Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Фармакогностическое изучение икотника серого

На правах рукописи

Лупнлина Татьяна Игоревна

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ИКОТНИКА СЕРОГО (ВЕКТЕЫОАINCANA (Ь.) БС.)

14.04.02 — фармацевтическая химия, фармакогнозия

1 О ИЮН 2015

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

005569963

Пятигорск - 2015

005569963

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель: доктор фармацевтических наук, доцент

Дроздова Ирина Леонидовна

Официальные оппоненты: Сливкин Алексей Иванович

доктор фармацевтических наук, профессор, декан фармацевтического факультета, заведующий кафедрой фармацевтической химии и фармацевтической технологии ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет»

Новиков Олег Олегович

доктор фармацевтических наук, профессор, заведующий кафедрой фармацевтической химии и фармакогнозии Медицинского института ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный университет»

Ведущая организация: Государственное бюджетное

образовательное учреждение высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «3» июля 2015 г. в 10® часов на заседании диссертационного совета Д 208.008.09 при ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России (357532, Ставропольский край, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Пятигорского медико-фармацевтического института - филиала ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России (357532, Ставропольский край, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11) и на сайте http://www.pmedpharm.ru

Автореферат разослан « -¿У »

Ученый секретарь

диссертационного совета

2015 года

/

ж Ремезова Ирина Петровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время проблема поиска и внедрения новых перспективных лекарственных растений остается актуальной, т.к. препараты на основе растительных биологически активных веществ имеют широкий спектр действия и используются для лечения и профилактики многих заболеваний (Высочина Г.И. и др., 2011; Серебрякова В. А., 2011).

Сейчас в России до 30% составляют препараты растительного происхождения (Булаев В.М. и др., 2013), официнальными являются лишь около 350 лекарственных растений (Государственный реестр, 2008). Однако в народной медицине нашей страны применяется более 10 тысяч видов (Киселева Т.Л., Смирнова Ю.А., 2009). При этом биоразнообразие лекарственных растений используется далеко не полностью, что связано с недостатком сведений о химическом составе, малой изученностью фармакологических свойств и отсутствием данных о ресурсах (Немерешина О.Н. и др., 2012). Современным подходом к решению проблемы поиска лекарственных растений является изучение представителей отечественной флоры, которые издавна применяются в народной медицине (Серебрякова В.А., 2011).

Одним из таких представителей является икотник серый (Berteroa incana (L.) DC.) семейства крестоцветные (Brassicaceae В. Juss.), который широко распространен в Центральной России, имеет достаточную сырьевую базу, издавна используется в народной медицине при лечении заболеваний органов дыхания, сердечно-сосудистой и пищеварительной систем, а также наружно -для промывания ран. Однако его химический состав и фармакологическая активность изучены недостаточно, отсутствуют данные о показателях подлинности и доброкачественности сырья.

Таким образом, фитохимическое и фармакологическое изучение травы икотника серого, разработка показателей качества лекарственного растительного сырья являются актуальной проблемой.

Степень разработанности темы исследования.

Химический состав травы икотника серого практически не изучен. Имеются литературные данные о содержании в надземной части витамина С и минеральных элементов (фосфор, магний, натрий); в листьях - фенольных соединений (кумаринов, флавоноидов), карденолидов, углеводов и органических кислот. Однако не изучены качественный состав и количественное содержание основных групп БАВ.

Экспериментальные фармакологические исследования икотника серого проводились в 50-70-е годы XX века. Установлена гипотензивная и диуретическая активность данного растения, антифунгальная активность свежего сока листьев, антибактериальная активность экстракта надземной части, а также противовоспалительные свойства настойки корней и настоя надземной части икотника серого.

Отсутствуют данные о морфолого-анатомических признаках сырья. Не разработаны методики стандартизации сырья и числовые показатели его качества, не обоснованы оптимальные фазы заготовки сырья.

Цель и задачи исследования. Цель исследования заключалась в фармакогностическом изучении травы икотника серого и научном обосновании возможности использования данного растения в официнальной медицине.

Задачи исследования:

1. Провести фитохимический анализ травы икотника серого на различные группы БАВ.

2. Провести морфолого-анатомическое изучение и установить диагностические признаки сырья.

3. Разработать методики стандартизации сырья.

4. Установить нормы содержания основных групп БАВ и других числовых показателей.

5. Изучить динамику накопления основных групп БАВ в различные фазы вегетации и установить научно обоснованные сроки заготовки сырья.

6. Провести фармакологический скрининг извлечений и комплексов БАВ из травы икотника серого.

Научная новизна. Проведено фитохимическое изучение травы икотника серого, установлен состав основных групп БАВ. Определен качественный состав и количественное содержание полисахаридов, фенольных соединений (флавоноидов, фенолкарбоновых кислот, дубильных веществ), тритерпеновых сапонинов, каротиноидов, органических кислот (в том числе аскорбиновой кислоты), аминокислот, макро- и микроэлементов; обнаружены кумарины и азотистые основания.

Впервые исследован аминокислотный состав травы икотника серого. Установлено, что трава икотника серого содержит 16 аминокислот (в том числе 7 — незаменимых). Преобладающими являются глутаминовая и аспарагиновая кислоты. Содержание незаменимых аминокислот составляет в исследуемом виде 37,74% от суммы аминокислот, среди которых преобладает лейцин.

Впервые изучен макро- и микроэлементный состав травы икотника серого. Установлено, что трава икотника серого содержит 25 элементов, из которых 11 являются эссенциальными и 6 — условно эссенциальными.

Впервые проведено фракционное выделение полисахаридов: водорастворимых полисахаридов, пектиновых веществ, гемицеллюлоз А и Б. Определен качественный и количественный состав моносахаридов. Проведен анализ функциональных групп пектинов.

Впервые исследованы фенольные соединения методом ВЭЖХ. Идентифицировано 17 соединений фенольной природы, среди которых 8 флавоноидов (дигидрокверцетин, апигенин, лютеолин-7-гликозид, лютеолин, кверцетин, гиперозид, нарингин, рутин), 5 фенолкарбоновых кислот (галловая, кофейная, феруловая, хлорогеновая, неохлорогеновая), 4 производных дубильных веществ: танин, катехин, эпикатехин, эпигаллокатехингаллат. Методом внутренней нормализации было установлено, что из флавоноидных соединений в наибольшем количестве содержатся лютеолин, апигенин, дигидрокверцетин, из фенолкарбоновых кислот преобладают галловая и

неохлорогеновая кислоты, из производных дубильных веществ - эпикатехин и танин. Все идентифицированные фенольные соединения в траве икотника серого обнаружены впервые.

Впервые для стандартизации сырья травы икотника серого разработаны методики количественного определения суммы водорастворимых полисахаридов (методом гравиметрии) и суммы флавоноидов (методом спектрофотометрии). Определены нормы содержания БАВ и других числовых показателей качества сырья. Предложенные методики валидированы по показателям: линейность, повторяемость, воспроизводимость и правильность.

Впервые проведено изучение морфологического и анатомического строения травы икотника серого, в результате установлена совокупность диагностических признаков, позволяющих определять подлинность сырья.

Впервые исследована динамика накопления водорастворимых полисахаридов и флавоноидов в траве икотника серого в различные стадии периода вегетации растений. Установлены научно обоснованные сроки заготовки лекарственного сырья.

Скрининговые фармакологические исследования показали наличие у травы икотника серого следующих видов фармакологической активности: отхаркивающей, антимикробной, анальгезирующей, антиоксидантной.

Теоретическая и практическая значимость исследования.

Результаты экспериментальных исследований позволяют расширить сведения о химическом составе, морфолого-анатомическом строении и фармакологической активности травы икотника серого.

Проведенные фитохимические исследования травы икотника серого позволяют рекомендовать его в качестве перспективного отечественного источника различных групп природных БАВ.

Результаты фармакологического скрининга могут служить экспериментальным обоснованием перспективности дальнейшего более глубокого изучения икотника серого и внедрения его в официнальную медицину.

На основании проведенных исследований разработаны и внедрены:

- методика количественного определения суммы полисахаридов в траве икотника серого (Акты внедрения в учебный и научно-исследовательский процессы ГБОУ ВПО «Кубанский государственный медицинский университет», ГБОУ ВПО «Воронежская государственная медицинская академия имени H.H. Бурденко»);

- методика количественного определения суммы флавоноидов в траве икотника серого (Акты внедрения в учебный и научно-исследовательский процессы Пятигорского медико-фармацевтического института - филиала ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет», ГБОУ ВПО «Воронежская государственная медицинская академия имени H.H. Бурденко», ГБОУ ВПО «Северо-Осетинский государственный университет им. K.JI. Хетагурова»);

результаты микродиагностического анализа лекарственного растительного сырья «Икотника серого трава» (Акты внедрения в учебный и научно-исследовательский процессы ГБОУ ВПО «Кубанский государственный медицинский университет», ГБОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия»);

- результаты фотохимического анализа лекарственного растительного сырья - травы икотника серого (Акты внедрения в учебный и научно-исследовательский процессы Пятигорского медико-фармацевтического института - филиала ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет», ГБОУ ВПО «Воронежская государственная медицинская академия имени H.H. Бурденко», ГБОУ ВПО «СевероОсетинский государственный университет им. K.JI. Хетагурова»),

Методология н методы исследования. В работе использована методология комплексного анализа и стандартизации нового вида лекарственного растительного сырья - травы икотника серого (включающая информационно-аналитическое, фотохимическое, морфолого-анатомическое, фармакологическое исследование). Фармакогностическое изучение объекта

выполнено с использованием различных методов, широко применяемых при анализе лекарственного растительного сырья (химических, физико-химических, макро- и микроскопического, микробиологического, фармакологического и статистического).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Результаты фитохимического исследования Б AB травы икотника серого.

2. Результаты морфолого-анатомического исследования и диагностические признаки, позволяющие определить подлинность сырья.

3. Результаты разработки методик стандартизации сырья и числовые показатели качества сырья.

4. Результаты изучения динамики накопления основных групп БАВ и установления научно обоснованных сроков заготовки сырья.

5. Результаты фармакологического скрининга травы икотника серого.

Степень достоверности и апробация результатов. Основные

результаты диссертационных исследований были представлены на 78-й, 79-й, 80-й Всероссийских научных конференциях молодых ученых и студентов КГМУ с международным участием «Молодежная наука и современность» (Курск, 2013, 2014, 2015); на II Международной научно-практической интернет-конференции «Лекарственное растениеводство: от опыта прошлого к современным технологиям» (Полтава, 2013); на I Международной научной конференции молодых ученых и студентов «Перспективы развития биологии, медицины и фармации» (Шымкент, 2013); на Всероссийской научной Интернет-конференции с международным участием «Ботаника и природное многообразие растительного мира» (Казань, 2013); на Международной научно-практической конференции «Фармацевтическое образование, наука и производство -ориентир на стратегию «Казахстан-2020» (Шымкент, 2014); на Международной научно-практической конференции «Перспективы внедрения инновационных технологий в фармации» (Орехово-Зуево, 2014); на III Всероссийской научно-

практической конференции с международным участием «Беликовские чтения» (Пятигорск, 2014).

По теме диссертации опубликованы 23 печатные работы, из которых - 10 в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

Личный вклад автора. Диссертант непосредственно участвовал в постановке цели, задач и составлении плана исследований. Автор самостоятельно выполнил сбор и анализ отечественных и зарубежных литературных источников по теме диссертации, проводил экспериментальные фотохимические, морфолого-анатомические, фармакологические исследования, статистическую обработку, обобщение и анализ полученных данных, формулировку выводов. Автором подготовлены доклады, написаны статьи, диссертация и автореферат. В работах, выполненных в соавторстве, использованы результаты исследования с долей личного участия автора 8590%.

Объем и структура диссертационной работы. Диссертация изложена на 156 страницах компьютерного текста и включает введение, обзор литературы (1 глава), главу «Объекты и методы исследования», три главы экспериментальной части, заключение, список литературы, приложение. Текст диссертации содержит 28 рисунков и 38 таблиц. Список цитируемой литературы состоит из 278 источников, из которых - 36 на иностранных языках.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объектом исследований явилась трава икотника серого (Вейегоае ¡псапае (Ь.) БС. ЬегЬа), заготовленная в различных районах Курской области в период с 2012 г. по 2014 г. в различные фазы вегетации растений.

Фитохнмнческнй анализ травы икотника серого

При изучении качественного состава БАВ в траве икотника серого обнаружены свободные и связанные сахара, фенольные соединения (кумарины,

флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты, дубильные вещества), органические кислоты, азотсодержащие соединения, каротиноиды, сапонины.

Впервые в траве икотника серого определено количественное содержание дубильных веществ - 2,14±0,02%; суммы органических кислот - 4,94±0,08%; (в том числе аскорбиновой кислоты — 2,12±0,03%); тритерпеновых соединений -0,0130±0,0003%; каротиноидов - 7,02±0,04 мг%.

Впервые методом ВЭЖХ изучен аминокислотный состав травы икотника серого. Установлено наличие 16 аминокислот, из которых 7 являются незаменимыми (валин, изолейцин, лизин, лейцин, метионин, треонин, фенилаланин). Преобладающими являются глутаминовая и аспарагиновая кислоты (16,76% и 11,01% от суммы аминокислот соответственно). Содержание незаменимых аминокислот составляет в исследуемом виде 37,74% от суммы аминокислот, среди которых преобладает лейцин (9,06%).

Впервые методом элементного спектрального анализа изучен макро- и микроэлементный состав. Установлено, что трава икотника серого содержит 25 элементов, из которых 11 являются эссенциальными и 6 - условно эссенциальными. Выявлено, что трава икотника серого способна накапливать молибден и бор в количествах, превышающих их содержание в почве.

Впервые при помощи хроматографических методов (БХ, ТСХ, ВЭЖХ) обнаружено 24 соединения фенольной природы, из которых методом ВЭЖХ идентифицировано 17 (из них 8 флавоноидов, 5 фенолкарбоновых кислот, 4 дубильных вещества) (таблица 1). Методом внутренней нормализации установлено, что из флавоноидных соединений в исследуемом виде в наибольшем количестве содержатся лютеолин (3,16% от общей суммы фенольных соединений), апигенин (2,81%), дигидрокверцетин (2,79%), из фенолкарбоновых кислот преобладают галловая (12,59%) и неохлорогеновая кислоты (12,12%), из производных дубильных веществ - эпикатехин (7,54%) и танин (7,09%). Все идентифицированные фенольные соединения в траве икотника серого обнаружены впервые.

Таблица 1 - Результаты исследования фенольных соединений травы икотника серого методом ВЭЖХ

Наименование вещества Время Кол и ч ественн ое

удерживания, мин соотношение в смеси, % от суммы

Танин* 3,82 7,09

Катехин* 4,14 5,20

Галловая кислота* 4,54 12,59

Эпикатехин* 5,10 7,54

Эпигаллокатехингаллат* 5,80 2,37

Хлорогеновая кислота* 6.44 9,03

Кофейная кислота* 8,19 1,75

Феруловая кислота* 8,82 2,97

Неохлорогеновая кислота* 9,98 12,12

Дигидрокверцетин* 11,37 2,79

Апигешш* 12,58 2,81

Лютеолин-7-гликозид* 13,86 1,46

Неидентифицированное вещество 15,01 2,67

Лютеолин* 16,91 3,16

Кверцетин* 19,69 0,61

Гиперозвд* 20,67 1,39

Нарингин* 21,86 1,10

Рутин* 24,42 1,89

Неидентифицированное вещество 28,83 1,44

Неидентифицированное вещество 37,01 7,13

Неидентифицировашюе вещество 38,78 2,28

Неидентифицированное вещество 40,98 1,01

Неидентифицировашюе вещество 48,06 2,14

Неидентифицированное вещество 51,30 7,46

* - означает, что вещество в исследуемом растении обнаружено впервые

Впервые из травы икотника серого по методике, описанной Н.К. Кочетковым, последовательно выделены полисахариды по фракциям: водорастворимые полисахариды (ВРПС), пектиновые вещества (ПВ), гемицеллюлозы А и Б (ГЦ А и ГЦ Б). Выход их составил: ВРПС - 11,9±0,09%, ПВ - 9,7±0,14%, ГЦ А - 4,5±0,08%, ГЦ Б - 3,0±0,06%. Качественный состав и количественное содержание моносахаридов в гидролизатах полисахаридов определяли денситометрическим методом после проведения тонкослойной хроматографии. Установлено, что в состав ВРПС травы икотника серого входят нейтральные (глюкоза, галактоза, ксилоза, арабиноза, рамноза) и кислые (глюкуроновая кислота) сахара. В составе ПВ обнаружили кислые (галактуроновая и глюкуроновая кислоты) и нейтральные (глюкоза, галактоза,

ксилоза, арабиноза, рамноза) моносахариды. В состав ГЦ А и ГЦ Б входят нейтральные моносахариды: глюкоза, галактоза, ксилоза, арабиноза. В ВРПС преобладающими являются глюкоза (6,3%) и арабиноза (4,7%). В пектиновых веществах преобладает кислота галактуроновая (83,2%). В гемицеллюлозах доминирует ксилоза (10,3-15,1%). Высокий выход полисахаридов говорит о перспективности использования травы икотника серого в качестве источника ВРПС и ПВ.

Впервые определено количественное содержание функциональных групп ПВ: свободных карбоксильных групп (4,19±0,05%), метоксилированных карбоксильных групп (0,89±0,01%), метоксильных групп (0,61 ±0,01%). Установлено, что ПВ относятся к группе низкоэтерифицированных пектинов (\<50%).

Морфолого-анатомнческое изучение травы икотника серого

Возможность внедрения травы икотника серого в официнальную медицину предусматривает обязательное проведение морфолого-анатомических исследований с целью выявления признаков, которые могут быть использованы при диагностике лекарственного сырья.

При макроскопическом анализе впервые были выявлены морфологические признаки травы икотника серого. При микроскопическом анализе впервые были описаны анатомические признаки травы икотника серого.

При рассмотрении микропрепарата листа с поверхности видны клетки эпидермиса, местами имеющие четковидные утолщения; клетки верхнего эпидермиса 5-7-угольные, со слабо извилистыми стенками, клетки нижнего эпидермиса более извилистостенные. Устьица округлые, окружены 3 околоустьичными клетками, 1 из которых значительно больше или меньше других (анизоцитный тип), расположены на обеих сторонах листа (преобладают на нижнем эпидермисе). Замыкающие клетки устьиц почковидной формы. Волоски простые многочисленные, особенно на нижней стороне листа,

1-клеточные, разветвленные, звездчатые, 6-8-конечные, толстостенные с гладкой поверхностью; лучи волоска прижаты к поверхности листа (рисунок 1).

При рассмотрении чашелистика с поверхности видны клетки верхнего эпидермиса 5-7-угольные, со слабо извилистыми стенками, клетки нижнего эпидермиса более извилистостенные. Устьица анизоцитного типа, расположены на обеих сторонах чашелистика. Волоски простые многочисленные, особенно на нижней стороне чашелистика, 1-клеточные, разветвленные, звездчатые, 6-8-конечные, толстостенные с гладкой поверхностью; лучи волоска прижаты к поверхности чашелистика (рисунок 2).

Диагностическое значение для лепестка венчика имеют: клетки эпидермиса у основания с вытянутыми стенками, у верхушки и по краю — с сосочковидными выростами. Встречается пыльца в виде крупных зерен овальной формы (рисунок 3).

На поперечном срезе стебель округлый, имеет вторичное строение. Покровная ткань представлена однослойным эпидермисом, с хорошо выраженной складчатостью кутикулы. Первичная кора хорошо развита; состоит из уголковой колленхимы, паренхимы первичной коры и эндодермы с крахмальными зернами. В центральном цилиндре проводящая система представлена открытыми биколлатеральными пучками, расположенными по кругу. В центральной части стебля находятся рыхло расположенные тонкостенные клетки паренхимы сердцевины округлой формы с крахмальными зернами. Клетки эпидермиса стебля вытянутые, многоугольные, с устьицами анизоцитного типа. На эпидермисе стебля имеются простые 1-клеточные, разветвленные, звездчатые, 6-8-конечные, толстостенные волоски с гладкой поверхностью; лучи волоска прижаты к поверхности стебля (рисунок 4).

Для эпидермиса плода характерны извилистостенные клетки наружного эпидермиса с устьицами анизоцитного типа (рисунок 6). Клетки внутреннего эпидермиса плода узкие, длинные, волокнообразные (рисунок 5). Волоски простые многочисленные, расположены на наружном эпидермисе плода, 1-кле-точные, разветвленные, звездчатые, 6-8-конечные, толстостенные с гладкой

Рисунок 2 - Фрагмент верхнего (А) и нижнего (Б) эпидермиса чашелистика с устьицами и волосками (Увел. 10x20)

Рисунок 4 - Фрагмент поперечного среза стебля (Увел. 10x20)

С ^ ш

■ут-

Рисунок 1 - Фрагмент верхнего (А) и нижнего (Б) эпидермиса листа с устьицами и волосками (Увел. 10х40)

Рисунок 3 - Фрагмент лепестка венчика и пыльцевые зерна (Увел. 10x20)

Рисунок 5 - Фрагмент внутреннего эпидермиса плода (Увел. 10x20)

Рисунок 6 - Фрагмент наружного эпидермиса плода с устьицами и волосками (Увел. 10x40)

поверхностью; лучи волоска прижаты к поверхности плода (рисунок 6).

Разработка методик стандартизации сырья

Для объективной оценки качества сырья по содержанию суммы флавоноидов и суммы ВРПС нами использованы методики спектрофотометрического определения флавоноидов и гравиметрического определения ВРПС в траве икотника серого.

Для анализа сырья травы икотника серого нами впервые разработана методика определения суммы флавоноидов методом спектрофотометрии непосредственно в извлечении из лекарственного сырья. В основе данной методики лежит реакция образования комплексов флавоноидов с алюминия хлоридом в среде спирта этилового 70% в сочетании с дифференциальным спектрофотометрическим методом определения оптической плотности полученных комплексов. Данная методика отличается экспрессностью, простотой в исполнении, хорошей воспроизводимостью, использованием оборудования, доступного для любой контролирующей лаборатории и рекомендуется ГФ-Х1 для анализа лекарственного растительного сырья, содержащего флавоноиды.

Определение оптимальных условий экстракции флавоноидов из травы икотника серого проводили на одном образце сырья. Установлено, что в составе суммы флавоноидов травы икотника серого содержатся производные лютеолина, кверцетина, нарингенина, одним из преобладающих является лютеолин. Полученные экспериментальные данные показали, что максимум поглощения спирто-водного извлечения из травы икотника серого с алюминия хлоридом находится при 400 нм и совпадает с максимумом поглощения комплекса лютеолина с алюминия хлоридом. Поэтому в качестве стандартного образца нами применен лютеолин-стандарт. Для расчета суммы флавоноидов мы использовали удельный показатель поглощения комплекса лютеолина с алюминия хлоридом.

В результате проведенных исследований нами были определены оптимальные условия и разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в траве икотника серого (таблица 2). Методика валидирована по показателям: повторяемость, воспроизводимость, линейность, правильность.

Таблица 2 - Оптимальные условия количественного определения суммы флавоноидов в траве икотника серого спектрофотометрическим методом

Наименование параметра (условий) Величина показателя

Степень измельчения сырья, мм 2

Условия экстракции Концентрация спирта этилового, % 70

Время, мин 60

Параметры спектрофото- метрирования Количество экстракта, мл 3,0

Концентрация спирта этилового, % 70

400

Время образования комплексов с А1СЬ, мин 45

Стандартное вещество Лютеолин

Содержание суммы флавоноидов, % от 1,04±0,01 до 1,31±0,01

По данной методике проанализировано 5 партий травы икотника серого, заготовленных в различных районах Курской области в разные годы. Результаты исследований показывают, что количественное содержание суммы флавоноидов в траве икотника серого колеблется от 1,04±0,01% до 1,31±0,01%. Ошибка единичного определения с 95% вероятностью не более 2,70%. В связи с этим предлагаем установить показатель содержания суммы флавоноидов в траве икотника серого не менее 1,0%.

Количественное определение ВРПС проводили методом гравиметрии, основанным на извлечении суммы ВРПС из лекарственного сырья водой с их осаждением спиртом этиловым 96%. Этот метод рекомендуется ГФ-Х1 для анализа сырья, содержащего полисахариды.

Определение оптимальных условий экстракции и условия осаждения ВРПС из травы икотника серого проводили на одном образце сырья. Установлено, что оптимальными условиями, обеспечивающими максимальный выход ВРПС из сырья и полноту их осаждения, являются: степень измельчения сырья - 2 мм, трехкратная экстракция водой в течение 90 минут (3 раза по 30 минут) в соотношении сырье-растворитель (1:10) и четырехкратное количество 16

спирта этилового 96% по отношению к извлечению. На основании проведенных исследований впервые разработана методика количественного определения суммы ВРПС для травы икотника серого (таблица 3). Методика валидирована по показателям: повторяемость, воспроизводимость, линейность.

Таблица 3 - Оптимальные условия количественного определения суммы ВРПС в траве икотннка серого гравиметрическим методом

Наименование параметра (условий) Величина показателя

Степень измельчения сырья, мм 2

Условия экстракции Экстрагент Вода

Соотношение сырье - экстрагент 1:10

Время экстракции, мин 90 (3x30)

Условия осаждения Осадитель Спирт этиловый 96%

Объем осадителя (кратность по отношению к объему извлечения) 4

Содержание суммы ВРПС, % от 10,23±0,16 до 11,90±0,22

Предложенной методикой проанализировано 5 партий сырья, собранных в разных районах Курской области в разные годы. Содержание суммы ВРПС колеблется от 10,23±0,16% до 11,90±0,22%. Ошибка единичного определения с 95% вероятностью не превышает 4,14%. В связи с этим предлагаем установить показатель содержания суммы ВРПС в траве икотника серого не менее 10,0%.

Разработка числовых показателей качества сырья Для разработки критериев качества травы икотника серого проведены исследования по определению числовых показателей сырья согласно требованиям ГФ-Х1. На основании анализа 5 партий сырья, заготовленных в различных районах Курской области в разные годы, предложены следующие критерии оценки качества и нормы: влажность - не более 12,0%, зола общая -не более 11,0%, зола, нерастворимая в 10% растворе кислоты хлористоводородной, - не более 1,0%, части сырья, утратившие естественную окраску (пожелтевшие, почерневшие), - не более 1,0%, другие части растения, не соответствующие установленному описанию сырья (корни), - не более 0,5%, органическая примесь - не более 1,0%, минеральная примесь — не более 1,0%.

Изучение динамики накопления основных групп БАВ и установление научно обоснованных сроков заготовки сырья

Для обоснования оптимальных сроков заготовки сырья травы икотника серого нами впервые изучена сезонная динамика накопления суммы флавоноидов и суммы ВРПС в различные фазы вегетации растений. В результате проведенных исследований установлено, что максимальное накопление флавоноидов и ВРПС в исследуемом растении происходит в период массового цветения - начала плодоношения, достигая 1,27% и 11,90% соответственно. Полученные данные можно рекомендовать для установления научно обоснованных сроков заготовки сырья.

Проведение фармакологического скрининга

Результаты информационно-аналитического исследования, а также проведенный нами фитохимический анализ травы икотника серого позволили определить направления фармакологического скрининга.

Острую токсичность настоя (по ГФ-Х1; доза 1,0 мл) и ВРПС (1500 мг/кг) определяли по методике Б.М. Штабского на мышах. Установлено, что настой и ВРПС относятся к классу малоопасных веществ.

Изучение отхаркивающего действия настоя и ВРПС травы икотника серого проводили по методике В.В. Гацура, используя модель изучения моторной функции мерцательного эпителия пищевода лягушки. Результаты показывают, что настой травы икотника серого достоверно повышает двигательную активность ресничек мерцательного эпителия пищевода лягушки на 17,18% (коэффициент ускорения 0,83), ВРПС - на 29,65% (коэффициент ускорения 0,71) соответственно. Изучение отхаркивающего действия настоя и ВРПС травы икотника серого проведено впервые.

Противовоспалительное действие икотника серого изучено с учетом влияния на разные стадии воспаления. При исследовании антиэкссудативной активности установлено, что настой и ВРПС достоверно уменьшают отек на 37,6% и 38,2% по сравнению с контролем. Настой и ВРПС травы икотника

серого влияют на пролиферативную фазу воспаления, достоверно снижая образование гранулемы на 45,0% и 18,4% соответственно по сравнению с контролем.

Впервые изучена анальгезирующая активность настоя и ВРПС на моделях термического и химического раздражения. В результате установлено, что настой и ВРПС достоверно снижают уровень болевой чувствительности на модели «уксусных корчей» на 31,0% и 17,2% соответственно. На модели «горячая пластинка» настой и ВРПС икотника серого достоверно удлиняют латентный период проявления первых признаков боли на 125,8% и 62,9% соответственно, а также тормозят болевую реакцию при пороге переносимости боли на 458,2% и 72,4% соответственно.

Изучение диуретической активности показало, что однократное внутрижелудочное введение крысам настоя травы икотника серого достоверно увеличивает количество выделяемой мочи на 56,5% по сравнению с контролем. Однако полученные результаты свидетельствуют о менее выраженном мочегонном эффекте настоя травы икотника серого, чем у официнальных лекарственных растений - хвоща полевого и брусники обыкновенной.

Впервые исследована антимикробная активность настоя и 1% раствора ПВ травы икотника серого методом серийных разведений в сравнении с контролем. При этом установлено, что настой травы икотника серого проявляет антимикробное действие в отношении грамположительной спорообразующей бациллы Bacillus cereus (во всех исследуемых разведениях), дрожжеподобных грибов Candida albicans (в соотношении 1:2 и 1:4) и грамотрицательных энтеробактерий Escherichia coli (в соотношении 1:2). Раствор ПВ показал высокую фунгистатическую активность в отношении грибов рода Candida (рост подавлялся во всех разведениях) и грамположительных стафилококков Staphylococcus aureus (в соотношении 1:2).

Впервые методом ТСХ в настое и ВРПС из травы икотника серого обнаружили по 3 вещества, в спиртовом извлечении (на спирте этиловом 70%)

— 2 вещества, относящиеся к среднеполярным (11г 0,21-0,50) и неполярным (1^0,51-1,0) соединениям, проявляющим антиоксидантную активность.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных экспериментальных исследований расширены сведения о химическом составе, морфолого-анатомическом строении и фармакологической активности травы икотника серого, подтверждена возможность его использования в качестве доступного отечественного источника БАВ. В итоге были сделаны следующие выводы:

1. Проведен общий фитохимический анализ травы икотника серого на различные группы БАВ. Обнаружены свободные и связанные сахара, азотистые основания, органические кислоты, дубильные вещества, кумарины, флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты, тритерпеновые сапонины, каротиноиды. Впервые установлено наличие 16 аминокислот (в том числе 7 незаменимых) и 25 макро- и микроэлементов (в том числе 11 — эссенциальных и 6 — условно эссенциальных). Обнаружено 24 соединения фенольной природы, из которых впервые идентифицировано 17 (в том числе 8 флавоноидов, 5 фенолкарбоновых кислот, 4 производных дубильных веществ). Впервые из травы икотника серого выделено 4 фракции полисахаридов: ВРПС — 11,9%, ПВ - 9,7%, ГЦ А - 4,5%, ГЦ Б - 3,0%, установлен их моносахаридный состав. Впервые определено количественное содержание функциональных групп ПВ; установлено, что они являются низкоэтерифицированными (>.<50%).

2. Впервые в результате морфолого-анатомического анализа травы икотника серого выявлена и описана совокупность макро- и микродиагностических признаков сырья, позволяющих устанавливать его подлинность. Ми кро диагностическое значение имеют: извилистостенные клетки эпидермиса с четковидными утолщениями; складчатость кутикулы; анизоцитный тип устьиц; трихомы (1-клеточные, разветвленные, звездчатые, 6-8-конечные, толстостенные с гладкой поверхностью волоски).

3. Впервые для стандартизации сырья разработаны методики количественного определения суммы флавоноидов (методом спектрофотометрии) и суммы ВРПС (методом гравиметрии). Установлено, что содержание суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин в траве икотника серого составляет 1,04-1,31%, суммы ВРПС - 10,23-11,90%. Исследования по валидации показали, что разработанные методики соответствуют критериям приемлемости и могут быть использованы для аналитических целей.

4. Анализ 5 партий сырья, заготовленного в различных районах Курской области в разные годы, позволил определить следующие критерии оценки качества и нормы: содержание суммы флавоноидов — не менее 1,0%, содержание суммы ВПРС - не менее 10,0%, влажность - не более 12,0%, зола общая - не более 11,0%, зола, нерастворимая в 10% растворе кислоты хлористоводородной, - не более 1,0%, части сырья, утратившие естественную окраску (пожелтевшие, почерневшие), - не более 1,0%, другие части растения, не соответствующие установленному описанию сырья (корни), — не более 0,5%, органическая примесь - не более 1,0%, минеральная примесь - не более 1,0%.

5. Впервые изучена сезонная динамика накопления флавоноидов и ВРПС в различные фазы вегетации растений. На основании экспериментальных исследований научно обоснованы оптимальные сроки заготовки сырья -период массового цветения — начала плодоношения растений.

6. Результаты фармакологического скрининга настоя и двух фракций полисахаридов (ВРПС, ПВ) травы икотника серого позволили установить, что настой и ВРПС относятся к классу малоопасных веществ; настой обладает диуретическим и антимикробным действием; настой и ВРПС — противовоспалительным, отхаркивающим, анальгезирующим, антиоксидантным действием; ПВ — антимикробной активностью.

Перспективы дальнейшей разработки темы диссертационного исследования. Полученные результаты могут служить экспериментальным обоснованием для рекомендации травы икотника серого в качестве перспективного отечественного источника различных групп природных БАВ и

дальнейшего более глубокого изучения с целью внедрения в официнальную медицину.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Дроздова, ИЛ. Анализ элементного состава травы икотника серого флоры Центрального Черноземья / ИЛ. Дроздова, Т.И. Лупилина // Науч. ведомости Белгород, гос. уи-та. Серия: Медицина. Фармация.-2012. -№ 22 (141), вып. 20/2.-С. 180-183.

2. Дроздова, И.Л. Изучение каротиноидов травы икотника серого / И.Л. Дроздова, Т.И. Лупилина // Университетская наука : Взгляд в будущее : материалы итог. науч. конф. сотрудников КГМУ, Центр.-Чернозем. науч. центра РАМН и отд-ния РАЕН, посвящ. 78-летию Курского гос. мед. ун-та (7 февр. 2013 г.) : в 2 т. / под ред. В.А. Лазаренко, П.В. Калуцкого, А.И. Конопли, О.О. Куриловой. - Курск, 2013. - Т. II. - С. 71-73.

3. Дроздова, И.Л. Исследование состава органических кислот икотника серого флоры Центрального Черноземья / И.Л. Дроздова, Т.И. Лупилина // XX Юбилейный Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» (15-19 апр. 2013 г.) : тез. докл. - М., 2013. -С. 332.

4. Дроздова, И.Л. Определение функциональных групп пектиновых веществ травы икотника серого / И.Л. Дроздова, Т.И. Лупилина // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2013. - Вып. 68. - С. 45^16.

5. Лупилина, Т.И. Содержание дубильных веществ в траве икотника серого / Т.И. Лупилина, И.Л. Дроздова // Молодежная наука и современность : материалы 78-й Всерос. науч. конф. студентов и молодых ученых с междунар. участием, посвящ. 78-летию со дня рождения чл.-кор. РАМН, проф. A.B. Завьялова (17-18 апр. 2013 г.) : в 3 ч. - Курск, 2013.-Ч. И.-С. 232-233.

6. Дроздова, И.Л. Тритерпеновые соединения травы икотника серого / И.Л. Дроздова, Т.И. Лупилина // Лекарственное растениеводство: от опыта прошлого к современным технологиям : материалы II Междунар. науч.-практ. интернет-конф. - Полтава, 2013. -С. 108-110.

7. Дроздова, ИЛ. Определение числовых показателей травы икотннка серого / ИЛ. Дроздова, Т.И. Лупилина // Науч. ведомости Белгород, гос. ун-та. - 2013. - № 11 (154), вып. 22/2. - С. 93-96.

8. Дроздова, ИЛ. Изучепие состава фенольных соединений травы икотника серого методом ВЭЖХ / ИЛ. Дроздова, Т.И. Лупилина // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2013. - Т. 13, JSs 6. - С. 891-895.

9. Дроздова, И.Л. Фенолкарбоновые кислоты травы икотника серого (Berteroa incana (L.) DC.) [Электронный ресурс] / И.Л. Дроздова, Т.И. Лупилина // Совремешше проблемы отечественной медико-биологической и фармацевтической промышленности. Развитие инновационного и кадрового потенциала Пензенской области : материалы III междунар. науч.-практ. конф. - ФГУП НТЦ «Информрешстр», Депозитарий электронных изданий. - Пенза, 2013. -С. 29-34.

10. Дроздова, И.Л. Изучение флавоноидов травы икотника серого (Berteroa incana (L.) DC.) / И.Л. Дроздова, Т.И. Лупилина// Хабаршы («Вестник») Южно-Казахстан. гос. фармац. академии. - 2013.-№ 4 (65). - С. 70-72.

11. Дроздова, И.Л. Изучение состава различных групп БАВ травы икотника серого / И.Л. Дроздова, Т.И. Лупилина // XXI Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» (07-11 апр. 2014 г.): тез. докл. -М„ 2014. -С. 235-236.

12. Лупилина, Т.И. Микродиагностические признаки листа икотника серого / Т.И. Лупилина, И.Л. Дроздова // Ботаника и природное многообразие растительного мира : материалы Всерос. науч. Интернет-конф. с междунар. участием (Казань, 17 дек. 2013 г.). -Казань, 2014.-С. 125-126.

13. Дроздова, И.Л. Азотистые основания травы икотника серого / И.Л. Дроздова, Т.И. Лупщшна // Актуальные проблемы фармацевтической науки и практики : материалы IV Всерос. науч.-практ. конф. / Сев.-Осет. гос. ун-т им. К.Л. Хетагурова. — Владикавказ, 2014.-С. 205-208.

14. Сравнительное изучение действия настоя и водорастворимых полисахаридов травы икотника серого на различные стадии воспаления / М.П. Гладчеико, Е.Б. Артюшкова, ИЛ. Дроздова, Т.И. Лупилииа // Ученые зап. Орлов, гос. ун-та (серия «Естественные, технические и медицинские науки»). - Орел, 2014. — № 7 (63). — С. 191-192.

15. Определение острой токсичности настоя и водорастворимых полисахаридов травы икотника серого / М.П. Гладчеико, Е.Б. Артюшкова, ИЛ. Дроздова, Т.И. Лупилииа // Ученые зап. Орлов, гос. ун-та (серия «Естественные, технические и медицинские науки»). - Орел, 2014. -№ 7 (63). - С. 193-194.

16. Лупилииа, Т. И. Изучение анатомического строения травы икотника серого / Т. И. Лупилина, И. Л. Дроздова // Молодежная наука и современность : материалы 79-й Всерос. науч. конф. студентов и молодых ученых с междунар. участием, посвящ. 79-летию КГМУ (16-17 апр. 2014 г.): в 3 ч. - Курск, 2014. - Ч. II. - С. 330.

17. Дроздова, ИЛ. Морфолого-анатомическое изучение травы икотника серого (Вег1егоа ¡псапа (Ь.) ОС.) / ИЛ. Дроздова, Т.И. Лупилина // Человек и его здоровье. -2014,-№2.-С. 94-98.

18. Изучение диуретической активности травы икотника серого [Электронный ресурс] / М.П. Гладченко, Е.Б. Артюшкова, ИЛ. Дроздова, Т.И. Лупилина // Современные проблемы науки и образования. — 2014. — № 4. - Режим доступа: 1Шр:// www.science-education.ru/118-13985.

19. Дроздова, И .Л. Выделение пектиновых веществ из травы икотника серого / И.Л. Дроздова, Т.И. Лупилина // Хабаршы («Вестник») Южно-Казахстан. гос. фармац. академии. -2014. - № 3 (68). - С. 171-173.

20. Дроздова, ПЛ. Изучение антимикробных свойств пектиновых веществ и настоя из травы икотника серого - ВеНегоа ¡псапа (Ь.) ПС. / ИЛ. Дроздова, О.Д. Печенин, Т.И. Лупилина //Традиционная медицина.-2014.-№ 3 (38).- С. 15-17.

21. Дроздова, ИЛ. Разработка методики количественного определения водорастворимых полисахаридов в траве икотника серого / ИЛ. Дроздова, Т.И. Лупилина // Человек и его здоровье. - 2014. - № 4. - С. 91-96.

22. Дроздова, И.Л. Сезонная динамика содержания водорастворимых полисахаридов в траве икотника серого / И.Л. Дроздова, Т.И. Лупилина // Фармация и фармакология. - 2014. -№6(7).-С. 8-11.

23. Дроздова, ИЛ. Экспериментальное изучение отхаркивающей активности настоя и водорастворимых полисахаридов из травы икотника серого — ВеЛегоа ¡псапа (Ь.) БС. / ИЛ. Дроздова, Т.И. Лупилина // Традиционная медицина. - 2014. - № 4 (39). -С. 20-23.

Лупилина Татьяна Игоревна

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ИКОТНИКА СЕРОГО (BERTEROAINCANA (L.) DC.)

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Лицензия ЛР № 020862 от 30.04.99 г. Сдано в набор 12.05.2015 г. Подписано в печать 14.05.2015 г. Формат 60x84'/i6. Бумага офсетная. Гарнитура Times New Roman. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 295(A). Издательство Курского государственного медицинского университета 305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3.