Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Фитохимическое исследование плодов черемухи обыкновенной (Padus avium Mill.). Совершенствование оценки показателей качества

Направахрукописи

БЕКЕТОВ ЕГОР ВЛАДИМИРОВИЧ

ФОТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПЛОДОВ ЧЕРЁМУХИ ОБЫКНОВЕННОЙ^^ U5AFWMM/LL.). СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ОЦЕНКИ ПОКАЗАТЕЛЕЙ КАЧЕСТВА.

15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Москва -2005

Работа выполнена в ГОУ ВПО Московская Медицинская Академия имени И.М. Сеченова Министерства Здравоохранения и Социального развития РФ

Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук, профессор Нестерова Ольга Владимировна

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, профессор Даргаева Тамара Дарижаповна

доктор фармацевтических наук, профессор Берлянд Александр Семёнович

Ведущая организация:

Институт государственного контроля лекарственных средств ФГУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства Здравоохранения и социального развития РФ

Защита состоится «ДО» _2005 г. в «14» часов на заседании диссертационного

совета Д 006.070.01 при Всероссийском НИИ лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН по адресу: 117216, г. Москва, ул. Грина, 7.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ВНИИ лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН по адресу: 117216, г. Москва, ул. Грина, 7.

Автореферат разослан 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 006.070.01

канд. с/х. наук ^^/^С*— М.В. Кирцова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

•В настоящее время происходит расширения фармацевтического рынка за счёт использования лекарственного растительного сырья в различных потребительских формах в том числе и измельчённого. Наряду с поиском новых лекарственных растений, проводится углублённое изучение сырья, издавна применяемого в медицине. Эти исследования направлены, прежде всего, на определение структуры биологически активных веществ и разработку объективных методик стандартизации растительного сырья. Предложения по использованию новых растений в фармацевтической и пищевой промышленности часто связаны с трудностями по обеспечению сырьевой базы. Проблема сертификации требует совершенствования методик стандартизации, т.к. на многие виды лекарственного растительного сырья отсутствуют необходимые разделы "Качественные реакции" и "Количественное определение" не только на измельчённое, но и на цельное сырьё. В связи с этим остро встаёт проблема совершенствования методов стандартизации и контроля качества измельчённого лекарственного растительного сырья и необходимость в пересмотре существующей нормативной документации.

Плоды черёмухи обыкновенной давно известны как ценное пищевое и лекарственное средство. Наличие огромной сырьевой базы на территории РФ ставит черёмуху в ряд самых перспективных объектов для изучения. Несмотря на это, сырьё черёмухи практически не изучалось с конца 50-х годов, хотя постоянно повышающиеся требования к качеству растительного сырья показывают необходимость количественной оценки содержания основных действующих веществ, а использование современных методов анализа позволяет проводить её с максимальной точностью и надёжностью.

Цели и задачи исследования

Целью диссертационной работы явилось изучение фармакогностических и физико-химических характеристик плодов черёмухи обыкновенной с целью обоснования методов контроля и показателей качества нормируемых при стандартизации.

Для реализации поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

• Провести фармакогностический анализ измельчённых плодов черёмухи обыкновенной, как перспективного источника липидного комплекса с целью расширения ассортимента промышленного масличного сырья, богатого ненасыщенными жирными кислотами, токоферолами, каротиноидами, фосфолипидами, что позволит рассматривать его в качестве источника получения этих веществ и создании на их основе лекарственных препаратов

• Определить оптимальные условия экстрагирования, позволяющие добиться максимального выхода липидного комплекса из плодов черёмухи обыкновенной

и провести сравнительный анализ физико-химических характеристик и числовых показателей липидных комплексов из плодов черёмухи обыкновенной, полученных с использованием различных экстрагентов.

• Определить в липидных комплексах, полученных с использованием различных экстрагентов, наличие и количественное содержание биологически активных веществ (БАВ) с известной фармакологической активностью (жирных кислот, токоферолов, каротиноидов и фосфолипидов).

• На основании полученных данных обосновать необходимые показатели и методы их стандартизации для исходного сырья (плоды черёмухи) и продуктов его переработки (липидный комплекс).

• Провести качественный анализ водно-спиртового извлечения из плодов черёмухи обыкновенной на наличие основных групп БАВ обладающих антиоксидантной активностью и определить их количественное содержание.

• Провести оценку антиоксидантного потенциала водно-спиртового извлечения.

• Исследовать возможность использования ультразвука для совершенствования процесса экстракции водно-спиртового извлечения из плодов черёмухи обыкновенной.

Научная новизна

Проведено микроскопическое исследование и определены основные диагностические признаки порошка плодов черёмухи обыкновенной, разработаны показатели качества плодов.

На основании результатов оценки масличности по методам Сокслета, Фолча и Блая предложен показатель количественного содержания липидного комплекса. Разработаны оптимальные условия получения липидного комплекса с использованием различных условий экстрагирования и различных экстрагентов.

Методом ГЖХ установлен жирнокислотный состав липидного комплекса плодов черёмухи обыкновенной и проведена его количественная оценка.

Проведен сравнительный анализ физико-химических характеристик и числовых показателей липидных комплексов полученных различными методами экстрагирования, а также идентификация и количественное определение токоферолов, каротиноидов и фосфолипидов.

Разработаны оптимальные условия экстрагирования водно-спиртового извлечения из плодов черёмухи обыкновенной, проведён его качественный анализ и определено значение антиоксидантной активности. На базе полученных данных разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в плодах черёмухи обыкновенной методом дифференциальной спектрофотометрии.

Проведена оценка влияния ультразвука на качественный и количественный выход БАВ из плодов черёмухи обыкновенной с последующей разработкой

математической модели процесса ультразвукового экстрагирования суммы флавоноидов из исследуемого сырья.

На основании данных исследования качественного и количественного состава водно-спиртовой фракции плодов черёмухи обыкновенной рекомендовано включение водно-спиртового экстракта из данного сырья в комплексное профилактическое средство применяемое в стоматологической практике при заболеваниях пародонта принятое на рассмотрение ВНИИГПЭ (заявка на изобретение №110.390 от 07.04.04)

Связь выполненной работы с проблемным планом фармацевтических наук и производства.

Диссертационная работа выполнена в рамках отраслевой научно-исследовательской программы ММА им. И.М. Сеченова «Разработка и совершенствование технологии подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием» (шифр, 16 утвержденный МЗ РФ); в соответствии с комплексной темой кафедры общей химии стоматологического факультета ММА им. И.М. Сеченова: «Новые знания и подходы в оценке качества и сертификации биологически активных соединений синтетического и природного происхождения, лекарственных препаратов, изделий медицинской техники (технологические аспекты)» (№ государственной регистрации 01.200.118796).

Практическая значимость

Разработан опытно-промышленный регламент на производство липидного комплекса черёмухи обыкновенной, утверждённый АО «Фармхим», г. Воронеж, (6 октября 2004 г.).

Разработаны показатели качества порошка плодов черёмухи обыкновенной включённые в проект ТУ для использования в качестве сырьевого источника при производстве эликсира зубного.

Результаты исследований внедрены в процесс контроля качества измельчённых плодов черёмухи в производстве фирмы «Фито-ЭМ» (10.10.2004)

Проведено внедрение способа «Получение водно-спиртового экстракта плодов черёмухи обыкновенной с использование ультразвука» в ГУЗ г.Москвы «Центр сертификации и контроля качества лекарств Департамента здравоохранения г. Москвы» (15.12.2004)

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ВЫДВИГАЕМЫЕ НА ЗАЩИТУ

• Результаты микроскопического определения основных диагностических признаков порошка плодов черёмухи обыкновенной.

• Данные по составу высших жирных кислот, токоферолов, каротиноидов, фосфолипидов в липидном комплексе плодов черёмухи обыкновенной.

• Данные по качественному составу водно-спиртового извлечения плодов черёмухи обыкновенной.

• Методика количественного определения суммы флавоноидов.

• , Результаты исследования влияния ультразвука на выход суммы флавоноидов из плодов черёмухи обыкновенной.

• Математическая модель ультразвуковой экстракции водно-спиртового извлечения из плодов черёмухи обыкновенной.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Основные результаты исследования доложены на:

• IX, X Российских национальных конгрессах "Человек и лекарство" (Москва, апрель 2002, май 2003 г.);

• VI съезде Международном съезде "Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения" г. Санкт-Петербург 2003

• Межкафедральная конференция ММА им. И.М. Сеченова 2004 г. Москва.

• Совместного заседания секции по поиску, разработке и технологии фитопрепаратов Учёного Совета ВИЛАР и кафедры общей химии стоматологического факультета Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова 2005 г.Москва

ПУБЛИКАЦИИ

По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 5 статей, 2 тезиса, 1 патент.

ОБЪЁМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 144 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (Глава 1), описания материалов и методов, 4 глав собственных исследований, выводов, библиографического указателя и приложений. Работа содержит 43 таблиц и 17 рисунков. Библиографический указатель включает 177 источников, из них 44 на иностранном языке.

Во введении сформулированы актуальность темы, цель и задачи исследования, научная новизна и практическая значимость работы.

В первой главе изложены ботанико-фармакогностическое описание сырья черёмухи обыкновенной, сведения о биологически активных веществах, фармакологическом действии, применении в официальной, народной медицине а также приводятся сведения о современных методиках идентификации и количественного определения основных действующих веществ черёмухи обыкновенной, в том числе о путях повышения качества извлечений из лекарственного растительного сырья.

Во второй главе приведены объекты исследования и методы их изучения.

Третья глава включает фармакогностическое изучение и вопросы стандартизации измельчённых плодов черёмухи обыкновенной.

В четвёртой главе приводятся данные по получению липидного комплекса плодов черёмухи обыкновенной и изучению его качественного и количественного состава.

Пятая глава посвящена качественному и количественному определению основных действующих веществ водно-спиртового извлечения плодов черёмухи обыкновенной.

В шестой главе изложены результаты изучения влияния ультразвука на повышение качества водно-спиртового извлечения плодов черёмухи обыкновенной. Приводятся данные по разработке математической модели процесса экстракции суммы флавоноидов с использованием ультразвука методами математического планирования эксперимента.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования явились плоды черёмухи обыкновенной - (Fructus Padi Mill.), заготовляемые Волгоградской фармацевтической фабрикой в 2001 - 2004 годах и соответствующие требованиям фармакопейной статьи 36 ГФ XI Fructus Padi и ГОСТ 3318-74 Плоды черёмухи.

В работе использовались современные физико-химические методы анализа: газожидкостная хроматография, высокоэффективная жидкостная • хроматография, хроматография в тонком слое сорбента, дериватография, спектрофотометрия.

При проведении исследований руководствовались требованиями общей статьи Государственной Фармакопеи XI издания (ГФ XI) «Плоды».

Определение числовых показателей и микроскопическое исследование по установлению диагностических признаков порошка плодов черёмухи обыкновенной проводили в соответствии с требованиями ГФ XI.

Физико-химические показатели липидного комплекса плодов черёмухи обыкновенной определяли согласно указаниям общей статья «Масла жирные» Государственной фармакопеи X изд. (ГФ X) и соответствующим методикам ГФ XI.

Определение состава жирных кислот липидного комплекса плодов черёмухи обыкновенной проводили методом ГЖХ по ГОСТ Р 51483-99 на хроматографе «CHROM 5», в качестве стандартов использовались метиловые эфиры жирных кислот («Sigma», США)

Определения наличия каротиноидов, токоферолов и фосфолипидов в составе липидного комплекса плодов черёмухи обыкновенной проводили методом

тонкослойной хроматографии на пластинках «Merck», с силикагелем марки Kieselgel 6OF254 с использованием свидетелей

Количественную оценку содержания каротиноидов и токоферолов проводили спектрофотометрически на приборе СФ-46 в пересчёте на ß-каротин ("La Roche", Швейцария) и ОС-ТОКОф ерол ("Sigma", США) соответственно.

Количественную оценку содержания суммы фосфолипидов проводили гравиметрически.

Идентификацию флавоноидов проводили методом тонкослойной хроматографии на пластинках «Merck» с силикагелем марки Kieselgel 6OF254

Количественно флавоноиды оценивали методом спектрофотометрии на спектрофотометре СФ-46.

Антиоксидантный потенциал определяли на приборе Яуза-ААА-01 (НПО Химавтоматика, г. Москва) с амперометрическим детектором, в качестве стандарта использовали рутин.

Оценка влияние ультразвука на качественный состав и количественный выход суммы флавоноидов проводилась на приборах ПСБ-Галс 1341-02, ПСБ-Галс 741-02 (ПСБ-Галс, г.Москва).

Математическое планирование эксперимента и оптимизацию по наиболее значимым факторам проводили согласно правилам построения многофакторного эксперимента и методу крутого восхождения по Боксу-Уилсону.

Статистическую обработку результатов проводили по общепринятым методам вариационной статистики (ГФХ1вып.1 с. 199-221).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Разработка методов стандартизации измельчённых плодов черёмухи обыкновенной. Действующая ФС на плоды черёмухи характеризуется отсутствием раздела "Качественные реакции", в разделе микроскопии отсутствует обязательное описание диагностических признаков измельченного сырья и порошка при этом значительно сужается область применения плодов (Вяжущее средство), в связи с чем возникает необходимость ее пересмотра и дополнения. Существующий в пищевой промышленности ГОСТ 3318-74 "Плоды черёмухи" также не учитывает перспектив введения данного растительного сырья в медицинскую практику, что требует его переработки с учетом специфики фармацевтического анализа. Таким образом существующая нормативная документация регламентирующая качество плодов черёмухи обыкновенной не может быть использована для стандартизации измельчённых плодов. В этой связи возникает вопрос разработки нормативно-технической документации на измельчённые плоды черёмухи обыкновенной,

которая бы включала все требования необходимые для стандартизации сырья черёмухи поступающего на фармацевтические предприятия, с учетом существующих требований к исходному сырью — плодам.

Для разработки характеристик подлинности сырья нами было проведено макро- и микроскопическое исследование измельченных плодов черёмухи обыкновенной.

По внешним признакам измельчённые плоды черёмухи представляют собой порошок желтовато-коричневатого цвета, проходящий сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм, со своеобразным запахом и приятным вкусом.

Раздел микроскопия выполнен в соответствии с требованиями ГФ XI, предъявляемыми к технике микроскопического исследования порошков плодов и семян. Анатомическое описание измельчённых плодов черёмухи обыкновенной сопровождается фотографиями микропрепаратов. Нами установлено, что диагностическое значение для измельчённых плодов черёмухи обыкновенной является светлые, некрупные, многоугольные, с утолщенными стенками клетки эпидермиса; устьица необильные, округлой формы, окружённые 7-9 околоустьичными клетками; тонкостенная паренхима мезокарпа клетки которой достигают весьма значительных размеров в средней части перикарпа; каменистые клетки эндокарпа, оболочки которых пронизаны частыми, узкими поровыми канальцами; обрывки эндосперма, содержащие липидный комплекс, обнаруживаемый по гистохимической реакции с Суданом Ш.

Определение числовых показателей проводилось согласно требованиям соответствующих методик ГФ XI. (Таблица 1)

Решение задачи оптимизации метода анализа доброкачественности лекарственного растительного сырья по такому показателю, как влагосодержание, возможно при неизотермическом варианте определения влагосодержания, с одновременной регистрацией и количественной оценкой процессов, протекающих при постоянном повышении температуры. Показатели влагосодержания и золы общей изучались методом ГФ XI издания и. дериватографически. Отмечено различие в числовых значениях при определении золы общей методами изотермического прокаливания и дериватографии (4,14% и 4,68% соответственно).

Таблица 1

Результаты определения числовых показателей _плодов черёмухи обыкновенной.

№ п/п Показатель Значение Предлагаемая норма

1. Содержание липидного комплекса, % 13,7810,73 не менее 12

2. Содержание суммы каротиноидов, мг% 27,85±1,75 не менее 25

3. Влажность, % 5,41+0,50 не более 6

4. Зола общая, % 4,14±0,05 не более 5

5. Зола нерастворимая в 10% НС1, % 0,8(Ш),03 не более 1

6. Частиц не проходящих, сквозь сито с диаметром отверстий 3 мм, % 2,90+0,01 не более 3

7. Частицы, проходящие сквозь сито с диаметром отверстий 0,5 мм, % 3,40+0,01 не более 4

С целью разработки показателя качества измельчённых плодов черёмухи обыкновенной по содержанию действующих веществ нами предложена методика количественного определения липидного комплекса, включающая экстракцию смесью хлороформ: метанол (1 : 1) из сырья в течении 4 часов в аппарате Сокслета, с последующим отгоном экстрагента и гравиметрическим определением содержания липидного комплекса в сырье (соотношение сырьё : экстрагент (1:10)). Относительная ошибка метода не превышала ±6%. Результаты количественного определения липидного комплекса в плодах черёмухи обыкновенной после экстракции различными экстрагентами представлены в таблице 2.

Таблица 2

Метрологические характеристики количественного определения липидного

комплекса в плодах черёмухи обыкновенной

Липидный комплекс f - Б Я2 Р,% А* Е%

полученный экстракцией

Хлороформ 4 17.20 0.2873 0.0825 95 0.87 ±5.08

Хлороформ:метанол (1:1) 4 24.67 0.4307 0.1855 95 1.31 ±5.31

Петролейный эфир 4 13.16 0.1978 0.0391 95 0.60 ±4.57

Гексан 4 13.61 0.2158 0.0466 95 0.66 ±4.82

Физико-химические показатели качества липидного комплекса плодов черёмухи обыкновенной.

Определение физико-химических характеристик проводили для образцов липидных комплексов полученных с использованием различных экстрагентов. В таблице 3 представлены результаты проведённых исследований.

Показатель «кислотное число», по которому контролируется процесс прогоркания липидного комплекса под действием факторов окружающей среды (свет,-! влага и т.д.), соответствует другим жирным растительным маслам и не превышает 10. Важнейшая константа, характеризующая степень ненасыщенности липидного комплекса - «йодное число», позволяет отнести исследуемый объект к полувысыхающим липидным комплексам (тип линолевой кислоты).

Таким образом, установлено, что по основным физико-химическим показателям липидный комплекс плодов черёмухи обыкновенной соответствует требованиям ГФ X и другим нормативным документам, регламентирующим качество растительных липидных комплексов.

Жирнокислотный состав. Проведено изучение жирнокислотного состава липидного комплекса плодов черёмухи обыкновенной методом ГЖХ. Хроматограмма метиловых эфиров жирных кислот приведена на рис. 1

Рис. 1. Газожидкостная хроматограмма смеси метиловых эфиров жирных кислот липидного комплекса плодов черёмухи обыкновеннной. 1 - лауриновая; 2 - миристиновая; 3 - пальмитиновая; 4 - пальмитолеиновая; 5 - стеариновая; 6 - олеиновая; 7 - линолевая; 8 - линоленовая

Таблица 3. Характеристика показателей качества липидных комплексов плодов черёмухи обыкновенной.

№ Липидный комплекс полученный экстракцией Описание Растворимость Плотность, г/мл Показатель преломления Кислотное число Йодное "число Число омыления

1. Хлороформ Маслянистая жидкость буро- коричневого цвета, приятного запаха Практически н/р в воде, растворимо в эфире, хлороформе, петролейном эфире 0,9149 1,3710 7,31 129 195

2. Хлороформ: метанол (1:1) Маслянистая жидкость красно- бурого цвета, приятного запаха, Практически н/р в воде, растворимо в эфире, хлороформе, петролейном эфире 0,9213 1,3548 8,44 126 167

3. Петролейный эфир Маслянистая жидкость желто-зеленого цвета, приятного запаха, Практически н/р в воде, растворимо в эфире, хлороформе, петролейном эфире. 0,9130 1,4756 3,99 139 126

4. Гексан Маслянистая жидкость буро-зеленого цвета, приятного запаха, Практически н/р в воде, растворимо в эфире, хлороформе, петролейном эфире 0,9193 1,4630 3,61 131 129

Таким образом идентифицировано и количественно определено 8 жирных кислот (таблица 4).

Таблица 4

Жирнокислотный состав масла плодов черёмухи обыкновенной

Качественный состав жирных Время Содержание жирных

кислот удерживания, мин кислот, %

Лауриновая (См) 24.8 0,4+0,02

Миристиновая (Ст) 29.3 0,4±0,02

Пальмитиновая (С^я) 34.5- 21,8±1,01

Пальмиголеиновая (Сш) 38.6 0,6±0,03

Стеариновая (Сад) 49.3 2,7±0,11

Олеиновая (С^О 52.0 21,3±1,03

Линолевая (Сша) 57.7 51,7±2,50

Линоленовая (Сш) 65.8 0,8+0,06

Состав жирных кислот, приведенных в таблице 4 показывает идентичность липидного комплекса плодов черёмухи растительным маслам линолевой серии, но с высокой долей пальмитиновой и олеиновой кислот. Преобладание линолевой кислоты позволяет отнести данный липидный комплекс к полувысыхающим, что хорошо согласуется с величиной йодного числа (таблица 3).

В результате установлено, что в липидном комплексе плодов черёмухи обыкновенной в большем количестве (более 70%) содержатся ненасыщенные жирные кислоты, в том числе незаменимые (эссенциальные) - линолевая и линоленовая.

Проанализировав банк данных результатов определения жирнокислотного состава липидных комплексов изучаемых на кафедре общей химии ММА им. И.М. Сеченова установлена специфичность набора жирных кислот липидного комплекса плодов черёмухи обыкновенной. Данную особенность можно использовать для подтверждения подлинности липидного комплекса из данного сырья.

Идентификация и количественное определение каротиноидов.

Сумма каротиноидов качественно определяли на пластинке «Merck» (Kieselgel 6OF254), используя метод ТСХ. Системой служила смесь бензол—петролейный эфир—ацетон (20:5:4), Использование этой системы позволяет добиться наилучшего отделения ксантофиллов от каротинов. О наличие каротиноидов судили по желтому окрашиванию пятен при дневном свете, а в УФ (X = 366 нм) по поглощению излучения, в результате чего проявляется в виде коричневых

пятен. Для проявления хроматографических зон использовали 10% раствор фосфосфорномолибденовой кислоты в этиловом спирте. В результате по свидетелю идентифицирован ß-карОТИН.

Количественно сумму каротиноидов определяли спекгрофотометрически при длине волны 450 нм по двум методикам: в пересчёте на стандартный раствор дихромата калия (метод 1) и учитывая известное значение удельного поглощения [5-каротина (метод 2).

Из таблицы 5 видно, что количественное содержание каротиноидов, рассчитанное по методу 1 и методу 2 различаются. Такие различия, по видимому, связаны с тем, что первый метод наименее специфичен (раствор сравнения представлен стандартным раствором дихромата калия, а не сравнение

абсорбции происходит только по насыщенности цвета растворов) и даёт заниженные результаты по сравнению со вторым методом в 1,7 раза.

Таблица 5

Метрологические характеристики методики количественного определения суммы _каротиноидов в липидном комплексе плодов черёмухи обыкновенной_

Липидный комплекс полученный экстракцией

а. й

и ы

о £

К 2

р,'

Дх

е%

Хлороформ

8.1

0.1323

0.0175

95

0.4022

±4,92

Хлороформ:метанол Петролейный эфир

19.38

0.1968

0.0387

95

0.5985

±3.09

20.27

0.2314

0.0535

95

0.7035

±3.47

Гексан

16.39

0.2134

0.0455

95

0.649

±3.96

Хлороформ Хлороформ:метанол Петролейный эфир Гексан

14.17 32.7 32.68 27.79

0.1736 0.4729 0.4894 0.3568

0.0301 0.2236 0.2395 0.1273

95 95 95 95

0.5279 1.438 1.488 1.085

±3.73 ±4.43 ±4.55 ±3.91

Идентификация и количественное определение токоферолов. Для идентификации токоферолов в липидном комплексе плодов черемухи использовали метод тонкослойной хроматографии на пластинках «Merck» (Kieselgel 6OF254) предварительно переведя токоферолы в состав неомыляемой фракции по известной методике.

Системой растворителей служила смесь гексан - диэтиловый эфир (в соотношении 1:1). Идентификацию токоферолов проводили после проявления реактивом Эммери-Энгеля, состоящего из равных объёмов 0,5% спиртового раствора СХ,а*-дипиридила и 0,25% спиртового раствора хлорида железа (Ш) - а-токоферол окрашивался в розовый цвет (Rf= 0,8).

Количественно токоферолы оценивали спекгрофотометрически на приборе СФ-46 (таблица 6) по стандартной методике. В качестве стандартного раствора использовали (Х-Токоферол ("Sigma", США).

Таблица 6

Метрологические характеристики количественного определения токоферолов в _липидном комплексе плодов черёмухи обыкновенной

Липидный комплекс

полученный f X S S2 Р,% Ах

экстракцией

Хлороформ 4 74.78 1.0625 1.1289 95 3.2305 ±4.32

Хлороформ:метанол 4 95.06 1.2629 1.5949 95 3.8399 ±4.04

Петролейный эфир 4 85.89 1.1404 1.3005 95 3.4674 ±4.04

Гексан 4 87.59 1.1060 1.2232 95 3.3627 ±3.84

Изучение фосфолипидного состава липидного комплекса плодов черёмухи обыкновенной. Большинство фосфолипидов находится в липидных комплексах в связанном с белками (реже с металлами) состоянии. Поэтому экстрагировать эти вещества можно лишь сочетая полярные органические растворители с неполярными или их смесями, разрушающими химические связи между липидами и белками.

Идентификацию групп фосфолипидов проводили методом ТСХ на пластинках "Merck" (Kieselgel 6OF254). При одномерной хроматографии использовалась система хлороформ : метанол : 25% аммиак : вода (70:30.6:1), в которой достигнуто разделение фосфотидилхолинов и лизофосфатидилхолинов. Для их обнаружения использовался групповой реагент (реактив Драгендорфа) - после чего холинсодержащие фосфолипиды проявлялись в виде оранжевых пятен.

При двухмерной хроматографии в первом направлении использовали систему растворителей хлороформ : метанол : 28% аммиак (13:6:1). После проявления первой системой пластинки высушивали до исчезновения запаха аммиака и хроматографировали во второй системе состоящей из смеси растворителей хлороформ : метанол : уксусная кислота: вода (34:5:5:1).

Фосфолипиды, содержащие аминогруппу, определялись с помощью нингидрина. При нагревании в течение 15 минут при 110°С появлялись фиолетово-розовые пятна липидов, содержащие первичную аминогруппу.

Во всех образцах были обнаружены: фосфатидилсерин, фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилинозитол и фосфатидная кислота.

Анализ полученных результатов позволяет рассматривать плоды черёмухи в качестве перспективного источника получения липидного комплекса, не уступающего по содержанию биологически активных веществ традиционному масличному сырью. Однако, на наш взгляд, в производстве целесообразнее использовать метод прессования, позволяющие избежать применение высокотоксичных экстрагентов, что и было реализовано в подготовленном нами проекте промышленного регламента на получение «Масла плодов черёмухи» утверждённом ЗАО «Фармхим» г.Воронеж.

Анализ литературной и патентной документации показывает сформировавшуюся тенденцию к использованию водно-спиртовых извлечений плодов и листьев растений семейства Rosaceae в качестве антиоксидантных и противовоспалительных средств.

Сведения о фотохимическом изучении водно-спиртовой фракции черёмухи обыкновенной немногочисленны. Данные о наличие в сырье наиболее распространённых групп биологически активных соединений неполные, разрозненные и обычно отличаются в зависимости от изучаемого сорта черёмухи. Действовавшая до настоящего времени нормативная документация на сырьё черёмухи обыкновенной не предусматривала наличие раздела качественные реакции на основные действующие вещества, помимо дубильных веществ. В связи с этим мы провели Качественный анализ водно-спиртового извлечения плодов черёмухи обыкновенной (Padus Avium Mill) с целью идентификации различных групп природных соединений, обладающих биологической активностью. Результаты определения представлены в таблице 7.

Таблица 7

Результаты качественного анализа водно-спиртового экстракта из плодов черёмухи обыкновенной.

№ Группы биологически-активных соединений Наличие

1 Антраценовые производные -

2 Кумарины -

4 Сапонины -

5 Фенолкабоновые кислота +

6 Флавоноиды +

7 Антоцианы +

Примечание: «+» - установлено наличие соединений в исследуемом сырье, «-» - группа соединений отсутствует.

Для анализа фенольных соединений использовали метод ТСХ. При подборе условий хроматографического разделения использовали пластинки фирмы «Merck» с силикагелем марки Kieselgel 6OF254 с размерами 8x15 см. Условия хроматографирования: температура 20-22°С, время насыщения камеры 30 минут. Время хроматографирования определялось прохождением фронта системы растворителей на расстояние 12 см.

Наилучшее разделение веществ наблюдалось при хроматографировании экстракта полученного 50% этиловым спиртом в системе н-бутанол : уксусная кислота : вода (4:1:5). На хроматограмме обнаруживалось 5 пятнен: Rf = 0,20 -розовое; Rf = 0,31 - розовое; Rf = 0,47 - жёлто-коричневое; Rf = 0,62 - голубое; Rf = 0,89 - малиновое (рисунок 3).

Рис. 3 Сравнительная хроматограмма спиртовых извлечений из плодов черёмухи (1:20)

Антоцианы обнаруживали при просматривании хроматограмм в видимом свете как розово-красные пятна. При обработке растворами щёлочи пятна приобретают синюю окраску. Таким образом, по результатам хроматографического анализа можно предположить, что в плодах черёмухи обыкновенной преобладают вещества фенольной природы гидрофильного свойства, при этом со свидетелями идентифицирован: рутин (ИГ = 0,47), кофейная кислота (И=0,89).

Количественное определение суммы флавоноидов в плодах черёмухи обыкновенной. Для количественного определения суммы флавоноидов, основываясь на данных литературного анализа, нами взят за основу спектрофотометрический метод после проведения реакции комплексообразования с хлоридом алюминия. Для разработки методики количественного определения суммы флавоноидов в плодах черёмухи обыкновенной и её воспроизводимости необходимо правильно подобрать условия извлечения веществ из сырья, учитывая степень измельчёноости сырья, концентрацию этилового спирта, гидромодуль и время экстракции.

В результате нами определены оптимальные условия экстрагирования суммы флавоноидов из плодов черёмухи обыкновенной: измельчённость сырья до частиц проходящих сквозь сито 2 мм; использование в качестве экстрагента 50% этилового спирта в соотношении сырьё : экстрагент (1:20). Максимальный выход суммы флавоноидов был достигнут при 2-х кратной экстракции на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течении 75 минут (первая экстракция 45 минут, вторая экстракция 30 минут).

В дальнейшем были отработаны условия фотометрической реакции образования окрашенного комплекса суммы флавоноидов в составе извлечения из плодов черёмухи и спиртового раствора АЮ3. Исследовались следующие параметры: область максимального поглощения света комплексом, концентрация и количество спиртового раствора АЮ3, необходимые для полного связывания суммы флавоноидов в комплексное соединение, зависимость светопоглощения фотометрируемых соединений от времени протекания реакции комплексообразования.

При регистрации спектра поглощения продуктов реакции суммы флавоноидов черёмухи обыкновенной с раствором алюминия хлорида величина максимального светопоглощения равна 414±2 нм , что соответствует максимуму поглощения рутина. Наиболее полное связывание суммы флавоноидов плодов черёмухи обыкновенной в комплекс наблюдается при использовании 2% спиртового раствора А10з в соотношении 1:2. Максимальное значение оптической плотности достигается через 30 минут после начала реакции комплексообразования и держится постоянным в течении 25-30 минут.

Полученные данные позволили разработать методику количественного определения суммы флавоноидов в плодах черёмухи обыкновенной используя метод дифференциальной спектрофотометрии в пересчете на рутин.

Достоверность и воспроизводимость результатов анализа проверена на образцах плодов черёмухи. Метрологические характеристики методики приведены в таблице 8. Как видно из представленных данных, относительная ошибка определения суммы флавоноидов по предлагаемой методике укладывается в доверительный интервал 95% и не превышает ± 5,53%.

Таблица 8

Метрологические характеристики методики количественного определения суммы флавоноидов в плодах черёмухи обыкновенной

Методом добавок выявлено отсутствие систематической ошибки. Относительная ошибка единичного определения находится в пределах случайной ошибки разработанной методики и имеет отклонения в сторону как положительных так и отрицательных значений, что свидетельствует об отсутствии систематической ошибки (Таблица 9).

Таблица 9

Результаты количественного определения суммы флавоноидов _с использованием метода добавок_

Номер образца Определено флавоноидов, мг Добавлено рутина, мг Теоретическое суммарное содержание, мг Найдено мг Относительная ошибка, %

1 31.7 40 71.7 68.1 -5.02

2 26.4 30 56.4 59.3 +5.14

3 23.2 25 48.2 46.3 -3.94

4 30.5 35 65.5 68.7 44.89

5 29.3 20 49.3 46.9 -4.87

Определение антиоксидантной активности. Величина антиоксидантной активности (АОА) является комплексным показателем качества, характеризующим суммарное содержание действующих веществ различных классов в извлечении из лекарственного растительного сырья.

Основные компоненты, отвечающие за антиоксидантные свойства плодов черёмухи обыкновенной, являются полифенолы, флавоноиды, дубильные вещества, антоцианы, витамины, фенолкарбоновые кислоты.

Определение АОА проводилось на приборе «Яуза-ААА-01», используя метод разработанный В.П. Пахомовым в Институте Клинической Фармакологии НЦ ЭСМП РФ после предварительного получения водно-спиртового экстракта по указанной выше методике. Условия определения: детектор амперометрический со стекл-угольным электродом; рабочая температура - 40°С; напряжение на электроде + 1,3 В; элюэнт - дистиллированная вода; стандарт - рутин; V вводимой пробы -20мкл. Обсчёт данных проводился на специализированном программном обеспечении поставляемом совместно с прибором.

Результаты определения антиоксидантной активности в пересчёте на рутин представлены в таблице 10.

Проведённое определение водно-спиртовых экстрактов полученных с использованием различных концентраций спирта показало, что использование в качестве экстрагента 50% этилового спирта позволяет получить экстракт богатый веществами флавоноидной природы, с высокой антиоксидантной активностью, что согласуется с ранее полученными данными.

Антиоксидантный потенциал водно-спиртового извлечения является интегральным показателем качества лекарственных средств растительного происхождения и может быть успешно использован для их стандартизации

Таблица 10

Результаты определения антиоксидантной активности водно-спиртового извлечения из плодов черёмухи обыкновенной.

Использование ультразвука для повышения качества водно-спиртовых экстрактов из плодов черёмухи обыкновенной. Процессы извлечения действующих веществ из растительного сырья в обычных условиях протекают довольно медленно. Ультразвуковые волны ускоряют проникновение экстрагента внутрь клеток, тем самым ускоряя растворение экстрактивных веществ. Переменное давление, кавитация и звуковой ветер приводят к возмущению слоя жидкости вокруг частицы растительного материала. Этот слой становится очень тонким, высоко подвижным и быстро сменяется другим количеством жидкости, которая ещё не вступала в контакт массообмена. Ультразвуковая экстракция приводит к разрыву клеток и клеточных структур с освобождением экстрагируемых соединений, которые сохраняют свою химическую структуру и биологическую функцию.

Так как под влиянием ультразвука не только интенсифицируется процесс экстракции, но и легко протекают процессы окисления, восстановления, гидролиза, полимеризации, деполимеризации и т.д. Скорость и направление этих процессов зависят как от параметров ультразвукового поля, так и от природы газов, в присутствии которых происходит процесс озвучивания. Поэтому нами проведено детальное изучение влияния ультразвука на выход биологически активных веществ и определение оптимальных условий экстрагирования для плодов черёмухи обыкновенной.

Для определения допустимых временных интервалов ультразвукового воздействия, при которых не наступает разрушение интересуемой группы биологически активных веществ (суммы флавоноидов) нами проведено исследование влияния продолжительности действия ультразвука на стабильность растворов рутина.

Для оценки влияния ультразвука на готовый стандартный раствор рутина были выбраны 2 временных интервала 45 и 60 минут. Колбы со стандартным раствором рутина помещали в рабочую зону ультразвуковой ванны ПСБ-Галс 134102 и обрабатывали ультразвуком частотой 42 кГц в течении 45 и 60 минут соответственно при комнатной температуре. Затем доводили объём колб до первоначального 96% этанолом и проводили измерение оптической плотности

растворов спектрофотометрическим методом после реакции комплексообразования с 2% раствором А1СЬ при длине волны 415 нм (таблица 11)

Таблица 11

Зависимость изменения оптической плотности РСО рутина от длительности обработки ультразвуком

№ Продолжительность обработки ультразвуком, мин Оптическая плотность

1. 0 0,535

2. 45 0,508

3. 60 0,475

Отмечено снижение оптической плотности после 45 минут обработки ультразвуком на 5%, а при дальнейшем увеличении продолжительности обработки ультразвуком с заданными параметрами, значение оптической плотности снижается на 12% по сравнению с первоначальным.

Система: бутанол: уксусная кислота: вода (4:1:5)

Детектирование: УФ - свет Сорбент: пластинка «Мегск» (Юеке^е! 60^54)

1 - PCO рутина после обработки 45 минут УЗ интенсивностью 2 Вт/см2.

2 - PCO рутина после обработки 60 минут УЗ интенсивностью 2 Вт/см2.

3 - PCO рутин без обработки УЗ

4 - PCO кверцетин без обработки УЗ

Рис. 4 Сравнительная хроматограмма спиртовых растворов рутина после обработки ультразвуком.

Идентификация исследуемых растворов на присутствие рутина проводилась методом тонкослойной хроматографии на пластинках «Merck» (Kieselgel 6OF254) в системе н-бутанол : уксусная кислота : вода (4:1:5). Результаты исследование представлены на рисунке 4

После проявление пластинки в УФ свете, обнаружились два дополнительных пятна, что свидетельствует о разрушительном эффекте длительного воздействия ультразвука на биологически активные вещества флавоноидной природы. Исходя из полученных данных верхним пределом ультразвукового воздействия при экстрагировании выбран интервал 45 минут.

Разработка математической модели процесса ультразвуковой экстракции суммы флавоноидов из плодов черёмухи обыкновенной. С целью экономного использования времени, экстрагента, энергии затрачиваемой на измельчение и нагревание реакционной смеси, предварительно установили оптимальные условия процесса экстракции с использованием ультразвука методом математико-статистического планирования эксперимента по Боксу-Уилсону.

В качестве параметра оптимизации выбрали выход суммы флавоноидов, выраженный в процентах от теоретического (т.е. содержания в сырье). В соответствии с данными литературы выбрали факторы, влияние которых на параметр оптимизации и оптимальные значения предстояло установить.

A. измельчённость сырья;^)

B. температура экстракции;( Х2)

C. концентрация экстрагента (этилового спирта);^3)

D. соотношение сырья и экстрагента; (х4)

E. время экстрагирования/*,)

В таблице 12 представлены условные обозначения, размерность и уровни факторов, выбранные в соответствии с технологическими соображениями.

Таблица 12

Xi, мм *2,°С Xj, об% Х4, част. Xs, мин

Хо 2 70 70 1:20 30

X 1 10 20 10 15

«+» 3 80 50 1:30 45

1 60 90 1:10 15

Экстрагирование проводили по следующей методике: 1,0 г плодов черёмухи обыкновенной, подвергнутых определённому измельчению, помещали в круглодонную колбу, заливали экстрагентом и проводили экстракцию при

определённой температуре на ультразвуковой ванне ПСБ-Галс 1341-02 с обработкой ультразвуком частотой 42 кГц, фазовая модуляция 50Гц мощность излучателя 50 Вт, рабочий объём ванны 1,3 литра, интенсивность 2 Вт/см2.

Исходя из вышесказанного, матрица планирования составила 32 опыта плана типа 25 в двухкратной повторности.

Анализ полученных данных позволил представить процесс экстрагирования суммы флавоноидов из плодов черёмухи обыкновенной с использованием ультразвука в виде математического уравнения:

у = 2,4235 +(• 0,841)х[ +(- 0,895)х2 +(■ 0,297)х} + (0,1192)х4 +

При анализе знаков коэффициентов уравнения регрессии легко сделать вывод о том, что выход суммы флавоноидов из плодов черёмухи обыкновенной возрастает при уменьшении измельчённости сырья, температуры экстракции и концентрации этилового спирта, а также при увеличении времени экстракции, и незначительно меняется при увеличении продолжительности экстракции. Величина коэффициентов уравнения позволяет судить о степени влияния каждого фактора. Наибольшее влияние на процесс экстракции с использованием ультразвука оказывает температура экстракции (0,895), затем измельчённость сырья (0,841). В меньшей степени на процесс экстрагирования оказывает влияние концентрация этилового спирта.

Статистический анализ показал, что все коэффициенты уравнения значимы, так как и уравнение адекватно описывает реальный

процесс.

Согласно обработке результатов эксперимента, данные не противоречат гипотезе об однородности (Срасч.<(5табл.) и адекватности (Ррасч.<Ргабл.) модели.

Оптимизация процесса экстракции плодов черёмухи обыкновенной с использованием ультразвука. Для оптимизации процесса экстрагирования использовался метод крутого восхождения. Крутое восхождение проводили по наиболее значимому фактору по методике изложенной выше, с навесками сырья массой 1,0 г в трёхкратной повторности.

Результаты представлены в таблице 11.

Максимальный выход суммы флавоноидов, который удалось достигнуть в результате оптимизации, составил 4,78% от содержания в сырье (при температуре экстракции 64°С).

Таблица 11.

Схема опытов крутого восхождения по фактору Хг (экстрагент 50% этиловый спирт)

№ опыта Температура экстракции, С Метрологические ха рактеристики

•с Б Б2 Р, % Ах £%

1 70 4.13% 0.06 0.0036 95 0.18 4.44

2 68 4.33% 0.06 0.0036 95 0.18 4.24

3 66 4.70% 0.05 0.0025 95 0.14 3.92

4 64 4.78% 0.05 0.0025 95 0.14 4.01

5 62 4.71% 0.04 0.0016 95 0.15 3.61

6 60 4.61% 0.05 0.0025 95 0.16 3.39

Анализируя полученные результаты нами были определены оптимальные условия экстракции суммы флавоноидов из плодов черёмухи обыкновенной с использованием ультразвука (см. табл. 12).

_Таблица 12.

Параметр экстракции Значение параметра

1. Измельчённость сырья, мм 1 мм

2. Температура экстракции, °С 64

3. Концентрация спирта этилового, об% 50

4. Гидромодуль 1:30

5. Параметры ультразвука

5.1. Частота, кГц 42

5.2. Интенсивность, Вт/см2 2

6. Продолжительность экстракции, мин 15

Таким образом оптимальный режим проведения экстракции с использованием ультразвука позволил повысить выход суммы флавоноидов на 40% по сравнению с ранее полученными результатами, а также сократить время экстрагирования более чем в 3 раза.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Проведено фармакогностическое изучение и разработаны характеристики подлинности, показатели качества и их нормы для измельчённых плодов черёмухи обыкновенной.

2. Предложена методика контроля качества и определено содержание липидного комплекса в составе плодов черёмухи обыкновенной. Относительная ошибка методики составляет ±6%. Установлено, что плоды черёмухи можно отнести к высокомасличному сырью (содержание липидного комплекса не менее 13,0%).

3. Изучены физико-химические характеристики и разработаны показатели качества липидных комплексов плодов черёмухи обыкновенной в соответствии с требованиями общей статьи ГФ X "Масла жирные".

4. Проведена идентификация и количественная оценка каротиноидов, токоферолов и фосфолипидов в липидных комплексах плодов черёмухи обыкновенной полученных экстракцией различными экстрагентами .Подготовлен проект промышленного регламента на производство «Масла плодов черёмухи» и утверждён ЗАО «Фармхим» г. Воронеж (06.10.2004).

5. Проведена качественная оценка содержания основных групп БАВ в гидрофильной фракции плодов черёмухи обыкновенной. Обнаружены флавоноиды, антоцианы, фенолкарбоновые кислоты. Для раздела «Качественные реакции» предложена методика идентификации веществ флавоноидной природы методом тонкослойной хроматографии с использованием стандартных свидетелей.

6. Разработана методика количественно определения суммы флавоноидов. Предложен показатель содержания суммы флавоноидов не менее 2,3%. Проведена оценка антиоксидантного потенциала водно-спиртового извлечения из плодов черёмухи обыкновенной. Разработанные методики идентификации и количественного определения суммы флавоноидов включены в проект ТУ «Порошок плодов черёмухи обыкновенной» для использования в качестве сырьевого источника при производстве эликсира зубного.

7. С помощью методов математико-статистического планирования эксперимента изучено воздействие ультразвука на процесс извлечения суммы флавоноидов из плодов черёмухи обыкновенной. Составлена математическая модель процесса экстракции водно-спиртового извлечения с использованием ультразвука. Методом крутого восхождения проведена оптимизация технологии экстракции позволившая повысить выход суммы флавоноидов на 40% при существенном уменьшении времени экстрагирования (в 3 раза) по сравнению с традиционной методикой экстракции.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Кондрашев СВ., Бекетов Е.В, Решетняк В.Ю., Нестерова О В. Плоды черёмухи обыкновенной - возможный источник получения каротиноидов. // IX Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». М: Медицина, 2002.-С. 620.

2. Кондрашев СВ., Бекетов Е.В., Решетняк В.Ю., Нестерова О.В Разработка оптимальных условий экстракции липидного комплекса плодов черёмухи обыкновенной. // К Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». М: Медицина, 2002. - С. 621.

3. Бекетов Е.В., Трифонова Л.А., Репина Е.Е., Кондрашев СБ., Нестерова О.В., Решетняк В.Ю. Фармакогностическое и фитохимическое изучение измельчённых плодов черёмухи. // Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения.- Материалы Шестого Международного съезда.- СпБ., 2002.- С 175-178

4. Попков ВА. Бекетов Е.В., Решетняк В.Ю., Нестерова О.В., Кондрашев СВ. Черёмуха обыкновенная перспективный источник получения БАВ. // Нетрадиционные природные ресурсы, инновационные технологии и продукты. Труды РАЕН. - Москва, 2003.-Вып.9.-С103-108

5. Бекетов Е.В., Хахулина М.А., Кондрашев СВ., Нестерова О.В. Разработка методики количественного определения флавоноидов в плодах черёмухи обыкновенной. // Лекарственные растения в фармакологии и фармации.-Доклады научной конференции. 50-лет АГМУ.-Барнаул, 2004.-С 22-26

6. Бекетов Е.В., Нестерова О.В., Кондрашев СВ. Изучение антиоксидантных свойств черёмухи обыкновенной.// Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции.-Труды ПГФА. - Пятигорск, 2004.-Вып.59.-С.143-144

7. Бекетов Е.В., Абрамов А.А., Нестерова О.В., Кондрашев СВ. Идентификация и количественная оценка флавоноидов в плодах черёмухи обыкновенной. // Вестник Московского Университета.- Москва, 2005.-Сер.2. Химия, в печати.

8. Бекетов Е.В., Пахомов В.П., Нестерова О.В. Совершенствование процесса извлечения флавоноидов из плодов черёмухи обыкновенной с использованием ультразвука. // Химико фармацевтический журнал.-Москва, 2005., в печати.

Заказ № 743 Тираж: 100 экз.,

0 00 «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 (095) 318-40-68 www.autoreferat.ru

\

22 к\I?¿:J

Актуальность темы

В настоящее время происходит расширения фармацевтического рынка за счёт использования лекарственного растительного сырья в различных потребительских формах в том числе и измельчённого. Наряду с поиском новых лекарственных растений, проводится углублённое изучение сырья, издавна применяемого в медицине. Эти исследования направлены, прежде всего, на определение структуры биологически активных веществ и разработку объективных методик стандартизации растительного сырья. Предложения по использованию новых растений в фармацевтической и пищевой промышленности часто связаны с трудностями по обеспечению сырьевой базы. Проблема сертификации требует совершенствования методик стандартизации, т.к. на многие виды лекарственного растительного сырья отсутствуют необходимые разделы "Качественные реакции" и "Количественное определение" не только на измельчённое, но и на цельное сырьё. В связи с этим остро встаёт проблема совершенствования методов стандартизации и контроля качества измельчённого лекарственного растительного сырья и необходимость в пересмотре существующей нормативной документации.

Плоды черёмухи обыкновенной (Padus avium Mill.) давно известны как ценное пищевое и лекарственное средство. Наличие огромной сырьевой базы на территории РФ ставит черёмуху в ряд самых перспективных объектов для изучения. Несмотря на это, сырьё черёмухи практически не изучалось с конца 50-х годов, хотя постоянно повышающиеся требования к качеству растительного сырья показывают необходимость количественной оценки содержания основных действующих веществ, а использование современных методов анализа позволяет проводить её с максимальной точностью и надёжностью.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью диссертационной работы явилось изучение фармакогностических и физико-химических характеристик плодов черёмухи обыкновенной с целью обоснования методов контроля и показателей качества нормируемых при стандартизации.

Для реализации поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

• Провести фармакогностический анализ измельчённых плодов черёмухи обыкновенной, как перспективного источника липидного комплекса с целью расширения ассортимента промышленного масличного сырья, богатого ненасыщенными жирными кислотами, токоферолами, каротиноидами, фосфолипидами, что позволит рассматривать его в качестве источника получения этих веществ и создании на их основе лекарственных препаратов.

• Определить оптимальные условия экстрагирования, позволяющие добиться максимального выхода липидного комплекса из плодов черёмухи обыкновенной и провести сравнительный анализ физико-химических характеристик и числовых показателей липидных комплексов из плодов черёмухи обыкновенной, полученных с использованием различных экстрагентов.

• Определить в липидных комплексах, полученных с использованием различных экстрагентов, наличие и количественное содержание биологически активных веществ (БАБ) с известной фармакологической активностью (жирных кислот, токоферолов, каротиноидов и фосфолипидов). На основании полученных данных обосновать необходимые показатели и методы их стандартизации для исходного сырья (плоды черёмухи) и продуктов его переработки (липидный комплекс).

• Провести качественный анализ водно-спиртового извлечения из плодов черёмухи обыкновенной на наличие основных групп БАВ, обладающих антиоксидантной активностью, и определить их количественное содержание.

• Исследовать возможность повышения качества водно-спиртовых извлечений из плодов черёмухи обыкновенной за счёт совершенствования процесс экстракции.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Проведено микроскопическое исследование и определены основные диагностические признаки порошка плодов черёмухи обыкновенной, разработаны показатели качества плодов.

На основании результатов оценки масличности по методам Сокслета, Фолча и Блая предложен показатель количественного содержания липидного комплекса. Разработаны оптимальные условия получения липидного комплекса с использованием различных условий экстрагирования и различных экстрагентов.

Методом ГЖХ установлен жирнокислотный состав липидного комплекса плодов черёмухи обыкновенной и проведена его количественная оценка.

Проведен сравнительный анализ физико-химических характеристик и числовых показателей липидных комплексов, полученных различными методами экстрагирования, а также идентификация и количественное определение токоферолов, каротиноидов и фосфолипидов.

Разработаны оптимальные условия экстрагирования водно-спиртового извлечения из плодов черёмухи обыкновенной, проведён его качественный анализ и определено значение антиоксидантной активности. Проведено изучение качественного состава водно-спиртового извлечения методом ВЭЖХ. На базе полученных данных разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в плодах черёмухи обыкновенной методом дифференциальной спектрофотометрии.

Проведена оценка влияния ультразвука на качественный и количественный выход БАВ из плодов черёмухи обыкновенной с последующей разработкой математической модели процесса ультразвукового экстрагирования суммы флавоноидов из исследуемого сырья.

На основании данных исследования качественного и количественного состава водно-спиртовой фракции плодов черёмухи обыкновенной рекомендовано включение водно-спиртового экстракта из данного сырья в комплексное профилактическое средство применяемое в стоматологической практике при заболеваниях пародонта, принятое на рассмотрение ВНИИГПЭ (заявка на изобретение №110.390 от 07.04.04)

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Разработан опытно-промышленный регламент на производство липидного комплекса черёмухи обыкновенной, утверждённый АО «Фармхим», г. Воронеж, (6 октября 2004 г.).

Разработаны показатели качества порошка плодов черёмухи обыкновенной, включённые в проект ТУ для использования в качестве сырьевого источника при производстве эликсира зубного.

Результаты исследований внедрены в процесс контроля качества измельчённых плодов черёмухи в производстве фирмы «Фито-ЭМ» (10.10.2004)

Разработанные методики микроскопического анализа плодов черёмухи обыкновенной и количественного определения суммы фенольных соединений апробированы в ОКК ОАО «Красногорсклексредства».

Проведено внедрение способа «Получение водно-спиртового экстракта плодов черёмухи обыкновенной с использование ультразвука» в ГУЗ г.Москвы «Центр сертификации и контроля качества лекарств Департамента здравоохранения г. Москвы» (15.12.2004)

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ВЫДВИГАЕМЫЕ НА ЗАЩИТУ

• Результаты микроскопического определения основных диагностических признаков порошка плодов черёмухи обыкновенной.

• Данные по составу высших жирных кислот, токоферолов, каротиноидов, фосфолипидов в липидном комплексе плодов черёмухи обыкновенной.

• Данные по качественному составу водно-спиртового извлечения плодов черёмухи обыкновенной. - - .

• Методика количественного определения суммы флавоноидов.

• Результаты исследования влияния ультразвука на выход суммы флавоноидов из плодов черёмухи обыкновенной.

• Математическая модель ультразвуковой экстракции водно-спиртового извлечения из плодов черёмухи обыкновенной.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Основные результаты исследования доложены на:

• IX, X Российских национальных конгрессах "Человек и лекарство" (Москва, апрель 2002, май 2003 г.);

• VI съезде Международном съезде "Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения" г. Санкт-Петербург. -2003;

• Межкафедральная конференция ММА им. И.М.Сеченова 2004 г. Москва;

• Совместного заседания секции по поиску, разработке и технологии фитопрепаратов Учёного Совета ВИЛАР и кафедры общей химии стоматологического факультета Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова 2005 г. Москва.

ПУБЛИКАЦИИ

По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 5 статей, 2 тезиса, 1 патент.

ОБЪЁМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 144 страницах машинописного текста и состоит из: введения, обзора литературы (Глава 1), описания материалов и методов, 4 глав собственных исследований, выводов, библиографического указателя и приложений. Работа содержит 43 таблицы и 17 рисунков. Библиографический указатель включает 177 источников, из них 44 на иностранном языке.

Во введении сформулированы актуальность темы, цель и задачи исследования, научная новизна и практическая значимость работы.

В первой главе изложены ботанико-фармакогностическое описание сырья черёмухи обыкновенной, сведения о биологически активных веществах, фармакологическом действии, применении в официальной, народной медицине, а также приводятся сведения о современных методиках идентификации и количественного определения основных действующих веществ черёмухи обыкновенной, в том числе о путях повышения качества извлечений из лекарственного растительного сырья.

Во второй главе приведены объекты исследования и методы их изучения.

Третья глава включает фармакогностическое изучение и вопросы стандартизации измельчённых плодов черёмухи обыкновенной.

В четвёртой главе приводятся данные по получению липидного комплекса плодов черёмухи обыкновенной и изучению его качественного и количественного состава.

Пятая глава посвящена качественному и количественному определению основных действующих веществ водно-спиртового извлечения плодов черёмухи обыкновенной.

В шестой главе изложены результаты изучения влияния ультразвука на повышение качества водно-спиртового извлечения плодов черёмухи обыкновенной. Приводятся данные по разработке математической модели процесса экстракции суммы флавоноидов с использованием ультразвука методами математического планирования эксперимента.

Общие выводы:

1. Проведено фармакогностическое изучение и разработаны характеристики подлинности, показатели качества и их нормы для измельчённых плодов черёмухи обыкновенной.

2. Предложена методика контроля качества и определено содержание липидного комплекса в составе плодов черёмухи обыкновенной. Относительная ошибка методики составляет +6%. Установлено, что плоды черёмухи можно отнести к высокомасличному сырью (содержание липидного комплекса не менее 13,0%).

3. Изучены физико-химические характеристики и разработаны показатели качества липидных комплексов плодов черёмухи обыкновенной в соответствии с требованиями общей статьи ГФ X "Масла жирные".

4. Проведена идентификация и количественная оценка каротиноидов, токоферолов и фосфолипидов в липидных комплексах плодов черёмухи обыкновенной полученных экстракцией различными экстр агентами Подготовлен проект промышленного регламента на производство «Масла плодов черёмухи» и утверждён ООО «Фармхим» г. Воронеж (06.10.2004).

5. Проведена качественная оценка содержания основных групп БАВ в гидрофильной фракции плодов черёмухи обыкновенной. Обнаружены флавоноиды, антоцианы, фенолкарбоновые кислоты.

6. Разработана методика количественно определения суммы флавоноидов. Предложен показатель содержания суммы флавоноидов не менее 2,1%. Проведена оценка антиоксидантного потенциала водно-спиртового извлечения из плодов черёмухи обыкновенной. Разработанные методики идентификации и количественного определения суммы флавоноидов включены в проект ТУ «Порошок плодов черёмухи обыкновенной» для использования в качестве сырьевого источника при производстве эликсира

--------зубного.------ - --------------------- ------------------- - ------

7. С помощью методов математико-статистического планирования эксперимента изучено воздействие ультразвука на процесс извлечения суммы флавоноидов из плодов черёмухи обыкновенной. Составлена математическая модель процесса экстракции водно-спиртового извлечения с использованием ультразвука. Методом крутого восхождения проведена оптимизация технологии экстракции позволившая повысить выход суммы флавоноидов на 40% при существенном уменьшении времени экстрагирования (в 3 раза) по сравнению с традиционной методикой экстракции.