Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Фармакогностическое изучение и стандартизация иглицы шиповатой и сухого экстракта на ее основе

На правах рукописи

ии^471793

Томашевская Ольга Юрьевна

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ И СТАНДАРТИЗАЦИЯ ИГЛИЦЫ ШИПОВАТОЙ И СУХОГО ЭКСТРАКТА НА ЕЕ ОСНОВЕ

15.00.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

:" 'О

Москва-2009 г.

003471793

Диссертационная работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН

Научный руководитель:

Доктор фармацевтических наук,

профессор Даргаева Тамара Дарижаповна

Официальные оппоненты:

Доктор фармацевтических наук,

профессор, академик РАЕН Патудин Александр Васильевич

Доктор фармацевтических наук Боковикова Татьяна Николаевна Ведущая организация:

Всероссийский научный центр по безопасности биологически активных веществ (ВНЦ БАВ)

Защита состоится « 2009 г. в 14 часов на заседании

диссертационного совета Д 006.070.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН по адресу: 117216, г. Москва, ул. Грина, 7

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЛАР по адресу: 117216, г. Москва, ул. Грина, 7

Автореферат разослан 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 006.070.01,

доктор фармацевтических наук

А. И. Громакова

Актуальность темы

Хроническая венозная недостаточность нижних конечностей (ХВН) - одно из наиболее часто встречаемых в повседневной медицинской практике патологических состояний, характеризующихся прогрессивным и часто осложненным течением заболеваний. По данным статистики, в Российской Федерации данной патологией страдают от 30 до 50% трудоспособного населения, причем прослеживается зависимость частоты венозной патологии от возраста. Она существенно увеличивается у людей после 40 лет, а в возрасте старше 60 лет частота различных поражений венозного русла нижних конечностей достигает 80%.

В настоящее время номенклатура венотонизирующих средств представлена в основном препаратами растительного происхождения зарубежного производства на основе конского каштана обыкновенного и его сочетаний с другими компонентами.

Данное обстоятельство диктует необходимость поиска новых видов сырья и создания на их основе эффективных отечественных фитопрепаратов для профилактики и лечения венозной недостаточности.

Перспективным объектом изучения, на наш взгляд, являются подземные органы иглицы шиповатой Ruscus aculeatus L. (семейство Liliaceae), используемые в производстве биологически активных добавок к пище, а также в получении лекарственных препаратов венотонизирующего действия, таких как Цикло-3 крем и Цикло-3 форт, капсулы (Франция).

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы является фармакогностическое изучение подземных органов иглицы шиповатой, разработка способа получения сухого экстракта и их стандартизация.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие основные задачи:

- провести фармакогностическое изучение подземных органов иглицы шиповатой, установить диагностически значимые признаки в макро- и микроскопическом строении сырья;

- разработать методики качественного и количественного определения основных групп биологически активных веществ (БАВ) в подземных органах иглицы шиповатой;

- установить закономерности выхода БАВ из лекарственного растительного сырья в зависимости от основных факторов, влияющих на процесс экстракции;

- разработать рациональную технологическую схему получения сухого экстракта, позволяющую проводить максимальное извлечение БАВ;

- исследовать химический состав, технологические свойства и разработать показатели качества сухого экстракта иглицы шиповатой, провести валидацию методик анализа;

- по результатам исследований оформить технические условия (ТУ) на новый вид лекарственного растительного сырья - корневища и корни иглицы шиповатой, разработать проект фармакопейной статьи (ФС) на иглицы шиповатой экстракт сухой, оформить лабораторный регламент на получение сухого экстракта, оформить протокол валидации методик анализа.

Научная новизна работы

Информационно-аналитическими исследованиями показана необходимость разработки отечественного лекарственного средства венотонизирующего действия.

На основании макро- и микроскопического анализа установлены диагностически значимые признаки в морфологическом и анатомическом строении корневищ и корней иглицы шиповатой.

Подобраны условия анализа БАВ в сырье иглицы с помощью физико-химических методов: хроматографии в тонком слое сорбента (ТСХ), высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), спектрофотометрии. Изучен качественный и количественный состав основных групп БАВ (стероидные сапонины, фенольные соединения, органические кислоты, сахара, аминокислоты), состав микро- и макроэлементов.

Установлены закономерности выхода экстрактивных веществ и стероидных сапонинов из растительного сырья в зависимости от степени его измельченности, типа экстрагента, соотношения сырье-экстрагент, гидродинамических условий, кратности экстракции, температуры, позволяющих разработать рациональный способ получения сухого экстракта иглицы шиповатой.

Подобраны условия анализа стероидных сапонинов в растительном сырье и сухом экстракте и разработаны методики их стандартизации.

Показана возможность разработки отечественного лекарственного средства венотонизирующего действия на основе иглицы шиповатой.

Практическая значимость работы

На основании проведенных исследований разработаны и внедрены:

- Технические условия ТУ 9377-170-04868244-2008 «Корневища и корни иглицы шиповатой»;

- Проект ФС «Иглицы шиповатой экстракт сухой» (Акт внедрения методики количественного определения суммы стероидных сапонинов в иглице шиповатой экстракте сухом в Государственном учреждении здравоохранения «Центр сертификации и контроля качества лекарств Департамента здравоохранения г. Москвы» (ГУЗ «ЦСиККЛ ДЗ»);

- Лабораторный регламент ЛР 04828244-01-09 на производство иглицы шиповатой экстракта сухого.

Основные положения, выносимые на защиту

- результаты фармакогностического изучения сырья иглицы шиповатой;

результаты исследований качественного состава и количественной оценки БАВ иглицы шиповатой;

- результаты исследований по установлению закономерности выхода БАВ в зависимости от степени измельченности сырья, вида экстрагента, соотношения сырье/экстрагент, кратности экстракции, температуры, гидродинамических условий и разработки технологии сухого экстракта;

- результаты разработки методик контроля качества сырья и сухого экстракта иглицы шиповатой, обеспечивающих сквозную стандартизацию от источника к лекарственному средству, результаты валидации методик анализа.

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на XV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2008), V Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (Уфа, 2008), научной конференции «Мэс засал» (Улан-Батор, 2008), III Международной научной конференции «Traditional medicine a current situation and

perspectives of development» (Улан-Удэ, 2008), IX международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2008).

Связь задач исследований с проблемным планом НИР

Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ ВИЛАР РАСХН по «Программе фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса РФ на 2006 - 2010 гг.», задание 04, шифр 04.13 «Разработка технологий производства высокоэффективных лечебных и профилактических препаратов из растительного сырья».

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 135 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы (глава 1), четырех глав экспериментальной части, выводов, списка литературы, включающего 117 источников, в том числе 36 иностранных, приложений. Работа содержит 14 рисунков и 38 таблиц.

В первой главе на основании обзора данных литературы описаны этиология и патогенез хронической венозной недостаточности, номенклатура и классификация венотонизирующих средств. Представлено ботаническое описание, данные по химическому составу, распространению, применению в народной и научной медицине препаратов иглицы шиповатой. Приведена характеристика стероидных сапонинов (выделение, установление структуры и стандартизация). Отражены особенности современного производства сухих экстрактов из растительного сырья и их стандартизация. В разделе «Объекты и методы исследования» приведены сведения об объектах изучения, о методах и приборах, используемых в экспериментах.

Вторая глава посвящена фармакогностическому исследованию корневищ и корней иглицы шиповатой, установлению показателей, позволяющих идентифицировать данное сырье и контролировать его качество.

В третьей главе представлены данные анализа состава биологически активных веществ подземной части иглицы шиповатой с использованием современных физико-химических методов.

В четвертой главе изложены результаты исследований по подбору оптимальных условий и разработке рациональной технологии сухого экстракта иглицы шиповатой.

Пятая глава содержит результаты изучения химического состава, установления показателей качества иглицы шиповатой экстракта сухого и его количественного определения.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования

Объектами исследования служили образцы опытных партий подземных органов иглицы шиповатой, заготовленные в фазу полного созревания плодов (сентябрь-ноябрь) в ботаническом саду ВИЛАР в 2006-2008 гг. и ботаническом саду Башкирского Государственного Университета в 2008 г.

Отбор проб и анализ лекарственного растительного сырья (JIPC) проводили по методикам ГФ XI и ОФС.

Исследование морфологических признаков сырья и приготовление микропрепаратов осуществляли в соответствии с требованиями статьи «Корни, корневища, клубни, луковицы, клубнелуковицы» (ГФ XI, вып. 1, с. 282).

Изучение анатомических признаков цельного сырья проводили в соответствии с указаниями статьи «Техника микроскопического и микрохимического исследования лекарственного растительного сырья» (ГФ XI, вып. 1, с. 277).

Приготовление реактивов, используемых в экспериментальной части работы осуществляли согласно ГФ XII, часть 1, С. 220; для экстракции БАВ и приготовления хроматографических систем использовали растворители марки «ч» и «х.ч».

Объектами изучения являлись: лекарственное растительное сырье (корневища и корни иглицы), извлечение из сырья, сухой экстракт иглицы шиповатой.

Для хроматографии в тонком слое сорбента использовали пластинки Kieselgel 40 F254; Merck, Германия, размером 15x15 см, Сорбфил, РФ. Хроматографирование выполняли при температуре 19-23 °С в герметически закрытых вертикальных стеклянных камерах. Нанесение исследуемых растворов на хроматографические пластинки осуществляли при помощи шприца Hamilton (10 мкл).

Для тонкослойной хроматографии использовали следующие системы растворителей: дихлорметан : метанол (93:7); этилацетат : уксусная кислота : вода (25:5:5).

Спектры поглощения снимали на спектрофотометре «Gelios» (США) в кювете с толщиной поглощающего слоя жидкости 10 мм.

ВЭЖХ-анализ БАВ проводили на хроматографе «GILSTON» (Франция) с металлической колонкой размером 4,6x250 мм PLATINUM EPS С 18 100, размер частиц 5 микрон, с последующей компьютерной обработкой результатов исследования с помощью программы «Мультихром для Windows».

Изучение аминокислотного состава сырья и сухого экстракта проводили с помощью LC-2000 BIOTRONIK (Германия).

Определение микро- и макроэлементного состава проводили на спектрографе ДФС-8 с плоской дифракционной решеткой методом эмиссионного спектрального анализа.

Для исследования БАВ использованы достоверные образцы и стандартные образцы: галловая кислота - Fluka, кат. №48630 (Fluka 2005-2006), лютеолин ГСО (ФС 42-0174-06); рускогенин «ChromaDex», США. гесперидин, коричная кислота, хлорогеновая кислота, салициловая кислота, апигенин, гиперозид ГСО (ФС 42-0106-03); цикориевая кислота, пирогаллол, феруловая кислота (ТУ 9369-14304868244-06).

Фармакологические и токсикологические исследования (острая токсичность) сухого экстракта иглицы шиповатой проводили в отделе биологически активных веществ Института общей и экспериментальной биологии СО РАН (Улан-Удэ).

1. Фармакогностическое изучение сырья иглицы шиповатой и разработка методов контроля его качества

Обоснование наименования исследуемого сырья иглицы При выборе названия нового вида сырья установлено, что подземные органы иглицы шиповатой состоят из корневищ и корней. При этом корни иглицы немногочисленные, крупные и по диаметру сопоставимы с корневищем. В связи с этим изучаемое сырье иглицы шиповатой предложено отнести к морфологической группе «Корневища и корни - Rhizomata et radices».

Товароведческая характеристика сырья Проведена товароведческая оценка сырья корневищ и корней иглицы шиповатой. Установлены следующие характеристики: внешние признаки: цельные или разрезанные поперек куски корневищ и придаточных корней с небольшими остатками надземных побегов. Корневища со следами отмерших надземных побегов прошлых лет, симподиальные с очень короткими междоузлиями, одно- двуглавые, горизонтальные, длиной до 150 мм, диаметром до 13 мм. Поверхность корневищ от светло-серого до светло-коричневого цвета, на изломе серовато-белого цвета. От корневищ отходят немногочисленные, довольно крупные и длинные корни. Поверхность корней продольно-морщинистая, соломенно-желтого или желтовато-бурого цвета, в изломе корни серовато-белые, длиной до 150 мм и толщиной до 6 мм. На корневищах находятся остатки надземных побегов текущего года вегетации длиной до 30 мм.

В ходе исследования определяли диагностические признаки J1PC, а также нормативы таких числовых показателей, как влажность, измельченность, содержание минеральной и органической примеси, золы общей, золы, не растворимой в 10 % хлористоводородной кислоте.

Исследование морфологических и микроскопических признаков сырья На основании изучения морфологических характеристик образцов опытных партий составлено описание внешних признаков «Иглицы шиповатой корневищ и корней». Сырье должно представлять собой цельные или разрезанные поперек куски корневищ и придаточных корней с небольшими остатками надземных побегов, корневища со следами отмерших надземных побегов прошлых лет.

При микроскопическом исследовании (рис.1) выявлены диагностические признаки анатомического строения поперечного среза корня: широкая мощная кора и небольшого диаметра полиархный центральный (осевой) цилиндр с центростремительной дифференциацией сосудов ксилемы. Покровная ткань корня -ризодерма (каждая клетка эпидермиса развилась в одноклеточный волосок). Ризодерму подстилает однорядный слой экзодермы, состоящей из полигональных радиально вытянутых клеток с лигнифицированными стенками. Паренхима коры представлена округлыми клетками разнообразного размера, межклетники имеют, преимущественно, треугольную форму. Среди паренхимных клеток

встречаются идиобласты с пучками рафид оксалата кальция. Внутренняя граница коры представлена кольцом эндодермы, состоящей из и - образных клеток с толстыми одревесневшими внутренними и боковыми стенками, среди которых имеются тонкостенные пропускные клетки, располагающиеся напротив каждого луча ксилемы. Наружный слой осевого цилиндра - перицикл -однорядный, выражен слабо. Участки флоэмы в осевом цилиндре располагаются между лучами ксилемы, которая занимает основную площадь осевого цилиндра, и представлена волокнами ксилемы с одревесневшими толстыми стенками, среди которых видны многочисленные лучи из трахеид протоксилемы и крупных сосудов.

. .

Рис.1. - Диагностические признаки в анатомическом строении корневища иглицы: А. Сегмент поперечного среза корневища диаметром 9 мм. Ув. х 74; Б. идиобласт с рафидами оксалата кальция в паренхиме коры корневища. Ув. х1200; В. Фрагмент поперечного среза корневища Ув.хЗОО. Г. Эпидерма корневища в плане. Ув. х 600: 1-кора, 2-сердцевина, 3-эпидерма, 4-склеренхима, 5-проводящий пучок, 6-идиобласт с рафидами оксалата кальция, 7-сосуды ксилемы, 8-участки флоэмы, 9-клетки сердцевины, 10-клетки коры, 11-устьица

В центральной части корня (рис. 2) расположена сердцевина, состоящая из округлых тонкостенных клеток, среди которых могут встречаться идиобласты с пучками рафид оксалата кальция. Диагностические признаки предложено использовать для определения подлинности измельченного сырья.

Рис.2. - Диагностические признаки в анатомическом строении корня иглицы шиповатой: А. Поперечный срез корня диаметром 3,5 мм (ув.х74); Б. Идиобласт с пучком рафид оксалата кальция в паренхиме коры корня, (ув.х 600); В. Осевой цилиндр корня (ув.хЗОО): 1-ризодерма; 2-экзодерма; 3-осевой цилиндр; 4-мезодерма; 5-эндодерма; 6-сердцевина; 7-идиобласты с пучками рафид оксалата кальция; 8 - паренхима коры; 9 - флоэма; 10 -ксилема

2.Фитохимическое изучение сырья иглицы шиповатой

Установление подлинности и разработка методики количественного определения стероидных сапонинов в сырье Подземные органы иглицы содержат стероидные сапонины -рускозиды, состоящие из агликона - рускогенина (рис. 3) или его изомера неорускогенина и углеводной части, присоединенной с С1-гидроксилу и содержащей до 4 Сахаров (рамноза, глюкоза, арабиноза).

Для установления подлинности корневищ и корней иглицы кроме макроскопического и микроскопического методов, нами предложено использовать тесты, основанные на качественных реакциях и методике

тех.

На основании данных химического изучения состава БАВ иглицы шиповатой, в разделе «Качественные реакции» проекта НД предусмотрено проведение тестов на обнаружение в сырье иглицы двух основных групп БАВ: стероидных сапонинов и восстанавливающих Сахаров. Образование осадка в реакции осаждения из водного извлечения ацетатом свинца свидетельствует о наличии стероидных сапонинов. Появление желтого окрашивания после добавления нескольких капель раствора ванилина в серной кислоте к извлечению из сырья также подтверждает присутствие данной группы веществ в сырье. Идентификацию основного представителя сапонинов иглицы предложено проводить методом ТСХ со стандартным образцом рускогенина. Установление наличия восстанавливающих Сахаров проводят с помощью реакции с реактивом Фелинга (появляется кирпично-красный осадок). Наряду с этим для установления наличия различных БАВ было проведено их определение методом ВЭЖХ.

Согласно данным литературы и проведенному фитохимическому исследованию преобладающей группой БАВ сырья иглицы шиповатой являются стероидные сапонины. Для количественной оценки содержания БАВ разработана методика спектрофотометрического определения суммы стероидных сапонинов с использованием стандартного образца рускогенина. В основе методики лежит измерение оптической плотности окрашенного комплекса, образующегося при взаимодействии сапонинов с раствором ванилина в серной кислоте. Для разработки методики количественного определения суммы стероидных сапонинов в пересчете на рускогенин подобраны условия анализа (кратность экстракции, выбор экстрагента, температура, степень измельченности). Установлены следующие оптимальные параметры экстракции: измельченность сырья до частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 3-5 мм; трехкратная экстракция; температура экстракции 60±5° С; экстрагент 50 % спирт этиловый; оптимальное соотношение сырье/экстрагент 1:100; время экстракции сырья на водяной бане с обратным холодильником - 60 мин. При изучении спектра поглощения комплекса стероидных

сапонинов иглицы с раствором ванилина в серной кислоте установлено, что при длине волны 395 нм наблюдается интенсивный максимум поглощения; аналогичный спектр поглощения имеет комплекс рускогенина с раствором ванилина в серной кислоте (рис. 4). Эти данные позволяют использовать в качестве аналитической длину волны 395 нм.

Рис. 4. - Спектр поглощения комплекса сапонинов иглицы шиповатой с кислотой серной (1) и комплекса СО рускогенина с кислотой серной (2)

Содержание суммы стероидных сапонинов в пересчете на рускогенин должно быть не менее 3%. Воспроизводимость методики количественного определения суммы стероидных сапонинов установлена на примере анализа одного образца сырья в 5 независимых повторностях. Метрологические характеристики методики (табл. 1) свидетельствуют, что относительная ошибка единичного определения с 95 % вероятностью составляет ±5,46 %.

Метрологические характеристики методики количественного определения суммы стероидных сапонинов в корневищах и корнях иглицы шиповатой в ___пересчете на рускогенин___

Г X Б2 Б Р,% АХ Е, %

4 3,404 0,02258 0,150 95 2,78 0,186 ±5,46

Отсутствие систематической ошибки методики подтверждено в опытах с добавками рускогенина непосредственно к навеске сырья перед экстракцией (табл. 2).

А

I

эм мо 17а ма ззс чсс 41а 4х «з из ШГ|

Таблица 1

Таблица 2

Результаты опытов с добавками рускогенина_

Взято в сырье, г Добавлено рускогенина (г) Должно быть (г) Найдено (г) Ошибка

Абсолютная (г) Относительная (%)

0,03404 0,00851 0,04255 0,04253 -0,00002 - 0,047

0,03404 0,01702 0,05106 0,05111 + 0,00005 + 0,098

0,03404 0,02553 0,05957 0,05952 - 0,00005 - 0,084

Методика количественного определения суммы стероидных сапонинов в пересчете на рускогенин в корневищах и корнях иглицы шиповатой включена в разработанный проект ТУ на сырье.

Изучение содержания стероидных сапонинов в некоторых видах рода

Иглица

С помощью разработанной методики количественного определения нами проанализированы образцы сырья (корневищ и корней) трех культивируемых видов иглицы: иглицы шиповатой, иглицы понтийской и иглицы подъязычной. Полученные результаты (табл. 3) свидетельствуют о том, что наибольшее количество стероидных сапонинов накапливается в подземных органах иглицы шиповатой.

Таблица 3

Содержание суммы стероидных сапонинов в пересчете на рускогенин в

подземных органах различных видов иглицы

Вид иглицы Содержание суммы стероидных сапонинов в

пересчете на рускогенин, %

И.шиповатая 3,46

И.понтийская 3,09

И.подъязычная 3,12

Определение рускогенина в сырье иглицы Нами разработана методика количественного определения рускогенина методом ВЭЖХ. Содержание рускогенина в подземных органах иглицы шиповатой составило 0,088±0,0034%. Относительная ошибка методики не превышает 3,86% (табл. 4).

Таблица 4

Метрологические характеристики методики определения рускогенина в сырье _иглицы методом ВЭЖХ_

{ X Б2 8 Р,% т ДХ Е, %

4 0,088 0,0000073 0,0027 95 2,78 0,0034 ±3,86

Исследование химического состава сырья - корневищ и корней иглицы

шиповатой

На основании данных литературы и предварительного фитохимического анализа нами установлено кроме сапонинов наличие следующих групп БАВ: фенольных соединений, свободных Сахаров и органических кислот, аминокислот.

Изучение качественного состава фенольных соединений проводили методом ВЭЖХ. Детектирование проводили при длине волны 254 нм (рис. 5).

Рис.5. - ВЭЖХ-хроматограмма фенольных соединений корневищ и корней

иглицы шиповатой На основании проведенного исследования в подземных органах иглицы идентифицировано 6 веществ фенольного характера: галловая, хлорогеновая, кофейная, феруловая кислоты, апигенин и гиперозид (табл. 5).

Таблица 5

Результаты исследования фенольных соединений корневищ и корней

иглицы методом ВЭЖХ

№ Время Площадь пика, Концентра- Название

пика удерж., сек шУ*сек ция, %

1. 342.0 5557.28 35.32 Хлорогеновая кислота

2. 387.2 7627.21 48.48 Галловая кислота

3. 506.2 430.83 2.74 Кофейная кислота

4. 681.3 541.48 3.44 Феруловая кислота

5. 1067 25.35 0.16 Апигенин

6. 1186 93.20 0.59 Гиперозид

Определения содержания фенольных соединений в изучаемом сырье проводили методом спектрофотометрии в пересчете на галловую кислоту. В ходе исследования подобраны условия анализа фенольных соединений и выбрана аналитическая длина волны 270 нм (рис. 6).

Рис. 6. - УФ-спектр поглощения спиртового извлечения из подземных органов иглицы шиповатой (1) и спиртового раствора кислоты галловой (2)

Содержание суммы фенольных соединений в пересчете на галловую кислоту составило 4,25 %. Относительная ошибка методики не превышает 2,71% (табл. 6), что свидетельствует об удовлетворительной ее воспроизводимости; результаты опытов с добавками подтверждают отсутствие систематической ошибки.

Таблица 6

Метрологические характеристики методики количественного определения суммы фенольных соединений в пересчете на кислоту галловую

п f хср 82 Б Р,% ЦР,« АХ 8,%

5 4 4,248 0,00172 0,0415 95 2,78 0,115 ±2,71

Были подобраны условия анализа методом ВЭЖХ органических кислот и свободных Сахаров с рефрактометрическим детектированием (рис. 7).

mV 300250200 -150 -100 -50 -00 2 4 б S 10 12 lni"

Рис. 7. - ВЭЖХ-хроматограмма свободных Сахаров и органических кислот

На хроматограмме обнаружены щавелевая, лимонная, янтарная кислоты, галактоза, глюкоза, арабиноза. Доминирующим компонентом является глюкоза.

Предлагаемый нами для количественной оценки Сахаров в сырье иглицы метод спектрофотометрии предусматривает экстракцию полисахаридного комплекса из сырья водой, его осаждение спиртом этиловым, гидролиз, образование окрашенного комплекса продуктов гидролиза (моносахаридов) с пикриновой кислотой в щелочной среде, последующее измерение оптической плотности. Полученный окрашенный комплекс имеет максимум поглощения при длине волны 466±2 нм, как и комплекс глюкозы с пикриновой кислотой (рис. 8). Предложено использовать в качестве аналитической длину волны 466 нм и проводить определение суммы моносахаридов после гидролиза полисахаридов в пересчете на глюкозу.

А

Рис. 8. - Спектр поглощения комплекса моносахаридов иглицы (1) и комплекса глюкозы (2) с пикриновой кислотой в щелочной среде

Содержание моносахаридов в корневищах и корнях иглицы шиповатой составило 5,94 % при относительной ошибке единичного определения ±3,19%.

В связи с отсутствием в литературе сведений об аминокислотном составе иглицы шиповатой, нами исследован качественный состав и содержание аминокислот в изучаемом лекарственном растительном сырье (табл. 7).

Таблица 7

Содержание свободных аминокислот в корневищах и корнях иглицы

Аминокислота Содержание аминокислоты в 100 г сырья, мг

Аспарагиновая кислота 3,55

Глутаминовая кислота 3,64

Пролин 3,05

Глицин 0,48

Аланин 3,09

Цистеин 1,63

Валин 3,16

Метионин 3,64

Изолейцин 2,67

Лейцин 0,38

Тирозин 0,23

Фенилаланин 0,93

Лизин 2,45

Гистидин 0,19

Аргинин 0,92

Суммарное содержание 30,11

Доминирующими аминокислотами являются аспарагиновая и глутаминовая кислоты, метионин и аланин.

В литературных источниках отсутствуют сведения о микро- и макроэлементном составе подземных органов иглицы, поэтому нами проведены исследования по установлению их качественного состава и содержания.

Установлен микро- и макроэлементный состав в золе подземных органов иглицы шиповатой: превалирующими элементами являются Са и Обнаружены также Бе, Мп, Ва, Р, 81, Бп, Си, Сг, Со, Мо.

Изучение стабильности в процессе хранения

Изучение стабильности корневищ и корней иглицы при их хранении в рекомендуемой упаковке позволяет установить срок годности этого сырья 2 года. По истечении указанного срока годности по всем показателям качества лекарственное растительное сырье отвечало требованиям проекта НД .

Разработка нормативной документации на сырье

На основании проведенных исследований разработаны и оформлены ТУ 9377-170-04868244-2008 на новый вид лекарственного сырья «Корневища и корни иглицы шиповатой». В соответствии с требованиями ТУ контроль качества ЛРС осуществляется по следующим показателям: внешние признаки, подлинность (микроскопия, качественные реакции), числовые показатели (влажность; зола общая; зола, нерастворимая в 10 % растворе кислоты хлористоводородной; другие части растения, в т.ч. отделенные при анализе; частицы, проходящие сквозь сито с отверстиями диаметром 0,5 мм; органическая и минеральная примеси; сумма стероидных сапонинов в пересчете на рускогенин), микробиологическая чистота, определение содержания радионуклидов, упаковка, маркировка, транспортирование.

3. Разработка способа получения сухого экстракта иглицы

Сухие экстракты являются одним из наиболее рациональных способов переработки ЛРС, обеспечивающих максимальное извлечение действующих веществ и возможность создания стандартизованного фитопрепарата. Поэтому при разработке венотонизирующего средства на основе иглицы шиповатой предложено получение сухого экстракта как субстанции для создания готовых лекарственных форм. Для определения оптимальных условий стадии экстракции нами изучено влияние экстрагента, температурного режима, соотношения сырье/экстрагент, времени и кратности экстракции на выход биологически активных веществ.

Экспериментально установлено, что оптимальным является проведение трехкратной экстракции сырья с размером частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 5 мм, в соотношении 1:10 при использовании в качестве экстрагента 70% спирта и нагревании до 60 ± 5 °С. Подобранные в ходе эксперимента оптимальные параметры процесса экстракции были положены в

основу проведения серии балансовых загрузок в лабораторных условиях. Технологическая схема получения сухого экстракта представлена на рис. 9. Анализ готового продукта и отходов производства (шрота, осадка балластных веществ) осуществляли по сумме стероидных сапонинов в пересчете на рускогенин.

Рис. 9. - Технологическая схема производства сухого экстракта иглицы

На основании 5 проведенных загрузок оформлен и утвержден лабораторный регламент на производство иглицы шиповатой экстракта сухого № ЛР 04868244-01-09.

4. Разработка показателей качества сухого экстракта

Изучение качественного состава БАВ сухого экстракта По данным литературы и результатам наших исследований корневища и корни иглицы шиповатой содержат стероидные сапонины, фенольные соединения, углеводы, аминокислоты, микро- и макроэлементы. Нами проведен качественный анализ БАВ в экстракте в соответствии с методиками, используемыми при анализе сырья.

В сухом экстракте обнаружены стероидные сапонины, фенольные соединения, восстанавливающие сахара по методикам реакций, аналогичным таковым на сырье. Состав микро- и макроэлементов существенно не различается в сырье и сухом экстракте. Химическое изучение сухого экстракта показало, что состав БАВ экстракта близок таковому в нативном сырье.

Установление показателей подлинности и разработка методики количественного определения Для установления подлинности сухого экстракта предусмотрено проведение качественных реакций на две группы веществ, а также ТСХ-анализ со стандартными образцами. В ходе исследований подобранны условия анализа стероидных сапонинов и разработана методика количественного определения суммы стероидных сапонинов в пересчёте на рускогенин методом спектрофотометрии. Относительная ошибка методики не превышает ±3,86 % (табл. 8).

Таблица 8

Метрологические характеристики методики количественного определения

суммы стероидных сапонинов в сухом экстракте иглицы шиповатой в ___пересчете на рускогенин___

Г X Б2 Б Р,% № ДХ Е, %

4 12,63 0,0424 0,206 95 2,78 0,256 ±3,86

Отсутствие систематической ошибки методики подтверждено опытами с добавками рускогенина (табл. 9).

На основании анализа 5 опытных партий сухого экстракта установлена норма содержания суммы стероидных сапонинов в пересчете на рускогенин не менее 12 %.

Таблица 9

Результаты опытов с добавками рускогенина_

Найдено рускогенина в экстракте, г Добавлено рускогенина, г Должно быть, г Найдено, г Относительная ошибка, %

0,1264 0,0304 0,1568 0,1515 -3,37

0,1239 0,0536 0,1775 0,1818 + 2,45

0,1257 0,0798 0,2055 0,2169 +2,53

Установлен срок годности сухого экстракта - 2 года.

На основании полученных данных разработан и оформлен проект фармакопейной статьи (ФС) «Иглицы шиповатой экстракт сухой», который включает следующие разделы: описание, подлинность, потеря в массе при высушивании, тяжелые металлы, микробиологическая чистота, сульфатная зола, количественное определение суммы стероидных сапонинов в пересчете на рускогенин, упаковка, маркировка, хранение, транспортирование, срок годности.

Фармакологические исследования сухого экстракта иглицы шиповатой, проведенные в Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН, показали его выраженную антиоксидантную, мембраностабилизирующую и противовоспалительную активность. По данным токсикологического исследования (острая токсичность) сухой экстракт согласно действующей классификации отнесен к малотоксичным веществам.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Впервые проведено фармакогностическое изучение корневищ и корней иглицы шиповатой. Установлены числовые показатели, диагностически значимые признаки, дана качественная и количественная характеристика действующих веществ в сырье.

2. С применением различных физико-химических методов анализа подтверждено наличие в подземных органах иглицы шиповатой стероидных сапонинов, фенольных соединений, свободных Сахаров, органических кислот, аминокислот, микро- и макроэлементов.

3. Подобраны оптимальные условия анализа и разработаны методики количественного определения в сырье суммы стероидных сапонинов в пересчете на рускогенин; суммы фенольных соединений в пересчете на галловую кислоту; суммы моносахаридов после гидролиза в пересчете на глюкозу методом спектрофотометрии (относительные ошибки методик не превышают соответственно

±5,46 %, ±2,71 % и ±3,19 %) и рускогенина методом ВЭЖХ (относительная ошибка методики не превышает ±3,86 %).

4. Определены основные параметры экстракции БАВ из растительного сырья, позволяющие получить готовый продукт со стабильными показателями качества, на основании чего разработана рациональная схема получения сухого экстракта.

5. С использованием качественных реакций, метода хроматографии в тонком слое сорбента и ВЭЖХ установлено наличие основных групп БАВ в сухом экстракте, присущих исходному сырью.

6. Определены критерии подлинности сухого экстракта иглицы шиповатой; разработана методика количественного определения суммы стероидных сапонинов в пересчете на рускогенин методом спектрофотометрии (относительная ошибка методики не превышает ±3,86 %); оформлен протокол валидации методик анализа.

7. Исследован аминокислотный состав сырья и сухого экстракта иглицы шиповатой; доминирующими для сырья являются аспарагиновая и глутаминовая кислоты, метионин и аланин; преобладающими в экстракте являются лейцин и изолейцин. Установлен микро- и макроэлементный состав в изучаемых объектах: превалирующими элементами являются кальций и магний.

8. В результате проведенных исследований разработаны и оформлены ТУ 9377-170-04868244-2008 «Корневища и корни иглицы шиповатой», составлен проект ФС «Иглицы шиповатой экстракт сухой», оформлен и утвержден лабораторный регламент JIP 0486824401-09 на производство иглицы шиповатой экстракта сухого.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. O.Y. Tomashevskaya, T.D. Dargaeva Study of organic acids from organs of Ruscus aculeatus II Materials of the III international scientific conference "Traditional medicine: a current situation and perspectives of development". - Ulan-Ude, 2008. - P. 58-59.

2. Dargaeva Tamara D., Tomashevskaya Olga Y. Selection of the analytical methods and conditions for standardization of raw materials and extract of Ruscus aculeatus IIМЭС ЗАСАЛ. - 2008. -№11.- P. 106-110.

3. Томашевская О.Ю. Подбор условий и разработка методики количественного определения стероидных сапонинов в пересчете на

рускогенин в растительном сырье, применяемом в производстве венотонизирующих лекарственных средств // Тезисы докладов XV Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - М., 2008.-С. 710.

4. Томашевская О.Ю. Изучение качественного состава свободных моносахаридов в подземных органах иглицы шиповатой // Материалы V Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ». - Уфа, 2008. - С.285.

5. Томашевская О.Ю., Даргаева Т.Д. Разработка методик контроля качества сухого экстракта иглицы шиповатой // Научные труды IX международного конгресса «Здоровье и образование в XXI веке». - М.,

2008. - С.499-500.

6. Томашевская О.Ю., Даргаева Т.Д., Сокольская Т.А. Изучение качественного состава и определение содержания фенольных соединений в корневищах иглицы шиповатой (Ruscus aculeatus L.) II Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. -

2009. - № 2. - С.43-45.

7. Томашевская О.Ю., Даргаева Т.Д., Сайбель O.JI. Изучение фенольных соединений сухого экстракта иглицы шиповатой // Тезисы докладов XVI Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - М., 2009. - С.749.

8. Фармакогностическое изучение корневищ и корней Ruscus aculeatus L. / Томашевская О. Ю., Вандышев В. В., Даргаева Т.Д. и др. // Фармация. - 2009. - № 3. - С.62-65.

9. Томашевская О.Ю., Даргаева Т.Д. Разработка аналитических методик идентификации и количественного определения стероидных сапонинов в подземных органах иглицы шиповатой // Тезисы докладов Международной студенческой научной конференции «Клинические и теоретические аспекты современной медицины». - М., 2009. - С.231.

Заказ № 28-а/04/09 Подписано в печать 14.04.2009 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30; (495) 778-22-20 www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru

Актуальность темы. Хроническая венозная недостаточность (ХВН) нижних конечностей — одно из наиболее часто встречаемых в повседневной медицинской практике патологических состояний, характеризующихся прогрессивным и часто осложненным течением, существенным социально-экономическим значением. По данным статистики в Российской Федерации данной патологией страдают от 30-50% трудоспособного населения, причем прослеживается зависимость частоты венозной патологии от возраста, которая начинает существенно увеличиваться после 40 лет и у людей старше 60 лет частота различных поражений венозного русла нижних конечностей достигает 80%.

В настоящее время номенклатура венотонизирующих средств представлена в основном препаратами растительного происхождения зарубежного производства на основе конского каштана обыкновенного и его сочетаний с другими компонентами.

Данное обстоятельство диктует необходимость поиска нового вида сырья и создания на его основе эффективного отечественного фитопрепарата для профилактики и лечения венозной недостаточности.

Перспективным объектом изучения, на наш взгляд, являются подземные органы иглицы шиповатой Rvscus aculeatus L., (семейство Liliaceae) используемые в производстве биологически активных добавок к пище, а также в получении лекарственных препаратов венотонизирующего действия Цикло-3 крем и Цикло-3 форт, капсулы (Франция).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является фармакогностическое изучение подземной части иглицы шиповатой, разработка технологии получения сухого экстракта и их стандартизация.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие основные задачи:

- провести фармакогностическое изучение подземных органов иглицы шиповатой, установить диагностически значимые признаки в макро- и микроскопическом строении сырья;

- разработать методики качественного и количественного определения основных групп биологически активных веществ (БАВ) в подземных органах иглицы шиповатой; установить закономерности выхода БАВ из лекарственного растительного сырья в зависимости от основных факторов, влияющих на процесс экстракции;

- разработать рациональную технологическую схему получения сухого экстракта, позволяющую проводить максимальное извлечение БАВ;

- исследовать химический состав, технологические свойства и разработать показатели качества сухого экстракта иглицы шиповатой, провести валидацию методик анализа;

- по результатам исследований оформить технические условия (ТУ) на новый вид лекарственного растительного сырья - корневища и корни иглицы шиповатой, разработать проект фармакопейной статьи (ФС) на иглицы шиповатой экстракт сухой, оформить лабораторный регламент на получение сухого экстракта, оформить протокол валидации методик анализа.

Научная новизна работы. Информационно-аналитическими исследованиями показана необходимость разработки отечественного лекарственного средства венотонизирующего действия.

На основании макро- и микроскопического анализа установлены диагностически значимые признаки в морфологическом и анатомическом строении корневищ и корней иглицы шиповатой.

Подобраны условия анализа БАВ в сырье иглицы с помощью физико-химических методов: хроматографии в тонком слое сорбента (ТСХ), высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), спектрофотометрии. Изучен качественный и количественный состав основных групп БАВ (стероидные сапонины, фенольные соединения, органические кислоты, сахара, аминокислоты), состав микро- и макроэлементов.

Установлены закономерности выхода экстрактивных веществ и стероидных сапонинов из растительного сырья в зависимости * от степени его измельченности, типа, экстрагента, соотношения сырье/экстрагент, гидродинамических условий, кратности экстракции, температуры, позволяющих разработать рациональный способ получения сухого экстракта иглицы шиповатой.

Подобраны условия анализа стероидных сапонинов в растительном сырье и сухом экстракте и разработаны методики их стандартизации.

Показана возможность разработки отечественного лекарственного средства венотонизирующего действия на основе иглицы шиповатой.

Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований разработаны и внедрены:

- Технические условия ТУ 9377-170-04868244-2008 «Корневища и корни иглицы шиповатой»;

- Проект ФС «Иглицы шиповатой экстракт сухой» (Акт внедрения методики количественного определения суммы стероидных сапонинов в иглице шиповатой экстракте сухом в Государственном учреждении здравоохранения «Центр сертификации и контроля качества лекарств Департамента здравоохранения г. Москвы» (ГУЗ «ЦСиККЛ ДЗ»);

- Лабораторный регламент ЛР 04868244-01-09 на производство иглицы шиповатой экстракта сухого.

Связь задач исследований с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских - работ ВИЛАР РАСХН по «Программе фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса РФ на 2006 — 2010 гг.», задание 04, шифр 04.13 «Разработка технологий производства высокоэффективных лечебных и профилактических препаратов из растительного сырья».

Основные положения, выносимые на защиту:

- результаты фармакогностического изучения сырья иглицы шиповатой;

- результаты исследований качественного состава и количественной оценки БАВ иглицы шиповатой;

- результаты исследований по установлению закономерности выхода БАВ в зависимости от степени измельченности сырья, вида экстрагента, соотношения сырье/экстрагент, кратности экстракции, температуры, гидродинамических условий и разработки технологии сухого экстракта;

- результаты разработки методик контроля качества сырья и сухого экстракта иглицы шиповатой, обеспечивающих сквозную стандартизацию от источника к лекарственному средству, результаты валидации методик анализа.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Впервые проведено фармакогностическое изучение корневищ и корней иглицы шиповатой. Установлены числовые показатели, диагностически значимые признаки, дана качественная и количественная характеристика действующих веществ в сырье.

2. С применением различных физико-химических методов анализа подтверждено наличие в подземных органах иглицы шиповатой стероидных сапонинов, фенольных соединений, свободных Сахаров, органических кислот, аминокислот, микро- и макроэлементов.

3. Подобраны оптимальные условия анализа и разработаны методики количественного определения в сырье суммы стероидных сапонинов в пересчете на рускогенин; суммы фенольных соединений в пересчете на галловую кислоту; суммы моносахаридов после гидролиза в пересчете на глюкозу методом спектрофотометрии (относительные ошибки методик не превышают соответственно ±5,46 %, ±2,71 % и ±3,19 %) и рускогенина методом ВЭЖХ (относительная ошибка методики не превышает ±3,86 %).

4. Определены основные параметры экстракции БАВ из растительного сырья, позволяющие получить готовый продукт со стабильными показателями качества, на основании чего разработана рациональная схема получения сухого экстракта.

5. С использованием качественных реакций, метода хроматографии в тонком слое сорбента и ВЭЖХ установлено наличие основных групп БАВ в сухом экстракте, присущих исходному сырью.

6. Определены критерии подлинности сухого экстракта иглицы шиповатой; разработана методика количественного определения суммы стероидных сапонинов в пересчете на рускогенин методом спектрофотометрии (относительная ошибка методики не превышает ±3,86 %); оформлен протокол валидации методик анализа.

7. Исследован аминокислотный состав сырья и сухого экстракта иглицы шиповатой; доминирующими для сырья являются аспарагиновая и глутаминовая кислоты, метионин и аланин; преобладающими в экстракте являются лейцин и изолейцин. Установлен микро- и макроэлементный состав в изучаемых объектах: превалирующими элементами являются кальций и магний.

8. В результате проведенных исследований разработаны и оформлены ТУ 9377-170-04868244-2008 «Корневища и корни иглицы шиповатой», составлен проект ФС «Иглицы шиповатой экстракт сухой», оформлен и утвержден лабораторный регламент JIP 04868244-01-09 на производство иглицы шиповатой экстракта сухого.