Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Фармакогностическое изучение и стандартизация винограда культурного (vitis vinifera l.) листьев красных и сухого экстракта на их основе

На правах рукописи

Дул Вячеслав Николаевич

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ И СТАНДАРТИЗАЦИЯ ВИНОГРАДА КУЛЬТУРНОГО (У1Т1Б У1ШРЕЯА Ь.) ЛИСТЬЕВ КРАСНЫХ И СУХОГО ЭКСТРАКТА НА ИХ ОСНОВЕ

14.04.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

005551801

2 I АБГ 2014

Москва-2014 г.

005551801

Диссертационная работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений (ГНУ ВИЛАР)

Научный руководитель:

Копытько Янина Федоровна - кандидат фармацевтических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории аналитической химии ГНУ ВИЛАР

Официальные оппоненты:

Потанина Ольга Георгиевна - доктор фармацевтических наук, директор центра научных исследований и разработок Центра коллективного пользования (Научно-образовательного центра) ФГБОУ ВПО РУДН.

Боковикова Татьяна Николаевна - доктор фармацевтических наук, начальник лаборатории химико-фармацевтических препаратов №1 Испытательного центра ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минзрава РФ.

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт фармации «ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Российской Федерации г. Москва.

Защита состоится « й » С Л- 2014 года в "{^ часов на заседании

Диссертационного совета Д 0061)70.01 при Государственном научном учреждении «Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений» (117216, г. Москва, ул. Грина, 7) по адресу: 123056, г. Москва, ул. Красина, д.2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВИЛАР по адресу: 117216, г. Москва, ул. Грина, 7

Автореферат разослан « £ » Сьбии-Г^^, 2014 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор фармацевтических наук

Громакова А.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

На протяжении многих лет лекарственные средства растительного происхождения широко используются в медицинской практике для профилактики и лечения различных заболеваний. Эффективность применения фитопрепаратов обусловлена комплексным действием биологически активных веществ (БАВ) на различные звенья патогенетического процесса. Помимо этого, растительные средства в сравнении с синтетическими препаратами обладают меньшей токсичностью и минимальными побочными эффектами, что особенно важно при их длительном применении в терапии хронических патологий.

К числу таких заболеваний относится хроническая венозная недостаточность (ХВН), характеризующаяся уменьшением пропускной способности венозного русла, перегрузкой венозной системы и нарушением лимфатического оттока.

Данная патология характеризуется широкой распространенностью и достигает среди трудоспособного населения 40-50 %. При этом наблюдаются тяжелое хроническое течение болезни и ранняя инвалидация больных, что свидетельствует о медико-социальной значимости ХВН для современного общества. В связи с этим, совершенствование методов профилактики и лечения на ранних стадиях заболевания по средствам внедрения в практику новых эффективных венотропных лекарственных средств является актуальной проблемой фармацевтической науки.

В настоящее время фармакологическая терапия ХВН базируется на использовании преимущественно зарубежных препаратов растительного происхождения на основе тритерпеновых и стероидных сапонинов, флавоноидов, стильбенов. Одним из таких лекарственных средств является препарат Антистакс, выпускаемый швейцарской компанией Берингер Ингельхайм, содержащий комплекс БАВ красных листьев винограда культурного. Высокая эффективность Антистакса проявляется уменьшением выраженности симптомов ХВН и способствует улучшению качества жизни пациентов.

В этой связи, в рамках выполнения требований федеральной целевой программы развития фармацевтической промышленности Российский Федерации, направленной на поэтапное замещение импортируемых лекарственных средств препаратами отечественного производства, актуальным и перспективным направлением является углубленное изучение и стандартизация красных листьев винограда культурного (К/'/к \inifera Ь.) как лекарственного растительного сырья для разработки в нашей стране на его основе венотонизирующих лекарственных средств.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы является фармакогностическое изучение винограда культурного листьев красных (ВКЛК), разработка сухого экстракта и их стандартизация.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие основные задачи:

- провести фармакогностическое изучение ВКЛК, установить диагностически значимые макроскопические и микроскопические признаки данного сырья;

- определить качественный состав и оценить содержание основных групп биологически активных веществ в ВКЛК;

- разработать методики стандартизации ВКЛК; оформить технические условия (ТУ) на лекарственное растительное сырье (ЛРС);

- установить оптимальные параметры экстракции биологически активных веществ из ЛРС; разработать технологическую схему получения сухого экстракта, позволяющую проводить максимальное извлечение БАВ, оформить лабораторный регламент,

- исследовать химический состав, технологические свойства и разработать показатели качества для ВКЛК экстракта сухого, разработать проект фармакопейной статьи (ФС).

Научная новизна работы

В результате информационно-аналитического анализа установлена целесообразность разработки отечественного лекарственного средства венотонизирующего действия.

На основании макро- и микроскопического анализа выявлены диагностически значимые признаки ВКЛК.

С помощью адаптированной методики высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием аутентичных образцов охарактеризован качественный состав фенольных соединений.

Установлено наличие и оценено содержание ресвератрола методом ВЭЖХ в сырье и экстракте винограда культурного.

Изучен состав липофильной фракции, определен аминокислотный и микроэлементный состав, установлено содержание моносахаридов ВКЛК и сухого экстракта.

Установлены закономерности извлечения экстрактивных веществ и фенольных соединений из растительного сырья в зависимости от степени измельченности сырья, температурного режима, типа экстрагента, соотношения сырье — экстрагент, гидродинамических условий, позволяющих разработать способ получения ВКЛК экстракта сухого.

Подобраны условия анализа фенольных соединений в растительном сырье и сухом экстракте и разработаны методики их стандартизации. Проведена валидация методик количественного определения фенольных

соединений по показателям линейности, воспроизводимости, правильности и повторяемости.

Практическая значимость работы

На основании проведенных исследований разработаны и внедрены:

- технические условия ТУ 9374-176-04868244-2012 «Винограда культурного листья красные»;

- лабораторный регламент ЛР 04868244-02-2013 на производство винограда культурного листьев красных экстракта сухого;

- проект ФС «Винограда культурного листьев красных экстракт сухой» (Акт внедрения методики количественного определения суммы фенольных соединений в сухом экстракте винограда культурного в ГБУЗ «ЦЛО и КК

да»).

Личный вклад автора

Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, постановке цели и задач, выборе объектов исследования, проведении экспериментальных исследований, обобщению полученных данных и их статистической обработке.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности Научные положения диссертации соответствуют паспорту специальности 14.04.02 — фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведенных исследований соответствуют пунктам 3 и 6 паспорта специальности.

Основные положения, выносимые на защиту

- результаты исследований качественного состава и количественной оценки БАВ ВКЛК и получаемого из него сухого экстракта;

- результаты исследований по подбору условий и разработке технологии получения сухого экстракта из ВКЛК;

- результаты разработки методик контроля качества сырья и экстракта сухого ВКЛК, обеспечивающих сквозную стандартизацию от источника к лекарственному средству.

Апробация работы

Основные положения диссертации представлены и доложены на 76-й Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученных с международным участием «Молодежная наука и современность» (Курск, 2011); XVIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2011); XXI Московской международной гомеопатической конференции «Развитие гомеопатического метода в современной медицине» (Москва, 2011); XI Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке. Научные и прикладные аспекты концепции здоровья и здорового образа жизни» (Москва, 2010); Международном конгрессе «Физическое и духовное здоровье: традиции

и инновации» (Москва, 2011); XVI Международной научно-практической конференции по актуальным вопросам виноделия» (Москва, 2012); Первой научно-практической конференции аспирантов и молодых ученных «Молодые ученные и фармация XXI века» (Москва, 2013); Всероссийская конференция с международным участием: «От растения к препарату: традиции и современность» (Москва 2014).

Связь задач исследований с проблемным планом НИР.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с «Программой фундаментальных и приоритетных прикладных исследований Всероссийского научно-исследовательского института лекарственных и ароматических растений по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса (АПК) Российской Федерации на 2011 - 2015 годы».

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ, в том числе 8 статей, входящих в перечень периодических изданий рецензируемых ВАК.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 129 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы (глава 1), четырех глав экспериментальной части, выводов, списка литературы, включающего 135 источников, в том числе 67 иностранных, приложений. Работа содержит 29 рисунков и 39 таблиц.

В первой главе на основании обзора данных литературы описаны принципы современной фармакотерапии ХВН, дана характеристика номенклатуры венотонизирующих лекарственных средств растительного происхождения, зарегистрированных в РФ. Обоснована рациональность использования винограда культурного в качестве сырья для создания флеботропного средства. Приведены сведения о перспективности использования ресвератрола в составе лекарственных субстанций. Отражены особенности современного производства сухих экстрактов из растительного сырья.

В разделе «Объекты и методы исследования» приведены сведения об объектах изучения, о методах и приборах, используемых в экспериментах.

Вторая глава посвящена фармакогностическому исследованию красных листьев винограда культурного, установлению показателей качества сырья и норм содержания БАВ.

В третьей главе изложены данные анализа состава фенольных соединений, ресвератрола, моносахаридов, аминокислот, липофильной фракции, макро- и микроэлементов с использованием современных физико-химических методов.

В четвертой главе представлены результаты по разработке рациональной технологической схемы получения сухого экстракта винограда культурного.

Пятая глава содержит сведения по фитохимическому изучению и стандартизации сухого экстракта винограда культурного.

Объекты и методы исследования

Объектами исследования служили образцы опытных партий винограда культурного листья красные сорта Каберне, Саперави, Голубок, Красностоп Золотовский, заготовленные в фазу интенсивного покраснения (конец вегетации), собранные в сентябре-октябре в Ростовской обл., Константиновского р-на, хутор Ведерников и Молдова с. Конгаз в 2009-2012 гг.

Отбор проб и анализ JIPC проводили по методикам ГФ XI изд. и разработанными нами методами качественного и количественного определения суммы фенольных соединений.

Исследование морфологических признаков полученного сырья осуществляли в соответствии с требованиями статьи «Листья» (ГФ XI, том. 1, с. 282).

Изучение анатомических признаков цельного сырья проводили в соответствии с указаниями статьи «Техника микроскопического и микрохимического исследования лекарственного растительного сырья» (ГФ XI, том. 1, с. 277). Микроскопические исследования проводили с помощью микроскопа MINIMED 501 сбинокуляром АУ-12 1,5х (окуляр 10х и объективы: 3,7х, 10х, 20х, 40х) и микровизора |_iVisor (ЛОМО). Полученное на микровизоре изображение редактировали в Microsoft Photo Editor.

Для хроматографии в тонком слое сорбента использовали пластинки Kieselgel 40 F254; Е. Мегк, Darmstadt размером 10x20 см. Хроматографирование выполняли при температуре (19-23) °С в герметически закрытых вертикальных стеклянных камерах. Нанесение исследуемых растворов на хроматографические пластинки осуществляли при помощи шприца Hamilton (10 мкл). Соотношение растворителей учитывали в объемных частях. Все значения Rf обнаруженных соединений рассчитаны как средние из пяти измерений. Для тонкослойной хроматографии подобрана система растворителей: хлороформ — этилацетат — муравьиная кислота (25 : 10 : 1). Обнаружение зон адсорбции ресвератрола производили после высушивания и просматривания хроматограмм в УФ-свете при длине волны 365 нм.

Спектры поглощения снимали на спектрофотометре «Сагу 100 Sean» Varían (США) в кювете с толщиной поглощающего слоя жидкости 10 мм.

Изучение фенольных соединений осуществляли на хроматографе «Gilston», модель 305 (Франции) с последующей компьютерной обработкой результатов исследования с помощью программы Мультихром для «Windows». В качестве неподвижной фазы использована металлическая колонка Kromasil С 18 (4,6x250 мм), размер частиц 5 мкм. Подвижной фазой служила смесь метанол - вода — фосфорная кислота концентрированная, в соотношении 400 : 600 : 5. Анализ проводили при комнатной температуре. Скорость подачи

элюента 0,8 мл/мин. Детектирование проводилось с помощью УФ-детектора «Gilston», UV/VIS модель 151, при длине волны 254 нм.

Исследование ресвератрола проводили на хроматографе «Shimadzu LC 20 prominence» с диодноматричным детектором SPD - М20А. Размер колонки 250x4,6 мм, сорбент - Кромасил 100 С 18,5 мкм, температура - комнатная, длина волны детектирования - 306 нм, подвижная фаза - ацетонитрил : вода (30:70).

Исследования липофтьной фракции проводили в системе: хроматограф-масс-спектрометр-ЭВМ, состоящей из газового хроматографа Hewlett-Paccard 5890, масс-селективного детектора НР5973А - ЭВМ Vectra и программой обработки данных «HP Chem Station». Разделение компонентов смеси проводили на кварцевой капиллярной колонке HP - 5MS30 м х 0,25 мм х 0,33 ммкс привитой фазой 5 % метилфенилсиликона, 95 % диметилсилоксана, при программировании температуры от 50 °С до 280 °С со скоростью 10 °С в мин. Температура инжектора 280 °С, температура интерфейса 290 °С, температура масс-селективного детектора 250 °С. Скорость газа носителя (гелия) 1 мл/мин. Объем вводимой пробы с помощью автосамплера 1 мкл. Сброс отсутствует. Давление в инжекторе программируется с 8,8 до 22,0 psi. Масс-спектры получали при ионизации электронным ударом 70 eV сканирование спектров от 33 до 450 а.е.м. При интерпретации масс-спектров пользовались системой автоматического поиска из Chem Station, контроль интерпретации проводили на основании спектро-структурных корреляций. Идентификацию компонентов осуществляли по масс-спектрам электронного удара.

Изучение аминокислотного состава проводили на аминокислотном анализаторе Amino Acid Analyzer AAA 339 (Чехия).

Определение микроэлементов осуществляли на волновом рентгеновском спектрометре S4 Pioner (Bruker AXS, Germany).

Фармакологическое исследование in vitro сухого экстракта винограда культурного выполняли в отделе экспериментальной и клинической фармакологии ГНУ ВИЛАР.

При разработке методик качественного и количественного определения БАВ использованы хроматографически чистые вещества и стандарты фирмы Sigma, Fluka и отвечающие требованиям ФС - лютеолин, лютеолин-7-глюкозид, рутин. Для экстракции БАВ и приготовления хроматографических систем использовали растворители марки «ч» и «хч». Приготовление реактивов, используемых в экспериментальной части работы осуществляли согласно ГФ XI и ГФ XII.

Разработанные методики количественного определения суммы фенольных соединений методом спектрофотомерии валидированы в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002 и проектом ОФС «Валидация фармакопейных методов».

Статистическая обработка результатов количественного определения проводилась в соответствии с требованиями ГФ XI изд.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Фармакогностическое изучение винограда культурного листьев красных и разработка методов контроля его качества

Обоснование выбора исследуемого сырья

Согласно ГФ XI статье «Листья» (Folia) сырье данной морфологической группы должно представлять собой высушенные или свежие листья или отдельные листочки сложного листа. Однако, согласно данным литературы и проведенными нами исследованиям название сырья винограда требует уточненной формулировки «Винограда культурного листья красные», поскольку сырьем являются листья, собранные осенью. В этот период растение вместо хлорофилла, необходимого летом для фотосинтеза, начинает синтезировать антоцианы, придающие листьям красный цвет.

Кроме того, в этот период вегетации в целях адаптации к холодной погоде, растение вырабатывает повышенное количество ресвератрола, что делает красные листья более ценным источником биологически активных веществ.

Следует учитывать также целесообразность сбора данного растительного сырья в период полного покраснения листьев, поскольку в климатических условиях нашей страны большинство виноградников находится в зоне рискованного земледелия, в связи с чем для улучшения условий зимовки перед укрытием, как правило, листья целенаправленно обрывают, что практикуется в первую очередь в Ростовской области. При этом красные листья являются вторичными ресурсами виноградарства, и их сбор не вредит использованию винограда культурного в качестве сырья пищевой промышленности и виноделия.

Таким образом, новый вид лекарственного растительного сырья предложено назвать «Винограда культурного листья красные».

Виноград культурный является самым распространенным видом, широко культивируемым на территории РФ и успешно используемым для селекции. В настоящее время известно около 4 тысяч сортов винограда. В связи с этим, для обоснования выбора лекарственного сырья нами проведено исследование красных листьев четырех широко культивируемых сортов винограда, таких как Саперави, Голубок, Каберне, Красностоп Золотовский. В указанных сортах определено содержание экстрактивных веществ (по методике ГФ XI изд.), суммы фенольных соединений в пересчете на рутин (методом спектрофотометрии) и ресвератрола (методом ВЭЖХ). Согласно полученным данным наибольшее количество экстрактивных веществ, ресвератрола и фенольных соединений содержится в красных листьях винограда культурного сорта Каберне.

Наряду с этим, проведено биотестирование в опытах in vitro с использованием глутатионредуктазной и пируваткиназной реакций сухих экстрактов, полученных из красных листьев 4 сортов винограда культурного. В результате исследования было установлено, что образцы сортов Голубок и

Каберне обладают более высокой скоростью экспериментальных реакций и тем самым оказывают более выраженный фармакологический эффект.

Таким образом, в качестве сырья для производства венотонизирующих средств предложено использовать винограда культурного листья красные сорта Каберне.

Исследование морфологических признаков сырья По результатам анализа морфологических характеристик образцов опытных партий составлено описание внешних признаков «Винограда культурного листьев красных». Сырье должно представлять собой трех-пятилопастные или рассеченные пластинки листьев при основании с более или менее глубокой выемкой различной формы, по краю неравномернозубчатые, голые или в различной степени опушенные короткими щетинистыми или паутинистыми волосками, особенно с нижней стороны листа. Цвет листьев от красно-бурого до красного с зеленоватым оттенком. Запах пряный специфический. Вкус слегка вяжущий.

Исследование микроскопических признаков сырья Для выявления диагностических признаков в анатомическом строении проведено микроскопическое исследование главной жилки, жилок второго порядка, эпидермиса верхней и нижней стороны листа (Рисунок 1).

Для определения строения жилки готовили поперечный срез главной жилки и жилок второго порядка. Препараты окрашивали флороглюцином в присутствии соляной кислоты, а также использовали реакцию двойного окрашивания. При обработке флороглюцином ксилема и механические элементы окрашивались в красно-малиновый цвет. После проведения реакции двойного окрашивания ксилема должна приобретать зеленый цвет, а флоэма и паренхима - синий. В нашем случае, в связи с присутствием пигментов в тканях красных листьев винограда, четкого цветового различия не наблюдалось, поэтому ткани приобретали черную или темно-синюю окраску. Кроме того, на поперечном срезе видны закрытые коллатеральные пучки, расположенные по окружности. В главной жилке количество пучков составило 6-8, в жилках второго порядка — 4.

При рассмотрении листа с поверхности видны клетки эпидермиса верхней стороны - многоугольные со слабоизвилистыми равномерно утолщенными стенками с ровной кутикулой. Под верхней эпидермой располагаются клетки столбчатого мезофилла. Эпидермальные клетки нижней стороны - овальной формы со слабоизвилистыми равномерно утолщенными стенками и ровной кутикулой. Под нижней эпидермой располагаются клетки губчатого мезофилла. Устьица располагаются на обеих сторонах листа. Основная масса сосредоточена на нижней стороне листа. Устьица имеют овальную форму и окружены 3-7 клетками эпидермиса (аномоцитный тип). Устьичные (замыкающие) клетки - ладьевидные, т.е. с утолщенными

внутренними стенками и веретенообразной щелью. Для эпидермы листа винограда характерны трихомы (выросты эпидермы) разного типа:

- многочисленные многоклеточные (4-9-клеточные) конусовидные волоски. Имеют утолщенные стенки клеток (толстостенные) и многоклеточное основание, покрыты бородавчатой кутикулой. Расположены вдоль жилок на нижней стороне листа.

- железистые трихомы - булавовидные железки (железистые волоски) с многоклеточной многорядной головкой на одноклеточной ножке.

- на нижней эпидерме встречаются крупные гусеницевидные волоски со складчатой кутикулой.

- железки - округлой формы, с 5-7-клеточной головкой. В месте прикрепления железки образуется розетка из клеток эпидермиса.

Рисунок 1 - Микроскопия винограда культурного листьев красных: поперечный срез главной жилки (1), верхняя эпидерма (2), нижняя эпидерма (3), многочисленные многоклеточные конусовидные волоски (4), железистые трихомы с многоклеточной многорядной головкой на одноклеточной ножке (5),

гусеницевидные волоски со складчатой кутикулой (6), железки округлой формы (7), минеральные включения в виде друз (8), минеральные включения в

виде рафид (9).

При микроскопии листа винограда обнаружили присутствие минеральных включений в виде друз, расположенных преимущественно вдоль жилок и рафиды (скопление игольчатых кристаллов).

2. Установление подлинности и разработка методики количественного

определения

Для подтверждения подлинности красных листьев винограда помимо макроскопического и микроскопического методов, нами предложено использовать качественные реакции (на фенольные соединения с раствором железа окисного хлорида и на флавоноиды с концентрированной хлористоводородной кислотой и порошком магния) и ТСХ со стандартным образцом ресвератрола.

По данным литературы и проведенному исследованию основной группой БАВ, обусловливающей антиоксидантное, капилляроукрепляющее и венотонизирующее действие сырья винограда культурного, являются фенольные соединения. В связи с этим, для количественной оценки содержания БАВ предлагается методика спектрофотометрического определения суммы фенольных соединений. В ходе исследования было установлено, что УФ-спектр поглощения комплекса фенольных соединений винограда культурного с раствором алюминия хлорида имеет максимум поглощения при 410 им, и совпадает со спектром поглощения аналогичного комплекса рутина (Рисунок 2). В связи с этим, в качестве аналитической длины волны предложено использовать 410 нм и проводить определение содержания фенольных соединений в пересчете на рутин. Расчет проводили с использованием удельного показателя поглощения комплекса рутина с алюминия хлоридом равном 249 нм, установленным нами экспериментально.

1.0 1

0,80,6-

350 400 450 500

\Л/ауе!епд01 (гап)

Рисунок 2 - Спектр поглощения комплекса фенольных соединений винограда культурного листьев красных с алюминия хлоридом (1) и комплекса СО рутина

с алюминия хлоридом (2)

В ходе исследований нами подобраны оптимальные условия экстракции данной группы БАВ: аналитическую пробу сырья измельчают до частиц, размером не более 2 мм, экстракцию ведут при нагревании на водяной бане с обратным холодильником в течение 1 ч, в качестве экстрагента используют 50 % спирт при соотношении сырье : экстрагент 1 : 50. Относительная ошибка разработанной методики составляет 5,55 % (Таблица 1)

Таблица 1 - Метрологические характеристики методики количественного определения суммы фенольных соединений в пересчете нарутин в красных ___ листьях винограда культурного __

f Р,% Х,% Б2 8 дх Е%

9 95 2,26 2,784 0,00467 0,06835 0,154 ±5,55

Результаты опытов с добавками рутина представлены в таблице 2 свидетельствуют об отсутствии систематической ошибки методики.

Кроме того, в соответствии с современными требованиями, предъявляемыми к аналитическим методикам, нами проведена валидация разработанной методики определения суммы фенольных соединений в пересчете на рутин по критериям правильность, воспроизводимость, специфичность и линейность.

Таблица 2 - Результаты опытов с добавками рутина в навеску сырья

Содержание Добавлено Должно Найдено, Абсолютная Относитель

фенольных рутина, г быть, г г ошибка, г ная

веществ в ошибка,%

навеске, г

0,0550 0,0137 0,0687 0,0672 0,0015 +2,18

0,0561 0,0278 0,0839 0,0847 0,0008 -0,92

0,0549 0,0534 0,1083 0,1097 0,0014 -1,31

Методика количественного определения суммы фенольных соединений в пересчете на рутин в красных листьях винограда культурного включена в разработанные проект ТУ на сырье и в лабораторный регламент на производство сухого экстракта.

Содержание фенольных соединений в зависимости от места сбора сырья Для определения зависимости накопления БАВ от места произрастания нами проведен анализ сырья, заготовленного в зоне укрывного виноградарства Ростовской области и в Молдове. На основании полученных данных установлена норма содержания фенольных соединений в сырье - не менее 2 %.

Разработка нормативной документации на сырье На основании проведенных исследований разработаны и оформлены технические условия на новый вид лекарственного сырья «Винограда культурного листья красные». В соответствии с требованиями ТУ контроль качества ЛРС осуществляется по следующим показателям: внешние признаки, подлинность (микроскопия, качественные реакции), числовые показатели (сумма фенольных соединений в пересчете на рутин; влажность; зола общая; зола, нерастворимая в 10 % растворе кислоты хлористоводородной; другие части растения, в т.ч. отделенные при анализе; почерневших и зеленых листьев; частицы, проходящие сквозь сито с отверстиями диаметром 0,5 мм; органическая и минеральная примеси), упаковка, маркировка.

ТУ 9374-176-04868244-2012 «Винограда культурного листья красные» зарегистрирован и утвержден в ГНУ ВИЛАР.

3. Фитохимическое изучение винограда культурного листьев красных

Определение фенольных соединений Согласно сведениям литературы ВКЛК содержат такие группы БАВ, как фенольные соединения, липиды, сахара, терпеноиды, витамины, полиамины. С помощью качественных реакций нами обнаружены фенольные соединения (по реакции с раствором железа окисного хлорида и реакции с концентрированной хлористоводородной кислотой и порошком магния). Для установления качественного состава фенольных соединений винограда культурного проведен ВЭЖХ-анализ сырья (Рисунок 3).

Рисунок 3 - ВЭЖХ-хроматограмма фенольных соединений винограда культурного листьев красных

В результате исследования в винограда культурного листьев красных идентифицировано 15 веществ, относящихся к различным группам фенольных соединений, таким как флавоноиды (рутин, кверцетин, кверцетин-глюкоронид, дигидрокверцетин, апигенин), фенолкарбоновые кислоты (о-кумаровая, хлорогеновая, кофейная, феруловая), дубильные вещества (катехин, эпикатехин), стильбены (ресвератрол) и кумарины (дикумарин и дигидрокумарин). Преобладающим в процентном отношении в смеси являются кверцетина глюкоронид, кофейная, феруловая кислоты, дикумарин, витексин, эпикатехин.

Определение ресвератрола Учитывая важность предполагаемого участия данного БАВ в суммарном фармакологическом эффекте красных листьев винограда при заболеваниях вен нижних конечностей, нами предложена методика идентификации и определения содержания ресвератрола в исследуемом сырье (Рисунок 4).

!г

тм» ц\

60000- ¡1 \|

юооо V

•ММу и

о Ч, л _____л__

Пик Время удерживания Площадь Высота Площадь % Имя

1 5,350 217650 23096 18,175

2 5,684 58841 10292 4,913

3 6,262 143454 12732 11,979

4 9,791 777594 67265 64,933 Транс-резвератрол

Общий 1197540 113385 100,000

Рисунок 4 — Результаты определения содержания ресвератрола методом ВЭЖХ в красных листьях винограда культурного

Содержание ресвератрола в красных листьев винограда составляет 0,007%. Относительная ошибка единичного определения 2,29 % (Таблица 3).

Таблица 3 - Метрологические характеристики методики количественного определения ресвератрола в красных листьях винограда методом ВЭЖХ

П Р,% Х,% 52 5 АХ Е%

10 95 2,26 2,784 0,00467 0,06835 0,154 ±5,55

Изучение липофильной фракции Исследование липофильного комплекса проводили путем исчерпывающей экстракции сырья н-гексаном в аппарате Сокслета и последующим анализом гексановой фракции на газо-жидкостном хроматографе. Идентификацию компонентов осуществляли по масс-спектрам электронного удара.

Анализируя полученные данные можно отметить, что в липофильной фракции идентифицировано 20 соединений, относящиеся к различным химическим группам: 1) жирные кислоты и их производные (миристиновая, пальмитиновая, линоленовая, пальмитолеиновая кислоты); 2) соединения терпеновой природы, являющиеся составной частью эфиромасличной фракции (<1-лимонен, геранилфенилацетат, сквален и др.); 3) дитерпеновый спирт фитол; 4) жирорастворимые витамины - а- и у-токоферолы; 5) производное пиразола; 6) высшие алифатические углеводороды и другие органические вещества.

Определение моносахаридов Для оценки содержания данной группы БАВ в красных листьях винограда культурного использована методика спектрофотометрического определения суммы моносахаридов после гидролиза с применением реакции образования окрашенного комплекса моносахаридов с пикриновой кислотой. Содержание суммы моносахаридов в пересчете на глюкозу в данном сырье составило 1,35 % (Таблица 4).

Таблица 4 - Метрологические характеристики методики количественного определения суммы моносахаридов после гидролиза в красных листьях винограда культурного

п Р,% КР,0 Х,% Б* в ДХ Е,%

10 95 2,26 0,007 0,00000032 0,00057 0,0004 ±5,76

Определение аминокислот Учитывая, что аминокислоты являются гидрофильными соединениями, объектом исследования стали водные извлечения из растительного сырья. В результате проведенного анализа в красных листьях винограда идентифицировано 18 аминокислот, в том числе 9 незаменимых для организма человека (аргинин, валин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, треонин, фенилаланин) и 3 соединения, содержащих аминогруппу (таурин, фосфоэтаноламин и этаноламин),

Преобладающими по содержанию аминокислотами являются аспарагиновая и глутаминовая кислоты, глицин и аланин.

Определение макро- и микроэлементов С помощью рентгенофлуоресцентного анализа определено 22 элемента и установлено их количественное содержание. В красных листьях винограда обнаружено высокое содержание кальция (более 3 %), значительные концентрации кремния, магния, калия, серы и алюминия.

4. Разработка способа получения сухого экстракта винограда культурного

Определение оптимальных параметров экстракции Опыт современного производства фитопрепаратов подтверждает рациональность использования сухих экстрактов в качестве субстанции для получения различных лекарственных форм. Технологическая схема получения сухих экстрактов из ЛРС предусматривает стадии твердофазной экстракции, упаривания полученного извлечения, очистку и сушку концентрированного экстракта (Рисунок 5).

При исследовании оптимальных условий стадии экстракции исследуемого сырья было установлено, что для красных листьев винограда необходимо проведение трехкратной экстракции по 1 ч сырья со степенью измельчения 5 мм в соотношении 1 : 10 при использовании в качестве экстрагента 24 % спирта и нагревания до 60 °С.

Все подобранные параметры процесса экстракции были положены в основу проведения серии балансовых загрузок в лабораторных условиях.

Анализ готового продукта и отходов производства (шрота, осадка балластных веществ) осуществляли по разработанной нами методике определения суммы фенольных соединений в пересчете на рутин. На основании проведенных загрузок оформлен и утвержден лабораторный регламент на производство винограда культурного листьев красных экстракта сухого № ЛР 04868244-02-2013

Изучение физических свойств сухого экстракта Готовый продукт - винограда культурного экстракт сухой представляет собой растворимый в 50 % спирте аморфный гигроскопичный порошок красновато-коричневого цвета со специфическим слегка ароматным запахом. Вкус кисло-горький, вяжущий. Гигроскопичный, комкуется.

Для характеристики сухого экстракта винограда культурного изучены его технологические свойства: насыпная масса при свободном падении 0,66 г/см , насыпная масса при уплотнении 0,83 г/см3, сыпучесть 2,69 г/с, угол естественного откоса 38°.

Спирт этиловый

Вода очищенная

тп. 2.1 Приготовление 24 % этилового спирта и экстракция измельченного сырья

ТП. 2.2 Фильтрация экстракта

ТП. 2.3 Концентрирование экстракта

ТП. 2.4 Центрифугирование концентр ированногоэкстр акта

ТП. 2.5 Сушка очищенного экстракта 4

ТП. 2.6 Измельчение сухого экстракта

ТП.1 Измельчение

растительного

сырья

ТП. 2 Получение

готового

продукта

УМОЗ Фасовка,

упаковка,

маркировка

сухого

экстракта

Потери

В канализацию

Шрот

В сборник на выброс

Отгон спирта

Осадок балластных веществ

В сборник на выброс

Потери

В сборник на выброс

Рисунок 5 - Технологическая схема производства сухого экстракта винограда культурного листьев красных

5. Фотохимическое изучение сухого экстракта винограда

По данным литературы и на основании предварительного фитохимического изучения красные листья винограда культурного содержат фенольные соединения, резвератрол, сахара, аминокислоты, макро- и микроэлементы. Для подтверждения присутствия указанных действующих веществ в сухом экстракте проведен качественный анализ БАВ в данной лекарственной субстанции.

Определение фенольных соединений В результате анализа методом ВЭЖХ в сухом экстракте ВКЛК идентифицировано 13 веществ фенольной природы (танин, галловая кислота, катехин, эпигаллокатехингаллат, хлорогеновая кислота, эпикатехин, кофейная кислота, лютеолин-7-глюкозид, гиперозид, резвератрол, кверцетин-глюкуронид, лютеолин, апигенин), преобладающим в процентном соотношении является резвератрол и кверцетин-глюкуронид.

Определение ресвератрола Подтверждение присутствия и установление содержания ресвератрола в сухом экстракте красных листьев винограда проводили с помощью адаптированной методики ВЭЖХ (Рисунок 6).

Пик Время удерживания Площадь Высота Площадь % Имя

1 8,609 234390 19506 19,867

2 9,556 416046 37440 35,264 Транс-резвератрол

3 18,879 529368 26428 44,869

Общий 1179804 83374 100,000

Рисунок 6 — Результаты определения содержания ресвератрола методом ВЭЖХ в сухом экстракте винограда культурного листьев красных

В сухом экстракте винограда культурного содержание ресвератрола составляет 0,0092 %. Метрологические характеристики методики представлены в таблице 5.

Таблица 5 - Метрологические характеристики методики количественного определения ресвератрола в сухом экстракте винограда культурного методом

ВЭЖХ _

П Р,% 1(Р,0 Х,% Б ДХ Е,%

10 95 2,26 0,0092 0,00000052 0,00072 0,00051 ±5,56

Определение моносахаридов Методом спектрофотометрии по методике, аналогичной таковой на сырье оценено содержание суммы моносахаридов в пересчете на глюкозу, которое составило 3,92 % (Таблица 6).

Таблица 6 — Метрологические характеристики методики количественного определения суммы моносахаридов в сухом экстракте винограда культурного

{ X Б Б Р,% «У») ДХ Е,%

9 3,92 0,0763 0,2762 95 2,26 0,198 ±5,04

Определение аминокислот На основании проведенного исследования с помощью аминокислотного анализатора в сухом экстракте винограда культурного обнаружено 13 аминокислот, из которых 5 (валин, изолейцин, лейцин, фенилаланин, лизин) относятся к незаменимым.

Определение макро- и микроэлементов Изучение минерального состава осуществляли методом РФА анализа. В результате эксперимента определено 13 элементов, преобладающими по количественному содержанию являются кальций и марганец

6. Разработка методик стандартизации сухого экстракта винограда

культурного

Для установления подлинности сухого экстракта предусмотрено проведение качественных реакций на присутствие фенольных соединений, а также ТСХ-анализ со стандартным образцом ресвератрола.

Для контроля содержания БАВ использована методика спектрофотометрического определения суммы фенольных соединений в пересчете на рутин, разработанная для анализа красных листьев винограда культурного, и адаптированная для сухого экстракта.

Метрологические характеристики методики, представленные в таблице 7, свидетельствуют об удовлетворительной воспроизводимости, а результаты опытов с добавками показали отсутствие систематической ошибки в процессе ее проведения (Таблица 8).

Таблица 7 — Метрологические характеристики результатов количественного определения суммы фенольных соединений, в пересчете на рутин, в сухом экстракте

{ X Б Б2 Р,% ДХ Е,%

9 8,814 0,0631 0,00398 95 2,26 0,142 ±2,62

Найдено суммы фенольных соединений в экстракте, г Добавлено рутина, г Должно быть, г Найдено, г Ошибка

Абсолютная г Относитель ная, %

0,0862 0,0215 0,1077 0,1086 +0,0009 +0,83

0,0868 0,0434 0,1302 0,1279 -0,0023 -1,79

0,0865 0,0648 0,1513 0,1483 -0,003 -2,02

Результаты, полученные при валидации методики количественного определения суммы фенольных соединений, в пересчёте на рутин, позволяют оценить ее положительно по параметрам правильность, прецизионность, специфичность, аналитическая область, линейность и диапазон.

На основании проведенных экспериментов разработан и оформлен проект фармакопейной статьи «Винограда культурного листьев красных экстракт сухой». В фармакопейную статью включены следующие разделы: описание, подлинность, потеря в массе при высушивании, тяжелые металлы, микробиологическая чистота, количественное определение суммы фенольных соединений в пересчете на рутин, упаковка, маркировка, хранение срок годности. В настоящее время продолжаются исследования по изучению стабильности сухого экстракта при хранении и сроков его годности.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. В результате фармакогностического изучения винограда культурного листьев красных установлены показатели качества сырья и их нормы. Подобраны оптимальные условия анализа и предложена методика количественного определения суммы фенольных соединений в пересчете на рутин.

2. В ходе фитохимического исследования винограда культурного листьев красных определен качественный состав фенольных соединений. Подтверждено наличие и установлено содержание суммы моносахаридов, липидного комплекса, аминокислот, ресвератрола, микро- и макроэлементов в изучаемом сырье. В результате проведенных исследований оформлены и утверждены технические условия ТУ 9374-176-04868244-2012 «Винограда культурного листья красные».

3. Подобраны оптимальные условия экстрагирования, позволяющие получить максимальный выход готового продукта со стабильными показателями качества. Предложена рациональная схема получения сухого экстракта ВКЛК. По результатам исследования оформлен и утвержден лабораторный регламент ЛР 04868244-02-2013.

4. В сухом экстракте винограда культурного подтверждено наличие фенольных соединений, ресвератрола, моносахаридов, аминокислот и микроэлементов, присущих исходному сырью, что свидетельствует о рациональности предложенной технологии получения сухого экстракта из красных листьев винограда культурного.

5. Определены критерии подлинности сухого экстракта винограда культурного и разработана методика количественного определения суммы фенольных соединений в пересчете на рутин. На основании проведенных исследований составлен проект ФС «Винограда культурного листьев красных экстракт сухой».

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Виноград культурный УШэ Ут^ега Ь. - новый источник макро- и микроэлементов / В.Н .Дул, Е.В. Чупарина, Т.Д. Даргаева, Я.Ф. Копытько, Т.А. Сокольская // Вестник ВГУ серия География Геоэкология. - 2010. - № 2. -С.76-78.

2. Изучение компонентного состава липофильной фракции, полученной из листьев винограда \inifera Ь.) / В.Н. Дул, К.А. Пупыкина, Т.Д. Даргаева, Я.Ф. Копытько, Т.А. Сокольская // Башкирский химический журнал. — 2010. — Том 17. - № 5. - С. 121-124.

3. Исследование красных листьев винограда на содержание фенольных соединений и макро- и микроэлементов / В.Н. Дул, А.А. Кирьянов, Я.Ф. Копытько, Т.А. Сокольская, Т.Д. Даргаева // XI международный конгресс «Здоровье и образование в XXI веке» «Научные и прикладные аспекты концепций здоровья и здорового образа жизни». - 2010. - С. 361-362.

4. Дул, В.Н. Оценка содержания фенольных соединений в красных листьях винограда / В.Н. Дул, Я.Ф. Копытько, Т.Д. Даргаева, Т.А. Сокольская // Тезисы докладов XXI Московской международной гомеопатической конференции. Развитие гомеопатического метода в современной медицине. — 2011. — С.160-161.

5. Дул, В.Н. УШб Ут^ега в гомеопатии / В.Н. Дул, Я.Ф. Копытько, Т.Д. Даргаева, Т.А. Сокольская // Тезисы докладов XXI Московской международной гомеопатической конференции. Развитие гомеопатического метода в современной медицине. - 2011. - С.161-163.

6. Дул, В.Н. Изучение аминокислотного состава в красных листьях винограда / В.Н. Дул, Я.Ф. Копытько, Т.Д. Даргаева, Т.А. Сокольская // Сборник материалов конференции/ Тезисы докладов. XVIII Российский национальный конгресс «Человек и Лекарство». - 2011. - С. 503.

7. Дул, В.Н. Фитохимическое изучение красных листьев винограда / В.Н. Дул, Я.Ф. Копытько // Сборник 76-й Всероссийсккой научной

конференции студентов и молодых ученных с международным участием: «Молодежная наука и современности». - 2011. - Часть II. - С.238.

8. Фитохимическое изучение жирорастворимого комплекса выделенного из листьев винограда / В.Н. Дул, Т.Д. Даргаева, К.А. Пупыкина, Я.Ф. Копытько, ТА. Сокольская // Медицинский вестник Башкоторстан. — 2011. - №3. - С. 128-130.

9. Фармакологическое изучение листьев винограда культурного Vitis Vinifera L. / В.Н. Дул, Т.Д. Даргаева, Т.А. Сокольская, К.А. Пупыкина Р.Р.Файзулина // Традиционная медицина, международный конгресс. - 2011. -№5. —С.184—186.

10. Анатомо-диагностические признаки листьев винограда культурного {Vitis Vinifera L.) / В.Н. Дул, Т.Д. Даргаева, Т.А. Сокольская, К.А. Пупыкина, P.P. Файзулина, Я.Ф. Копытько // Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии. - 2012. - №1. - С.109-112..

11. Дул, В.Н. Листья винограда культурного — как источник ценных биологически активных веществ / В.Н. Дул, Т.Д. Даргаева, Т.А. Сокольская, КА. Пупыкина // Медицинский вестник Башкоторстана. - 2012. - №5. - Том7. -С.38-39.

12. Химический состав и биологически активные вещества красных листьев винограда / Л.А. Оганесян, АЛ. Панаснж, Е.И. Кузьмина, ДА. Свиридов, ТА. Сокольская, Т.Д. Даргаева, В.Н. Дул // Напитки. Технологии и инновации. -2012. - №10. - С.63-65.

13. Перспективы использования красных листьев винограда в качестве вторичного сырья / Л.А. Оганесян, А.Л. Панасюк, Е.И. Кузьмина, ДА. Свиридов, ТА. Сокольская, Т.Д. Даргаева, В.Н. Дул // XVI Международный профессиональный конкурс вин и спиртных напитков. — 2012. — №5. —С.24-26.

14. Дул, В.Н. Изучение аминокислотного состава красных листьев винограда / В.Н. Дул, Я.Ф. Копытько, Т.Д. Даргаева, Т.А. Сокольская// Материалы первой научно-практической конференции аспирантов и молодых ученых ГНУ ВИЛАР Россельхозакадемии. - 2013. - С.60-63.

15. Изучение состава фенольных веществ красных листьев винограда культурного (Vitis vinifera L.) методом ВЭЖХ. / В.Н. Дул, Т.Д. Даргаева, Я.Ф. Копытько, ТА. Сокольская / Научно-практический журнал «Вопросы обеспечения качества лекарственных средств». - 2014. — №3. - С.ЗЗ—36.

16. Дул, В.Н. Качественное и количественное определение ресвератрола в красных листьях винограда (Vitis vinifera L.) и сухом экстракте / В.Н. Дул, Я.Ф. Копытько, ТД. Даргаева, СЛ. Баслимов, Т.А. Сокольская, А.И. Громакова // Сборник научных трудов Всероссийской конференции с международным участием: «От растения к препарату: традиции и современность». - 2014. - С.199-203.

Подписано в печать:

05.08.2014

Заказ № 10145 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru