисабол ена эпо ксид, 6,] 0,14-три мешл-2-пентад еканон

Найдены оптимальные условия анализа флавоноидов - качественного (методом ТСХ) и количественного (методом дифференциальной УФ-спектрофотометрии) в траве чисгеца крупноцветноюго Изучена динамика содержания флавоноидов различных органах травы в зависимости от фазы вегетации Установлено, что мак симапьное количество флавоноидов накапливается в листьях и в траве в период цв тения — начало плодоношения, в соцветиях - во время цветения

Установлен аминокислотный состав, который представлен 14 аминокисло ми, 8 из которых, являются незаменимыми метаонин, треонин, гистидин, аргини лейцин, валин, фенил аланин, изолейцин.

Впервые изучен макро- и микроэлементный состав травы чисгеца крупно цветкового,представленный 24 элементами, из которых доминирующими являютс калий, кальций, кремний, магний, фосфор и железо

Проведена стандартизация сырья чисгеца крупноцветно во го с учетом совр менных требований предъявляемых к подлинности и качеству лекарственного р тигельного сьрья

Впервые проведены фармакологические исследования и установлена желч тонная, противовоспалительная и ранозаживляющая активность экстракта трав чисгеца крупной веткою го

Практическая значимость

Выявлена возможность использования нового вида отечественного сьрь травы чисгеца крупноцветкового для получения биологически активных со един ний, включающих флавоноиды, ьу марины, дубилшые вещества, иридоиды, фенол кислоты, эфирные масла, полисахариды, органические кислоты, аминокислоты, о ладающие желчегонным, противовоспалительным и рано заживляющим действием Для травы чисгеца крупноцветко во го разработаны методики качественного количественного анализа флавоноидов, иридоидов, дубильных веществ, органич ских кислот, эфирного масла, аминокислот и др соединений с использованием годовБХ, ТСХ , ВЭЖХ, ГЖХ-МС, спектрофотометрии

б

На основании и микроскопических исследований травы чистеца крупноцвет-kd во го выявлена совокупность анато мо-диагностических признаков, nt> которым можно проводить идентификацию его сырья

В результате проведенных ресурсных исследований определена ориентировочная урожайность травы чистеца крупноцветно но го и выявлены два района, пригодные для промышленной заготовки сьрья этого видана Северном Кавказе Выявлена также возможность выращивания в условиях культуры чистеца крупноцветкоюго наКМВ

Внедрение результатов исследования По результатам исследования биологической активности сухого экстракта травы чистеца крупноцветыового получен акт внедрен и я ГОУ ВПО Пятигорской государственной фармацевтической академии Росздрава (акт о внедрении от 15 июня 2007 г) Сухой экстракт рекомендован для дальнейшего углубленного фармакологического исследования

Подготовлена ФСП «Чистеца крупноцветно во го трава» (подтверждена актом внедрения от 19 июня 2007 г.), принятая ЗАО «Вифитех» (Россия), позволяющая использовать в дальнейшем траву чистсца крупноцветкового как новый вид сьрья для получения лекарственных прел aparro в желчегонного и противовоспалительного действия

Основные положения, выносимые на защиту

1 Результаты изучения химического состава травы чистеца кругшоцветнового физико-химическими методами

2 Результаты качественного и количественного определения флавоноидов в траве чистеца крупноцветкоюго с помощью предложенных методик.

3 Результаты ресурооведческих исследований травы чистеца крупноцветкового натерритории Карачаево-Черкесской Республики и Ставропольского края

4 Результаты изучения фармакологической активности экстракта травы чистеца крупноцветю вого

5 Нормы качества, необходимые для стандартизации травы чистеца крупноцветно во го

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом нф'чн исследовательских работ ГОУ ВПО Пятигорской государственной фармацевтам ской академии Росздрава(номер государственной регистрации 01200112164)

Апробация работы и публикации

Основные положения диссертационной работы доложены на 60-й межреги нальной конференции «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтич ской продукции» (Пятигорск, 2005 г.) По материалам диссертации опубликовано 1 работ в том числе 2 статьи - в журналах, рекомендованных ВАК

Объем и структура диссертации

Работа изложена на 167 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзоралитературы, описания объектов и методовисспедования, 4 глав собственных исследований,общих выводов, списка цишруалой литературы, включающего 250 источник)в, из которых 54 иностранных авторов, и приложения. Диссертация иллюстрирован а 32 рисунками и 43 таблицами.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объект исследования — трава чистеца крупноцветкового, заготовленная в р личных районах Северного Кавказа (Предгорный район Ставропольского края и ранаевский район Каранаево-Черкесской Республики)

1 Изучение биологически активных соединений, содержащихся в траве чистеца крупноцветкового В результате исследования качественного состава БАВ травы чистеца круп цветкового установлено присутствие в ней фенольньк и тритерпеновых соединен ир идо ид о в, эфирного масла, полисахаридов, органических кислот, макро- и микр эл ементо в, амино кислот.

Методом ВЭЖХ изучен качественный и количественный состав фенолшых единений чистеца крупноцветкового. Впервые идентифицированы галловая кисло ИЗО сап илу рПОЗИД, ди ку мйрИН, ДИГИДрО КБсрЦсТИН, ГИПфОЗИД,у мбеллиффон (рюС 1

Рисунок 1 - Спектр ВЭЖХ фенольных соединений водно-спиртового (спиртэтиловый 70%) извлечения нз травы чистеца крупноцветиэвого Методом внутренней нормализации выявлено, что вфенольном комплексе преобладают у мбеллиферон (12,48%), галловая шепота (11,74%) и гиперозид (822%). Из полученньк данных также следует, что в фенол шом комплексе содержится высокая концентрация не идентифицированного вещества (21,93%). Результаты анализа фенольных соединений представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Фенольные соединения водно-спиртового извлечения из травы чистеца крупноцветкового,идентифицированные методомВЭЖХ

№ ' ¡аимснование вещества Содержание веществ в выделенной смеси, %

1 ке идентифицированное вещество 21,93

2 галловая к-та 11,74

3 ичосалипурпсиид 4,52

4 дикумарин 1,70

5 дигидрокверцетин 0,40

6 гиперозид 8,22

7 умбеллиферон 12,48

Количественное определение суммы флавоноидов в траве чисгеца крупноцвет-кового.проводили методомдифференциальной спектрофотометрии. Содержание су ммы флавоноидов в изучаемом объекте в пересчёте на гиперспид составило в среднем 1,10 %.

В различных органах травы чистеца крупноцветшвого изучена динамика наг коштения фиавоноидов(рис2).

- листья SN 1 -бутонизация 2-начало цветения

/ . " - Vpaea 3- цветение 4-начало плодоношения

— """ - - - , соцветия 5-плодоношение

У . '

.. -'

Рксукок2 - Содфжание флавоноидов в различных органах травы ч. фупноцветшвого в зависимости от фаз вегетации При сравнении содержания суммы флавоноидов в траве чистеца крупноц:

швого в разные фазы вегетации, установлено, что наибольшее содержание сумм?

флавоноидов наблюдается в фазу цветения - начало плодоношения в листьях и

траве. Максимал ьное накопление фиавоноидов для соцветий характерно в фазу и ве

тения. В стеблях растения обнаружено наимск ыпсс количество флавоноидов.

Содфжание тритерпеновых соединений определяли также в фазу цветения начато плодоношения. Спектрофотометрическим методом установлено, что тритер пеновые соединения составляют 036-039%. Органические кислоты определял! титр и метрическим методом в пересчете на яблочную кислоту. Общее содержани| составило i ,08-i /4% (таблЗ).

Содержание полисахаридов (4 £7-5,49%) в сьрье определяли - гравиметрически. Методом пфманганато метрического титрования определяли дубильные веще-, ства. Их количество составило 2,40-3,20%.

Эфирное масло из травы чистеца крупноцветна вою получали Пфегонюй с во дяным паром по методу 2 ГФ XI издания. Качественный состав эфирного масла и количественное содержание в нём отдельных компонентов установлен методом га зожидкостной хроматографии на хромато-масс-спектрометре АТ-5973 SMART Компонентный состав идентифицирован сравнением времен удфживания пиков исследуемых веществ с до сто верными образцами.

Количественное содержание компонентовопределено методом нормировки при компьютерной обработке данных. Преобладающими компонентами эфирного масла чистеца крупноцветкового являются сесквитфпеноиды. Масс-спектры и структур-

ные формулы некоторых из них представлены ниже. Всего в составе эфирного масла идентифицировано 56 соединений.

41

79|

,55

40 ПО 180 ?50 3?0 390 (герЕЬ) ГйрЬ!Ьа!гпе, 1Д3.4,4а.5.8,8а-она hydra-7.fr,в!!1у

д-кадинен

1«нТ

, I 107

и

40 110 180 250 320 390 (татйЬ) СагуорЬу11епе охйе

оксид кариофиллша

40 80 120 160 200 240 (герНЬ) МарЬ«Па!епе, 1^,3,446^ 1-.у{1го-1,&<11гпе{Ьу1-4Ч1-

Ь-капамен

1

05

'та 111

он

X

40 100 160 220 280 340 татйЬЦаи.-СасЛпо!

х- кадинол

100-

он

121

222

40 70 100 130 160 190 220 250 ;татКЬ) а-СэЙ1П01

а-кадинол

56 к7 93

у

У I

151

187 220

40 70 100 130 160 190 220 25( ;татПЬ) с|&г-а-аяЬо1епе ерохШе

цис-С- а-бисаболенаэпоксид

120 160 200 240

40 70 100 130 160 190 220

{тэ!п№) 12-ОхаЬгсус1о[91 0]йо<2есэ-3.7-(^епе, 1,5,5.8-1.6 (т а ¡п!|Ь) Оер1сейгопе-1-озог(е

1 ^^,8-тепрамегил-[1 Я-(1 Я,ЗЕ,7Е,11 &)]- диэпицедрен-1-оксид

12-оксабицикпо [9.1.0]додека-3,7-диен

В ходе анализа иридоидовдля их количественного определения было важно установить влияние экстрагента на их извлечение из сырья Для этого нами была про ведена сравнительная оценка экстр агентов, результаты которой прея ставлены в таб-лице2

Таблица 2 - Влияние растворителя на извлечение иридоидов из травы чистец крупноцветкового

Показатели Экстрагент

хлороформ сгашг этиловый 96% спирт этиловый 70% раствор натрия хлорида 25%

Содержание иридоидов, 0 13 0,29 1 12 0,73

Таким образом, установлено, что максимальное количество иридоидов из тра вы чистеца крупноцветкового извлекалось спиртом этиловым 70%

Результаты количественного определения БАВ в траве чистеца крупноцветно юге приведены в таблице 3

ТаблицаЗ - Биологически активные вещества травы чистеца *рупноцветкового

БАБ Количественное содержание БАВ в пересчёте на абсолютно сухое сырьё, % I

Ставропольский край Карачаево-Черкесская Республика 1

Дубильные вещества Хср=2,40, Ьхср=0,027,Дх=0,07,£=2,92 Хср=3,20,5хср=0,03,Дх=0,08,е=2,41

Флавоноиды ХчгМД», Ьхср=0,008,Дх=0,02,с=1,88 Хср=1,12,5>Хср=0,011 ,Дх=0,03,е=2,53

Хлорофилл Хср=1,61, 8x^=0,027, Лх-0,07, е=4,29 Хсв=1,99,8хсо=0,038,Дх=0,08, е=4,02

Гритерпеноиды Хср=0,36, 5x^=0,006, Дх=0,02, е=4,17 Хср=0,39, БхсИ),004,Дх=0,01 ,е-2,56

Аскорбиновая кислота ^=0,07, 8x^=0,001,Д\=0,003,е=4,22 Хср=0,05,8Хср=0,001, ДХ=0,002,Е=4,5 1

Эфирное масло Хср=0,10, 8x^=0,001,Дх=0,004,ё=4, 14 Хср=0,12,5хср=0,0008,Дх=0,002,е=1,71

Свободные органические кислоты Хф=1,08, 8x^=0,008, Дх=0,02, £=1,94 Хср=1,24, 8x^=0,011, Дх=0,03, е=2 26

Почисахариды ¡Хср-5,49, 5хср=0,09 Дх=0,23,8=4,19 Хср=4,97, 5\с„=0,08, Дх=0,21, е=4,15

Иридоиды ХсР=1,12, 8хср=0,011, Дх=0,03, е=2,50 Хср=1,08, 8хсР=0,009, Дх=0,02, е=2,14

В результате фитохимического исследования установлено, что основные БАВ данного растения следует считать дубилшые вещества - (2,40-3,20)%, флаво ноиды — (1,09-1,12) %, хлорофилл - (1,61-1 £9)%, свободные органические кислот - (] .9А-226)°/« иридоцды( 1,08-1,12) % и полисахариды - (4 07-5 49) % в пересчет« на абсолютно сухое сырье

Исследован макро- и микроалементный состав травы чистеца крупноцветкового Установлено, что изучаемый вид лекарственного растительного сырья, накапливает 24 макро- и мифоалемента Преобладающими элементами являются калий, натрий, кальций, магний, фосфор,железо, кремний

Определено содержание аминокислот в сырье (7,27 мг/100г) В исследуемом объекте преобладают аспарагиновая и глутаминовая кислоты Обнаружено 8 незаменимых аминокислот (метионин, треонин, гистидин, аргинин, лейцин, валин, фенил атанин, изолейцин)

Минеральные компоненты и аминокислоты, подчеркивают терапевтическую значимость сьрья ч. крупноцветно во го и позволяют его использовать для создания лекарственных средств,обладающих комплексным действием

2 Изучение фармакологической активности сухого экстракта чистеца крупноцветкового Учитывая сведения об использовании травы чистеца круп но цветкового в народной медицине, а также содержание в ней комплекса биологически активных соединений, следующим этапом наших исследований явилось изучение фармакологический активности БАВ данного растения Фармакологические исследования проводились на кафедре фармакологии ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава под руководством проф ВЕ Погорелого

Объектом исследования явился сухой экстракт чистеца крупноцветкового, полученный методом биемзцерации, в качестве экстр агента использовали спирт этиловый 70% Оэдержание суммы флавоноидов в полученном экстракте в пересчете на гиперозид составило не менее5,4% Препаратом сравнения служил «Фламин» Наибольший интерес представляло изучение желчегонной активности экстракта чистсца крупноцветкового

Установлено, что ЬЭ^ экстракт чистеца крупноцветкового для самцов и самок крыс составила более 5000 мг/кг, что позволяет его отнести согласно классификации опасности веществ по степени воздействия на организм к1У классу (малотоксичные) со-

( ■ ■ 1 имнмии

Экспериментальными исследованиями было установлено, влияние экстракта чис-

13

теца крупноцветкового на желчевыделительную функцию нечени. Так, применение экс тракта ускоряло секрецию желчи через 1 ч после его введения в среднем на 46,1%, чере: 3 ч - на 162,7% по сравнению с показателями у крыс контрольной группы. Общее коли^ чество желчи, выделившейся за 3 часа у животных, которым вводили экстракт чистецг крупноцветкового, составило 1229Р ± 44,3 мг/100г, т.е. экстракт активирует желчевыде лительную функцию печени на 65,6%> (рис.3). Экстракт чисгсца крупноцветкового Такж' оказывает значительное влияние па показатель холестерина, снижая концентрацию дан ного компонента желчи до 21,0±1,7 мг%, в то Бремя как у животных контрольной 1руп1 пы данный показатель составил 34,5±3,6мг%. Таким образом, экспериментально уста новлено, что при введении экстракта чистеца крупноцветкового происходит выраженно; снижение концентрации ХОЛЙСГШИНЙ (на 39,1%) И I и |ЙКП!|ГНИГ ЙП) 1гп'А"/]ИИя ^КСЛЧНЫХ Ки[ слот (на 78,8%), в результате чего происходит повышение холато-холестеринового ко эффициента (на 187,3%).

желчные холестерин холато- Общее кол-во

кислоты холестериновый желчи1а?ч

коэффициент

Рисунок 3 - Влияние экстракта травы чистеца кру пноцветкового на желчевыдели-

тельную функцию печени

Примечание: обозначены достоверные сдвиги (р<0,05) по сравнению: * - с контрольными животными ;# - с животными, которым вводили фламин)

Поскольку хронические воспалительные заболевания печени, желчного пузу ря и желчных путей возникают при нарушении образования и выведения желчи сопровождаются воспалительными процессами и структурно-дегенеративными к

менениями, то следующим этапом нашей работы явилось определение противовоспалительной и рапозаживляющей активности. Установлено,что куроовое применение экстракта ч истец а крупноцветювого эффективно ограничивает экссудат вную (на443 %) и пролиферагивную (на 51,] %) фазы асептичесюго воспаления (относительно юнтроль-ной группы животных) и способствует увеличению прочности сращения раны более, чем в2 раза по сравнению с животными безлечения(рис.4).

Рисунок 4 - Противовоспалительное и ранозаживляющее действие экстракта ч истец а крупноцветкового (* - р<0,05 — обозначены достоверные сдвиги по сравнению с контрольными животными)

Таким образом,установпено, что экстракт чиетеца крупноцветююго обладает хо-леретическим, протаю воспалительным и рзюзаживпяющим действием.

3 Ресурсоведческие исследования травы чиетеца крупноцветкового СЬектр фармаюлогичесюй активности биологически активных соединений чиетеца крупноцветювого обуславливает возмоиность его применения в медицинсюй практике. Однаю, важнейшим условием использованиялюбого лекарственного растительного сырья, является наличиесьюьевой базы.

Определениеурожайносгги проводили на протяжении 2002-2005 гг. в отдельных це-нопопуляциях на территории: Предгорного района Сгавропольсюго края (3703±15,48 г/м2) и Карачаевсюго районаКарачаею-Черкессюй Республики (206,6*12,! 1 г./м2).

Были исследованы запасы травы чиетеца крупноцветкового в обследованных районах. Данные представлены таблице4.

Таблица4 — Площади зарослей и запасы надземной части чистеца крупноцветково в обследованных районах Северного Кавказа

Районы Площадь зарослей, га Запас воздушно-сухого сырья, т Объем возможной ежегодной заготовки,т

биологический эксплуатационный

Предгорный район 1,20 4,44 4,07 1,02

Карачаевский район 1,93 3,99 3,52 0,88

Итого 3,13 8,43 7,59 1,90

Анализ результатов ресурсоведческих исследований, погазывает; что общая пл щздь заросла! травы чистаца крупноцветювого составляет 3,13 га, а объем возможно ежегоднойтаготговки составляет-1 £0 т

Таким образом, на Северном Кавказе имеются достаточные для промышленн заготовки запасы фавы чистеца 1фупноцветювого

При изучении возможности культивирования диюрастущего сырья изучены периода в жизненном цикле чистеца крупноцветювого Данные представлены в те лице 5

Таблица 5 - Среднеарифметические зншения неюторых биоморфологичесю признаю в разновозрастных особей чистеца крупноцветювого

Возрастные группы Длина корн евища, см «а |||| ¡111 12 1» "3 §15 >8 р! - I? | | (О ^ Г"? и Количество придаточных корней на корн шшце и $ О м а« ГУ о Ц ^ Размер листьев розего«вого побега, см

| Длина пластинки Ширина пластики

Ювенильная 0,6 № 0.3 0,3 0,7 4,5 0,3 4,0 0,7 1,3

Имматурная и 1 7 1,0 0,4 1,1 10,7 0,6 11,1 4,9 3,0

I-1-1-1-1-1-

IV V VI VII УШ

' - образование ■ плодов

, - созреваяяе

- бутошгэацнз г

плодов

- цветенне - отмирание

Рисунок5 -Феноспектр чистеца крупноцветкового вусгсовиях культуры Таким образом, выявленная возможность выращивания в ¡ультуре травы чистеца ¡фупноцветиэвого позволяет при необходимости расширить возможности сырьевой базы этого вида лекарственного сьрья.

4 Стандартизация травы чистеца крупноцветкового Важным этапом стандартизации сьрья является определение его подлинности. В связи с этим нами были выявлены совоьупности анаагомо-диагносшческих признака в, позволяющие идентифицировать этот вид лекарственного растительного сырья.

1 -клетки эпидермиса с извилистыми стен ками, 2-простые волоски, 3-4-8-кпеточные железки, 4 — устьица с друмя онтпоустьичными клетками (дианитный тип) Рисунокб - Фрагмент строения листа с поверхности с нижней (А) и верхней (Б) стороны

Установлено, что форма стенок клеток верхней эпидермы листа извилистая ил слабо извилистая, устьиц не обнфужено. На эпидермисе встретаются простые одн клеточные и многоклеточные волосками Основания волосюв образованы розетю состоящей из 3-4 клеток. С нижней сторонылиста эпидерма представлена клетками извилистыми или сильно извилистыми стенками Устьичный аппаратдиацитного т па На эпидерме встречаются как простые одноклеточные, так и многоклеточные 1 лоски Эфиромаспичные железки расположены с нижней стороны листа округло формы с трудно различимыми, рааиалшо расположенными 4-8 выделительны, клетками

1оваро всяческие показатели травы ч истец а крупноцветювого определяли ф. маюпейными методами. Для анализа использовали 8 серий сырья, заготовленного Сгавропольсюм крае и Кардааево-Черкессюй Республике Нормы товароведчески показателей при вол сны в таблицеб.

Таблицаб — Нормы качества лекарш вен но го растительного сырья «Чистеца __крупноцветкового трава»_

Показатели качества Методы Нормы

Микросколия Микроскопический Простые одноклеточные и мной клеточные волоски, железки круг лые, 4-8-клеточные, диащггаы устьица

Качественные реакции 1 Реакция с раствором концентрированной хлористоводородной кислоты в присутствии порошка магния 2 Реакция с реактивом Трим-Хилла 3 ТСХ в системе растворителей хлороформ-метанол-вода (61 32 7) 1 Красно-коричневое окрашивание, флавоноиды 2 Красно-желтое окрашивание, иридоиды 3 Наличие пятна желтого цвета 1И=0,34 соответствующие ГСО ги-перозида

Влажность ГФ XI, вып 1, с 285-286 Не более 12%

Зола общая ГФ XI, вып 2, с 24 Не более 7%

Зола не растворимая в хлористоводородной кислоте 10% ГФ XI, вып 2, с 25 Не более 2,0%

Органические примеси ГФ XI вып 1, с 276 Не более 2,0%

Минеральные примеси ГФ XI, вып 1, с 276 Не более 1,0%

Кмгаичестиенное оппе леденив Дифференциальная епектро-фотометрия Сумма флавоноилов в пересчете на гиперозид не менее 0,8 %

При выборе действующей группы БАВ травы чистеца крупноцветювого руководствовались экспериментально получетными данными о фар маю логических свойствах травы чистеца крупноцветювого, в тч выявленным желчегонным эффектом, по активности сопоставимым с эффектом фламина (препарата сухого экстракта бессмертника песчаного), что позволило реюмендовать стандартизацию сырья проводить по сумме флавоноидов

Для юличественного определения суммы флавоноидов использовали метод дифференциальной спекфофотомеприи,основанный на реакции юмплекеообразова-ния флавоноидов с алюминия хлоридом Нами были подобраны оптимальные условия извн иения флавочоидовиз сьрья Дачные представлены в таблице7.

Таблица7 — Влияние условий экстрагирования на выход флавоноидов из травы чистеца крупноцветнового

Критерии экстракции Содержание флавоноидов в сырье, %

Эксграгент

30% спирт этиловый 0,53

50% спирт этиловый 0,75

70% спирт этиловый 1,12

95% спирт этиловый 0,96

Степень измельчения сырья (эксграгент спирт этиловый 70%)

1 мм 1,10

2мм 1,02

Змм 0,78

Время экстракции (эксграгент спирт этиловый 70%, степень измельчения сырья 1 мм)

15 мин 0,45

30 мин 0,93

45 мин 1,12

60 мин 1,12

Экспериментально полученные данные свидетельствуют, что максимальный выход флавоноидовобеспечивается при экстракции спиртом этиловым 70% Оптимальное время экстракции составляет 45 минут, с последующим наступлением равновесия, а степень измепгкения сьрья дол жна быть 1 чч.

ЛЛ_I

зза.с 35С. 45й, 4ш"3.1

Дли на еолн*>1. А нм

Рисунок? - Дифференциальные спектры поглощения продуктов взаимодействия ГСО гипфизидаи флаюноидов травы чистеца крупноцветкоюго с атюминияхло

ридом

Ли(ЬшСЮснимальные спектоы комплексов с алюминия хпопитюм (Ьгтаноноидс

..... . — тг 1

чистеца крупноцветювого по положению максимумов свею по то щени я близки дифференциальному спектру ю.мттлекса гипфозида (X тах 402 нм) (рис.7), поэтов предложено расчет содержания су ммы флаюноидов проводить в пересчете на тип розид, преобладающий юмпонент в сумме флаюноидов (табл. 8).

Таблипа8- Количественное содержание флаюноидов в пересчете на гиперозт'

Район заготовки сырья Г X $ 5 * Р,% 1(Р,0 Д-т Е,%

Ставропольский край 5 1,09 0,00007 0,008 95 2,57 0,021 1,88

Карачаево - Черкесская Республика 5 1,12 0,0001 0,011 95 2,57 0,028 2,53

Былау становлена норма содфжания суммы флаюноидов в траве чистеца кру ноцветюволо в пересчете на гипфозид- не мен ее 0,8 %.

Таким образом, было устаношено, что данная методика позволяет достовф!' определить содфжаниеосновной гоуппы БАВ- флаюноидов.

Особенностью методики является воспроизводимость (относительная ошиб определения со ставил а не более 3,0%), эюномичностъ (не требует применения дог го стоящего сорбента) и относительная быстрота про ведения.

Полученные экспериментальные данные легли в основу проекта ФСП на лекарственное растительное сырье «Чистеца крупноцветкового трава»

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1 На основании проведенных комплексных исследований выявлена возможность использования нового вида отечественного сырья - травы чистеца крупноцветкового для получения БАВ, обладающих желчегонным, противовоспалительным и ранозаживляющим действием

2. Ресурсные исследования, проведенные в Ставропольском крае (Предгорный район) и в Карачаево-Черкесской Республике (Карачаевский район) позволили выявить места произрастания и ориентировочные запасы чистеца крупноцветкового Объем возможных ежегодных заготовок составляет 1,9 т Общая площадь зарослей 3,13 га

3 Изучен химический состав травы чистеца крупноцветкоЕоге Установлено содержание флавоноидов (1,09 — 1,12%), конденсированных дубильных веществ (2,40 - 3,20%), тритерпеновых соединений (0,36 - 0,39%), кислоты аскорбиновой (0,05 - 0,07%), свободных органических кислот (1,08 - 1,24%), полисахаридов (4,97 - 5,49%); иридоидов (1,08-1,12%), хлорофилла (1,61-1,99%); эфирного масла (0,10-0,12%), 14 аминокислот (8 незаменимых), 24 макро- и микроэлемента

4 Методом газовой хромато-масс-спектрометрии впервые в эфирном масле чистеца крупноцветкового идентифицировано 56 компонентов основными из которых являются сесквитерпеноиды, из которых доминирующими являются - <;-кадинен, Ь-каламенен, 1,5,5,8-тетраметил-[1 Я-( Ш,ЗЕ,7Е, 11 Я)]-12-оксабицикло [9 1.0]додека-3,7-диен, диэпицедрен-1-оксид, т-кадинол, а — кадинол, оксид кариофиллена, цис-4- а-бисаболена эпоксид, 6,10,14-триметил-2-пентадеканон

5 Методом ВЭЖХ впервые выделены и идентифицированы в траве чисзеца крупноцветкового 6 фенольных соединений: флавоноиды (гиперозид, дигид-рокверцетин, изосалипурпозид), фенолокислоты (галловая кислота), кумарины (дикумарин, умбеллиферон)

6 Впервые изучен фракционный состав полисахаридного комплекса. Выявлен ВРПС (0,78-0,83%), ПВ (0,36-0,55%), ГЦА (3 00-3 21%), ГЦБ (2 45-3,26%)

7 Изучена динамика накопления флавоноидов в траве чистеца крупноцветков го в зависимости от фаз вегетации и органа растения В результате определ оптимальный период заготовки сырья, в котором наблюдается оптимальн содержание флавоноидов (не менее 0,8 %) фазу цветения - начало плодонош ния.

8 Проведена стандартизация сырья (травы) чистеца крупноцветкового Опред лены основные показатели подлинности и качества сырья: морфолог анатомические диагностические признаки листа и стебля, норма содержал флавоноидов в пересчете на гиперозид (не менее 0,8%) и товароведческие п> казатели

9 Проведены фармакологические исследования сухого экстракта чистеца кру ноцветкового Установлено, что L"D50 сухого экстракта составляет более 50 мг/кг, что позволяет его отнести к IV классу соединений

10 Установлена желчегонная активность. Сухой экстракт в дозе 200 мг/кг акл вирует желчевыделительную функцию печени на 65,6%. Выявлена против воспалительная и ранозажинляющая активность сухого экстракта чисте крупноцветкового

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1 Основные диагностические признаки травы чистеца крупноцветкового Молодежь XXI века - будущее Российской науки тез докл 2-ой межрегион на)" практ. конф студентов, аспирантов и молодых ученых - Ростов-на-Дону, 2004 -140-141

2 Аминокислотный состав надземной части Stachys macrantha (чистеца кру ноцветкового) / Современные проблемы фармакологии и фармации тез докл В( рос науч-практ конф 18-19 мая 2005 г - Новосибирск, 2005. - С 342-344 (Coa В А Челомбитько)

3 Минеральный состав надземной части чистеца крупноцветкового (Stachys macrantha) / Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции сб науч тр /-Пятигорск Пятигорская ГФА, 2005 -Вып 60 -С 57-59

4 Оценка желчегонной активности экстракта чистеца крупноцветкового (Stachys macrantha) / Санкг-Пегербург-Гастро-2005 материалы 7-го Между-нар Славяно-Балтийского науч. форума - СПб • ООО "Гастро", 2005 - № 1-2 - С. М141-М142 (Соавт. JIM Макарова, В.А Челомбитько)

5 Противовоспалительная и регенерирующая активность сухого экстракта Stachys macrantha С Koch (чистеца крупноцветкового) / Человек и лекарство тез. докл 13 Рос науч конгр 3-7 апр 2006 г -М, 2006 - С.594. (Соавт JI М Макарова, В Б Погорелый, В А Челомбитько)

6. Изучение аминокислотного и микроэлементного состава надземной части Stachys macrantha (С Koch) Steam (чистеца крупноцветкового) / Химия, технология, медицина: материалы Междунар. конф., носвящ. 75-летию образования ВИЛАР -М, 2006 - Т XVII. - С. 284-288 (Соавт В А. Челомбитько)

7 Количественное определение флавоноидов в траве чистеца крупноцветкового (Stachys macrantha С Koch) / Достижения, проблемы и перспективы фармацевтической науки и практики материалы регион, науч -практ конф с Междунар участием, посвящ 40-летию фармац факультета КГМУ - Курск: КГМУ, 2006 - С 318321 (Соавт В.А Челомбитько)

8 Основные биологически активные вещества травы чистеца крупноцветкового (Stachys macrantha) / Университетская наука Взгляд в будущее- сб науч тр КГМУ -Курск.КГМУ,2006.-Т.2 - Выл 71 -С 196-197

9 Компонентный состав эфирного масла Stachys macrantha (С. Koch) Srearn / Кубанский научный медицинский вестник. - 2006 -№10(91) - С 98-100

10 Желчегонная активность сухого экстракта из надземной части Stachys macrantha (Lamiaceae) / Растительные ресурсы - 2007 - Т 43 - Вып 1 - С 135-140 (Соавт J1 М Макарова, В Е Погорелый, В А Челомбитько)

ТАМКОВИЧ ТАТЬЯНА ВИТАЛЬЕВНА

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЧИСТЕЦА КРУПНОЦВЕТКОВОГО

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Подписано к печати « т » 008 г Формат бумаги 60x84 1/6

Бумага книжно-журнальная. Печать ротапринтная. Усл. печ л 1,0 Тираж 100 экз Заказ №/670

ГОУ ВПО «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» 357532, г Пятигорск, пр Калинина, 11

24

Актуальность темы Перед современной фармацевтической наукой стоит задача - увеличить поисковую работу по созданию новых эффективных растительных лекарственных препаратов. В настоящее время в России, как и в большинстве других стран, большой процент взрослого населения страдает острой и хронической патологиями печени и желчевыводящих путей. В' связи со значительным распространением этих заболеваний, тяжестью их течения, наличием гепато-токсических свойств широко применяющихся синтетических препаратов, в настоящее время предпочтение отдается лекарственным средствам растительного происхождения.

Отмеченная в последние годы тенденция к росту патологий желчевыводящих путей и постепенное истощение природных ресурсов традиционных желчегонных лекарственных растений (бессмертник песчаный, пижма обыкновенная, барбарис обыкновенный и др.) делают актуальным поиск новых сырьевых источников лекарственных средств для лечения заболеваний печени и желчевыводящих путей. По литературным данным некоторые растения рода чистец (ч. лекарственный - Stachys officinalis L., ч. буквицецветный - S. betonicaeflora Rupr. и ч. болотный - S. palustris L.), сем. яснотковые (Lami-асеае) в традиционной медицине многих стран, используются в качестве желчегонных средств и проявляют фармакологическую активность схожую с известным препаратом «Фламин». В конце 70-х годов на Украине из травы ч. вздутого (S. inflata Benth.) был предложен препарат «Стахихол», отнесенный к группе истинных холеретиков. Однако, из-за отсутствия достаточной сырьевой базы некоторых видов рода чистец и вследствие геополитических изменений, произошедших в последние годы, поиск новых растительных источников желчегонных средств продолжает оставаться актуальным.

В этой связи наше внимание привлек -чистец крупноцветковый (Stachys macrantha С. Koch), известный также как буквица крупноцветковая (Betonica macrantha С. Koch). Наличие значительной надземной фитомассы по сравнению с другими видами чистеца и достаточная распространенность на территории Северного Кавказа, прогнозируют перспективность его использования в качестве нового сырья для получения лекарственных средств. Однако, для внедрения в медицинскую практику необходимы исследования по изучению химического состава его биологически активных соединений и разработке методов стандартизации сырья. Поэтому фармакогностическое изучение чис-теца крупноцветкового является актуальной проблемой для фармацевтической науки и практики.

Цель и задачи исследования Цель настоящего исследования - фармакогностическое изучение травы чистеца крупноцветкового, разработка нормативной документации на сырьё (трава), как потенциального источника получения БАВ, обладающих желчегонным и противовоспалительным действием.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Выявить характерные места произрастания и определить ориентировочные запасы сырья чистеца крупноцветкового в некоторых регионах Северного Кавказа: в Ставропольском крае и в Карачаево-Черкесской Республике.

2. Изучить возможность интродукции чистеца крупноцветкового в ботаническом саду Пятигорской ГФА.

3. Провести фитохимическое изучение травы чистеца крупноцветкового (полифенольных соединений, иридоидов, эфирного масла, полисахаридов, органических кислот, аминокислот, макро- и микроэлементного состава).

4. Изучить оптимальные условия извлечения флавоноидов из травы чистеца крупноцветкового и разработать методику их количественного определения.

5. Изучить морфолого-анатомическое строение надземной части растения и выявить диагностические признаки травы чистеца крупноцветкового.

6. Провести стандартизацию травы чистеца крупноцветкового, разработать нормативную документацию на данный вид сырья.

7. Провести фармакологические исследования экстракта чистеца крупноцветкового.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук

Диссертационная работа выполнена по плану научно-исследовательских работ Пятигорской государственной фармацевтической академии (номер государственной регистрации 01200112164) и соответствует проблеме «Фармация» Ученого совета МЗ РФ, секция № 38.

Научная новизна и теоретическая значимость работы Впервые были определены места произрастания и ориентировочные ресурсы травы чистеца крупноцветкового на Северном Кавказе (в Предгорном районе Ставропольского края и в Карачаевском районе Карачаево-Черкесской Республики). В Ставропольском крае (Предгорный район) эксплуатационный запас травы чистеца крупноцветкового составил 4,07 т воздушно-сухого сырья, а в Карачаевском районе Карачаево-Черкесской Республики - 3,52 т воздушно сухого сырья.

В результате проведенных фитохимических исследований установлено содержание в траве ч. крупноцветкового основных групп биологически активных соединений: эфирное масло, флавоноиды, дубильные вещества, окси-коричные кислоты, кумарины, иридоиды, полисахариды, аминокислоты, ранее в литературе не описанные для этого вида.

Методом ВЭЖХ в сырье чистеца крупноцветкового впервые идентифицированы и количественно определены шесть фенольных соединений: флавоноиды (гиперозид, дигидрокверцетин и изосалипурпозид), фенолокислоты (галловая кислота), кумарины (дикумарин и умбеллиферон). Методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) в траве чистеца крупноцветкового идентифицированы иридоиды: гарпагид, гарпагидацетат, аюгозид и аюгол.

Впервые изучен фракционный состав полисахаридного комплекса травы чистеца крупноцветкового. Обнаружены: водорастворимые полисахариды (0,78-0,83%), пектиновые вещества (0,36-0,55%), гемицеллюлоза А (3,003,21%), гемицеллюлоза Б (2,45-3,26%).

Охарактеризованы свободные органические кислоты, которые представлены: винной, лимонной и аскорбиновой кислотами.

Методом газовой хромато-масс-спектроскопии (ГЖХ-МС) изучен состав эфирного масла чистеца крупноцветкового. Впервые идентифицировали 56 соединений, преобладающими компонентами эфирного масла чистеца крупноцветкового являются сесквитерпеноиды, из которых доминирующими являются - д-кадинен, Ь-каламенен, 1,5,5,8-тетраметил-[Ш-(Ш,ЗЕ,7Е,11К)]-12-оксабицикло [9.1.0]додека-3,7-диен, диэпицедрен-1-оксид, т-кадинол, а -кадинол, оксид кариофиллена, цис-£- а-бисаболена эпоксид, 6,10,14-триме-тил-2-пентадеканон.

Найдены оптимальные условия анализа флавоноидов - качественного (методом ТСХ) и количественного (методом дифференциальной УФ-спектро-фотометрии) в траве чистеца крупноцветкового. Изучена динамика накопления флавоноидов по органам растения в основные фазы его развития и в зависимости от фазы вегетации. Установлено, что максимальное количество флавоноидов накапливается в фазу цветения - начало плодоношения в листьях и траве; в соцветиях - в фазу цветения.

Установлен аминокислотный состав, который представлен 14 аминокислотами, 8 из которых являются незаменимыми: метионин, треонин, гисти-дин, аргинин, лейцин, валин, фенилаланин, изолейцин.

Впервые изучен макро- и микроэлементный состав травы чистеца крупноцветкового, представленный 24 элементами, из которых доминирующими являются: калий, кальций, кремний, магний, фосфор и железо.

Проведена стандартизация сырья чистеца крупноцветкового с учетом современных требований предъявляемых к подлинности и качеству лекарственного растительного сырья.

Впервые проведены фармакологические исследования и установлена желчегонная, противовоспалительная и ранозаживляющая активность экстракта травы чистеца крупноцветкового.

Практическая значимость

Выявлена возможность использования нового вида отечественного сырья- травы чистеца крупноцветкового для получения биологически активных соединений, включающих флавоноиды, кумарины, дубильные вещества, ири-доиды, фенолокислоты, эфирные масла, полисахариды, органические кислоты, аминокислоты, обладающие желчегонным, противовоспалительным и ра-нозаживляющим действием.

Для травы чистеца крупноцветкового разработаны методики качественного и количественного анализа флавоноидов, иридоидов, дубильных веществ, органических кислот, эфирного масла, аминокислот и др. соединений с использованием методов БХ, ТСХ , ВЭЖХ, ГЖХ-МС, спектрофотометрии.

На основании макро- и микроскопических исследований установлена совокупность анатомо-диагностических признаков, по которым можно проводить идентификацию сырья. •

В результате проведенных ресурсных исследований определена ориентировочная урожайность травы чистеца крупноцветкового и выявлены два района, пригодные для промышленной заготовки сырья этого вида на Северном Кавказе. Выявлена также возможность выращивания в условиях культуры чистеца крупноцветкового на КМВ.

Внедрение результатов исследования

По результатам исследования биологической активности сухого экстракта травы чистеца крупноцветкового получен акт внедрения ГОУ ВПО Пятигорской государственной фармацевтической академии Росздрава (акт о внедрении от 15 июня 2007 г.). Сухой экстракт рекомендован для дальнейшего углубленного фармакологического исследования.

Подготовлена ФСП «Чистеца крупноцветкового трава» (подтверждена актом внедрения от 19 июня 2007 г.), принятая ЗАО «Вифитех» (Россия), позволяющая использовать в дальнейшем траву чистеца крупноцветкового как новый вид сырья для получения лекарственных препаратов желчегонного и противовоспалительного действия.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Результаты изучения химического состава травы чистеца крупноцветкового физико-химическими методами.

2. Результаты качественного и количественного определения флавоноидов в траве чистеца крупноцветкового с помощью предложенных методик.

3. Результаты ресурсоведческих исследований травы чистеца крупноцветкового на территории Карачаево-Черкесской Республики и Ставропольского края.

4. Результаты изучения фармакологической активности экстракта травы чистеца крупноцветкового.

5. Нормы качества, необходимые для стандартизации травы чистеца крупноцветкового.

Апробация работы и публикации

Основные положения диссертационной работы доложены на 60-й межрегиональной конференции «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2005 г.). По материалам диссертации опубликовано 10 работ.

Объём и структура диссертации

Работа изложена на 167 страницах машинописного текста, содержит 43 таблицы, 32 рисунка и 13 расчётных формул. Состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, 4 глав собственных исследований, общих выводов, списка литературы, включающего 250 источников, в том числе 54 иностранных, и приложения.

Фармакологические исследования травы ч. крупноцветкового проводили под руководством профессора кафедры фармакологии, докторабиол. наук Погорелого В.Е. и ассистента кафедры фармакологии, к.ф.н. Макаровой Л.М., за что выражаем им глубокую благодарность и признательность.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. На основании проведенных комплексных исследований выявлена возможность использования нового вида отечественного сырья - травы чи-стеца крупноцветкового для получения БАВ, обладающих желчегонным, противовоспалительным и ранозаживляющим действием.

2. Ресурсные исследования, проведенные в Ставропольском крае (Предгорный район) и в Карачаево-Черкесской Республике (Карачаевский район) позволили выявить места произрастания и ориентировочные запасы чистеца крупноцветкового. Объем возможных ежегодных заготовок составляет 1,9 т. Общая площадь зарослей 3,13 га.

3. Изучен химический состав травы чистеца крупноцветкового. Установлено содержание флавоноидов (1,09 - 1,12%), конденсированных дубильных веществ (2,40 - 3,20%); тритерпеновых соединений (0,36 -0,39%); кислоты аскорбиновой (0,05 - 0,07%); свободных органических кислот (1,08 - 1,24%), полисахаридов (4,97 - 5,49%); иридоидов (1,08-1,12%); хлорофилла (1,61-1,99%); эфирного масла (0,10-0,12%), 14 аминокислот (8 незаменимых), 24 макро- и микроэлемента.

4. Методом газовой хромато-масс-спектрометрии впервые в эфирном масле чистеца крупноцветкового идентифицировано 56 компонентов основными из которых являются сесквитерпеноиды, из которых доминирующими являются - д-кадинен, Ь-каламенен, 1,5,5,8-тетраметил-[1К-(1К,ЗЕ,7Е,1Ш)]-12-оксабицикло [9.1.0]додека-3,7-диен, диэпицед-рен-1-оксид, т-кадинол, а -кадинол, оксид кариофиллена, цис-£- а-биса-болена эпоксид, 6,10,14-триметил-2-пентадеканон.

5. Методом ВЭЖХ впервые выделены и идентифицированы в траве чистеца крупноцветкового 6 фенольных соединений: флавоноиды (гиперо-зид, дигидрокверцетин, изосалипурпозид), фенолокислоты (галловая кислота), кумарины (дикумарин, умбеллиферон).

6. Впервые изучен фракционный состав полисахаридного комплекса. Выявлены: ВРПС (0,78-0,83%), ПВ (0,36-0,55%), ГЦА (3.00-3.21%), ГЦБ (2.45-3,26%).

7. Изучена динамика накопления флавоноидов в траве чистеца крупноцветкового в зависимости от фаз вегетации и органа растения. В результате определен оптимальный период заготовки сырья, в котором наблюдается оптимальное содержание флавоноидов (не менее 0,8 %) фазу цветения - начало плодоношения.

8. Проведена стандартизация сырья (травы) чистеца крупноцветкового. Определены основные показатели подлинности и качества сырья: мор-фолого-анатомические диагностические признаки листа и стебля, норма содержания флавоноидов в пересчете на гиперозид (не менее 0,8%) и товароведческие показатели.

9. Проведены фармакологические исследования сухого экстракта чистеца крупноцветкового. Установлено, что ЬБ50 сухого экстракта составляет более 5000 мг/кг, что позволяет его отнести к IV классу соединений.

10. Установлена желчегонная активность. Сухой экстракт в дозе 200 мг/кг активирует желчевыделительную функцию печени на 65,6%. Выявлена противовоспалительная и ранозаживляющая активность сухого экстракта чистеца крупноцветкового.