Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Применение физико-химических методов в анализе настоев из сырья лекарственных растений семейства яснотковых

На правах рукописи

МАРАХОВА Анна Игоревна

ПРИМЕНЕНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ МЕТОДОВ В АНАЛИЗЕ НАСТОЕВ ИЗ СЫРЬЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ СЕМЕЙСТВА

ЯСНОТКОВЫХ

15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

п Л '.....- " ■ 1

ПЕРМЬ-2009

003481768

Работа выполнена в ГОУ ВПО Московская медицинская академия имени

И.М. Сеченова

Научные руководители:

доктор фармацевтических наук Алла Анатольевна Сорокина кандидат химических наук Николай Николаевич Федоровский

Официальные оппоненты:

Доктор фармацевтических наук, профессор

Юрий Александрович Хомов

Доктор фармацевтических наук, профессор Тамара Дарижабовна Даргаева

Ведущая организация - ГОУ ВПО «Курский государственный медицинский

заседании Диссертационного Совета Д 208.068.01 при ГОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» по адресу: 614990, г. Пермь, ул. Ленина,48.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Пермская фармацевтическая государственная академия» по адресу: 614070, г. Пермь, ул. Крупской, 46.

Дата размещения объявления о защите диссертации на сайте ПГФА ММ: www.psfa.ru 10 октября 2009 года Автореферат разослан «16» октября 2009г.

Ученый секретарь диссертационного

совета Д 208.068.01

кандидат фармацевтических наук,

.2009 г.

часов на

доцент

Ирина Аркадьевна Липагаикова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Лекарственные растительные средства, обладающие малой токсичностью, широко используются в медицинской практике при лечении различных заболеваний организма человека. Из всех видов лекарственного растительного сырья (ЛРС), включенных в Государственный реестр лекарственных средств, около половины используются в виде настоев и отваров для внутреннего и наружного применения.

Сырье, применяемое для получения водных извлечений, содержит различные группы биологически активных веществ (БАВ). Наиболее широко используется ЛРС, содержащее эфирное масло, горечи, флавоноиды, полисахариды, дубильные вещества, витамины, антраценпроизводные. Фармакологическое действие водных извлечений определяется комплексом БАВ, переходящим в настои и отвары из ЛРС.

Для изготовления настоев часто используется сырье растений семейства Яснотковых: листья мяты перечной, шалфея лекарственного, трава мелиссы, душицы, чабреца.

Научный подход к анализу настоев впервые разработан на кафедре фармакогнозии ММА им. И.М. Сеченова профессором И.А. Самылиной и профессором A.A. Сорокиной.

Большое количество ЛРС, используемого для получения настоев и отваров, не стандартизуется по веществам, составляющим гидрофильную фракцию. Традиционные методы с использованием индикаторов требуют значительного разбавления, что снижает точность анализа. В связи с этим вопросы использования физико-химических методов определения БАВ при идентификации и количественном анализе настоев являются актуальными.

Целью настоящего исследования является обоснование применения физико-химических методов в анализе настоев из лекарственного сырья растений семейства Яснотковых: листьев мяты перечной и шалфея

лекарственного, травы чабреца, мелиссы лекарственной, душицы

обыкновенной.

Задачи исследования:

1. Провести качественный анализ БАВ и определить их суммарное содержание гравиметрическим методом в настоях изучаемых объектов: листьев мяты перечной и шалфея лекарственного, травы чабреца, мелиссы лекарственной, душицы обыкновенной.

2. Разработать методику пробоподготовки для идентификации флавоноидов в настоях с использованием ВЭЖХ на примере настоя травы мелиссы лекарственной.

3. Провести определение содержания суммы флавоноидов в настоях изучаемых объектов спектрофотометрическим методом.

4. Изучить возможность управления процессом экстракции флавоноидов в настои путем изменения рН экстрагента.

5. Разработать методики определения содержания суммы дубильных (окисляемых) веществ в настоях редокс титрованием с использованием индикаторов и потенциометрическим методом. Провести их сравнительный анализ.

6. Разработать методики определения содержания суммы органических кислот в настоях кислотно-основным титрованием с использованием индикаторов и потенциометрическим методом. Провести их сравнительное изучение.

7. Предложить описание математической модели, позволяющей определить состав раствора, содержащего смесь органических кислот по результатам потенциометрического титрования.

Работа выполнена в соответствии с планом НИР кафедры фармакогнозии и кафедры химии ГОУ ВПО ММА им. И. М. Сеченова по теме: «Разработка современных технологий подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием на основе

достижений медико-биологических исследований» (код темы 24.10.07 проблема № 1056 АМН РФ, номер Госрегистрации 01.2.006 06352)

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

заключается в изучении вопросов применения физико-химических методов в анализе настоев, учитывающих специфику водных извлечений: низкие концентрации биологически-активных веществ, окраску извлечений, рН среды и др. Разработаны методики определения содержания в настоях суммы свободных органических кислот и дубильных (окисляемых) веществ титрованием с использованием индикаторов и потенциометрических методов. Установлена возможность управления процессом экстракции флавоноидов при получении водных извлечений путем изменения рН экстрагента, создаваемого буферными системами. Разработана методика пробоподготовки для идентификации флавоноидов в настоях с использованием ВЭЖХ - анализа на примере настоя травы мелиссы лекарственной. Описана математическая модель для определения состава раствора, содержащего смесь органических кислот по результатам потенциометрического титрования.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ПОЛУЧЕННЫХ

РЕЗУЛЬТАТОВ состоит в разработке методик качественного и количественного определения БАВ (органических кислот, дубильных веществ, флавоноидов) в настоях, учитывающих их специфику. Описанная математическая модель для определения состава раствора, содержащего смесь органических кислот по результатам потенциометрического титрования положена в основу компьютерной программы «ЛСЭ-Шг». Составлены методические рекомендации «Определение суммы органических кислот в настоях из ЛРС». Методики потенциометрического титрования органических кислот используются в учебном процессе кафедры аналитической и неорганической химии МГУ Технологий и управления.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные положения работы доложены на Конгрессе молодых ученых с международным участием (М.,2008 г.),

конференции студенческих научных работ «Татьянин день» (М.,2007 г.), научной конференции кафедры фармакогнозии и межкафедральной конференции кафедр ММА им. И. М. Сеченова (2007-2008 г.)

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам исследования опубликовано 10 печатных работ.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Результаты качественного определения БАВ в настоях сырья растений семейства Яснотковых: листьев мяты перечной и шалфея лекарственного, травы душицы, чабреца и мелиссы, а также определения их суммарного содержания гравиметрическим методом.

2. Результаты определения суммы флавоноидов в настоях из ЛРС -изучаемых объектов.

3. Результаты изучения возможности управления процессом экстракции флавоноидов в настои путем изменения рН экстрагента.

4. Результаты исследований по разработке методик количественного определения содержания суммы свободных органических кислот и дубильных (окисляемых) веществ в настоях титрованием с использованием индикаторов и потенциометрическим методом.

5. Результаты разработки математической модели для определения состава раствора, содержащего смесь органических кислот по результатам потенциометрического титрования.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 112 страницах, включает 18 таблиц и 21 рисунок. Диссертация содержит введение, обзор литературы, экспериментальную часть, состоящую из 4-х глав, общие выводы, список литературы (104 наименования). Во введении обоснована актуальность проблемы, сформулированы цели и задачи исследования, охарактеризована научная новизна и практическая значимость работы. Первая глава представлена обзором литературы, в котором изложены сведения по характеристике лекарственной формы «настои», определению качества и способам их приготовления. Рассмотрено фармакологическое

действие основных групп биологически активных веществ, составляющих гидрофильную фракцию, таких как органические кислоты, флавоноиды и дубильные вещества, а также изложены методы качественного и количественного анализа этих веществ.

Вторая глава «объекты и методы исследования» описывает объекты исследования и методы исследования.

Третья глава посвящена изучению флавоноидов в настоях из сырья растений сем. Яснотковых. С помощью качественных реакций в настоях установлено присутствие различных групп флавоноидов и дубильных веществ. Определены значения рН настоев. Представлены данные по суммарному содержанию БАВ в настоях, полученные гравиметрическим методом.

Проведено количественное определение флавоноидов в настое травы мелиссы лекарственной спектрофотометрическим методом. Приведены данные по качественному анализу флавоноидов в настое травы мелиссы лекарственной методом ВЭЖХ. Описаны приемы пробоподготовки, которые показали зависимость эффективности экстракции флавоноидов от рН среды. Выявленная зависимость подтверждена рядом опытов на настоях других растений семейства Яснотковых. Приведены результаты изучения зависимости эффективности экстракции флавоноидов от рН.

Проведено изучение зависимости экстракции флавоноидов от рН с помощью компьютерной программы ЛСОЬАВУ.

В четвертой главе приведены результаты определения суммы свободных органических кислот и дубильных (окисляемых) веществ по методикам с использованием индикаторов. Пятая глава посвящена исследованиям по потенциометрическому титрованию органических кислот и дубильных (окисляемых) веществ. Проведена валидационная оценка нового метода - потенциометрии в сравнении с методиками титрования в присутствии индикаторов, описанными в литературе, и доказана возможность его применения. Описана математическая модель для расчета

констант одно- и двух- основных органических кислот и модель для определения состава раствора, содержащего смесь органических кислот по результатам потенциометрического титрования с помощью метода наименьших квадратов

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ При приготовлении настоев руководствовались способом, указанным в инструкции по применению сырья. Точную навеску сырья массой Зг помещали в эмалированную посуду на 500 мл, приливали 200 мл доведенного до кипения экстрагента и нагревали на водяной бане в течение 15 минут, настаивали при комнатной температуре 45 минут, фильтровали через ватно-марличный фильтр. В качестве экстрагента использовалась вода, а также буферные растворы.

Качественный и количественный анализ настоев В исследуемом сырье, согласно литературным данным, содержатся флавоноиды, дубильные вещества, органические кислоты и другие биологически-активные вещества, составляющие гидрофильную фракцию. Их присутствие в настоях было подтверждено качественными реакциями. Было дано описание внешнего вида настоев и определены их значения рН (табл.2).

Таблица 1.

Условия получения настоев согласно инструкциям по применению

ЛРС Количество сырья и экстрагента Соотношение сырья и экстрагента Соотношение сырья и экстрагента (ГФ XI)

Листья мяты перечной 5 г сырья на 200 мл 1:40 1:10

Травы душицы обыкновенной 10 г сырья на 200 мл 1:20

Трава чабреца 10 г сырья на 200 мл 1:20

Трава мелиссы лекарственной 2-3 г сырья на 200 мл 1:100/1:67

Листья шалфея лекарственного 10 г сырья на 200 мл 1:20

Таблица 2

Значения рН настоев из ЛРС семейства Яснотковых

Объекты исследования Настой

листьев мяты перечной травы душицы листьев шалфея лекарственного травы чабреца травы мелиссы

рН 5,10±0,01 5,43±0,02 5,07±0,03 5,01±0,01 4,46±0,01

Установлено, что все извлечения имеют слабокислую реакцию среды. Наиболее кислым оказалось извлечение травы мелиссы, наименее кислым -настой травы душицы.

Определено суммарное содержание БАВ в настоях гравиметрическим методом (табл.3).

Таблица 3

Содержание сухого остатка в настоях

Объекты исследования Настои сырья

мяты перечной душицы шалфея лекарственного чабреца мелиссы

Сухой остаток, % 0,56 ±0,05 0,81 ±0,02 1,24 ±0,05 1,56 ±0,02 0,55 ±0,03

Количественный анализ суммы флавоноидов в настоях

Определение содержания суммы флавоноидов в настоях объектов исследования проводили спектрофотометрически после реакции с хлоридом алюминия. Сначала получали спектр настоя на фоне раствора сравнения -воды. Наличие сдвига в спектрах настоев в область коротких длин волн и отсутствие батохромного сдвига длинноволнового максимума свидетельствовало о том, что характер кривых поглощения определяется в основном комплексом веществ фенольной природы. Сравнительный анализ дифференциальных спектров водных извлечений объектов исследования и УФ спектров растворов ГСО лютеолина и ГСО рутина в присутствии

хлорида алюминия показал, что при определении суммы флавоноидов в настое травы мелиссы пересчет целесообразно проводить на лютеолин, в настоях остальных объектов - на рутин. Содержание суммы флавоноидов в настоях представлено в табл. 3.

Изучение флавоноидного состава настоя травы мелиссы лекарственной

методом ВЭЖХ

Для установления зависимости коэффициента распределения и растворимости некоторых флавоноидов в воде и органической фазе от рН был сделан теоретический просчет при помощи программы АСОЬАВЬ. Установлено, что флавоноиды обладают слабыми кислотными свойствами, так как их наиболее полная экстракция происходит в нейтральную и слабощелочную среду. Принимая во внимание эту закономерность, была разработана пробоподготовка для идентификации флавоноидов ВЭЖХ-анализом в настое травы мелиссы, учитывающая их низкие концентрации. Изучение влияния рН эктрагента на экстракцию флавоноидов в настои из ЛРС семейства Яснотковых

Обнаруженная зависимость эффективности экстракции флавоноидов от рН среды требовала изучения в более широком диапазоне рН.

Для сравнительного изучения влияния экстрагентов с различными значениями рН на переход флавоноидов анализировали настои приготовленные с использованием воды, а также буферных растворов. Спектры комплекса флавоноидов с хлоридом алюминия настоя травы душицы представлены на рис.1.

н ш. [счеши: I нишсчешю 2 извлечение 3

340 4Г0 IXI 600 ■>,<

Рис.1 Спектры комплексов флавоноидов настоев травы душицы с А1С13

10

Обозначения на рисунке 1: извлечение 1 - настой, приготовленный на буферном растворе с рН=1,68; извлечение 2 — настой, приготовленный на буферном растворе с рН=6,86; извлечениеЗ- настой, приготовленный на буферном растворе с рН=9,18.

В результате исследований установлено, что наиболее эффективно экстракция флавоноидов листьев мяты перечной происходит в экстрагент с рН=6,86, травы чабреца, листьев шалфея лекарственного и травы мелиссы -в раствор с рН=6,86.

В полученных спектрах комплексов флавоноидов с хлоридом алюминия заметен сдвиг при щелочных значениях рН в сторону более длинных волн. Был проведен модельный опыт на примере рутина (рис.2). Наибольшее количество рутина судя по интенсивности поглощения наблюдается при рН экстрагента равным 9,18. Максимум поглощения комплекса рутина с хлоридом алюминия в щелочной среде сдвинут в длинноволновую область по сравнению с нейтральной средой. Сдвиг аналогичен обнаруженному при анализе флавоноидов настоев.

350 400 500 600

Рис.2. Спектры комплексов рутина с хлоридом алюминия Обозначения на рисунке 2:1 - спектр раствора рутина в буфере с рН=б,86, 2- спектр раствора рутина с рН=9,18 В связи с выявленной корреляцией между эффективностью экстракции флавоноидов и рН экстрагента, эта зависимость была рассмотрена в диапазоне рН более близком к физиологическому уровню. Содержание суммы флавоноидов а настоях при различных значениях рН экстрагента представлено на рис. 3. Сравнительный анализ спектров настоев при всех указанных на рис.3 значениях рН экстрагента, а также приготовленных на

воде подтверждает идентичность состава экстрагируемых веществ из ЛРС в буферные растворы и воду.

■ рН=1,68

■ рН=5,07

■ рН=6,86

■ рН=7,24 ■рН=9Д8 ■врдарН=7,25

настой настой настой настои настои

травы травы листьев листьев травы

дуимиы чабреца мяты шалфея мелиссы

перечной лекар.

Рис. 3. Содержание суммы флавоноидов в настоях при различных значениях рН в пересчете на рутин Определение содержания органических кислот титрованием с использованием индикаторов

Аликвоту настоя, равную 100 мл помещали в колбу на 250 мл, добавляли 100 мл дистиллированной воды и титровали раствором натрия гидроксида с концентрацией 0,1 М в присутствии индикаторов: 1 мл 1% раствора фенолфталеина и 2 мл 0,1 % раствора метиленового синего до появления в пене лилово - красной окраски. Полученные данные показывают, что наименьшее количество органических кислот содержит настой листьев мяты перечной, наибольшее - настой травы мелиссы (табл.З).

Определение содержания суммы дубильных (окисляемых) веществ титрованием с использованием индикаторов Настой в объеме, равном 50 мл переносили в коническую колбу вместимостью 250 мл, прибавляли 100 мл воды, 5 мл раствора индигосульфокислоты и титровали при постоянном перемешивании раствором калия перманганата (0,02 М) до золотисто - желтого окрашивания.

Параллельно проводили контрольный опыт. Полученные данные по определению содержания дубильных (окисляемых) веществ представлены в табл. 4. Наименьшее количество дубильных (окисляемых) веществ

обнаружено в настоях листьев мяты перечной, наибольшее - в настоях листьев шалфея лекарственного. Содержание дубильных (окисляемых) веществ в настоях, приготовленных с использованием буферных растворов, представлено в табл.5.

Таблица 3/

Содержание суммы свободных органических кислот в настоях в пересчете на яблочную кислоту (гнитрометрия с использованием индикаторов) (п=10; Р=0,95)

Объект исследования Содержание суммы органических кислот, %

Настой листьев мяты перечной Образец 1 0,15 ±0,01

Образец 2 0,100 ±0,006

Образец 3 0,16 ±0,003

Настой травы душицы Образец 1 0,16 ±0,05

Образец 2 0,16 + 0,02

Образец 3 0,13 ±0,02

Настой травы мелиссы Образец 1 0,15 ±0,02

Образец 2 0,14 ±0,02

Образец 3 0,24 + 0,03

Настой листьев шалфея лекарственного Образец 1 0,190 ±0,007

Образец 2 0,13 ±0,02

Образец 3 0,14 ±0,02

Настой травы чабреца Образец 1 0,13 ±0,04

Образец 2 0,20 ±0,01

Образец 3 0,19 ±0,02

Обозначения в таблице: Образец 1 — настой из сырья, заготовленного в Московской области (Ботанический садММА им. ИМ. Сеченова и ВИЛАР); Образец 2 и 3-настои из промышленных образцов сырья.

Таблица 4

Содержание суммы дубильных (окисляемых) веществ в настоях в пересчете на танин (титрометрия с использованием индикаторов) (п=10; Р=0,95)

Настой листьев мяты перечной Настой травы душицы Настой листьев шалфея лекарственного Настой травы чабреца Настой травы мелиссы

Содержание дубильных веществ, %

0,020 + 0,008 0,085 + 0,002 0,17 ± 0,01 0,16 + 0,02 0,029 ±0,004

Таблица 5

Содержание дубильных (окисляемых) веществ в настоях, приготовленных с использованием буферных растворов в пересчете на танин (п=10; Р=0,95)

Настой

Объекты исследования листьев мяты перечной травы душицы листьев шалфея лекарственного травы чабреца

РН экстрагента 6,86 9,18 6,86 9,18 6,86 9,18 6,86 9,18

Содержание дубильных веществ, % 0,018 ± 0,005 0,024 ± 0,004 0,073 ± 0,006 0,086 ± 0,004 0,17 ± 0,02 0,21 + 0,02 0,12 + 0,02 0,18 + 0,03

Полученные данные показывают, что подщелачивание среды положительно влияет на переход дубильных веществ в настои (табл. 6).

Определение содержания суммы свободных органических кислот и дубильных веществ потенциометрическим титрованием

В связи с разницей в содержании органических кислот в растениях, рН настоев различается. Они имеют слабокислую реакцию среды в интервале от 4,4 до 6,2 единиц рН. Цвет индикатора, используемого при титрометрическом определении, зависит от рН среды, что затрудняет точное установление конечной точки титрования. Определение содержания БАВ по методикам с использованием индикатора содержит в себе ошибку,

обусловленную чувствительностью человеческого глаза. Применение потенциометрического титрования позволяет исключить указанные недостатки.

Для количественного определения органических кислот в мерный стакан с помощью пипетки отмеряли 50 мл настоя, опускали стеклянный и хлорсеребряный электроды и титровали 0,1 М раствором натрия гидроксида с помощью микробюретки. По полученным данным строили кривые титрования для определения точек эквивалентности.

Результаты, полученные потенциометрическим методом, представлены в табл. б.

Таблица б

Содержание органических кислот в пересчете на яблочную кислоту в

настоях (потенциометрическое титрование) (п~10; Р=0,95)

Объекты исследования Настон

листьев мяты перечной травы душицы листьев шалфея лекарственного травы чабреца травы мелиссы

Содержание суммы органических кислот, % 0,130 + 0,003 0,150 + 0,001 0,130± 0,002 0,180 ± 0,002 0,190 ± 0,003

На основании теоретического анализа и полученных данных был описан расчет констант ионизации одно- и двухосновных кислот по кривым потенциометрического титрования методом наименьших квадратов. Для вывода уравнения, описывающего кривую потенциометрического титрования раствора смеси нескольких слабых кислот можно использовать следующие закономерности:

1. Уравнения, выражающие условия химических равновесий, существующих в растворе

2. Уравнения, выражающие материальный баланс по атомам элементов, входящих в состав частиц системы

3. Уравнение, выражающее электронейтральность раствора Рассмотрим раствор одной п-основной кислоты. В таком растворе содержатся частицы, состав которых можно выразить общей формулой:

с рассмотрения раствора одной п-основной кислоты. В таком растворе содержатся частицы, состав которых можно выразить общей формулой:

НЫА'"

Где 1 принимает значения от 0 (что соответствует незаряженным молекулам кислоты) до п (что соответствует непротонированному аниону кислоты).

Н++Н„,Аг-

Откуда:

При 1=1:

[Н„,А'-] 0)

Н А^ГНЧН^А' [Н.А]

(3)

Откуда:

1Н.+ЫМ (4)

К,

Гн+12Гн гАг'1

Подставив (2) в (4) получим: [Н„А]=-—^-^ (5)

Приняв, что К0 = 1 получаем выражение, связывающее равновесные концентрации незаряженных молекул и концентрации частиц всех форм кислоты в растворе, в котором 1 может принимать значения от О до п:

г , Гн+ТГн„,А"1

[н„ А]=-—————± (6)

гк

Выразим из (6) равновесную концентрацию иона

[НА]ПК,

Н.-,А-:[Н„,А-]= ~ (7)

Материальный баланс раствора по анионам кислоты можно выразить

уравнением С =]Г[н„.,Л'-] (8)

1=0

Где С,- суммарная концентрация всех форм кислоты в растворе. Подставив

. гк

(7) в (8) получим: Са=[Н„А]£^1—(9)

1=01Н ]

Выразив из (9) концентрацию молекул кислоты и подставив полученное выражение в (7) получим в явном виде формулу, которая позволяет рассчитать равновесные концентрации любой формы кислоты в растворе в зависимости от концентрации протонов и суммарной концентрации кислоты:

гк

[Н„А"] = С.---(10)

,. гк

В исследуемом растворе присутствуют катионы металла, протоны, гидроксид ионы и разные анионы кислоты, электронейтральность для него будет

выражаться уравнением: [Ме+]+[н+] = [оН"]+^/[н„А"] (11)

1=0

Концентрация катионов металла складывается из ионов, содержащихся в исходном растворе и ионов, вносимых со щелочью. Для упрощения модели примем, что в исходном растворе могут содержаться только ионы щелочных

г -I СУ СУ

металлов, тогда: Ме+ = м 0 +—(12)

1 ] к+к к+к

Где Си- концентрация катионов металла в исходном растворе; Сь-концентрация щелочи, приливаемой к раствору; Уа- объем исходного раствора; Уь- объем прилитой щелочи.

17

Концентрация протонов определяется потенциометрически, следовательно:

[Н+] = 1(Г'Я (13)

Концентрация гидроксид ионов находится из ионного произведения воды:

[0Н-] = ^ (14)

Суммарный заряд всех форм кислоты, присутствующих в растворе можно определить на основе уравнения (10):

гк

1- О

ш,

Сн*15[нТ

(15)

Где функция

1К

вводится для упрощения записи

выражений.

Объединив выражения (11), (12), (13), (14) и (15) после небольших

(16)

преобразований получаем: --Ь-=саГа [Рн)-Сиу^

Для упрощения записи введем следующие обозначения: У6 " ^ ' Уо+Уь КГ""

/Ж)=-

К+К

После этого (16) преобразуется к очень простому виду: т,РН)=СХ (РН)+СиГм(Уь)

(17)

(18)

Расширим (19) на случай раствора нескольких кислот. Тогда уравнение (19)

приобретет вид: /ь(^,рЯ) = £{с^/аДрЯ)}+С,,/м(К4) (20)

¿=1

Где N - общее количество кислот в растворе, а индекс к показывает номер кислоты, к которой относится соответствующее выражение. На основании составленной математической модели, а также теоретических и практических данных по титрованию индивидуальных органических кислот и их смеси составлена компьютерная программа «АСО-Мг».

Определение содержания суммы дубильных (окисляемых) веществ в настоях потенциометрическим титрованием Для количественного определения суммы дубильных веществ в химический стакан пипеткой отбирали 20 мл настоя, помещали платиновый и хлорсеребряный электроды и титровали 0,02 М раствором калия перманганата. По полученным данным строили кривые титрования. Результаты, полученные потенциометрическим методом, представлены в табл. 7.

Таблица 7

Содержание дубильных веществ в пересчете на танин в настоях

(потенциометрическое титрование) (п=10; Р=0,95)

Объекты исследования Настой

листьев мяты перечной травы душицы Листьев шалфея лекарственного травы чабреца травы мелиссы

Содержание суммы дубильных веществ, % 0,022 ± 0,006 0,076 ± 0,001 0,1 ю± 0,001 0,140± 0,001 0,032 ± 0,003

Потенциометрическим методом установлено, что наибольшее количество дубильных (окисляемых) веществ содержится в настое травы чабреца, наименьшее - в настое листьев мяты перечной, что коррелирует с данными, полученными по методике с использованием индикаторов.

Валидационная оценка методики определения суммы свободных органических кислот и дубильных (окисляемых) веществ в настоях методом потенциометрического титрования.

Валидационную оценку методики количественного определения органических кислот и окисляемых веществ проводили по показателям: специфичность, линейность и аналитическая область методики, правильность и воспроизводимость в соответствии с ОФС «Валидация фармакопейных методов». Величины относительного стандартного отклонения (меньше 0,01) свидетельствуют об отсутствии систематической ошибки. Рассчитанные значения контрольных критериев были меньше табличных. Рассчитанные значения коэффициентов корреляции составляют 0,999 и 0,997 также соответственно для методов определения суммы органических кислот и дубильных (окисляемых) веществ. Поскольку рассчитанный критерий Фишера (1,14 и 1,38) соответственно меньше табличного (3,18), то можно заключить, что различия между дисперсиями статистически не значимы (табл.9). Для оценки правильности методов рассчитывали критерий Стьюдента. Так как рассчитанный критерий (1,67 и 1,89 соответственно для метода определения органических кислот и окисляемых веществ) меньше табличного (2,26), результаты эксперимента не отягощены систематической ошибкой. Метод потенциометрического титрования органических кислот и окисляемых веществ в настоях валиден по показателям «специфичность» и «воспроизводимость».

Таблица 8

Метрологические характеристики методик определения количественного содержания органических кислот и дубильных (окисляемых) веществ на примере настоя листьев шалфея лекарственного

Метод определения содержания органических кислот Метод определения содержания дубильных веществ

Параметр Потенцио-метрнческое титрование Алкалиметрия с использованием индикаторов Потенцио-метрическое титрование Редокс титрование с использованием индикаторов

Среднее значение выборки 0,13 0,14 0,11 0,17

дисперсия 1,74-10"3 1,99-10'3 1,21-Ю"3 1,67-10'3

Относительное стандартное отклонение ±5 0,108 0,014 0,035 0,0129

Стандартное отклонение среднего результата ±ДХ 0,002 0,004 0,002 0,003

Полуширина доверительного результата 0,0027 0,032 0,033 0,029

Относительная ошибка 1,50 2,86 1,82 1,76

ВЫВОДЫ

1. Проведенный качественный анализ БАВ настоев листьев мяты перечной, шалфея лекарственного, травы душицы, чабреца, мелиссы подтвердил присутствие флавоноидов и дубильных веществ и определено суммарное количество БАВ (сухой остаток) в настоях - объектов исследования

гравиметрическим методом, которое колеблется от 0,55 ±0,03 до 1,56 ±0,02%.

2. В настое травы мелиссы лекарственной с помощью ВЭЖХ - анализа после предварительной разработки пробоподштовки установлено присутствие рутина, кверцетина, лютеолина и дегидрокверцетина.

3. Определено содержание суммы флавоноидов спектрофотометрическим методом в настоях исследуемого ЛРС, которое колеблется от 0,009±0,001% до 0,029 ±0,003%.

4. Изучена возможность управления процессом экстракции флавоноидов в настои путем изменения рН экстрагента. Показано, что флавоноиды травы чабреца и листьев мяты перечной лучше переходят в экстрагент с рН=7,24; флавоноиды листьев шалфея лекарственного и травы мелиссы - в экстрагент с рН=6,86. Флавоноиды травы душицы более эффективно экстрагируются в раствор с рН=9,18.

5. Разработаны методики количественного определения суммы дубильных (окисляемых) веществ в настоях редокс титрованием с использованием индикаторов и потенциометрическим методом. Проведена их валидация. Содержание суммы дубильных (окисляемых) веществ в настоях варьирует от 0,022 ±0,008% (настой листьев мяты перечной) до 0,17 ±0,01% (настой травы чабреца).

6. Разработаны методики количественного определения суммы органических кислот в настоях кислотно-основным титрованием с использованием индикаторов и потенциометрическим методом. Проведена их валидация. Содержание суммы органических кислот в настоях находится в интервале от 0,130 ±0,003% (настой листьев мяты перечной) до 0,190 + 0,003% (настой травы мелиссы). По теоретическим выводам и практическим результатам написана математическая модель для определения состава раствора, содержащего смесь органических кислот по результатам потенциометрического титрования с помощью метода наименьших квадратов, которая позволяет облегчить расчеты.

7. На основании теоретического анализа полученных практических результатов написана компьютерная программа для потенциометрического титрования органических кислот.

8. Составлены методические рекомендации «Определение органических кислот в настоях лекарственного растительного сырья».

Основное содержание диссертационной работы отражено в следующих

публикациях:

1. А.И. Марахова, H.H. Федоровский, A.A. Сорокина. Определение флавоноидов травы мелиссы лекарственной. // Фармация, 2007, №3, -с. 10-11.

2. А.И. Марахова, H.H. Федоровский. Исследование состава травы мелиссы лекарственной и ее водного извлечения. // Науки о человеке. VIII конгресс молодых ученых и специалистов,- Томск, 2007.- с.230-231.

3. С.Б. Лисовская, А.И. Марахова, H.H. Федоровский, A.A. Сорокина. Изучение флавоноидного состава водного извлечения травы мелиссы лекарственной методом ВЭЖХ. // Современные вопросы теории и практики лекарствоведения. Сборник материалов научно-практической конференции с международным участием, посвященной 25-летию фармацевтического факультета Ярославской государственной медицинской академии, -Ярославль, 2007,-с.191-193.

4. H.H. Федоровский, А.И. Марахова, A.A. Сорокина, О.В. Ольшанская. Потенциометрическое титрование в анализе водных извлечений//Фармация №2,- 2008-С.15-16.

5. А.И. Марахова, H.H. Федоровский. Изучение методов управления экстракцией из лекарственного растительного сырья и разработка методик стандартизации настоев. // Приложение к журналу «Вестник Российской академии медицинских наук», 2008, №6,-с.267-268.

6. А.И. Марахова. Изучение флавоноидного состава травы мелиссы лекарственной и ее водных извлечений. // Тезисы итоговой научной студенческой конференции с международным участием ММА им. И.М, Сеченова «Татьянин день», М., 2008. - с. 37-38.

7. H.H. Федоровский, A.A Сорокина, С.Б. Лисовская, О.В. Ольшанская, А.И. Марахова. Разработка методики определения содержания в водном извлечении сырья мелиссы лекарственной соединений, содержащих свободные фенольные гидроксилы. // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции. Сборник научных трудов - Пятигорск, 2008, выпуск 63,- с.351-353.

8. А.И. Марахова. Применение физико-химических методов в анализе биологически активных веществ лекарственных растений. // Фармация, 2009, №3.-с.52-55.

9. М.Е. Врубель, H.H. Федоровский, А.И. Марахова. Исследование биологически активных веществ отваров из сырья сосны кедровой сибирской.//Фармация в XXI веке: эстафета поколений. Тезисы докладов межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых -Санкт-Петербург, 2009. - с. 32.

10. А.И. Марахова, A.B. Кузнецов, H.H. Федоровский. Исследования по определению содержания суммы органических кислот в настоях из лекарственного растительного сырья.//Фармация в XXI веке: эстафета поколений. Тезисы докладов межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых - Сашсг-Петербург, 2009.- с.ЗЗ.

Подписано в печать 08.10.2009 г. Формат 60x84 1/16, Усл. Печ. Лист 2,0 Тираж 100 экз. Заказ № 3172 Отпечатано в типографии «ДЦ «Каретный Двор»» 101000, Москва, ул. Покровка, д.12, стр.1 Тел.: (495) 506-82-22 _www.allaprint.ru_

Лекарственные растительные средства, обладающие малой токсичностью, широко используются в медицинской практике при лечении различных заболеваний организма человека. Из всех видов лекарственного растительного сырья (ЛРС), включенных в Государственный реестр лекарственных средств, около половины используются в виде настоев и отваров для внутреннего и наружного применения.

Сырье, применяемое для получения водных извлечений, содержит различные группы биологически активных веществ (БАВ). Наиболее широко используется ЛРС, содержащее эфирное масло, горечи, флавоноиды, полисахариды, дубильные вещества, витамины, антраценпроизводные. Фармакологическое действие водных извлечений определяется комплексом БАВ, переходящим в настои и отвары из ЛРС.

Для изготовления настоев часто используется сырье растений семейства Яснотковых: листья мяты перечной, шалфея лекарственного, трава мелиссы, душицы, чабреца.

Научный подход к анализу настоев впервые разработан на кафедре фармакогнозии ММА им. И.М. Сеченова профессором A.A. Сорокиной.

Большое количество ЛРС, используемого для получения настоев и отваров, не стандартизуется по веществам, составляющим гидрофильную фракцию. Традиционные методы с использованием индикаторов требуют значительного разбавления, что снижает точность анализа. В связи с этим вопросы использования физико-химических методов определения БАВ при идентификации и количественном анализе настоев являются актуальными.

Целью настоящего исследования является обоснование применения физико-химических методов в анализе настоев из лекарственного сырья растений семейства Яснотковых: листьев мяты перечной и шалфея лекарственного, травы чабреца, мелиссы лекарственной, душицы обыкновенной.

Задачи исследования:

1. Провести качественный анализ БАВ и определить их суммарное содержание гравиметрическим методом в настоях изучаемых объектов: листьев мяты перечной и шалфея лекарственного, травы чабреца, мелиссы лекарственной, душицы обыкновенной.

2. Разработать методику пробоподготовки для идентификации флавоноидов в настоях с использованием ВЭЖХ на примере настоя травы мелиссы лекарственной.

3. Провести определение содержания суммы флавоноидов в настоях изучаемых объектов спектрофотометрическим методом.

4. Изучить возможность управления процессом экстракции флавоноидов в настои путем изменения рН экстрагента.

5. Разработать методики определения содержания суммы дубильных (окисляемых) веществ в настоях редокс-титрованием с использованием индикаторов и потенциометрическим методом. Провести их сравнительный анализ.

6. Разработать методики определения содержания суммы органических кислот в настоях кислотно-основным титрованием с использованием индикаторов и потенциометрическим методом. Провести их сравнительное изучение.

7. Предложить описание математической модели, позволяющей определить состав раствора, содержащего смесь органических кислот по результатам потенциометрического титрования.

Работа выполнена в соответствии с планом НИР кафедры фармакогнозии и кафедры химии ГОУ ВПО ММ А им. И. М. Сеченова по теме: «Разработка современных технологий подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образований на основе достижений медико-биологических исследований» (код темы 24.10.07 проблема № 1056 АМН РФ, номер Госрегистрации 01.2.006 06352)

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ заключается в изучении вопросов применения физико-химических методов в анализе настоев, учитывающих специфику водных извлечений: низкие концентрации биологически-активных веществ, окраску извлечений, рН среды и др. Разработаны методики определения содержания в настоях суммы свободных органических кислот и дубильных (окисляемых) веществ титрованием с использованием индикаторов и потенциометрических методов. Установлена возможность управления процессом экстракции флавоноидов при получении водных извлечений путем изменения рН экстрагента, создаваемого буферными системами. Разработана методика пробоподготовки для идентификации флавоноидов в настоях с использованием ВЭЖХ - анализа на примере настоя травы мелиссы лекарственной. Описана математическая модель для определения состава раствора, содержащего смесь органических кислот по результатам потенциометрического титрования.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ состоит в разработке методик качественного и количественного определения БАВ (органических кислот, дубильных (окисляемых) веществ, флавоноидов) в настоях, учитывающих их специфику. Описанная математическая модель для определения состава раствора, содержащего смесь органических кислот по результатам потенциометрического титрования положена в основу компьютерной программы «АСВ-йй*». Составлены методические рекомендации «Определение суммы органических кислот в настоях из ЛРС». Методики потенциометрического титрования органических кислот используются в учебном процессе кафедры аналитической и неорганической химии МГУ Технологий и управления.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные положения работы доложены на Конгрессе молодых ученых с международным участием (М.,2008 г.), конференции студенческих научных работ «Татьянин день» (М.,2007 г.), научной конференции кафедры фармакогнозии и межкафедральной конференции кафедр ММА им. И. М. Сеченова (2007-2008 г.). ПУБЛИКАЦИИ. По материалам исследования опубликовано 10 печатных работ.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1.Результаты качественного определения БАВ в настоях сырья растений семейства Яснотковых: листьев мяты перечной и шалфея лекарственного, травы душицы, чабреца и мелиссы, а также определения их суммарного содержания гравиметрическим методом

2. Результаты определения суммы флавоноидов в настоях из ЛРС -изучаемых объектов

3. Результаты изучения возможности управления процессом экстракции флавоноидов в настои путем изменения рН экстрагента

4. Результаты исследований по разработке методик количественного определения суммы свободных органических кислот и дубильных (окисляемых) веществ в настоях титрованием с использованием индикаторов и потенциометрическим методом

5. Результаты разработки математической модели для определения состава раствора, содержащего смесь органических кислот по результатам потенциометрического титрования

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Проведен качественный анализ БАВ настоев листьев мяты перечной, шалфея лекарственного, травы душицы, чабреца, мелиссы. Подтверждено присутствие флавоноидов и дубильных веществ.

2. Определено суммарное количество БАВ (сухой остаток) в настоях -объектов исследования гравиметрическим методом, которое колеблется от 0,55 + 0,03 до 1,56±0,02%.

3. На примере настоя травы мелиссы разработана методика пробоподготовки для идентификации флавоноидов с помощью ВЭЖХ-анализа. Установлено присутствие в настое травы мелиссы рутина, кверцетина, лютеолина и дегидрокверцетина.

4. Определено содержание суммы флавоноидов спектрофотометрическим методом в настоях исследуемого ЛРС, которое колеблется от 0,009 ±0,001% до 0,029 ±0,003%.

5. Изучена возможность управления процессом экстракции флавоноидов в настои путем изменения рН экстрагента. Показано, что флавоноиды травы чабреца и листьев мяты перечной лучше переходят в экстрагент с рН=7,24; флавоноиды листьев шалфея лекарственного и травы мелиссы — в экстрагент с рН=6,86. Флавоноиды травы душицы более эффективно экстрагируются в раствор с рН=9,18.

6. Разработаны методики количественного определения суммы дубильных веществ в настоях редокс-титрованием с использованием индикаторов и потенциометрическим методом. Проведена их валидация. Содержание суммы дубильных веществ в настоях варьирует от 0,022 ±0,008% (настой листьев мяты перечной) до 0,17 ±0,01% (настой травы чабреца).

7. Разработаны методики количественного определения суммы органических кислот в настоях кислотно-основным титрованием с использованием индикаторов и потенциометрическим методом. Проведена их валидация. Содержание суммы органических кислот в настоях находится в интервале от 0,13±0,003% (настой листьев мяты перечной) до 0,190 + 0,003% (настой травы мелиссы).

8. Описана математическая модель для определения состава раствора, содержащего смесь органических кислот по результатам потенциометрического титрования с помощью метода наименьших квадратов.

9. На основании теоретического анализа полученных практических результатов написана компьютерная программа для потенциометрического титрования органических кислот.

10. Составлены методические рекомендации «Определение органических кислот в настоях лекарственного растительного сырья».