Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Стандартизация конского каштана обыкновенного (Aesculus hippocastanum L.) семян и экстракта сухого на их основе

ДИССЕРТАЦИЯ
Стандартизация конского каштана обыкновенного (Aesculus hippocastanum L.) семян и экстракта сухого на их основе - диссертация, тема по фармакологии
АВТОРЕФЕРАТ
Стандартизация конского каштана обыкновенного (Aesculus hippocastanum L.) семян и экстракта сухого на их основе - тема автореферата по фармакологии
Жарова, Олеся Глебовна Москва 2009 г.
Ученая степень
кандидата фармацевтических наук
ВАК РФ
15.00.02
 
 

Автореферат диссертации по фармакологии на тему Стандартизация конского каштана обыкновенного (Aesculus hippocastanum L.) семян и экстракта сухого на их основе

□□3468130

На правах рукописи

Жарова Олеся Глебовна

СТАНДАРТИЗАЦИЯ КОНСКОГО КАШТАНА ОБЫКНОВЕННОГО (АЕ5С1Л Ш ШРРОСАЯТАКиМ Ь.) СЕМЯН И ЭКСТРАКТА СУХОГО НА ИХ ОСНОВЕ

15.00.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

?> ог.:"]

Москва 2009 г

003468130

Диссертационная работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН

Научный руководитель:

Кандидат фармацевтических наук

Шемерянкина Татьяна Борисовна

Официальные оппоненты:

Доктор фармацевтических наук, профессор

Даргаева Тамара Дарижаповна

Доктор фармацевтических наук

Лякина Марина Николаевна

Ведущая организация:

ОАО Всероссийский научный центр по безопасности биологически активных веществ «ВНЦ БАВ» (г. Старая Купавна)

Защита состоится «20» мая 2009 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 006.070.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН по адресу: П 7216, г. Москва, ул. Грина, 7

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЛАР по адресу: 117216, г. Москва, ул. Грина, 7

Автореферат разослан « 17 » апреля 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Д 006.070.01,

доктор фармацевтических наук

Громакова Алла Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

В настоящее время среди населения наблюдается значительный рост сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ), в том числе, хронической венозной недостаточности (ХВН). На сегодняшний день варикозная болезнь нижних конечностей является самой распространенной патологией периферических сосудов. Согласно эпидемиологическим данным различные формы этого заболевания встречаются у 26-38 % женщин и у 10-20 % мужчин трудоспособного возраста. Ежегодный прирост новых случаев заболевания у жителей индустриально развитых стран достигает 2,6 % среди женщин и 1,9 % среди мужчин. Специалисты связывают это с ухудшением экологии, увеличением частоты стрессовых ситуаций, употреблением спиртных напитков, курением, малоподвижным образом жизни, статическими перегрузками. По возрастным особенностям ССЗ имеют тенденцию к омоложению.

Варикозная болезнь является не только косметической проблемой: варикотромбофлебиты, трофические нарушения кожи, язвы значительно снижают трудоспособность, нарушают социальную адаптацию и качество жизни больных, а также может привести к инсульту, инфаркту миокарда и тромбоэмболии легочных артерий, которые чреваты летальным исходом. Именно поэтому лечение венозной недостаточности нужно начинать с самых ранних доклинических стадий развития заболевания. К сожалению, для большинства пациентов, да и врачей, необходимость лечения ХВН ассоциируется с осложненными формами заболевания уже на поздних его стадиях, когда реальную помощь больному может оказать только хирург. Вместе с тем, это заболевание на ранних стадиях является исключительно терапевтической проблемой, требующей только своевременного лечения.

До сих пор не создано универсальных препаратов для лечения ХВН. Спектр действия большинства из них достаточно узок (декстраны влияют на реологию крови, антиагреганты уменьшают агрегационную активность тромбоцитов, венотоники улучшают тонус венозной стенки). Для достижения оптимального лечебного эффекта врачам приходится применять несколько препаратов разных фармакотерапевтических групп. Таким образом, идеальный препарат для лечения ХВН должен воздействовать на как можно большее количество патогенетических звеньев заболевания, при этом иметь минимальное количество побочных эффектов и высокую биодоступность. Именно растительные препараты наиболее полно отвечают этим требованиям.

За рубежом номенклатура этих лекарственных средств чаще всего представлена препаратами на основе сырья конского каштана обыкновенного (Анавенол, Венитан, Эскузан, Эссавен-гель, Веноплант и другие), составляющих 70 % рынка ангиопротекторных и венотонизирующих средств. В России процент таких средств ничтожно мал. В связи с этим целесообразно вести разработки новых фитопрепаратов с венотонизирующими свойствами.

Венотонизирующее и ангиопротекторное действие большинства из известных фитопрепаратов обусловлено тритерпеновыми гликозидами (ТГ)

семян конского каштана обыкновенного.

В последние годы фармацевтическими субстанциями служат экстракты, полученные из растительного сырья с использованием специальной технологии и стандартизованные по основным биологически активным соединениям (БАС). Учитывая вышеприведенные факты, представляется актуальной разработка эргономичных и валидированных методик контроля качества ЛРС конского каштана обыкновенного и получаемых на его основе субстанций.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы является фармакогностическое и фитохимическое изучение семян конского каштана обыкновенного, разработка способа получения из них сухого экстракта и внедрение современных методик стандартизации качества этого сырья и субстанции.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- изучить морфолого-анатомические признаки измельченных и цельных семян конского каштана обыкновенного и выявить наиболее диагностически значимые из них;

- разработать методики качественного и количественного анализа ТГ (эсцина) для оценки качества семян конского каштана;

— - разработать и оформить проект нормативного документа на семена конского каштана - технические условия (ТУ);

- исследовать химический состав некоторых групп БАС в семенах конского каштана обыкновенного;

- разработать способ получения сухого экстракта из семян конского каштана, изучить его технологические свойства и оформить лабораторный регламент (ЛР) технологии его производства;

- разработать показатели и их нормы для контроля качества конского каштана семян экстракта сухого;

- разработать и оформить проект нормативного документа на конского каштана семян экстракт сухой - проект фармакопейной статьи (ФС).

Научная новизна работы

На основании макро- и микроскопического анализа выявлены диагностические признаки в анатомическом строении тканей измельченных семян конского каштана обыкновенного, предложены методики пробоподготовки для установления подлинности измельченных и цельных семян конского каштана методом микроскопии, что подтверждено оригинальными микрофотографиями.

Подобраны и отработаны условия проведения анализа ТГ (эсцина) в сырье и конского каштана семян экстракте сухом. Впервые разработаны унифицированные физико-химические методики как для контроля качества сырья, так и субстанции.

Впервые изучен качественный состав основных групп БАС (ТГ, флавоноидов и кумаринов, полисахаридов, моносахаридов, аминокислот,

липидов и микроэлементов) в семенах конского каштана обыкновенного, произрастающего в Подмосковье.

Впервые изучено содержание ТГ, полисахаридов, моно- и дисахаридов, аминокислот, липидов и микро- и макроэлементов в сырье и сухом экстракте из него.

Подобраны параметры технологии получения сухого экстракта из семян конского каштана и разработан способ получения конского каштана обыкновенного семян экстракта сухого, который оформлен в виде ЛР.

С учетом современных требований к стандартизации J1PC и экстрактам сухим разработаны критерии для установления подлинности и контроля качества семян и сухого экстракта из них конского каштана обыкновенного.

Практическая значимость работы

На основании проведенных исследований разработаны и утверждены:

- Технические условия ТУ 9377-075-04868244-2008 «Конского каштана обыкновенного семена».

- Проект ФС «Конского каштана обыкновенного семян экстракт сухой».

- Лабораторный регламент ЛР 04868244-02-08 на производство конского каштана обыкновенного семян экстракта сухого.

Основные положения, выносимые на защиту:

- Результаты фармакогностического исследования цельных и измельченных семян конского каштана обыкновенного. ~

- Результаты разработки способа получения конского каштана обыкновенного семян экстракта сухого.

- Результаты фитохимического изучения состава БАВ семян и получаемого на их основе сухого экстракта.

- Результаты разработки методик для стандартизации и контроля качества семян и получаемого на их основе сухого экстракта.

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на 69-ой итоговой конференции СНО (Самара, 2001), 70-ой итоговой конференции СНО (Самара, 2002), XXVIII Самарской областной студенческой научной конференции (Самара, 2002), М1жнародноТ конференци студенев та молодих вчених «Медицина - здоров'я XXI стор1ччя» (Днепропетровск, 2002), VI Международном съезде Фитофарм-2002 «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» (С.-П., 2002), М1жнародна науково-практична конференци молодих вчених «Вчеш майбутнъого» (Одесса, 2002), 71-ой итоговой конференции СНО (Самара, 2003), X Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2003), Российской научно-практической конференции «Рациональное использование лекарств» (Пермь, 2004), VIII Международном съезде Фитофарм-2004 «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» (Финляндия, Миккели, 2004), IX Международном конгрессе «Здоровье и Образование в XXI веке» (Москва, 2008).

Связь задач исследований с проблемным планом НИР

Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ ВИЛАР по «Программе фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса РФ на 2006-2010 гг.», задание 04, шифр 04.13 «Разработка технологий производства высокоэффективных лечебных и профилактических препаратов из растительного сырья».

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 13 научных работ в научных журналах, сборниках международных конференций и научных трудах.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 150 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы (глава 1), четырех глав экспериментальной части, выводов, списка литературы, включающего 233 источника, в том числе 95 иностранных, 9 приложений. Работа содержит 22 рисунка и 31 таблицу.

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цели и задачи исследования, представлены научная новизна и практическая значимость работы.

В первой главе на основании обзора данных- литературы дана общая характеристика ТГ растений, их физико-химические свойства, идентификация, методы количественного определения, способы выделения из лекарственного растительного сырья (ЛРС) и распространенность в природе. Отражена стандартизация качества сырья и препаратов из конского каштана обыкновенного. Изложены современные подходы к технологии получения сухих экстрактов из ЛРС. Приведены общие сведения о растении и БАС, накапливающихся в его органах. Рассмотрены фармакологическая активность и применение препаратов на основе семян конского каштана обыкновенного в медицине. Дана краткая характеристика номенклатуры лекарственных средств растительного происхождения и биологически активных добавок к пище (БАД), рекомендуемых для лечения ХВН. Обоснована целесообразность использования сырья и БАС конского каштана обыкновенного в качестве основы для создания средств с венотонизирующей активностью.

В разделе «Объекты и методы исследования» приведены сведения об объектах изучения, о методах и приборах, использованных нами в экспериментах.

Вторая глава посвящена совершенствованию фармакогностических и физико-химических методов контроля качества семян конского каштана обыкновенного.

В главе 3 представлены данные исследования состава БАС семян конского каштана обыкновенного с использованием современных физико-химических методов.

В четвертой главе изложены результаты исследований по подбору

оптимальных условий и разработке способа получения конского каштана обыкновенного семян экстракта сухого.

Пятая глава содержит сведения по изучению химического состава и установлению показателей качества конского каштана обыкновенного семян экстракта сухого.

В приложении представлены материалы НД, формулы БАВ конского каштана обыкновенного; заключение о фармакологической активности полученной субстанции; номенклатура венотонизирующих и ангиопротектор-ных препаратов традиционной медицины и БАД; номенклатура венотонизирующих препаратов, содержащих эсцин, зарегистрированные на территории РФ, их состав, показатели подлинности и доброкачественности.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования

Объектами для исследования служили образцы опытных партий зрелых семян конского каштана обыкновенного —Aesculus hippocastanum L., собранные с земли по мере созревания и осыпания плодов осенью в 2001-2003 годах на территории Самарской области, в 2004-2008 годах Ботаническом саду ВИЛАР Московской области. В опытах использовалось измельченное сырье. Измельчение сырья осуществляли на мельнице - экспериментальный измельчитель растительного материала МИР-1 (номинальная частота вращения 3000 об/мин, производительность 40 кг/ч). Измельченные семена просеивали через сито с отверстиями размером 0,5 и 3 мм по ТУ 23.2.2068-89. Товароведческий анализ проводили в соответствии с требованиями ГФ XI.

Отбор проб ЛРС и их анализ проводили по методикам ГФ XI и разработанными нами методами качественного и количественного определения ТГ. Микроскопический анализ цельного и измельченного сырья проводили согласно общей фармакопейной статье «Техника микроскопического и микрохимического исследования лекарственного растительного сырья» ГФ XI, изд. (вып. 1, С. 277-285). Поперечные срезы семян конского каштана сделаны на салазочном микротоме, микрофотографии - камерой Axiocam HRc на микроскопе Axiolmager М1 (объективы 2,5х - ЕС Plann-Neofluar).

Для экстракции БАВ и приготовления хроматографических систем использовали растворители марки «ч» и «хч». Приготовление реактивов, используемых в экспериментальной части работы, осуществляли согласно ГФ XI вып.1 и 2. Концентрирование извлечений и отгонку растворителей осуществляли в вакуум-выпарном ротационном испарителе марки ИР-1М.

Тонкослойную хроматографию (ТСХ) выполняли на пластинках «Сорбфил ПТСХ-П-А-УФ» (Россия) размером 15x15 и «Силуфол УФ 254» (Чехия) размером 10^10 см, при температуре (19-23) °С в герметически закрытых вертикальных стеклянных камерах. Нанесение исследуемых растворов на хроматографические пластинки осуществляли при помощи шприца Hamilton (10 мкл). Для ТСХ использовали систему растворителей: изопропанол-этилацетат-вода (40:40:30) и хлороформ-метанол-вода (26:14:3). Соотношение растворителей

учитывали в объемных частях. Обнаружение зон адсорбции тритерпенгликозидов, флавоноидов и кумаринов проводили УФ-облучением (254 и 366 нм) после высушивания хроматограмм, до и после обработки хроматограмм 25 % спиртовым раствором кислоты фосфорновольфрамовой с последующим нагреванием при 110 °С и диазобензолсульфокислотой в насыщенном растворе натрия карбоната. Все значения Rf соединений рассчитаны как средние из пяти измерений.

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) БАС семян и экстракта семян конского каштана обыкновенного. Для разработки методик качественного и количественного анализа методом ВЭЖХ был использован прибор «Agilent 1100 series» (США) с УФ-спектрофотометрическим детектором на диодной матрице (СДДМ) с последующей компьютерной системой для сбора и обработки хроматографических данных ChemStation for LC3D, Rev. А. 09.03 [1417], Agilent. В качестве неподвижной фазы использовалась хроматографическая колонка Waters 250x4,6 мм, заполненная сорбентом Symmetry С18 (США). В качестве подвижной фазы использована система растворителей: буферный раствор о-фосфорной кислоты (рН=2,5) -ацетонитрил в условиях градиентного элюирования. Для спектрофотометрического анализа исследуемых соединений использовался спектрофотометр фирмы GBC UV-visible Cintra 6 Spectrophotometer (Австралия) с диапазоном длин-волн от 190 нм до 1100 нм. Детектирование проводили с помощью УФ-детектора при длине волны 210 нм.

При разработке методик и проведении аналитических исследований по содержанию индикаторных компонентов в качестве стандартных образцов нами были использованы коммерчески доступные хроматографически чистые индивидуальные вещества и стандарты: эскулин кат. № 0205885 Indofine, фраксин кат. № 03052603 Sigma; рутин - СО по ФС 42-2508-87, эсцин Е1378-1 Sigma.

Определение содержания полисахаридов проводили гравиметрическим методом. Изучение состава моно- и дисахаридов семян и сухого экстракта из них конского каштана обыкновенного проводили с помощью ВЭЖХ. Жидкостной хроматограф «Agilent 1100 series» (США) с СДДМ с компьютерной системой ChemStation, Agilent. В качестве неподвижной фазы использовалась хроматографическая колонка 200x2,1 мм, заполненная сорбентом Kromasil 5ц NH2 (США); подвижной фазы - ацетонитрил-вода (77:23), скорость подвижной фазы 1,0 мл/мин., аликвота, вводимая в инжектор 10 мкл, использовался рефрактометрический детектор Merk L 7490 (Германия).

Изучение аминокислотного состава семян и сухого экстракта на их основе конского каштана обыкновенного проводили с помощью жидкостного хроматографа Agilent 1100 (США) с градиентным насосом высокого давления с подачей растворителя от 0,1 до 5,0 мл/мин, оборудованный СДДМ и флуориметрическим детектором, автосамплером, а также системой ChemStation, Agilent. В качестве неподвижной фазы использовалась хроматографическая колонка Agilent 200x2,1 мм, заполненная сорбентом Hypersil AA-ODS 5ц

(США).

Определение группового состава липидов семян проводили методом ТСХ. Количественное определение отдельных групп липидов осуществляли денситометрическим методом на приборе «Хромоскан 200». Исследование липофильной фракции семян и сухого экстракта семян конского каштана проводили методом ГЖХ на приборе Carlo Erba Strumentazione, HRGC 5300, Mega Series (Италия) с пламенно-ионизационным детектором с использованием програмно-аппаратного комплекса для сбора и обработки хроматографических данных «МультиХром for Windows». Анализ метиловых эфиров высших жирных кислот осуществляли на колонке Chrompack Capillary 7420 100x0,25 мм, при температурном режиме - термостат колонок: 110°С (10 мин), 5°/мин - 175°С (15 мин), 4°/мин - 200°С (5 мин), 3°/мин - 225°С (60 мин), температуре детектора 240 "С и температуре инжектора 260 "С. Газ носитель азот, скорость подачи элюента 1 мл/мин. Количественный анализ содержания отдельных жирных кислот определяли на интеграторе C-R6A Chromatopac фирмы Shimadzu. Расчет проводили методом внутренней нормализации.

Определение макро- и микроэлементного состава изучаемых объектов, включая микроэлементы проводили на спектрографе ДФС-8 с плоской дифракционной решеткой методом эмиссионного спектрального анализа.

Разработку способа получения сухого экстракта проводили в условиях лаборатории фитохимии ВИДАВ. Фармакологические исследования конского каштана обыкновенного семян экстракта сухого проведены в отделе медицины ВИЛАР. Разработанные для количественного определения методики ВЭЖХ были подвергнуты валидации (оценке пригодности). С этой целью было проведено экспериментально-обоснованное доказательство их пригодности для получения результатов, имеющих достаточную точность, прецизионность (воспроизводи-мость), линейность и специфичность в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002 и проектом ОФС «Валидация фармакопейных методов». Статистическая обработка результатов количественного определения проводилась в соответствии с требованиями ГФ XI изд. (вып.1, с. 199-207).

Совершенствование методов контроля качества семян конского каштана обыкновенного

Пересмотрены Технические условия 1996 года «Семена конского каштана обыкновенного». В новые ТУ впервые изложены требования к измельченному сырью, уточнены некоторые характеристики цельного сырья, а также включены современные методики контроля качества этого сырья.

Исследование морфологических и микроскопических признаков семян

На основании изучения морфологических характеристик образцов опытных партий, использованных для приготовления экстракта, составлено описание внешних признаков «Конского каштана обыкновенного семена».

В доступной литературе отсутствовала информация о массе семян. Использованные для приготовления экстракта семена конского каштана обыкновенного имели широкий диапазон значений масс. В среднем масса

семян составляла 7,0±3,0 г. Отбор аналитических проб для семян таких размеров и массы среди официнального растительного сырья из морфологической группы Semina требуют особой методики. На основании этого в ТУ включены массы аналитических проб для определения микробиологической и радионуклидной чистоты. В ТУ впервые включено описание пробоподготовки семян конского каштана обыкновенного.

Для выявления диагностических признаков в анатомическом строении проведено микроскопическое исследование цельных семян, что подтверждено оригинальными микрофотографиями. В микропрепаратах поперечного среза семян должно быть видно, что верхний эпидермис состоит из палисадоподобных клеток, стенки которых пронизаны поровыми канальцами; наружные стенки клеток утолщены сильнее боковых. Сверху эпидермис покрыт тонким слоем кутикулы. Основная часть семенной кожуры представлена паренхимной тканью из клеток с утолщенными стенками. Клетки наружных рядов ее плотносомкнутые, а более глубоких - рыхлые с крупными межклетниками разнообразной формы (рыхлая паренхима). По направлению к зародышу клетки паренхимы мельчают и спадаются, образуя слой сдавленных клеток, в котором находятся проводящие пучки. Глубже располагается слой из 4-5 рядов крупных продолговатых клеток паренхимы с тонкими стенками и темно-коричневым содержимым. Самый внутренний слой семенной кожуры (остаток эндосперма) в виде тонкой пленки из деформированных клеток. Эпидермис семядолей состоит из мелких клеток, ткань семядолей - из многоугольных плотносомкнутых паренхимных клеток, содержащих капельки жирного масла и крахмальные зерна. Преобладают крупные крахмальные зерна неправильно грушевидной формы, мелкие зерна - простые и двух-трехсложные.

Сырьем для производства конского каштана обыкновенного экстракта сухого служат измельченные семена этого растения.

Для установления подлинности измельченных семян конского каштана обыкновенного методом микроскопии нами изучены несколько способов приготовления микропрепаратов. Один из них заключается в изучении под микроскопом поперечного среза наиболее крупных кусочков семян, находящихся в измельченном сырье (аналогично методике анализа цельного сырья). При этом микропрепарат должен соответствовать представленным выше описаниям. Второй метод, рекомендуемый ГФ XI для микроскопического и микрохимического исследования J1PC, предусматривает исследование соскоба с наружной и внутренней части наиболее крупных кусочков среди аналитической пробы измельченных семян. При рассмотрении микропрепарата порошка соскоба в растворе хлоралгидрата или глицерина должны быть видны фрагменты покровных тканей, клетки паренхимы, проводящие пучки, остатки эндосперма и эпидермиса семядолей, крахмальные зерна, капли жирного масла, обрывки паренхимы с межклетниками.

Анализ дисперсного состава измельченных семян конского каштана показал, что фракция частиц, проходящих сквозь сито с отверстия диаметром 0,25 мм, составляет около 11%. На приготовлении микропрепарата из частиц

именно этой фракции основана третья методика для установления подлинности измельчённого сырья конского каштана методом микроскопии.

Рис. 1. Микропрепараты измельченных семян конского каштана 1 - клетки эпидермиса с поверхности кожуры (ув.х200); 2 - фрагмент поперечного среза эпидермиса кожуры (ув.хЗОО); 3 - клетки губчатой паренхимы семянной кожуры (ув.хЗОО);

4 - клетки паренхимы семядолей (ув.хЗОО); 5 - фрагмент поперечного сечения семянной кожуры (ув.х 111); 6 - проводящие пучки (ув.хЗОО); 7 - клетки паренхимы семядолей (ув.хЗОО); 8 - крахмальные зерна семядолей (ув.х 1200) и 9 - капли жирного масла семядолей (ув.х 1200) Для этого из аналитической пробы сырья нужно отобрать навеску массой около 20 г, поместить и просеять её в течение 5 минут через набор сит с отверстиями размером 0,5 мм и 0,25 мм. Порошок на сите с отверстиями размером 0,25 мм используют для приготовления микропрепаратов. Аликвоту порошка шпателем поместить в стаканчик и прилить 2,5 % раствор ШОН,

кипятить в течение 2 минут, а затем промыть водой. Далее небольшое количество порошка препаровальной иглой перенести на предметное стекло в каплю раствора хлоралгидрата, накрыть покровным стеклом и рассмотреть под микроскопом. Для установления наличия и свойств крахмальных зерен небольшую часть порошка следует внести в каплю воды. При просмотре нескольких микропрепаратов в воде должны быть видны: фрагменты паренхимы семядолей с плотносомкнутыми клетками, наполненными крахмальными зернами; крахмальные зерна неправильной грушевидной формы в группах и по отдельности и капли жирного масла. При просмотре нескольких микропрепаратов в растворе хлоралгидрата должны быть видны красно-коричневые, светло-коричневые фрагменты губчатой паренхимы семенной кожуры; серовато-белые фрагменты паренхимы семядолей; обрывки проводящих пучков; кусочки эпидермы семенной кожуры красно-коричневого цвета, состоящей из плотносомкнутых ячеистых клеток с прямыми стенками. Также могут в поле зрения попадаться и другие фрагменты семени (рис. 1).

Все вышеизложенные методики микроскопического анализа измельченного сырья конского каштана обыкновенного позволяют достоверно выявлять диагностические элементы анатомического строения семян конского каштана.

Установление подлинности семян конского каштана обыкновенного В разделе «Качественные реакции» нового варианта ТУ предусмотрено проведение тестов на обнаружение ТГ. Для определения наличия эсцина была разработана методика ТСХ. Наилучшие результаты были получены при использовании в качестве подвижной фазы смесь растворителей: этилацетат -изопропанол - вода (40:40:30), а в качестве проявителя хроматограммы 25 % спиртового раствора фосфорно-вольфрамовой кислоты. Пятна на хроматограммах испытуемых объектов оценивали в сравнении со стандартным образцом эсцина (пятно фиолетового цвета с около 0,71).

Разработка методики количественного определения ТГ в сырье С учетом современных требований к анализу БАС, для количественной

III. Изоэсцин 1а: Я^Т*, ^ =-Н, Я3=-СОСН3

IV. Изоэсцин 1Ь: 11,=А**, Я2= -Н, Я3 =-СОСН3

он

Рис. 2. Доминирующие компоненты эсцина

оценки суммы ТГ конского каштана обыкновенного разработана методика определения содержания суммы четырех основных гликозидов (эсцин 1а и lb, изоэсцин 1а и lb), которые мы условно называем «эсцином» (рис. 2), методом ВЭЖХ со спектрофотометрическим детектором с использованием эсцина-стандартного образца.

В основу методики положены следующие условия хроматографирования: длина волны (X) - 210 нм (рис.3), неподвижная фаза - С)8, колонка Waters Symmetry CI 8 250x4,6 мм, США, лучшими показателями разделения и стабильностью отличалась система состава: компонент А: буферный раствор о-фосфорной кислоты с рН=2,5; компонент В: ацетонитрил в условиях градиентного элюирования. Форма градиента линейная:

Время, мин

0

30

32

А, %

95

40

В,%

60

95

40 5 95

Наилучшее разделение ТГ наблюдалось при температуре термостата колонки 35 °С, скорости потока подвижной фазы 1 мл/мин. Объем вводимой пробы 10 мкл.

190 210 230 250 270 290 310 330 350 370)..нм Рис. 3. УФ-спектр поглощения спиртового раствора эсцила-стандартного образца.

mAU

25

5 10 15 20 25 30 35 40 min

Рис. 4. ВЭЖ-хроматограмма раствора эсцина-стандартного образца: 1, 2, 3,4 - эсцин 1а, эсцин lb, изоэсцин 1а, изоэсцин lb.

Хроматографическое разделение эсцина-стандартного образца представлено на рис. 4.

Условия пробоподготовки. Максимальный уровень эсцина в извлечении наблюдался при экстрагировании семян, измельченных до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 0,5 мм, 70 % этанолом на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 30 минут после предварительной обработки ультразвуком в течение 10 минут и соотношении сырья к экстрагенту 1:100. Типовая ВЭЖХ хроматограмма извлечения семян конского каштана обыкновенного представлена на рис. 5.

Мог4>.

?0М-

1750-

Рис. 5. ВЭЖ-хроматограмма извлечения из семян конского каштана обыкновенного: 1, 2, 3,4 - эсцин 1а, эсцин 1Ь, изоэсцин 1а, изоэсцин 1Ь.

Содержание ТГ (X, %) определяют методом абсолютной калибровки или по формуле:

С*52*Г*100

Х'/0" ^ 'ГДС

С — концентрация эсцина-стандартного образца, мг/мл; Б) - суммарная площадь пиков, соответствующая эсцину-стандарту, мм2; Бг - суммарная площадь пиков, соответствующая эсцину испытуемого образца, мм2; V - объем испытуемого образца, мл; ш — масса навески сырья, мг.

Содержание ТГ в семенах конского каштана обыкновенного в пересчете на безводное вещество должно быть не менее 4 %.

Валидация методики ВЭЖХ количественного определения эсцина

Основным критерием специфичности является степень разделения - Я5, определяющаяся на основе показателей пригодности хроматографической системы.

Для проверки пригодности хроматографической системы использовался раствор эсцина-стандартного образца. Расчет параметров хроматографической системы проводился для пиков эсцина на 5 хроматограммах, полученных в условиях анализа извлечения из семян конского каштана обыкновенного. Результаты представлены в таблице 1.

Прецизионность (воспроизводимость) методики характеризовалась величиной стандартного отклонения Б (0,1976) или относительным стандартным

отклонением 115 (4,29%) для серии измерений на примере одного образца сырья в 10 независимых повторностях.

Таблица 1

Параметры разделения основных компонентов эсцина _в условиях градиентного элюирования_

Пики Время Коэффи- Коэффи- Число Селектив Степень

удерживания, циент циент теоретических ность, а разделения,

мин асимметрии пика, Ав емкости, К тарелок, N ^

1 26,4 1,1 12,1 965 0,97 0,7

2 26,9 1,1 12,5 1002 0,99 1,05

3 27,2 1,1 12,6 1025 0,95 1,15

4 27,7 1,1 13,2 1063 1,05

Метрологические характеристики методики определения содержания эсцина приведены в таблице 2.

Таблица 2

Метрологические характеристики методики количественного определения эсцина в семенах конского каштана обыкновенного

Р - X Б2 8 Р,% ШР) АХср Е, %

9 4,601 3,904* 10"' 0,1976 95 2,78 0,1732 ±3,76

Относительная ошибка единичного определения методики количественного определения эсцина с 95 % вероятностью составляет ±3,76 %.

Линейность исследовалась на растворе эсцина-стандартного образца (таблица 3, рисунок 6).

Таблица 3

Параметры разделения сапонинов в условиях градиентного элюирования, скорость подвижной фазы 1 мл/мин, мертвый объем ^>=2,1 в семенах конского каштана обыкновенного

Соединение Параметры линейности Коэффициент корреляции

Диапазон линейных концентраций, мг/мл Уравнение регрессии или уравнение сглаживающей прямой (а = 320,95; Ь = 0,086 с прибора)

Эсцин 0,02-0,2 8 = 320,95*С + 0,086 0,9998

Рис. 6 Калибровочный график раствора эсцина-стандартного образца.

На основании полученных результатов можно утверждать, что соблюдается линейная зависимость между величинами площадей хроматографических пиков и содержанием эсцина в рабочем интервале, который можно определить как аналитическую область методики.

Точность (правильность) методики показывает систематические погрешности метода. Для проверки отсутствия систематической ошибки методики были поставлены эксперименты с добавками эсцина непосредственно к сырью перед началом экстракции (таблица 4).

Таблица 4

Результаты опытов с добавками эсцина в навеску сырья_

Найдено эсцина в Добавлено Должно быть, г Найдено, г Относительная

сырье, г эсцина, г ошибка, %

0,0460 0,0051 0,0511 0,0507 -0,78

0,0463 0,0042 0,0505 0,0510 + 0,99

0,0461 0,0055 0,0516 0,0508 -1,55

Диапазон применения методики составляет для количественного определения сырья от 80 % до 120 %.

По результатам валидации установлено, что приведенная методика является специфичной для определения содержания эсцина в сырье конского каштана обыкновенного, характеризуется корректной точностью и воспроизводимостью, линейной зависимостью, что позволяет использовать ее для достоверной оценки качества семян конского каштана обыкновенного. ~

Разработка нормативной документации на семена конского каштана обыкновенного В результате анализа 5 опытных партий высушенного сырья конского каштана обыкновенного установлены нормы его числовых показателей: содержание эсцина не менее 4 %; влажность не более 12%; содержание золы общей не более 2,5 %; содержание золы, нерастворимой в 10 % растворе кислоты хлористоводородной, не более 2 %; содержание других частей растения (околоплодника, плодоножек, веточек, листьев), в том числе отделенных при анализе, не более 0,5 %; частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 3 мм не более 1 %, содержание органической примеси не более 3 % и минеральной примеси не более 0,5 %, микробиологическая (по ОФС 42-0016-04) и радиоактивная (по ОФС 41-001-03) чистота.

На основании проведенных исследований зарегистрирован и утвержден в ВИЛАР новый вариант технических условий ТУ 9377-075-04868244-2008 «Семена конского каштана обыкновенного». Установлен срок годности сырья - 3 года.

Фитохимическое изучение семян конского каштана обыкновенного

Изучение качественного и количественного состава некоторых групп БАС семян По результатам проведенного фитохимического анализа в соответствии с данными литературы в семенах установлено наличие следующих групп БАС: ТГ (эсцин), флавоноидов и кумаринов, полисахаридов, моно- и дисахаридов,

свободных аминокислот, липидов.

Изучение содержания эсцина проводили описанными ранее методиками ТСХ и ВЭЖХ.

Гравиметрическим методом по ГФ XI (вып. 2, С. 264-267) в семенах конского каштана обыкновенного установлено 41,62 % полисахаридов.

При хроматографировании в системе (хлороформ-метанол-вода, 26:14:3), на пластинках силуфола или сорбфила, с последующей обработкой раствором диазобензолсульфокислоты или 20 % спиртовым раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты, а также при просмотре хроматограмм в УФ-свете при длине волны 366 нм и 254 нм обнаруживаются пятна с Rf 0,91 (фраксин); 0,86 (эскулин), 0,4 (рутин).

Идентификацию и количественное определение моно- и дисахаридов семян конского каштана обыкновенного проводили методом ВЭЖХ, используя внешние стандарты. Установлено, что семена конского каштана обыкновенного содержат фруктозу (0,3 %), глюкозу (0,32 %) и сахарозу (6,36 %); галактозы,

1 - фруктоза, 2 - глюкоза, 3 - сахароза

В связи с отсутствием в литературе сведений об аминокислотном составе семян конского каштана обыкновенного и значимости этой группы БАС нами исследован качественный состав и определено количественное содержание аминокислот методом ВЭЖХ с предколоночной дериватизацией ортофталевым альдегидом в присутствии меркапто-пропионовой кислоты (ОРА-реагент). Рассчет проводят методом абсолютной калибровки. Полученные результаты анализа свободных аминокислот в пересчете на сухое сырье приведены на рисунке 7 и в таблице 5.

Таким образом, обнаружено 15 аминокислот, из которых 5 (метионин, валин, лейцин, изолейцин, лизин) являются незаменимыми для организма человека. Преобладающими свободными аминокислотами по количественному содержанию являются треонин, аланин и аргинин, вдвое меньше содержится аспарагиновой и глутаминовой кислот, еще вдвое меньше которых лизин.

С целью изучения липофильных веществ семян конского каштана обыкновенного нами получено гексановое извлечение путем экстракции навески сырья (10 г) в аппарате Сокслета при температуре (40±5) °С.

Рис. 7. ВЭЖ-Хроматограмма свободных аминокислот семян конского каштана обыкновенного

Таблица 5

Характеристика ВЭЖ-хроматограммы свободных аминокислот в семенах конского каштана обыкновенного

№ Аминокислоты Время Содержание аминокислоты в 100 г

п/п удерживания сырья, мг

1. 5-гидрокситрнптофан 9,02 -

2. Алании 7,64 1,29

3. Аргинин 7,92 1,63

4. Аспарагин 3,72 -

5. Аспарагиновая кислота 1,35 0,67

6. Цнтруллин 6,81 -

7. Циспш 10,92 0,26

8. Глутаминовая кислота 1,66 0,76

9. Глутамин 5,47 -

10. Глицин 5,97 0,03

11. Гнстндинамоногидрат 5,79 0,26

12. Изолейцин 13,06 0,16

13. Лейцин 13,71 0,16

14. Лизина гидрохлорид 14,43 0,36

15. Метионнн 11,47 0,08

16. Орнитин 13,39 -

17. Фенилаланин 12,82 -

18. Пролин 17,89 -

19. Серии 4,85 0,23

20. Таурин 7,78 -

21. Треонин 6,33 1,45

22. Тирозин 9,61 0,19

23. Триптофан 12,61 -

24. Валин 11,23 0,25

25. Суммарное содержание 6,78

Гексановое извлечение упаривали под вакуумом, и полученный остаток (0,61 г) анализировали методами денситометрии и ГЭЖХ. Полученный остаток представлял собой маслянистую, легкоподвижную, мутную жидкость

зеленовато-желтого цвета с коэффициентом преломления [1,4728]022 с, относящуюсяся к полувысыхающим маслам.

Определение группового состава липидов семян проводили методом ТСХ на пластинках «БПи1Ы» с закрепленным слоем силикагеля. Пластинку предварительно смачивают в 2%-ном растворе фосфорномолибденовой кислоты в ацетоне. На пластинку наносится около 10 мкг липидов в эфирном растворе в виде полосы длиной 10 мм. Проявление хроматограммы проводят в системе растворителей гексан: диэтиловый эфир: уксусная кислота - 80:30:1,5. Пластинку высушивают на воздухе до исчезновения запаха растворителей и помещают в шкаф с принудительной вентиляцией при температуре 80 °С до появления синих пятен отдельных групп липидов на желтом фоне. Идентификацию отдельных групп липидов проводят сравнивая значения стандартных веществ с 11г пятен на хроматограмме.

Таблица 6

Групповой состав липофильных веществ семян конского каштана обыкновенного

Наименование групп липидов Содержание, %

Полярные липиды 0,7

Стерины 1,8

Свободные жирные кислоты 35,7

Триацилглицерины 58,5

Эфиры стеринов 3,3

Количественное определение отдельных групп липидов проводили денситометрическим методом на приборе «Хромоскан 200». Групповой состав липидов представлен в таблице 6. Расчет количества отдельных групп липидов проводили методом внутренней нормализации с использованием поправочных коэффициентов.

ел «С ГУ*> »»1Л-.

а» « « «и

«ж т а> т.

^ <и N. «».

Ою« <00 « «Чо

№ы>Гч Г^Ч К N ■*>

£ В«"»- в ^ Г- -- ГЧ-. гч .

1 » ? ~ »^

а Ч

Рис. 8. Хроматограмма МЭЖК семян конского каштана обыкновенного

Таблица 7.

Содержание МЭЖК в семенах конского каштана обыкновенного

№ п/п Метиловые эфиры ЖК Индекс ЖК Содержание в сумме, %

1 Капроновая 6:0 0,01

2 Каприловая 8:0 0,02

3 Каприновая 10:0 0,03

4 Лауриновая 12:0 0,08

5 Миристиновая 14:0 0,23

6 Пентадекановая 15:0 0,04

7 Пентадеценовая 15:1 0,04

8 нзо-гексадекановая 16:01 0,03

9 Пальмитиновая 16:0 10,00

10 Гексадеценовая 16:1 0,05

И Пальмитолеиновая 16:1 9-цис 0,34

12 Гексадекадиеновая 16:2 0,03

13 Маргариновая 17:0 0,36

14 Гептадеценовая 17:1 0,14

15 шо-октадекановая I8:0i 0,04

16 Стеариновая 18:0 2,87

17 Элаидиновая 18:1 9-транс 0,03

18 Олеиновая 18:1 9-Цис 43,40

19 Вакценовая 18:1 11 -транс 0,49

20 изо -октадекадиеновая 18:21 0,19

~ 21 Линолевая 18:2 29,86

22 у-линоленовая 18:3 ш-6 1,26

23 а-линоленовая 18:3 ю-3 0,66

24 Паринаровая 18:4 0,07

25 Арахиновая 20:0 0,14

26 Гондоиновая 20:1 4,82

27 Эйкозадпеновая 20:2 0,13

28 Бегсновая 22:0 0,20

29 Эруковая 22:1 2,65

30 Лигноцериновая 24:0 0,14

31 Тетракозеиовая 24:1 1,62

Определение состава жирных кислот проводили методом ГЖХ. Метиловые эфиры получают методом переэтерификации жиров метанолом в присутствии хлористого водорода (рис.8 и табл. 7). Таким образом, в жирном масле семян конского каштана обыкновенного (6,1 % от сырья) преобладают: олеиновая кислота (43,4 % от суммы кислот), линолевая кислота (29,7 % от суммы кислот) и пальмитиновая кислота (10,0 % от суммы кислот).

Установлено присутствие и оценено содержание микро- и макроэлементов в семенах конского каштана обыкновенного. В результате установлено, что преобладающим по содержанию в золе является калий, селен, бор и марганец.

Разработка способа получения конского каштана обыкновенного семян экстракта сухого

Разработка способа получения сухого экстракта При разработке противоварикозного средства на основе семян конского

каштана обыкновенного нами предложен способ получения сухого экстракта, поскольку данный способ переработки ЛРС является наиболее рациональным, обеспечивающих максимальное извлечение действующих веществ и возможность создания стандартизованного фитопрепарата.

Технологическая схема получения конского каштана обыкновенного семян экстракта сухого (рисунок 9) предусматривает стадии твердофазной экстракции, упаривания полученного извлечения, жидкофазной экстракции и сушки очищенного концентрированного экстракта.

Для определения оптимальных условий стадии экстракции нами изучено влияние экстрагента, температурного режима, соотношения сырье-экстрагент, времени и кратности экстракции на выход БАС. Экспериментально установлено, что оптимальным является проведение трехкратной экстракции (в течение 2 ч каждая) сырья с размером частиц не более 3 мм в соотношении 1:5, при использовании в качестве экстрагента 70 % спирта с нагреванием до (60±5)°С, последующей отгонкой полученных извлечений этилового спирта с добавлением бутанола (в качестве пеногасителя), затем двухкратной жидкофазной обработкой водного остатка этилацетатом в соотношении объемов водной и органической фаз 1:2 и, наконец, обезвоживанием водного слоя. Все подобранные параметры процесса экстракции были положены в основу проведения серии балансовых загрузок в лабораторных условиях. Анализ готового продукта и отходов производства (шрот, липофильная фракция) осуществляли по эсцину разработанным методом ВЭЖХ._

Спирт ЭТИЛОВЫЙ Вода очищенная

Приготовление 70 % этилового спирта и экстракция измельченного сырья 1

Неизмельченные семена конского каштана обыкновенного

Фильтрация экстракта

Концентрирование экстракта

Этил-ацетат

Очистка этилацетатом концентрированного экстракта: отгонка этилацетата

Сушка очищенного экстракта

Измельчение экстракта сухого

Измельчение растительного сырья

Потери

Получение готового продукта

Шрот

Отгон спирта

Масляный экстракт балластных веществ

Фасовка, упаковка, маркировка экстракта сухого

Отгон этилацетата

Потери

Рис. 9. Технологическая схема получения конского каштана обыкновенного семян экстракта сухого На основании проведенных загрузок составлен и утвержден лабораторный

регламент на производство конского каштана обыкновенного семян экстракта сухого № ЛР 04868244-02-08.

Изучение физических свойств сухого экстракта Готовый продукт - конского каштана обыкновенного семян экстракт сухой представляет собой аморфный гигроскопичный порошок желто-коричневого цвета со специфическим запахом. С целью характеристика сухого экстракта как технологической субстанции изучены его технологические свойства: насыпная масса при свободном падении 0,66 г/см3, насыпная масса при уплотнении 0,83 г/см3, сыпучесть - 6,0 г/с, угол естественного откоса 32°.

Конского каштана обыкновенного семян экстракт сухой, полученный нами по разработанному способу технологии, при фармакологических исследованиях, проведенных на различных моделях, показал выраженную противовоспалительную и антиэкссудативную активность.

Разработка показателей для контроля качества конского каштана обыкновенного семян экстракта сухого

Изучение качественного состава БАС сухого экстракта В ходе исследования качественного состава БАВ в сухом экстракте с применением ТСХ и ВЭЖХ установлено наличие ТГ (эсцина), флавоноидов и кумаринов, моно- и дисахаридов, свободных аминокислот.

Методом ТСХ, путем сравнения со стандартными образцами, в сухом экстракте обнаружены флавоноиды (рутин) и кумарины (эскулин и фраксин).

Изучение полисахаридов сухого экстракта проводили по методикам, использованным для семян конского каштана обыкновенного. Проведенный анализ по реакции осаждения 96 % спиртом с водным раствором экстракта показал практическое отсутствие этих веществ в экстракте.

Наличие и количественный состав моно- и дисахаридов - фруктозы, глюкозы и сахарозы - экстракта конского каштана обыкновенного определены методом ВЭЖХ, аналогично таковому в сырье (рисунок 10), количество которых составило 1,48 %; 1,16 % и 42,5 % соответственно.

Исследование аминокислотного состава экстракта сухого проводили методом ВЭЖХ по методике анализа аминокислот в семенах. Обнаружено 15 аминокислот, 5 из них (метионин, валин, лейцин, изолейцин, лизин) относятся к незаменимым для организма человека. Так же как и в сырье доминирующими в экстракте являются треонин, аланин и аргинин (рис. 11 и табл. 8).

Поскольку при получении конского каштана обыкновенного семян экстракта сухого использовалась стадия удаления липофильных веществ жидкофазной экстракцией с этилацетатом, то в готовом экстракте эти соединения находятся в минорном количестве. Однако методом ГЖХ в очень концентрированном гексановом растворе экстракта удалось идентифицировать 17 МЭЖК, обнаруженных ранее в исходном сырье, среди которых преобладали олеиновая и линоленовая кислоты.

Л' Хг 31- ¡

15- l(h Jr • i 2 3 S! ^ í- 1 4 5 6 7 8 9 10 11 ¿2 13 14 15 16 17 № 4i и

Piic. 10. Хроматограмма ВЭЖХ moho- и дисахаридов конского каштана ___обыкновенного семян экстракта сухого_

F I.D1 A. E»-34U. En »4;iCi. TT (2?0Н11Л(М OWHKIO 0)

LU ■ « i i s

300- ¡i í! 1 Íí

200 si k 11

100 0- \w\ _и i л* h¡ til mj 1 !i i <i h¡ íl ... 4 , 1 ií ! | , l| i ! | gf я 1JJÍÁ i £ i Л i ! К

7 1П i* 17S Tí) ' mi,

Рис. 11. Хроматограмма свободных аминокислот в сухом экстракте семян конского каштана обыкновенного

Таблица 8

Содержание свободных аминокислот в сухом экстракте семян конского каштана обыкновенного

Аминокислота Содержание аминокислот в 100 г сухого экстракта, г

Аспарагиновая кислота 1,19

Глутаминовая кислота 1,16

Серии 0,48

Гистидин 0,40

Глицин 0,03

Треонин 1,80

Алании 2,69

Аргинин 1,89

Тирозин 0,22

Цистин 0,38

Валин 0,46

Метионин 0,07

Изолейцин 0,22

Лейцин 0,21

Лизин 0,34

Суммарное содержание 11,56

В наших исследованиях показано, что состав микро- и макроэлементов существенно не различается в сырье и сухом экстракте.

Химическое изучение сухого экстракта показало, что состав основных действующих БАВ экстракта аналогичен таковому в нативном сырье.

Разработка критериев установления подлинности и методики количественного определения действующих веществ Нами разработаны критерии подлинности для сухого экстракта: качественная реакция и ТСХ для подтверждения присутствия ТГ (эсцина). В ходе исследований подобраны условия анализа экстракта, и разработана методика ВЭЖХ для количественного определения в нём эсцина (рис. 12). Методика провалидирована. Специфичность по показателю И, находится в пределах допустимых значений (0,6-1,2). Прецизионность (воспроизводимость): стандартное отклонение Б (0,86461), относительное стандартное отклонение КБ (5,12 %). Точность - отсутствие систематической ошибки, подтверждено в опытах с добавками эсцина непосредственно к навеске сухого экстракта (таблица 9).

Таблица 9

Результаты опытов с добавками эсцина в навеску сухого экстракта_

Найдено эсцина в Добавлено Должно быть, г Найдено, г Относительная

сухом экстракте, г эсцина, г ошибка, %

0,0332 0,0128 ~ 0,0460 0,0458 -0,44

0,0306 0,0151 0,0457 0,0466 1,93

0,0355 0,0113 0,0468 0,0462 -1,29

сухого: 1,2, 3,4 - эсцин 1а, эсцин 1Ь, изоэсцин 1а, изоэсцин 1Ь

Метрологические характеристики методики количественного определения эсцина рассчитаны на основании анализа одного образца экстракта в 10 независимых повторностях и представлены в таблице 10. Относительная

ошибка единичного определения с 95 % вероятностью составляет ± 4,48 % (воспроизводимость методики).

Таблица 10

Метрологические характеристики методики количественного определения _эсцина в конского каштана обыкновенного экстракте сухом_

р X Б Р,% КГ.Р) ДХ Е,%

9 16,90 0,74755 0,86461 95 2,78 0,7578 ±4,48

Относительная ошибка результатов опытов с добавками не превышает относительную ошибку единичного определения и имеет отклонения в сторону как положительных, так и отрицательных значений, что свидетельствуют об отсутствии систематической ошибки в процессе предлагаемой методики анализа. Методика полностью отвечает критериям валидации.

С помощью разработанной методики проанализированы 5 серий сухого экстракта, наработанных в лабораторных условиях. Содержание эсцина в экстракте составило: 17,77%; 16,26; 17,89 %; 16,91 %; 16,64 %. Данная методика включена в ЛР получения сухого экстракта, норму по этому показателю предлагается установить не менее 15 %. Изучена стабильность сухого экстракта и предложен срок годности этой субстанции - 2 года.

Разработка нормативной документации на сухой экстракт На основании проведенных экспериментов разработан и оформлен с учетом современных требований стандартизации к экстрактам сухим проект ФС «Конского каштана обыкновенного семян экстракт сухой». Проект ФС включает следующие разделы: описание, подлинность, потеря в массе при высушивании, тяжелые металлы, микробиологическая чистота, количественное определение эсцина и норма, упаковка, маркировка, хранение, срок годности.

ВЫВОДЫ

1. Установлены морфолого-анатомические диагностические признаки измельченных семян конского каштана обыкновенного.

2. С использованием комплекса физико-химических методов анализа изучен качественный состав семян конского каштана обыкновенного. По результатам количественного анализа определен состав основных групп БАС. Содержание полисахаридов составило 41,62%, углеводов — 6,98%, аминокислот - 0,01 %, липидов 6,1 %. Установлен микроэлементный состав.

3. Разработана методика количественного определения ТГ с использованием метода ВЭЖХ в семенах конского каштана обыкновенного. Проведение валидации методики позволило подтвержить ее пригодность. Норма содержания эсцина не менее 4 %.

4. На основании, проведенных исследований разработаны и утверждены ТУ 9377-075-04868244-2008 «Конского каштана обыкновенного семена».

5. Установлены основные параметры экстракции эсцина, позволяющие получить готовый продукт со стабильными показателями качества. Разработан и утвержден ЛР 04868244-02-08 на производство конского каштана обыкновенного семян экстракта сухого.

6. В сухом экстракте из семян конского каштана тритерпеновым гликозидам сопутствуют углеводы, аминокислоты, липиды, макро- и микроэлементы, комплекс которых аналогичен таковому в семенах конского каштана обыкновенного. Содержание углеводов составило 45,14 %, аминокислот -0,0012 %, липидов 0,02 %.

7. Определены показатели качества и критерии подлинности конского каштана обыкновенного семян экстракта сухого. Разработана валидированная методика количественного определения содержания эсцина в сухом экстракте с использованием метода ВЭЖХ. Установлена норма содержания эсцина - не менее 15 %. На основании проведенных исследований составлен проект ФС «Конского каштана обыкновенного семян экстракт сухой».

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Жарова О.Г. Сравнительное фитохимическое исследование различных органов каштана конского / Сборник тезисов докладов 69-ой итоговой конференции СНО под редакцией A.A. Лебедева. - Самара: 2001. - С. 46-47.

2. Жарова О.Г. Хроматографическое исследование препаратов на основе семян каштана конского / Сборник тезисов докладов 70-ой итоговой конференции СНО под редакцией A.A. Лебедева. - Самара: 2002. - С. 53-54.

3. Жарова О.Г. Сравнительное хроматографическое исследование препаратов на основе семян каштана конского / Тезисы XXVIII Самарской областной студенческой научной конференции. - Самара: 2002. - С. 117.

4. Жарова О.Г. Перспективы создания новых лекарственных средств на основе сырья каштана конского / Матер1али III КИжнародноУ конференшУ студент!в та молодих вчених «Медицина - здоров'я XXI стор1ччя». - Днепропетровск: 2002. - С. 247-248.

5. Куркин В.А., Жарова О.Г. Фитохимическое исследование новых препаратов на основе семян каштана конского / Материалы VI Международного съезда Фитофарм-2002 «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения». - С.-П.: 2002. - С. 248-250.

6. Жарова О.Г. Сравнительное хроматографическое исследование препаратов на основе семян каштана конского / Тезисы М1жнародна науково-практична конференщя молодих вчених «Вчеш майбутнього». - Одесса: 2002. - С. 4546.

7. Жарова О.Г. Разработка подходов к стандартизации сырья и препаратов на основе семян каштана конского / Сборник тезисов докладов 71-ой итоговой конференции СНО под редакцией A.A. Лебедева. - Самара: 2003. - С. 68.

8. Жарова О.Г. Фитохимический и фармакоэкономический анализ ангиопротекторных и венотонизирующих препаратов на основе сырья каштана конского / Материалы Российской научно-практической конференции «Рациональное использование лекарств». - Пермь: 2004. - С. 36-37.

9. Жарова О.Г., Куркин В.А., Петрухина И.К. Организационно-экономи-

ческий анализ ангиопротекторных препаратов в России / Материалы VIII Международного съезда Фитофарм-2004 «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения». -Финляндия, Миккели: 2004. - С.95-100.

Ю.Жарова О.Г. К вопросу о целесообразности использования препаратов каштана конского в медицинской практике (обзор) // Аспирантский Вестник Поволжья. - 2004. - № 1. - С. 20-22.

П.Жарова О.Г., Шемерянкина Т.Б., Савина A.A., Сокольская Т.А. Разработка технологии получения сухого экстракта семян конского каштана обыкновенного {Aesculus hippocastanum 1.) и его стандартизация // Вестник Российского университета дружбы народов. - 2008. - № 7. - С. 605-609.

12. Жарова О.Г., Шейченко В.И., Сокольская Т.А., Вандышев В.В. Изучение липидов семян конского каштана обыкновенного (Aesculus hippocastanum 1.) // Вестник Российского университета дружбы народов. - 2008. - № 7. - С. 609-614.

13.Жарова О.Г., Сокольская Т.А., Вандышев В.В. Морфолого-анатомическое изучение семян конского каштана обыкновенного // Фармация. - 2009. - № 1. -С. 18-21.

 
 

Оглавление диссертации Жарова, Олеся Глебовна :: 2009 :: Москва

ОГЛАВЛЕНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ИССЛЕДОВАНИЙ В ОБЛАСТИ СТАНДАРТИЗАЦИИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ НА ОСНОВЕ ТРИТЕРПЕНОВЫХ ГЛИКОЗИДОВ.

1.1 Тритерпеновые гликозиды лекарственных растений, методы идентификации, анализа и выделения.

1.1.1 Общая характеристика, классификация и химическое строение ТГ.

1.1.2 Физико-химические свойства ТГ.

1.1.3 Идентификация ТГ.

1.1.3.1 Химические и биологические методы.

1.1.3.2 Хроматографическое обнаружение.

1.1.3.3 ЯМР и масс- спектроскопия.

1.1.3.4 ИК-спектроскопия.

1.1.3.5 УФ-спектроскопия.

1.1.4 Количественное определение ТГ.

1.1.4.1 ВЭЖХ-анализ в определении ТГ.

1.1.5 Способы выделения ТГ из лекарственного растительного сырья.

1.1.6Распространение в природе ТГ.

1.2 Современные подходы к технологии получения сухих экстрактов из ЛРС.

1.3 Ботаническая характеристика конского каштана обыкновенного.

1.4 Химический состав семян конского каштана обыкновенного.

1.5 Стандартизация качества сырья и препаратов из семян конского каштана обыкновенного.

1.6 Применение препаратов на основе семян конского каштана обыкновенного в медицине.

1.6.1 Фитотерапия ХВН. Номенклатура, состав, показатели качества венотонизирующих лекарственных средств растительного происхождения.

1.6.1.1 Растительные препараты, содержащие тритерпеновые гликозиды и другие сапонины. Применение конского каштана в медицине.

1.6.1.2 Номенклатура биологически активных добавок к пище (БАД) растительного происхождения, способствующие нормализации периферического (капиллярного) кровообращения и улучшению состояния сосудов нижних конечностей.

1.6.2 Фармакологические свойства препаратов семян конского каштана обыкновенного.

1.7 Организационно-экономическое обоснование целесообразности создания отечественных препаратов на основе семян конского каштана обыкновенного

Выводы к главе 1.

ЧАСТЬ II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Объекты, материалы и методы исследования.

ГЛАВА 2. СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКИХ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ МЕТОДОВ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА СЕМЯН КОНСКОГО КАШТАНА ОБЫКНОВЕННОГО.

2.1 К фармакогнозии семян конского каштана обыкновенного и установление методов определения подлинности семян.

2.1.1 Исследование морфологических признаков семян.

2.1.2 Исследование микроскопических признаков цельных и измельченных семян.

2.1.3 Установление подлинности семян.

2.2 Разработка методики количественного определения ТГ. в сырье.

2.2.1 Подбор хроматографических условий разделения эсцина.

2.2.2Подбор оптимальных условий пробоподготовки семян.

2.2.3 Методика количественного определения эсцина в семенах.

2.2.4 Валидация методики количественного определения эсцина с использованием метода ВЭЖХ.

2.3 Изучение стабильности сырья в процессе хранения.

2.4 Обоснование номенклатуры и норм числовых показателей.

2.5 Разработка нормативной документации на сырье.

Выводы к главе 2.

ГЛАВА 3. ФОТОХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ СЕМЯН КОНСКОГО КАШТАНА ОБЫКНОВЕННОГО.

3.1 Изучение качественного и количественного состава некоторых групп БАС семян.

3.1.1 Тритерпеновые гликозиды.

3.1.2Флавоноиды и кумарины.

3.1.3 Углеводы.

3.1.3.1 Полисахариды.

3.1.3.2 Моно- и дисахариды.

3.1.4 Аминокислоты.

3.1.5 Липофильные вещества.

3.2 Макро- и микроэлементный состав.

Выводы к главе 3.

ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА СПОСОБА ПОЛУЧЕНИЯ СУХОГО ЭКСТРАКТА ИЗ СЕМЯН КОНСКОГО КАШТАНА ОБЫКНОВЕННОГО.

4.1 Разработка способа получения сухого экстракта.

4.2 Изложение технологического процесса получения сухого экстракта.

4.3 Характеристика конечного продукта производства.

Выводы к главе 4.

ГЛАВА 5. РАЗРАБОТКА ПОКАЗАТЕЛЕЙ КАЧЕСТВА КОНСКОГО

КАШТАНА ОБЫКНОВЕННОГО ЭКСТРАКТА СУХОГО.

5.1 Изучение качественного состава БАС в сухом экстракте.

5.1.1 Тритерпеновые гликозиды.

5.1.2Флавоноиды и кумарины.

5.1.3 Углеводы.

5.1.4 Аминокислоты.

5.1.5 Липофильные вещества.

5.2 Изучение микроэлементного состава.

5.3 Разработка методов установления подлинности.

5.4 Разработка количественное определение ТГ.

5.5 Разработка проекта НД на субстанцию «Конского каштана обыкновенного семян экстракт сухой».

Выводы к главе 5.

 
 

Введение диссертации по теме "Фармацевтическая химия и фармакогнозия", Жарова, Олеся Глебовна, автореферат

Актуальность темы

В настоящее время среди населения наблюдается значительный рост сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ), в том числе, хронической венозной недостаточности (ХВН). На сегодняшний день варикозная болезнь нижних конечностей является самой распространенной патологией периферических сосудов. Согласно эпидемиологическим данным различные формы этого заболевания встречаются у 26-38 % женщин и у 10-20% мужчин трудоспособного возраста. Ежегодный прирост новых случаев заболевания у жителей индустриально развитых стран достигает 2,6 % среди женщин и 1,9 % среди мужчин. Специалисты связывают это с ухудшением экологии, увеличением частоты стрессовых ситуаций, употреблением спиртных напитков, курением, малоподвижным образом жизни, статическими перегрузками. По возрастным особенностям ССЗ имеют тенденцию к омоложению.

Варикозная болезнь является не только косметической проблемой: варикотромбофлебиты, трофические нарушения кожи, язвы значительно снижают трудоспособность, нарушают социальную адаптацию и качество жизни больных, а также может привести к инсульту, инфаркту миокарда и тромбоэмболии легочных артерий, которые чреваты летальным исходом. Именно поэтому лечение венозной недостаточности нужно начинать с самых ранних доклинических стадий развития заболевания. К сожалению, для большинства пациентов, да и врачей, необходимость лечения ХВН ассоциируется с осложненными формами заболевания уже на поздних его стадиях, когда реальную помощь больному может оказать только хирург. Вместе с тем, это заболевание на ранних стадиях является исключительно терапевтической проблемой, требующей только своевременного лечения.

До сих пор не создано универсальных препаратов для лечения ХВН. Спектр действия большинства из них достаточно узок (декстраны влияют на реологию крови, антиагреганты уменьшают агрегационную активность тромбоцитов, венотоники улучшают тонус венозной стенки). Для достижения оптимального лечебного эффекта врачам приходится применять несколько препаратов разных фармакотерапевтических групп. Таким образом, идеальный препарат для лечения ХВН должен воздействовать на как можно большее количество патогенетических звеньев заболевания, при этом иметь минимальный перечень побочных эффектов и высокую биодоступность. Именно растительные препараты наиболее полно отвечают этим требованиям.

Номенклатура этих лекарственных средств чаще всего представлена импортными препаратами на основе сырья конского каштана обыкновенного (Анавенол, Венитан, Эскузан, Эссавен-гель, Веноплант и другие), составляющих 70 % рынка ангиопротекторных и венотонизирующих средств. В России процент таких средств ничтожно мал. В связи с этим целесообразно вести разработки новых фитопрепаратов с венотонизирующими свойствами.

Венотонизирующее и ангиопротекторное действие большинства из известных фитопрепаратов обусловлено тритерпеновыми гликозидами (ТГ) семян конского каштана обыкновенного.

В последние годы фармацевтическими субстанциями служат экстракты, полученные из растительного сырья с использованием специальной технологии и стандартизованные по основным биологически активным соединениям (БАС). Учитывая вышеприведенные факты, представляется актуальной разработка эргономичных и валидированных методик контроля качества ЛРС конского каштана обыкновенного и получаемых на его основе субстанций.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы является фармакогностическое и фитохимическое изучение семян конского каштана обыкновенного, разработка способа получения из них сухого экстракта и внедрение современных методик стандартизации качества этого сырья и субстанции.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- изучить морфолого-анатомические признаки измельченных и цельных семян конского каштана обыкновенного и выявить наиболее диагностически значимые из них;

- разработать методики качественного и количественного анализа ТГ (эсцина) для оценки качества семян конского каштана;

- разработать и оформить проект нормативного документа на семена конского каштана - технические условия (ТУ);

- исследовать химический состав некоторых групп БАС в семенах конского каштана обыкновенного;

- разработать способ получения сухого экстракта из семян конского каштана, изучить его технологические свойства и оформить лабораторный регламент (ЛР) технологии его производства;

- разработать показатели и их нормы для контроля качества конского каштана семян экстракта сухого;

- разработать и оформить проект нормативного документа на конского каштана семян экстракт сухой - проект фармакопейной статьи (ФС).

Научная новизна работы

На основании макро- и микроскопического анализа выявлены диагностические признаки в анатомическом строении тканей измельченных семян конского каштана обыкновенного, предложены методики пробоподготовки для установления подлинности измельченных и цельных семян конского каштана методом микроскопии, что подтверждено оригинальными микрофотографиями.

Подобраны и отработаны условия проведения анализа ТГ (эсцина) в сырье и конского каштана семян экстракте сухом. Впервые разработаны унифицированные физико-химические методики как для контроля качества сырья, так и субстанции.

Впервые изучен качественный состав основных групп БАС (ТГ, флавоноидов и кумаринов, полисахаридов, моносахаридов, аминокислот, липидов и микроэлементов) в семенах конского каштана обыкновенного, произрастающего в Подмосковье.

Впервые изучено содержание ТГ, полисахаридов, моно- и дисахаридов, аминокислот, липидов и микро- и макроэлементов в сырье и сухом экстракте из него.

Подобраны параметры технологии получения сухого экстракта из семян конского каштана и разработан способ получения конского каштана обыкновенного семян экстракта сухого, который оформлен в виде JIP.

С учетом современных требований к стандартизации ЛРС и экстрактам сухим разработаны критерии для установления подлинности и контроля качества семян и сухого экстракта из них конского каштана обыкновенного.

Практическая значимость работы

На основании проведенных исследований разработаны и утверждены:

- Технические условия ТУ 9377-075-04868244-2008 «Конского каштана обыкновенного семена».

- Проект ФС «Конского каштана обыкновенного семян экстракт сухой».

- Лабораторный регламент ЛР 04868244-02-2008 на производство конского каштана обыкновенного семян экстракта сухого.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

- Результаты фармакогностического исследования цельных и измельченных семян конского каштана обыкновенного.

- Результаты разработки способа получения конского каштана обыкновенного семян экстракта сухого.

- Результаты фитохимического изучения состава БАВ семян и получаемого на их основе сухого экстракта.

- Результаты разработки методик для стандартизации и контроля качества семян и получаемого на их основе сухого экстракта.

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на международных научно-практических конференциях, конгрессах, съездах: 69-ой итоговой конференции СНО (Самара, 2001), 70-ой итоговой конференции СНО (Самара, 2002), XXVIII Самарской областной студенческой научной конференции (Самара, 2002), 1УНжнародноТ конференци студентов та молодих вчених «Медицина - здоров'я XXI стор!ччя» (Днепропетровск, 2002), VI Международном съезде Фитофарм-2002 «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» (С.-П., 2002), М1жнародна науково-практична конференци молодих вчених «Вчеш майбутнього» (Одесса, 2002), 71-ой итоговой конференции СНО (Самара, 2003), X Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2003), Российской научно-практической конференции «Рациональное использование лекарств» (Пермь, 2004), VIII Международном съезде Фитофарм-2004 «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» (Финляндия, Миккели, 2004), IX Международном конгрессе «Здоровье и Образование в XXI веке» (Москва, 2008). Сданы в печать три ВАК статьи.

Связь задач исследований с проблемным планом НИР

Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ ВИЛАР по «Программе фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса РФ на 2006-2010 гг.», задание 04, шифр 04.13 «Разработка технологий производства высокоэффективных лечебных и профилактических препаратов из растительного сырья».

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 13 научных работ в научных журналах, сборниках международных конференций и научных трудах.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 150 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы (глава 1), четырех глав экспериментальной части, выводов, списка литературы, включающего 208 источника, в том числе 78 иностранных, 9 приложений. Работа содержит 24 рисунка и 31 таблицу.

 
 

Заключение диссертационного исследования на тему "Стандартизация конского каштана обыкновенного (Aesculus hippocastanum L.) семян и экстракта сухого на их основе"

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Установлены морфолого-анатомические диагностические признаки измельченных семян конского каштана обыкновенного.

2. С использованием комплекса физико-химических методов анализа изучен качественный состав семян конского каштана обыкновенного. По результатам количественного анализа определен состав основных групп БАС. Содержание полисахаридов составило 41,62 %, углеводов - 6,98 %, аминокислот - 0,01 %, липидов 6,1 %. Установлен микроэлементный состав.

3. Разработана методика количественного определения ТГ с использованием метода ВЭЖХ в семенах конского каштана обыкновенного. Проведение валидации методики позволило подтвердить ее пригодность. Норма содержания эсцина не менее 4 %.

4. На основании проведенных исследований разработаны и утверждены ТУ 9377-075-04868244-2008 «Конского каштана обыкновенного семена».

5. Установлены основные параметры экстракции эсцина, позволяющие получить готовый продукт со стабильными показателями качества. Разработан и утвержден ЛР 04868244-02-08 на производство конского каштана обыкновенного семян экстракта сухого.

6. В сухом экстракте из семян конского каштана тритерпеновым гликозидам сопутствуют углеводы, аминокислоты, липиды, макро- и микроэлементы, комплекс которых аналогичен таковому в семенах конского каштана обыкновенного. Содержание углеводов составило 45,14%, аминокислот -0,0012 %, липидов 0,02 %.

7. Определены показатели качества и критерии подлинности конского каштана обыкновенного семян экстракта сухого. Разработана валидированная методика количественного определения содержания эсцина в сухом экстракте с использованием метода ВЭЖХ. Установлена норма содержания эсцина - не менее 15 %. На основании проведенных исследований составлен проект ФС «Конского каштана обыкновенного семян экстракт сухой».

 
 

Список использованной литературы по фармакологии, диссертация 2009 года, Жарова, Олеся Глебовна

1. Азизов М. А. О комплексных соединениях некоторых микроэлементов с биоактивными веществами, 2 изд. Таш.: Медицина, 1969 г. - С. 36.

2. Акопов И.Э. Важнейшие отечественные лекарственные растения и их применение. М.: Медицина УзССР. - 1986г. - 177 с.

3. Аксенов Е., Аксенова Н. Декоративные растения. Энциклопедия природы России. М.: ABF, 1997. - Т. 1. - 560 с.

4. Альберт А., Сержент Е. Константы ионизации кислот и оснований. Л.: Химия, 1964.- 180 с.

5. Арзамазцев А.П., Садчикова Н.П., Харитонов Ю.Я. Валидация фармакопейных методов (проект ОФС) // Ведомости научного центра экспертизы и государственного контроля лекарственных средств. МЗ РФ. - 2001. - № 1. - С. 28-29.

6. Атлас лекарственных растений России / под ред. В.А. Быкова М.: 2006. - ОАО «Щербинская типография» - С. 136-138.

7. Бабенко Г. А., Микроэлементы в экспериментальной и клинической медицине, К., 1965

8. Барабой В. А. Биологическое действие растительных фенольных соединений. Киев: Изд., 1976. - С.65.

9. Барабой В.А. Растительные фенолы и здоровье человека. М.: Наука, 1984.- 160 с.

10. Бекетов Е.В., Пахомов В.П., Нестерова О.В. Совершенствование процесса извлечения флавоноидов из плодов черемухи обыкновенной // Хим.-фарм. журнал 2005. - т.39. - №6. - С.33-35

11. Белоусов Ю. Б., Моисеев В. С., Лепахин В. К. Клиническая фармакология и фармакотерапия.— М.: Медицина, 1993.— 398 с

12. Берестова Е.С. Краткий медицинский справочник для врачей-гомеопатов. -X., 1991.-78 с.

13. Биофлавоноиды и проницаемость капилляров. / Сборник статей. Пер. с анг. Г.Д. Зенкевич. Под ред. к. б. наук М. Н. Запрометова. Предисловиеакад. А. JL Курсанова. М.: Изд. иностр. лит., 1957. - С.57-59.

14. Биохимические методы анализа растений / под. Ред. М.Н. Запрометова.-М.: Иностранная литература, 1960. 592 с.

15. Богачев В.Ю. Современная фармакотерапия хронической венозной недостаточности нижних конечностей // Фармацевтический вестник. -2002.-№12.-С. 21-22.

16. Бондорина И. А., Сапелин А. Ю. Декоративно-лиственные деревья и кустарники для климатических условий России. М.: Кладезь-Букс, 2004. - 144 с.

17. Брежнева Т.А. Выделение и исследование сапонинов сахарной свеклы: Автореф. Диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук. М., 2003. - 25 с.

18. Бруно П., Кремер Деревья. М.: Внешсигма, 1998. - 288 с.

19. Вавилова Н. М. Гомеопатическая фармакодинамика. М.: Эверест,, 1994. -Ч. 1.-507 е.; 4.2.-475 с.

20. Ваннье Л. Гомеопатические средства при острых состояниях. М., 1993. -448 с

21. Варшавский В. М. Практическая гомеопатия. М., 1989. - 173 с

22. Витамин Р его свойства и применение / Сборник статей. Отв. ред. В. Н. Бунин и М.Н. Запрометов. - М.: Изд-во АН СССР, 1959. - 45-50.

23. Влияние процесса сушки на качество сырья ноготков лекарственных / Омельчук М.А., Кривут Б.А., Ворошилов А.М. и др. // Хим.-фарм. журнал. 1984. - № 3. - С. 329-331

24. Выделение и разработка показателей качества стандартного образца урсоловой кислоты./Шемерянкина Т.Б., Савина A.A., Шейченко В.И.,

25. Даргаева Т.Д., Сокольская Т.А.// Сб. научн. тр., выпуск 63 «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции». -Пятигорск, 2008. С. 357.

26. Георгиевский В.П., Комисаренко Н.Ф., Дмитрук С.Е. Биологически активные вещества лекарственных растений. Новосибирск: Наука. Сиб. Отд-ние, 1990. -333 стр.

27. Глебко JI. И., Красовская Н. П., Покушалова Т. В., Ильченко Г. Я., Будина Т. А. Стандартизация качества женьшеня корней и настойки по содержанию суммы гинзенозидов// Химико-фармацевтический журнал. — 2004. Т. 38. - № 4. - С.20-23.

28. Голяк Ю.А., Хишова О.М., Дубашинская Н.В., Кухарева JI.B. Количественное определение суммы тритерпеновых сапонинов в корневищах с корнями синюхи//Химико-фармацевтический журнал. -2008. Т.42. - №8. — С. 16-19.

29. Гомеопатия и фитотерапия в лечении сердечно сосудистых болезней / Под. ред. Киселевой T.JI. и Карпеева А. А. М.: Мосгорпечать. - 1997. -т. 1.-С. 279.-Т. 2.-С. 967.

30. Государственная фармакопея СССР XI изд., вып. 1. / МЗ СССР. М.: Медицина, 1987. - 336 с.

31. Государственная фармакопея СССР XI изд., вып. 2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье / МЗ СССР. М.: Медицина, 1989.-400с.

32. Государственный реестр лекарственных средств, официальное издание М.: 2008 г. www.regmed.ru

33. Давыдова В.Н. Современные технологии получения сухих экстрактов и их ассортимент // Новая аптека. Аптечный ассортимент. 2002. - № 4. -С.67-71

34. Деканосидзе Г. Е., Чирва В. Я., Сергиенко Т. В. Биологическая роль, распространение и химическое строение тритерпеновых гликозидов. -Тб.: Мецниереба, 1984. 347с.

35. Древесные растения Главного ботанического сада им. Н.В. Цицина РАН: 60 лет интродукции М.: Наука, 2005. - 586 с.

36. Дюкова В.В., Белова О.И. К вопросу об экстракции растительного сырья с подогревом // Сб. научн. тр. ВНИИФ, 1979. т. 17. - С. 163-169

37. Жарова О.Г. Фитохимический и фармакоэкономический анализ ангиопротекторных и венотонизирующих препаратов на основе семян конского каштана обыкновенного (Aesculus hippocastanum L.) II Аспирантские чтения. — Самара, 2004. С.,

38. Жукович E.H., Шарикова Л.А., Прибыткова Т.Ф., Бокарева С.Ю., Слуева Е.К. Стандартизация густого экстракта каштана конского // 2005. №2. -С. 12-14.

39. Иванова К. Справочное пособие по гомеопатии. Ставрополь: Изд., 1991. - 190 с.

40. Изучение особенностей экстрагирования липофильных веществ из растительного сырья двухфазной системой экстрагентов и органическими растворителями. / Иванов С.А., Демченко Т.Ю., Каухова И.Е., Вайнштейн

41. B.А.// Мат. VI Между нар. съезда «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения». СПб., 2002.1. C.69-71.

42. Изучение экстракции биологически активных веществ из лекарственного сырья под действием ультразвука / Семагина Н.В., Скульман М.Г., Сульман Э.М., Анкудинова Т.В. // Хим.-фарм. журнал 2000. - т.34. -№2. - С.26-29

43. Исследование процесса экстракции лекарственных веществ из растительного сырья / Гончаренко Г.К., Чернышов И.С., Орлова Е.И. и др. // Хим.-фарм журнал. 1979. - т. 29. - № 5. - С. 100-103

44. Каухова И.Е. Новая методика получения растительных препаратов // Фармация. 2006. - № 1. - С. 37-39

45. Каштан конский и его применение в медицине / Тихонов А.И., Соболева В.А., Пухир Н.В. // Провизор. 1999. - №22. - С.34-37.

46. Кейтс М. Техника Липидологии. М.: Мир, 1975. - С.58-81,78-93

47. Кинтя П.К., Лазурьевский Г.В. Стероидные гликозиды. Монография, Отв. редактор к.х.н. Чебан П.Л. Кишинев: Штиинца - 1979.

48. Киселева Т.Л. Конский каштан обыкновенный // Медицинская помощь. -1995.-№2.-С. 54-57.

49. Кияшко В.А. Консервативное лечение хронической венозной недостаточности // РМЖ. 2002. - Т. 10. - №26.

50. Климова В.А. Основные микрометоды анализа органических соединений. М. "Химия". - 1975. - С. 223

51. Клышев Л. К., Бандюкова В. А., Алюкина А. С. Флавоноиды растений. -Алма-Ата: Изд., 1978. 154 с.

52. Коломийцева М. Г., Габович Р. Д., Микроэлементы в медицине, М., 1970 (лит.)

53. Колхир B.K и др. Фитотерапия антиоксидантами биофлавонои-дами. / Колхир В.К., Тюкавкина H.A., Быков В.А., Селиванова И.А., Новоженов

54. B.Г., Дубова М.Н., Вичканова С.А. // 5-ый Российский нац. конгресс «Человек и лекарство». М.: 21-25 апреля 1998г. Тезисы докладов. 1998. - С.374

55. Кравченко Н.В. О возможности замены лекарственных чаев аналогичными по составу суммарными препаратами // Сб. тез.докл. III Всесоюзн. Съезда фармацевтов. Свердловск, 1975. - С. 151-152

56. Кричевская A.A., Лукаш А.И., Шугалей B.C. Аминокислоты и их производные в регуляции метаболизма. Ростов, 1983. - 135 е.,

57. Куркин В.А. Фармакогнозия. -М.: Изд., 2007. С. 551-555.

58. Лавренов В.К., Лавренова Г.В. Полная энциклопедия лекарственных растений. -М.: ОЛМА-Пресс, 1999. Т. 1. - 735 с.

59. Лекарственное растительное сырье. Фармакогнозия: Учеб. пособие / Под ред. Г.П. Яковлева и К.Ф. Блиновой. СПб.: СпецЛит, 2004. - 765 е.; ил.

60. Лекарственные растения (Растения-целители) /А.Ф. Гаммерман, Г.Н. Кадаев, М.Д. Шупинская, A.A. Яценко-Хмелевский. — М.: «Высшая школа». 2-ое издание, 1975

61. Лекарственные растения / Под ред. Баньковского М.: Колос, 1969. -Т. 15.-С. 641-649.

62. Лекарственные средства из растений / Под ред. А.Д. Туровой М.: Медицина, 1962.

63. Лесная энциклопедия. / Гл. ред. Воробьев Г.И., Ред.кол.: Анучин H.A., Атрохин В.Г., Виноградов В.Н. и др. М.: Сов. Энциклопедия, 1985. - В 2 т. - 563 с.

64. Лунин В. Декоративные растения. // Цветоводство. 2002. - № 2.

65. Лучник А.Н. Энциклопедия декоративных растений умеренной зоны. -М.: Институт технологических исследований, 1997. 464 с.

66. Майнсков A.B., Киселева Т.Л., Колхир В.К., Черных Д.С., Быков В.А. Лекарственные средства растительного происхождения в терапии хронической венозной недостаточности М.: МОКБ «Марс», 1999. -С.42.

67. Майстер А. Биохимия аминокислот. М., 1961. - 492 с.

68. Марковский Ю. Декоративные многолетники СПб.: Мир и семья, 2002. -196 с.

69. Матасова С.А., Митина H.A., Рыжова Г.Л., Жуганов Д.О., Дычко К.А. Получение сухого экстракта из корней девясила высокого и изучение его химического состава//Химия растительного сырья. 1999. - №2. - С. 119123.

70. Махлаюк В.П. — Лекарственные растения в народной медицине.

71. Саратов: Приволжское. 1991. - 544 с.

72. Машковский М.Д. Лекарственные средства. В 2-х тт. М.: Медицина, 1994.-Т. 2-С. 529.

73. Методы биохимического исследования растений / Под ред. А.И. Ермакова. Изд. 2-ое-Л.: Колос, 1972. С. 143-145.

74. Минина С.А., Каухова И.Е. Химия и технология фитопрепаратов. М.: Гэотар-мед., 2004. - 560 с

75. Мичник О.Ю. Методы получения сухих экстрактов из лекарственного растительного сырья // Сб. научн. трудов «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции». Вып.59. Пятигорск, 2004.-С.101

76. Молчанов Г. И., Гончаров В.Е., Сучков И.Ф. Краткий справочник по гомеопатии и фитотерапии. Ростов-на-Дону: Изд-во ростовского университета, 1990. - 160с.

77. Молчанов Г.И. Интенсивная обработка лекарственного сырья. М.: Медицина. - 1981. - 203 с.

78. Мясников И.Ю., Иванов Е.В., Саканян Е.И. Экстрагирование растительного сырья в пульсационном режиме / Мат. V Междунар. съезда «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения». СПб., 2001. - С. 114-117

79. Неш Е. Б. Ведущие симптомы в гомеопатии. X., 1993. - 224 с

80. Носов А.М. Лекарственные растения. М.:ЭКСМО-Пресс - 1999. - 350с.

81. Оуди Пенелопа. Полный медицинский травник.-М.: Слово,2000. 192с.

82. Перспективы использования растительных полисахаридов в качестве лечебных и лечебно-профилактических средств / Криштанова H.A., Сафонова М.Ю., Болотова В.Ц. и др. // Вестник ВГУ. Серия Химия. Биология. Фармация. 2005. - № 3. - С. 212-221

83. Плеханова Т.И., Хасанова С.Р., Галиахметова Э.Х. Поиск рациональных лекарственных форм на основе растительного сырья // Сб. научн. трудов «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции». Вып.59. Пятигорск, 2004. - С. 110-111

84. Пономарев В.Д. Экстрагирование лекарственного сырья. М.: Медицина, 1976.-203 с

85. Почему растения лечат / Ловкова М.Я., Рабинович A.M., Пономарева С.М. и др. М.: Наука, 1989. - С. 66-67

86. Практикум по фармакогнозии: Учеб. Пособие для студ. Вузов / В.Н. Ковалев, Н.В. Попова, B.C. Ксиличенко и др.; Под общ. ред. В.Н. Ковалева. Харьков: Изд-во НфаУ: Золотые страницы: МТК-Книга, 2004. - 512 е.: 615 ил.: 24 с. вкл.

87. Растения для нас: Справочное издание / Под ред. Г.П. Яковлева и К.Ф. Блиновой. С.-Пб.: Учебная книга, 1996. - 654 с.

88. Редченкова В.Н., Химова О.М. Анализ требований некоторых фармакопей, предъявляемых к экстрактам // Хим.-фарм. журнал. 2006. -т.40. - № 1. - С.37-40

89. Романовский A.B. Материалы II конференции флебологов России -Тверь, 1999.

90. Российская энциклопедия БАД / Под ред. Петрова В.И., Спасова A.A. -М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007. С. 601-603.

91. Руководство по методам анализа качества и безопасности пищевых продуктов / под ред. И.М. Скурихина, В.А. Тутельяна М., Медицина, 1998- 188 с.

92. Руководство по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище, Р 4.1.1672-03. Предел обнаружения 0,02-0,05%

93. Савватеев A.M., Белобородов З.Л., Тюкавкина H.A., Тихонов В.П. Валидация методики анализа препарата «Асковертин» // Фармация. -2004. -№3.-С. 11-14.

94. Савельев B.C. Флебология. М.: Медицина, 2001 г. - 664 с.

95. Савина A.A., Фесенко Д.А., Шейченко В.И., Щавлинский А.Н. Характер превращений олеаноловой кислоты в кислой среде// Химия природных соединений. 1986. - № 3. - С. 320.

96. Самылина И.А., Баландина И.А. Пути использования лекарственного растительного сырья и его стандартизации // Фармация. 2004. - № 2. -С. 39-40

97. Санитарно-Эпидемиологические правила и нормативы СанПиН 2.3.2.1153-02.

98. Соколов С .Я. Фитотерапия и фитофармакология: Руководство для врачей. М.: Медицинское информационное агенство, 2000. 976 с.

99. Способ экстрагирования лекарственного растительного сырья в планетарном аппарате / Иванов Е.В., Швырев М.В., Минина С.А., Кочнев В.Г. // Хим.-фарм. журнал. 2004. - № 11. - С. 29-32

100. Степаненко Б.Н. Химия и биохимия углеводов (моносахариды). М.: Высшая школа, 1977. — 224 с

101. Стыскин E.JL, Ициксон Л.Б., Брауде Е.В. Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография. М.:Химия, 1986. -312 с.

102. Сухие экстракты из лекарственного растительного сырья / Степанова Л.И., Янулис В.П., Нагаслаева JI.A. и др. // Тез. докл. XI Российского национального конгресса «Человек и лекарство». М., 1992. - С. 198

103. Сухие экстракты из растений основа создания современных лекарственных форм / Глызин В.И., Лубсандоржиева П.Б., Даргаева Т.Д. и др. // Сб. тр. «Физ.-биол. аспекты изучения лек. растений». — Улан-Удэ, 1998. - С.142-143

104. Технология лекарственных форм / Под ред. Ивановой Л.А.: М. -Медицина. 1991. - Т. 2. - С. 420.

105. Технология получения и фармакологические свойства сухого экстракта из травы очанки коротковолосистой / Петриченко В.М., Сухинина Т.В., Шрамм Н.И., Бабиян Л.К., Юшков В.В. // Хим.-фарм. журнал 2005. -т.39. - №6. - С.33-36

106. Технология, анализ и применение гомеопатических препаратов Aesculus / Тихонов А.И., Соболева В.А., Макарова O.E. // Провизор 1999. - №15. -С.24-28.

107. ТУ 64-4-75-96 Семена конского каштана обыкновенного.

108. ТУ 9369-148-04868244-02 Глицирризиновая кислота стандартный образец.

109. Физер Л., Физер М. Стероиды, пер. с англ. М.: Мир, 1964.

110. Химический анализ лекарственных растений / Под ред. Н.И.Гринкевич. -М.: Высшая школа, 1983.

111. Цубанова H.A. К вопросу о фармакотерапии венозных патологий // Провизор 2003. - №22. - С.16-18.

112. Шаретт Ж. Практическое гомеопатическое лекарствоведение.

113. Смоленск: Гомеопатическая медицина, 1997, пер. под ред. Захаренкова В.М.-305 с

114. Шатц В.Д., Сахартова О.В., Высокоэффективная жидкостная хроматография: Основы теории. Методология. Применение в лекарственной химии. Рига: Зинатне. -1988. - 380с.

115. Шашков В. С., Модин А. Ю. Проблемы экспериментальной и клинической фармакологии венотонизирующих веществ // Фармакол. и токсикол.— 1990 — Т. 53, N 4.— С. 9-13

116. Шовковый А.В., Шеин А.Т. Исследование состава биологически активного природного вещества эсцин. // Провизор 1999. - №12. - С

117. Штигеле А. Гомеопатическое лекарствоведение: пер. с нем. Б.М. Пащенко. М.: Терра, 1994. - 430 с.

118. Шторх Гервит. Гомеопатические лекарства для практики.-К., 1992. 96 с.

119. Шустов В. Я., Микроэлементы в гематологии, М., 1967

120. Энциклопедия декоративных садовых растений http://flower.onego.ru/

121. Эпшгейн Н.А. Оценка пригодности (валидация) ВЭЖХ методик в фармацевтическом анализе // Химико-фармацевтический журнал. -2004. -№38.-с. 40-56

122. Яблоков Е. Д. и др. Лекарственная терапия хронической венозной недостаточности. / Яблоков Е. Д., Богачев В.Ю., Домородская А.И. // Применение препарата Детралекс. Терапевт. Архив. 1996. - 68(10). - С. 80-81.

123. A. Gawron and К. Glowniak, Planta Med. 53 (1987) 526-529.

124. Agrati A.M., O. De Bartolo, G. Palmiery Heparan sulphate: efficacy and safely in patients affected by chronic venous disease. // Minerva Car-dioangiol. 1991. 39. 10. P. 395-400.

125. Amati C. Advantage of a micronised flavonoidic fraction Daflon 500 mg in comparison with nonmicronised diosmin // Angiology. 1994. - V. 45. — N. 6. - P. 531-536.

126. AOAC Official Methods of Analysis, Official Method 2001.03, 2002.

127. Apers S., Naessens T., Pieters L., Vlietinck A. Densitometric thin-layer chromatographic determination of aescin in a herbal medicinal product containing Aesculus and Vitis dry extracts // Journal of Chromatography A. -2006. -№1112. -P. 165-170.

128. Arpaia M.R. et al. Effects of Centella asiatica extract on mucopolysac-charids metabolism in subjects with varicose veins. // Int.J. din. Phar-macol. Res.1990.-V. 10.-N. 4.-P. 229-233.

129. Autery A., et al. Pharmacodynamics and pharmacocinetics ofVeliten (ratine, alfa-tocopherol and ascorbic acid) in patients with chronic venous insufficiency. // Int.J.CHn.Pharmacol.Res.- 1994. V. 14.- N. 3. - P. 95-100.

130. Bachmann P.P. Place des anticoagulants et de la fibrinolyse dans le traitement de la thrombose veineuse profonde (TVP) // Rev. Med.SuisseRomande.1991. V.lll. -N. 11. - P.1007-1012.

131. Bassler D, Okpanyi S, Schrodter A, et al. Bioavailability of beta-aescin from horse chestnut seed extract: comparative clinical studies of two Galenic formulations. Adv Ther. 2003 Sep-0ct;20(5):295-304.

132. Belearo G., Grimaldi R., Guidi G. Improvement of capillary permeability in patients with venous hypertension after treatment with TTFCA. // Angiology. 1990.-N. 41.-P. 533-539.

133. Bielanski TE, Piotrowski ZH. Horse-chestnut seed extract for chronic venous insufficiency. J Fam Pract. 1999 Mar;48(3): 171-2

134. Bromse N.L., Burnard K.G. The cause of venous ulceration. // Lancet 1982. -P. 243-245.

135. Carpentier P., Priollett P. Epidemiologic de L'Insuffisance Veineuse Chronique // Presse Med. 1994. - V.23, N. 5. - P. 197-205.

136. Cesarone M.R., Laurora G. Activity of Centella asiatica in venousinsufficiency // Minerva Cardioangiology. 1992. - V. 40.- N.4. - P. 137-143.

137. Cesarone M.R., Laurora G. Centella asiatica in venous insufficiency // Minerva Cardioangiol. -1994. -V. 42. -N. 6. P. 299-304.

138. Cheatle T.R., Scurr J.H., Colerige Smith P.D. Drug treatment of chronic venous insufficiency and venous ulceration: a review. // J.R. Soc. Med.-1991.-V. 84.-N. 6. P. 354-358.

139. Cheatle T.R., Stibe E., Colerdge Smith P.D., Scurr J.H., Cleridgesmith P.D. Scuri J.H. Vasomotion in venous diseases // J. Roy.Soc.Med. 1991. - N. 84. -P. 261-263.

140. Chen X., Salvinski S. and Lee T.J-F. Extracts of Ginkgo biloba and gin-senosides exert cerebral vasorelaxation via a nitric oxide pathway. // Clin.Exp.Pharmacol.Physiol. 1997. - V. 24. -N. 2. - P. 958-959.

141. Chinese pharmacopeia, 2005

142. Coleridge Smith P.D., Thomas P., Scurr J.A., Dormandy J.A. Causes of venous ulceration: a new hypothesis. // BMJ 1988. - N. 296. - P. 1726-1727.

143. Colgan M.P., Dormandy J.A., Jones P.W., Schraimann I.G., Shanik D.G., Yong R A L Oxpentifillin treatment of venous ulcer of the legs. // BMJ. -1990.-N. 300. -P. 972-975.

144. DAB, German Pharmacopoeia, 1999.

145. Depairon P. M. La thrombophlebite superficielle. // Rev. Med. Suisse Romande. 1991.-V. 111.-N. 11. - P. 1021-1026.

146. Devon T. K., Scott A. I. Handbook of naturally occurring compounds, VII Terpens. New York and London : Academic Press, 1972. - P. 281-286.

147. Diehm C., Trampisch H.J., Lange S., Schmidt C. Comparison of leg compression stocking and oral horse-chestnut seed extract therapy in patientswith chronic venous insufficiency. // Lancet. — 1996. 347(8997). P. 292-294.

148. Donnandy J.A. Importance of red cell aggregation in venous pathology. // Clin. Hemorheol. 1987. -N. 7. - P. 119-122.

149. Ernst E., Matrai A., Marschall M. Limited blood fluidity as a contributery factor to venous stasis in chronic venous insufficiency. // Phlebology. -1989. -N. 4. P. 107-111.

150. Ernst E., Saradeth T. Konservative Therapie der chronisch venosen Insuffizienz // Wien.Med.Wochenschr. 1992. - V. 142. - N. 1. - P. 16-22.

151. Folch J. at all // J. Biolog. Chem. 1957.

152. Geioulakos G. et al. Controlled studies of Daflon 500 mg in chronic venous insufficiency. //Angiology. 1994. - V. 45. -N. 6. - P. 549-553.

153. Golden G.J. Venoruton in chronic venous insufficiency (letter). // Ugeskr. Laeger. 1993. - V.155. - N. 3. - P. 182-183.

154. Gratzield-Huesgen A. Sensitive and Reliable Amino Acid Analysis in Protein Hydrolysates using the Agilent 1100 Series HPLC. Agilent Technologies., 1999.

155. Grecslce K. und Pohlmann K. Horse chestnut seed extract- an effective therapy principle in general practice. Drug therapy of chronic venous insuiriciency. //Fortschr. Med. 1996. 30. 114(15). P. 196-200.

156. Hamburger M., Baumann D., Adler S. Supercritical carbon dioxide extraction of selected medicinal plants effects of high pressure and added ethanol onyield of extracted substances// Phytochem. Analys. 2004. - V. 15. - N. 1. -P. 46-54.

157. Harborn J.B. Phytochemical methods. A guide to modern tecniques of plant analysis: London. Hcapment and hall., third edition, 1998. - 233 p.

158. Hiizenberg G. The therapeutic effectiveness of chestnut extract. // Wien Med.Wochenschr. 1989. 139(17). P. 385-389

159. Hübner G., Nahrstedt A., Wray V. Two new flavonoid glycosides from the seeds of aesculus hippocastanum L. // European Journal of Pharmaceutical Sciences Sept. 1994. - Vol. 2. - P. 122

160. Kicsewetter H., Jung F., Mrowietz I., Wenzel E. Hemorheological and circulatory effects of Gincosan. // Int. J. Clin. Pharmacol. Ther. Toxicol. -1992. V. 30. -N. 3. - P. 97-102.

161. Kim Nicholas D., Fergusson Jack E. Seasonal variations in the concentrations of cadmium, copper, lead and zinc in leaves of the horse chesnut (Aesculus hippocastanum L.) // Environmental Pollution 1994. - Vol. 86, Iss. 1 - P. 8997.

162. Kimbel H. Ginkgo biloba. // Lancet. 1992. - 340. - N. 8833. - P. 1474.

163. KimS.J., Lim M.H., Cun I.K. and Won Y.H. Effects of flavonoids of Ginkgo biloba on proliferation of human skin fibroblasts. // Skin. Pharmacol.- 1997. — V. 10.-N. 4. P. 200-205.

164. Kose K., Dogan P. In vitro antioxidant effects of Ginkgo biloba extract (EGb 761) on lipoperoxidation induced by hydrogen peroxide in erythrocytes of Behcet's patients. // J PN. J. Pharmacol.- 1997. V. 75. - N. 3. - P. 253-258.

165. Leach R. D. Venous ulceration, fibrinogen and fibrinolysis. // Ann. R. Coll. Surg. Eng. 1984. -N. 66. - P. 258-263.

166. Lin J.-T., Nes W.D., Heftmann E.J. Chromatography, V.207, P. 457 1981

167. Losonczy H.et al. Management of chronic venous insufficiency with the combination of coumarin (syncoumar) and oral pentosan poly-sulfate // preliminary report. Orv.Hetilap. 1993. -V. 134. - N. 6. - P.291-295.

168. Mac Lennan W.J., Wilson J. Hydroxyethylrutosides in elderly patients withchronic venous insufficiency: its efficacy and tolerability. // Gerontology. -1994. V.40. -N. l.-P. 45-52.

169. Meyer O.C. Safety and security of Daflon 500 mg in venous insufficiency and in hemmoroidal disease. // Angiology.- 1994. v.45, №6. - P. 579-584.

170. Michel C.C. Aetiology of venous ulceration. // Br. J. Surg. 1990. - V. 77. -P. 1071.

171. Montecchio G.P., Samadan A., Carbone S. Centella asiatica triterpenic fraction (CATTF) reduces the number of circulating endothelial cells in subjects with post-phlebitic syndrome. // Haematologica. 1991. - N. 76. - P. 256-259.

172. Neuman H.A. et al. A comparative clinical trial of graduted compression and 0-(beta-hydroxyethyl)-rutosides (HR) in the treatment of patients with chronic venous insufficiency. //Z.Lymphol. 1995. - V.19. -N.l. - P. 8-11.

173. Partsch Li., Mostbeck A. Constriction of varicose veins and improvement of venous pumping by dihidroergotamine. // Vasa. 1985. -N. 14. - P. 74-80.

174. Pedersen P.M. et al. Effect of O-(beta-hydroxyethyl) rutosides (Venoruton) on symptomatic venous insufficiency in the lower limbs // Ugeskr. Laeger. -1992. Sep. 14. - V. 154.-N. 38. - P. 2561-2563.

175. Pinccmail J., Dupuis M., Nasr C. Superoxide anion scavending effect and superoxide dismutase activity of Ginkgo biloba extract. // Experientia. -1989.-N. 45. P. 708-712.

176. Renton S. et al. The effect of hydroxyethylrutosides on capillary filtration in moderate venous hypertension: a double blind study // Int. Angiol. -1994. -N. 1313. P. 259-262.

177. Scott i I.J., Me Mullin G.M., Colerdge Smith P.D., Scurr J.H. Coleridgesmith P.D., Scuri J. H. Venous ulceration: the role of the white blood cells // Phlebologie. 1989.-N. 4. - P. 153-159.

178. Standart methods for the analysis of oils, fats and derivatives / Prepared for publication by Paquot C. Oxford-New York-Toronto-Sydney-Paris-FrankiliLt.: Pergamon Press, 1986. - P. 96-102.

179. Stankovic S. K., Bastic M. B., Jovanoc J. A. Composition of the triterpene alcohol fraction of horse chestnut seed // Phytochemistry. — 1985. Vol. 24, Iss. l.-P. 119-121

180. Steincr M. Conservative therapy of chronic venous insufficiency. The extentfruits of Aesculus pavia // Phytochemistry 2006. - №67. - P. 784-794 ^

181. Формулы БАВ конского каштана обыкновенного

182. Номенклатура венотонизирующих препаратов, содержащих эсцин, зарегистрированные на территории РФ

183. Торговое наименование Производитель Состояние РУ Форма выпуска Страна Лекформа нд• 1 2 3 4 5 6

184. Аэсцин Польша, АО Кутновский фармацевтический завод «Польфа» Действующее Таблетки покрытые оболочкой 20 мг Польша таблетки покрытые оболочкой 42-4456-01

185. Веностат Берингер Ингельхайм Фарма КГ, подразделение Берингер Ингельхайм Интеренешнл ГмбХ Истекло Капсулы пролонгированного действия Германия Капсулы пролонгированного действия 42-10023-99

186. Венен цт- Арцнаймиттель Хемише Темпельхоф ГмбХ Истекло драже; мазь (тубы) Германия драже; мазь (тубы); раствор для наружного применения

187. Венитан Лек д.д. Действующее Гель для наружного применения 1% (тубы алюминиевые) 50г Словения Гель для наружного применения 42-7373-03

188. Венитан Лек д.д. Действующее Крем 5% (тубы) 50г Словения Крем для наружного применения 42-2879-00

189. Веноплант Доктор Вильмар Швабе ГмбХ и Ко. КГ Истекло Таблетки ретард (блистеры) Германия Таблетки пролонгированного действия 42-9690-04

190. Гербион эскулюс КРКАд.д. Истекло Гель для наружного применения (тубы) 40г Словения Гель для наружного применения 42-10432-05

191. Концентрин цт- Арцнаймиттель Истекло Гель (тубы); раствор Гель для наружного 42-4804-95;

192. Хемише Темпельхоф ГмбХ для наружного применения (флаконы) применения

193. Концентрин цт- Арцнаймиттель Хемише Темпельхоф ГмбХ Истекло Гель (тубы); раствор для наружного применения (флаконы) Германия раствор для наружного применения 42-4316-95

194. Репарил Др. Мадаус АГ Истекло Порошок для приготовления инъекционного раствора (ампулы) 5мг; драже; гель ФРГ драже; порошок для приготовления инъекционного раствора 42-2927-94

195. Цикловен форте цт- Арцнаймиттель Хемише Темпельхоф ГмбХ Истекло драже Германия драже 42-4807-95

196. Эскузан капли Иенафарм ГмбХ и Ко. КГ / Компания Группы Шеринг Действующее Флаконы по 20 мл Германия Раствор стандартизованного водно спиртового экстракта

197. Эскузан 20 Йенафарм ГмбХ и Ко. КГ / Компания Группы Шеринг Действующее Таблетки покрытые пленочной оболочкой (блистеры) Германия таблетки покрытые оболочкой 42-2862-99

198. Номенклатура, состав, показатели подлинности и доброкачественности лекарственного растительного сырья и фитопрепаратов, оказывающих венотонизирующее действие

199. Название Состав препарата Характеристика подлинности и доброкачественности Количественный анализ по действующим веществам Фармакологическое действие1 2 3 4 5 6

200. Триэтаноламин 0,014 г Дистиллированная вода 0,441 г

201. Прострел 10 мл Яд змеиный 10 мл Каштан конский 15 мл Вспомогательные вещества: Спирт этиловый 43% 38,3 мл Вода очищенная 6,9 мл рН. Плотность. Спирт. Номинальный объем. Микробиологическая чистота (ГФ XI). Содержание этанола (ГХ).

202. Настойка «Эскулюс» гомеопатическая ВФС 42-2626-95 Описание. Подлинность (ТСХ, качественные реакции -эсцин). Сухой остаток (ГФ Х1).Спирт (ГФ XI). Микробиологическая чистота (ГФ XI). Применяется для изготовления гомеопатической мази «Эскулюс»

203. Эскулин (1,5 воды) эквивалентно 10 мг Вспомогат.вещества 968 мг ТСХ). Масса содержимого тубы. Гомогенность. Микробиологическая чистота (ГФ XI). микробиологический метод (ГФ XI и ШР) прохода.

204. Цикловен форте 1 драже содержит: Описание. Подлинность (ТСХ, Аналог ДАВ 10 семян Ангиопротекторное

205. Эсфлазид 1 таблетка содержит: Описание. Подлинность (ТСХ, Потенциометрическое Венотонизирующее